Nghiên cứu xác lập quy trình nuôi cấy tế bào sừng người trên màng collagen từ màng ối hướng tới ứng dụng ghép tự thân điều trị các tổn thương mất da

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



Trần Lê Bảo Hà

NGHIÊN CỨU XÁC LẬP QUY TRÌNH NUÔI CẤY
TẾ BÀO SỪNG NGƯỜI TRÊN MÀNG COLLAGEN
TỪ MÀNG ỐI HƯỚNG TỚI ỨNG DỤNG GHÉP TỰ THÂN
ĐIỀU TRỊ CÁC TỔN THƯƠNG MẤT DA

Chuyên ngành: Sinh lý học Người và Động vật
Mã số: 62 42 30 01



LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS. TS. BS. Trần Công Toại
2. TS. Hoàng Nghĩa Sơn



Thành phố Hồ Chí Minh - 2010

LỜI CAM ĐOAN
TÔI XIN CAM ĐOAN ĐÂY LÀ CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA
RIÊNG TÔI. NHỮNG KẾT QUẢ TRONG NGHIÊN CỨU NÀY HOÀN
TOÀN CHƯA ĐƯỢC CÔNG BỐ BỞI BẤT KỲ TÁC GIẢ NÀO KHÁC.

TRẦN LÊ BẢO HÀ
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành công trình này, tôi đã nhận được sự quan tâm,
giúp đỡ của những người thân, Thầy Cô, bạn bè, đồng nghiệp
xung quanh.
Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với PGS. TS. BS. Trần
Công Toại, người đã tạo cho tôi những điều kiện tốt nhất cũng như
đã tận tình hướng dẫn giúp tôi hoàn thành luận án. Cảm ơn Thầy
đã luôn nhiệt tình hỗ trợ, tạo nhiều thuận lợi cho tôi trong suốt
thời gian thực hiện đề tài.
Xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đối với TS. Hoàng Nghĩa
Sơn, người đã bỏ ra nhiều thời gian giúp tôi hoàn thành luận án.
Sự cố vấn của Thầy là nguồn động viên không nhỏ giúp tôi vững
bước trên con đường mà tôi đã chọn.
Dành cho người luôn động viên, hỗ trợ và gắn bó với tôi từ
khi tôi là sinh viên cho đến tận bây giờ và cả sau này, xin đặc biệt
cảm ơn Thầy, ThS. Phan Kim Ngọc.
Chân thành cảm ơn các anh chị, các em Bộ môn Mô phôi – Di
truyền – Giải phẫu bệnh, Trường Đại học Y Phạm Ngọc Thạch đã
hỗ trợ, chia sẻ vui buồn, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt
thời gian thực hiện luận án.
Chân thành cảm ơn các Thầy Cô, đồng nghiệp, các em thuộc
Bộ môn Sinh lý học và Công nghệ Sinh học Động vật cũng như
Phòng thí nghiệm Nghiên cứu và Ứng dụng Tế bào gốc, đặc biệt là

các em trong nhóm Vật liệu sinh học, đã luôn bên cạnh và hỗ trợ
tôi trong suốt những năm qua.
Cảm ơn PGS. TS. Nguyễn Văn Út đã cho tôi những góp ý
chân thành.
Luận án này không thể hoàn thành nếu không nhận được
nguồn cung cấp nguyên vật liệu. Qua đó, chân thành cảm ơn Bệnh
viện Chấn thương Chỉnh hình đã cung cấp nguồn da và Bệnh viện
Hùng Vương đã cung cấp màng ối để tôi có thể thực hiện đề tài
này.
Đề tài được hoàn thiện nhờ sự hỗ trợ kỹ thuật từ nhiều cá
nhân và đơn vị. Xin cảm ơn Cô Thoa, Huy - Viện Vệ sinh Dịch tễ
Trung ương, anh Bình – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã
giúp đỡ tôi rất nhiều trong việc đánh giá sản phẩm của đề tài.
Đồng thời, xin gửi lời cảm ơn đến các bác sĩ, kỹ thuật viên thuộc
Bệnh viện Chợ Rẫy, Bệnh viện Nhi Đồng I và Trường Đại học Y
Dược Tp.HCM đã hỗ trợ tôi trong việc phân tích kết quả mô học.
Xa cách về địa lý nhưng rất gần về tấm lòng, xin bày tỏ lòng
kính trọng và biết ơn đối với các chuyên gia Nhật Bản trong việc
cố vấn, huấn luyện về mặt kỹ thuật cho tôi: GS. Hirotoshi Miyoshi
và GS. Ookawa ở trường đại học Tsukuba, TS. Yuji Shirakata và
TS. Lujun Yang thuộc trường đại học y Ehime và TS. Masahiro
Kino_oka đến từ trường đại học Osaka.
Lời cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với Ba Mẹ,
Người đã nuôi nấng, dạy dỗ, luôn tin tưởng và cho tôi niềm thương
yêu vô bờ. Cảm ơn các Anh Chị đã luôn yêu thương và dành cho
tôi sự quan tâm sâu sắc. Cảm ơn Chồng, người đã cùng chia sẻ,
luôn tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi được song hành trên con
đường tình yêu và sự nghiệp, là chỗ dựa vững chắc nhất của cuộc
đời tôi. Cảm ơn Kirin, Sóc – hai con yêu của Mẹ

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2009

Trần Lê Bảo Hà
CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AEC Amniotic epithelial cells
ARN Acid ribonucleic
bp Base pair
CEA Cultured Epidermal Autograft
DEPC Diethylpyrocarbonate
DMEM Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium
DMSO Dimethyl sulfoxide
DPBS Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline
ECM Extracellular matrix
EDTA Ethylene diaminetetraacetic acid
EGF Epidermal Growth Factor
EPU Epidermal proliferative unit
FBS Fetal Bovine Serum
FDA Food and Drug Administration
G banding Giemsa banding
HAM Human Amniotic Membrane
HBV Hepatitis B virus
HCV Hepatitis C virus
HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethanesulfonic acid
hESC Human embryonic stem cell
HIV Human immunodeficiency virus
HLA Human leukocyte antigen
ISO International Organization for Standardization
kGy Kilogray
LSD Least Significant Different

MMP Matrix metalloproteinase
MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide
PAS Periodic acid Schiff
PCM Primary culture medium
PCR Polymerase chain reaction
PEDF Pigment epithelium-derived factor
pH Hydrogen ion concentration
PROM Premature rupture of the foetal membrane
RT Reverse transcriptase
SDS Sodium dodecyl sulfate
SEM Scanning Electron Microscopy
SFM DK-SFM – Defined keratinocyte serum free medium
SLPI Secretory leukocyte proteinase inhibitor
TEM Transmission Electron Microscopy

BẢNG ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ

TIẾNG ANH TIẾNG VIỆT
Apoptosis Sự chết tế bào được lập trình
Cultured Epidermal Autograft Ghép tự thân tấm biểu bì nuôi cấy
Defined keratinocyte serum free medium Môi trường không chứa huyết
thanh dành cho tế bào sừng
Desmosome Thể liên kết
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Dung dịch muối đệm phosphat,
không chứa ion Ca
2+
và Mg
2+

Epidermal Growth Factor Yếu tố tăng trưởng biểu bì

Epidermal proliferative unit Đơn vị tăng sinh biểu bì
Epidermal stem cell Tế bào gốc biểu bì
Extracellular matrix Khuôn ngoại bào
Fetal Bovine Serum Huyết thanh bào thai bò
Hemidesmosome Thể bán liên kết
Hepatitis B virus Virus gây viêm gan B
Hepatitis C virus Virus gây viêm gan C
Human Amniotic Membrane Màng ối người
Human embryonic stem cell Tế bào gốc phôi người
Human immunodeficiency virus Virus gây suy giảm miễn dịch ở
người
Keratinocyte Tế bào sừng
Label-retaining cell Tế bào giữ chất đánh dấu
Ligand Phối tử
Marker Yếu tố đánh dấu
Polymerase chain reaction Phản ứng tổng hợp dây chuyền
nhờ polymerase
Primary culture medium Môi trường nuôi sơ cấp
Reverse transcriptase Enzyme phiên mã ngược
Scaffold Khung nâng đỡ
Transforming growth factor Nhân tố tăng trưởng chuyển dạng
Transient amplifying cell Tế bào khuếch đại chuyển
Transmission Electron Microscopy Kính hiển vi điện tử xuyên



DANH MỤC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ
Bảng 1.1. Hiệu quả của các liều chiếu xạ gamma khác nhau lên khả năng
ngăn thấm vi sinh vật của màng ối 12
Bảng 1.2. Tóm tắt các thử nghiệm lâm sàng sử dụng CEA trên thế giới 30

Bảng 3.1. Tóm tắt hiệu quả loại tế bào biểu mô HAM khi sử dụng
trypsin/EDTA và cạo 61
Bảng 3.2. Kết quả kiểm nghiệm màng collagen 64
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của màng collagen đến sự thay đổi
pH của môi trường SFM 65
Bảng 3.4. Thông tin về các mẫu da đã thu nhận 69
Bảng 3.5. Số tế bào sống và % tế bào sống sau khi phân lập 73
Bảng 3.6. Sự tăng sinh của tế bào sừng sau lần cấy chuyền thứ nhất 77
Bảng 3.7. Kết quả đo mật độ quang đánh giá sự tăng trưởng tế bào sừng
trên màng collagen 83
Đồ thị 3.1. Đường cong tăng trưởng của tế bào sừng sau lần cấy chuyền
thứ nhất 78
Đồ thị 3.2. Đường cong tăng trưởng của tế bào sừng trên màng collagen
thông qua kết quả đo mật độ quang 84


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Màng ối bọc quanh thai nhi 3
Hình 1.2. Sơ đồ mô tả cấu trúc của màng ối 4
Hình 1.3. Minh họa vai trò của các tế bào tách từ màng ối trong
chữa tổn thương 9
Hình 1.4. Bé trai 3 tuổi bị bỏng 3% độ 2 tại mặt, sử dụng màng ối
sau khi đã rửa sạch và sấy khô 14
Hình 1.5. Cấu trúc cơ bản của da người 15
Hình 1.6. Đơn vị tăng sinh biểu bì EPU 16
Hình 1.7. Các lớp tế bào sừng của biểu bì 18
Hình 1.8. Tế bào gốc biểu bì ở vùng sâu nhất và nông nhất trong da 20
Hình 1.9. Các dạng tế bào trong quá trình biệt hóa tế bào gốc biểu bì 22
Hình 1.10. Các yếu tố đánh dấu của tế bào sừng tương ứng chương trình
biệt hóa biểu bì 23

Hình 1.11. Sự phân bố của p63 (đỏ) và involucrin (xanh) trong biểu bì
người bình thường 23
Hình 1.12. Protein Wnt hoạt hóa các tế bào gốc biểu bì (EpSC)
bất hoạt thành các tế bào khuếch đại chuyển (TA) 25
Hình 1.13. Các tế bào sừng lan ra làm liền vết thương 26
Hình 1.14. Chỉ định của CEA 32
Hình 1.15. Mô hình minh họa các bước của CEA 32
Hình 2.1. Một số hình ảnh xử lý HAM 43
Hình 2.2. Mẫu da toàn bộ và da mỏng 46
Hình 2.3. Minh họa phương pháp nuôi cấy tế bào trên màng collagen
đã được trải trên đĩa lồng 50
Hình 2.4. Vùng lấy da ghép 56
Hình 3.1. Lớp tế bào biểu mô nguyên vẹn của HAM 58
Hình 3.2. HAM nguyên (a), HAM được xử lý trypsin-EDTA
15 phút (b), 30 phút (c), 45 phút (d) và cạo để loại biểu mô 59
Hình 3.3. HAM đã được xử lý trypsin-EDTA 30 phút và cạo để
loại biểu mô 60
Hình 3.4. Kết quả nhuộm trichrom (a) và nhuộm PAS (b) của HAM
đã loại biểu mô 61
Hình 3.5. Lớp biểu bì và trung bì tách rời nhau sau khi ủ enzym 71
Hình 3.6. Mô học biểu bì đã tách rời (a), mô học trung bì đã tách rời (b), mô học
trung bì tách rời đã được thu nhận hoàn toàn tế bào lớp đáy (c) 72
Hình 3.7. Tế bào được nuôi sơ cấp 76
Hình 3.8. Tế bào sừng bám trên đĩa nuôi (a) và trên màng collagen (b)
sau 3 giờ cấy chuyền 82
Hình 3.9. Tế bào sừng tăng sinh tạo lớp đơn trên màng collagen 85
Hình 3.10. Tấm tế bào sau 7 ngày nâng lên bề mặt không khí 86
Hình 3.11. Kết quả tạo nhiều lớp tế bào sau 4 ngày (a), 7 ngày (b), 10 ngày (c)
nâng lên bề mặt không khí 87
Hình 3.12. Tấm tế bào sau 7 ngày tăng Ca

2+
trong môi trường 88
Hình 3.13. Kết quả tạo nhiều lớp tế bào sau 4 ngày (a), 7 ngày (b), 10 ngày (c)
tăng nồng độ Ca
2+
trong môi trường nuôi 89
Hình 3.14. Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch với kháng thể p63
tấm tế bào sừng nhiều lớp được tạo ra trên màng collagen 91
Hình 3.15. Hình chụp dưới kính hiển vi điện tử truyền suốt cho thấy
có sự hình thành liên kết giữa tế bào và màng collagen 93
Hình 3.16. Hình chụp dưới kính hiển vi điện tử truyền suốt cho thấy
có sự hình thành liên kết giữa hai tế bào kế cận 94
Hình 3.17. Bộ nhiễm sắc thể tế bào người nữ sau nuôi cấy 95
Hình 3.18. Bộ nhiễm sắc thể tế bào người nam sau nuôi cấy 95
Hình 3.19. Kết quả RT-PCR các yếu tố đánh dấu của tế bào sừng 96
Hình 3.20. Kết quả ghép tự thân tấm tế bào sừng nuôi cấy trên bệnh nhân 101








MỞ ĐẦU

1
Hiện nay, nhu cầu điều trị bỏng, mất da, mất phần mềm do tai nạn giao
thông, tai nạn lao động, loét do tiểu đường, do các bệnh lý tim mạch, các vết thương
do xạ trị… rất lớn. Cho đến nay, ghép da tự thân vẫn là “tiêu chuẩn vàng” để tái tạo
bề mặt các vết thương. Tuy nhiên, vùng da cho để ghép tự thân bị hạn chế trong các
vết thương mất da rộng. Điều này thúc đẩy phát triển các liệu pháp khác, trong đó

có liệu pháp ghép tấm tế bào nuôi cấy.
Công nghệ nuôi cấy tế bào là công nghệ hiện đại trong điều trị bỏng, tổn
thương mất da, điều trị thẩm mỹ Trên thế giới, công nghệ này liên tục được
nghiên cứu để hoàn chỉnh về quy trình công nghệ, về môi trường nuôi cấy… Thông
qua công nghệ nuôi cấy tế bào, nhiều nước trên thế giới đã đạt được những tiến bộ
vượt bậc trong điều trị bỏng và tổn thương mất da, nhiều nạn nhân bỏng sâu và rộng
trên 70% diện tích cơ thể đã được cứu sống cũng như giảm thiểu các di chứng nặng
nề do bỏng sâu để lại. Đồng thời, nhiều vật liệu cũng được nghiên cứu để làm màng
phủ tạm thời các vết thương mất da. Với những ưu điểm như kháng viêm, kháng
khuẩn, tính sinh miễn dịch thấp…, kể từ nghiên cứu đầu tiên của David vào năm
1910, màng ối đã được sử dụng rộng rãi trong chữa trị vết thương mất da. Hơn nữa,
màng ối còn có đặc điểm nổi bật là cấu tạo collagen của màng cơ bản tương tự
màng cơ bản của da người.
Do đó, việc kết hợp giữa màng collagen từ màng ối và tế bào sừng của người
được nuôi cấy để tạo ra tấm tế bào sừng nhằm ứng dụng ghép tự thân là một giải
pháp khả thi trong điều trị các tổn thương mất da và bỏng.
Tại Việt nam đã có nhiều giải pháp điều trị các tổn thương mất da bằng các
màng sinh học, trong đó có màng ối. Thậm chí có nhiều tác giả còn đề xuất việc
ứng dụng tế bào nuôi cấy trong việc điều trị. Tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa có
công trình khoa học nào về việc tạo vật liệu điều trị tổn thương mất da từ sự kết hợp
tế bào nuôi cấy và màng ối được công bố tại Việt nam.


2
Vì vậy tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu xác lập quy trình nuôi cấy tế bào
sừng người trên màng collagen từ màng ối hướng tới ứng dụng ghép tự thân
điều trị các tổn thương mất da” nhằm đạt các mục tiêu sau:
1. Xây dựng được quy trình chế tạo màng collagen từ màng ối người ứng dụng
làm giá thể cấy tế bào
2. Xây dựng được quy trình phân lập, nuôi cấy tăng sinh tế bào sừng người

3. Tạo được tấm tế bào sừng nhiều lớp trên giá thể collagen từ màng ối người













CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN

3
1.1. MÀNG ỐI NGƯỜI
Màng ối là một màng mỏng, dai, trong suốt, bao bọc quanh xoang nước ối,
bao quanh dây rốn từ điểm xuất phát ở nhau đến rốn thai nhi. Màng ối có thể được
tách khỏi màng đệm và bánh nhau dễ dàng ngay sau sanh. Ngoài chức năng sản
xuất nước ối, màng ối còn có khả năng ngăn ngừa sự xâm nhập của vi sinh vật trong
thời kỳ bào thai [60].









1.1.1. Cấu tạo của màng ối
Về nguồn gốc, màng nhau phát triển từ mô ngoài phôi, vừa chứa thành phần
của con (màng ối, màng đệm) và thành phần của mẹ (màng rụng). Cấu trúc màng
đệm-màng ối trên tạo thành hàng rào bao bọc phôi [62].
Về cấu trúc, màng ối bao gồm một lớp đơn tế bào biểu mô, một lớp màng

đáy và một lớp nền. Màng ối không chứa mạch máu hay dây thần kinh. Thay vào
đó, chất dinh dưỡng cần thiết được cung cấp trực tiếp cho màng ối nhờ sự khuếch
tán của dịch ối và từ lớp màng rụng ở bên dưới.
Độ dày trung bình của màng ối từ 0,02 – 0,4mm.

Hình 1.1. Màng ối bọc quanh thai nhi [121]


4











Hình 1.2. Sơ đồ mô tả cấu trúc của màng ối [62]
Bên trong cùng, gần thai nhất là lớp đơn các tế bào biểu mô nằm trên màng
đáy.
Lớp đặc ở bên dưới màng đáy tạo thành bộ khung dạng sợi chính cho màng
ối. Collagen của lớp đặc do các tế bào trung mô nằm ở lớp nguyên bào sợi tiết ra.
Trong đó, chủ yếu là collagen loại I và loại III tạo thành các bó song song, duy trì
tính cơ học của màng ối. Collagen loại V và loại VI giúp kết nối hai loại collagen
trên với màng đáy.
Nằm ngay trên màng đệm là lớp trung gian hay lớp xốp, chứa nhiều
proteoglycan, glycoprotein, collagen loại III tạo thành cấu trúc xốp [111]. Vì lớp

xốp này liên kết lỏng lẻo với màng đệm nên màng ối có thể dễ dàng tách khỏi màng
đệm [62].

Dịch ối
Màng rụng (mẹ)
Thành phần ngoại bào
Lớp
Lớp đặc
Màng đáy
Biểu mô
Màng ối
Dưỡng bào
Lớp lưới
Màng đệm
Lớp xốp
Lớp nguyên
bào sợi
Màng đáy


5
1.1.2. Các đặc điểm sinh học của màng ối giúp cho màng ối có tính ứng dụng
cao trong kỹ nghệ mô (tissue engineering)
1.1.2.1. Đặc điểm kháng viêm, kháng khuẩn
Trong một số trường hợp, các phản ứng viêm là tốt do chúng khởi động quá
trình hàn gắn vết thương. Tuy nhiên, các phản ứng này cũng thường gây ra các hậu
quả không mong muốn. Phản ứng chống lại vật thể lạ kích thích đại thực bào và các
tế bào khổng lồ tiết ra những cytokinee, thu hút nguyên bào sợi, gây nên sự xơ hóa
(fibrosis). Các nguyên bào sợi được hoạt hóa bởi nhân tố tăng trưởng chuyển dạng β
(TGF - Transforming growth factor) [82].

Màng ối làm giảm tiết TGF-β cũng như các thụ thể của TGF-β trên nguyên
bào sợi và do đó làm giảm chứng xơ hóa nói trên. Không những vậy, khung nâng
đỡ (scaffold) từ màng ối có thể điều khiển quá trình hàn gắn vết thương bằng cách
kích thích tái cấu trúc mô hơn là kích thích hình thành mô sẹo [143].
Đã có nghiên cứu chứng minh màng ối có tác dụng kháng viêm. Khuôn nền
của màng ối ức chế biểu hiện của một số cytokinee tiền viêm như IL-1α và IL-1β
[132]. Một loại protein khác là MMP (Matrix metalloproteinase) được biểu hiện
trên các tế bào đa nhân và đại thực bào cũng bị ức chế bởi màng ối [66]. Hyaluronic
acid, một glycosaminoglycan có khối lượng phân tử lớn, hiện diện rất nhiều trên
màng ối có thể gắn với CD44. Đây là yếu tố đánh dấu (marker) biểu hiện trên các tế
bào gây viêm và đóng vai trò quan trọng trong quá trình gắn của các tế bào gây
viêm (ví dụ: tế bào lympho) với chất nền của màng ối [65].
β-defensin là nhóm các peptide kháng khuẩn do các tế bào biểu mô và bạch
cầu tiết ra, đóng vai trò trong hệ thống miễn dịch bẩm sinh [86]. Các tế bào biểu mô
màng ối cũng có khả năng sản xuất β-defensin [81]. Ngoài ra, màng ối còn tiết ra
hai chất ức chế elastase khối lượng phân tử thấp là SLPI (secretory leukocyte
proteinase inhibitor) và elafin [23]. Ngoài đặc tính kháng viêm, cả SLPI và elafin
đều có hoạt tính kháng khuẩn và tham gia vào hệ thống miễn dịch bẩm sinh giúp


6
bảo vệ các bề mặt không bị nhiễm. Việc xử lý màng ối với cả hai chất đối kháng thụ
thể lactoferrin và IL-1 làm cho màng ối có khả năng kháng khuẩn và kháng viêm.
1.1.2.2. Đặc điểm kháng tạo mạch
Màng ối có hoạt tính kháng tạo mạch nhờ sự hiện diện của các hóa chất
kháng tạo mạch trong các tế bào biểu mô và trung mô màng ối như
thrombospondin-1, IL-1, collagen XVIII, IL-10, các nhân tố ức chế mô
metalloprotease (TIMP-1, -2, -3, -4). Màng đáy của màng ối giàu PEDF (pigment
epithelium-derived factor), một yếu tố kháng tạo mạch mới được phát hiện [10].
1.1.2.3. Đặc điểm miễn dịch

Màng ối có tính sinh miễn dịch thấp.
Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch trong suốt quá trình mang thai là bước quan
trọng đầu tiên để chứng minh tính sinh miễn dịch của màng ối. Điều thần kỳ của tạo
hóa thể hiện trong quá trình mang thai. ADN của hợp tử có một nửa từ cha, do đó
thai có các kháng nguyên bán đồng sinh đối với cơ thể mẹ. Tuy nhiên, hợp tử hay
thai không hề bị thải loại. Có thể có vài cơ chế liên quan đến việc bảo vệ thai không
bị tác động bởi hệ miễn dịch của mẹ. Các cơ chế ức chế không đặc hiệu có tính hệ
thống cũng như tại chỗ đã được mô tả. Chúng làm giảm đáp ứng miễn dịch mà
không gây tổn hại đến hệ miễn dịch của người mẹ. Một hàng rào nhau thai ngăn cản
sự lưu thông của các tế bào cũng như các kháng thể gây độc tế bào trước khi chúng
đi vào vòng tuần hoàn của thai. Nhân tố chính ngăn chặn sự thải loại của dưỡng bào
là HLA-G (Human leukocyte antigen). Trái ngược với các gen HLA-A và HLA-B
lớp I bị ức chế ở dưỡng bào, HLA-G biểu hiện trên các sợi lông nhung ngoài dưỡng
bào cũng như trên các tế bào của màng ối và dịch ối. Vai trò của HLA-A, HLA-B,
HLA-C là gây ra đáp ứng miễn dịch đặc hiệu bằng cách trình diện kháng nguyên
cho các tế bào T. Ngược lại, HLA-G lại liên quan đến sự chịu đựng miễn dịch do
chúng làm phối tử (ligand) cho các thụ thể ức chế hiện diện trên tế bào diệt tự nhiên
và đại thực bào [27], [108]. Các tế bào biểu mô màng ối không biểu hiện các kháng
nguyên HLA-A, -B, -C và -DR nhưng biểu hiện HLA-G trên bề mặt. Do đó, sự thải


7
loại cấp tính sẽ không xảy ra sau khi ghép. Mặc dù còn nhiều tranh cãi nhưng người
ta vẫn tin rằng tính sinh miễn dịch của màng ối thấp [68].
Hơn thế nữa, màng ối được bảo quản lạnh sâu có tính sinh miễn dịch thấp
hơn so với màng ối tươi vì các tế bào sống giảm đến 90%. Điều này giúp các nhà
nghiên cứu sử dụng màng ối bảo quản lạnh sâu hơn là màng ối tươi [88].
1.1.2.4. Đặc điểm gây chết tế bào được lập trình (pro-apoptosis)
Màng ối tiết một số chất hoạt động như là tác nhân gây chết tế bào được lập
trình. Sự chết được lập trình của các đại thực bào hoạt hóa interferon- được màng

ối kích thích do sự ngắt quãng các con đường sống sót qua trung gian NFB và Akt-
FKHR.
Ngoài ra, màng ối có thể thúc đẩy sự chết được lập trình của các bạch cầu đa
nhân [10].
1.1.2.5. Đặc điểm cơ học
Cho đến nay, hầu hết nghiên cứu về đặc tính cơ học của màng ối là nghiên
cứu sự vỡ màng thai sớm (PROM: premature rupture of the foetal membrane).
PROM được định nghĩa là sự vỡ màng ối và màng đệm trước khi cơn co tử cung
xảy ra. Màng thai phải chịu được áp suất thủy tĩnh của dịch ối trong suốt quá trình
mang thai. Màng ối chiếm khoảng 20% độ dày của cả màng ối lẫn màng đệm nhưng
nó phải chịu áp lực nhiều hơn so với màng đệm. Do đó, khả năng chống chịu áp lực
của màng thai chủ yếu phụ thuộc vào màng ối. Do tầm quan trọng như vậy in vivo
nên màng thai, đặc biệt là màng ối, là tâm điểm của nhiều nghiên cứu về đặc điểm
cơ học in vitro.
Màng ối có tính mềm dẻo và nhớt. Đây là đặc tính quan trọng của khung
nâng đỡ trong hầu hết các mô như mô mạch máu (nếu khung nâng đỡ cứng, thiếu
tính mềm dẻo thì sẽ kích thích áo trong của mạch tăng sản và làm nghẽn mạch)
[68], [88]. Đại lượng đo độ mềm dẻo là modul Young. Đây là đại lượng được sử
dụng nhiều trong vật lý cơ, được định nghĩa là tỉ lệ ứng suất trên sức căng. Modul


8
Young của màng ối 26 đến 36 tuần là 3,6 MPa, màng ối 36-40 tuần là 2,29 MPa. Sự
thay đổi này có thể do lượng collagen hoặc elastin bên trong [18], [64], [94].
1.1.3. Một số ứng dụng của màng ối
1.1.3.1. Thu nhận tế bào gốc
Các tế bào biểu mô màng ối - AEC (Amniotic epithelial cells) là một nguồn
tế bào gốc đầy tiềm năng cho kỹ nghệ mô. Tương tự như ba lớp mầm của phôi là
ngoại phôi bì, trung phôi bì và nội phôi bì, biểu mô màng ối cũng tách khỏi lá phôi
ngoài (epiblast) trước quá trình tạo phôi ba lá [110]. Điều này cho thấy biểu mô

màng ối có khả năng duy trì một nguồn tế bào gốc trong suốt quá trình mang thai
[62]. Các nghiên cứu gần đây cũng cho thấy AEC biểu hiện các yếu tố đánh dấu bề
mặt tương tự với tế bào gốc phôi là SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 cũng
như biểu hiện các nhân tố phiên mã chuyên biệt tế bào gốc đa năng là Oct-4 và
Nanog [101], [102]. Tính đa tiềm năng của AEC được kiểm chứng thông qua việc
tạo các thể khảm (chimera) dị sinh từ AEC và tế bào gốc phôi chuột in vitro [140].
Thể khảm này tăng sinh thành các tế bào của cả ba lớp mầm. Nhiều thí nghiệm khác
cũng đã chứng minh khả năng biệt hóa in vitro của các AEC thành các tế bào ở cả 3
lớp mầm, đó là tế bào tim (dòng trung bì), nơron và tế bào thần kinh đệm (dòng
ngoại bì), tế bào tụy và tế bào gan (dòng nội bì) [74], [101]. Tất cả các tế bào trên
đều dương tính với yếu tố đánh dấu chuyên biệt. Ví dụ, các AEC sản xuất và tiết ra
albumin, dự trữ glycogen tương tự như dữ liệu biểu hiện gen của các tế bào gan
khác [139].
Tạo dòng là khả năng hình thành một dòng tế bào từ một tế bào đơn, đây là
chức năng quan trọng thể hiện tính tự làm mới của tế bào gốc. Các AEC có khả
năng tạo dòng và khả năng này được so sánh với các dòng tế bào gốc phôi người
hESC (Human embryonic stem cell) [74]. Tính sinh khối u là một hạn chế đáng kể
của các tế bào gốc phôi người đa tiềm năng trong kỹ nghệ mô. Trong khi đó, mặc
dù cũng là các tế bào đa tiềm năng nhưng các AEC không tạo thành khối u khi cấy
vào tinh hoàn chuột SCID [74], [104]. Điều này đã được chứng minh trong các


9
nghiên cứu sử dụng AEC điều trị tổn thương thị giác [133], [143], [146]. Trong cơ
thể, hiện tượng ức chế khối u có thể do telomerase của các AEC thiếu hoạt tính
[101], [105]. Người ta cũng chứng minh các AEC tự nhiên biểu hiện loại kháng
nguyên bạch cầu người là HLA-G. Loại kháng nguyên này không đa hình [33].
AEC không có các kháng nguyên đa hình như HLA-A, HLA-B (lớp IA) và HLA-
DR (lớp II) [126]. Những khám phá này cho thấy các AEC có khả năng trơ, làm
giảm nguy cơ thải loại hoặc đáp ứng miễn dịch sau khi cấy ghép. Một ưu điểm quan

trọng khác của các AEC so với hESC là các tế bào này có khả năng tăng sinh mà
không cần một loại tế bào khác làm lớp nuôi dưỡng (feeder layer). Các AEC tự tạo
lớp nuôi dưỡng cho riêng chúng với vài tế bào trãi rộng trên bề mặt đĩa nuôi. Lớp
nuôi dưỡng tự thân này hỗ trợ AEC bám dính, tiết ra các nhân tố duy trì AEC ở tình
trạng không biệt hóa [101].










Hình 1.3. Minh họa vai trò của các tế bào tách từ màng ối
trong chữa tổn thương [149]
Ưu điểm khác của AEC là số lượng tế bào lớn (hơn một trăm triệu AEC trên
1 màng ối) [101]. Những tế bào này lại có khả năng tăng sinh rất nhanh dưới sự
Nhau thai
Chữa bỏng
Tế bào sừng, da
Biệt hóa
Ghép trực tiếp
tế bào vào mô
Các tế bào màng ối
Màng ối
Tiểu đường loại 1
Tiểu đảo, tụy
Ghép bắt cầu trong

viêm gan, xơ gan,
tổn thương
Tế bào gan, gan


10
hiện diện của một vài nhân tố tăng trưởng như EGF [142]. Như vậy, một số lượng
lớn tế bào gốc có thể thu nhận khi sử dụng màng ối. Hơn nữa, màng ối là sản phẩm
thải sau sinh nên việc sử dụng màng ối không ảnh hưởng đến vấn đề y đức.
1.1.3.2. Ứng dụng màng ối làm khung nâng đỡ trong kỹ nghệ mô
Một thành phần quan trọng của kỹ nghệ mô là khung nâng đỡ giúp các tế bào
và mô tăng trưởng. Các khung nâng đỡ này phải sáp nhập với mô chủ và cung cấp
một môi trường lý tưởng cho tế bào tăng trưởng và biệt hóa. Phần lớn vật liệu tạo
khung nâng đỡ có nguồn gốc tự nhiên từ mô động vật có vú. Với cấu trúc đặc biệt
và hoạt tính sinh học, màng ối trở thành ứng viên lý tưởng, một nguồn có tiềm năng
làm vật liệu khung nâng đỡ cho kỹ nghệ mô. Thành phần nền ngoại bào của màng
đáy màng ối tạo ra một khung tự nhiên cho cấy tế bào trong kỹ nghệ mô. Ngoài ra,
màng ối có các đặc tính sinh học khác quan trọng cho kỹ nghệ mô như kháng viêm,
kháng khuẩn, kháng xơ hóa, kháng sẹo và tính sinh miễn dịch thấp…
Một yêu cầu quan trọng trong lựa chọn khung nâng đỡ là tính tương hợp sinh
học [15]. Ngoài ra, một số đặc tính khác cũng cần được lưu ý, đó là tính thấm, tính
ổn định, độ đàn hồi, độ mềm dẻo, khả năng tạo hình và khả năng phân hủy sinh học
với tốc độ bằng với tốc độ thay thế của mô [157]. Bên cạnh đó, khung nâng đỡ sẽ lí
tưởng hơn nếu tế bào có thể bám dính và giải phóng các nhân tố tăng trưởng [150].
Khả năng bám dính của tế bào lên khung nâng đỡ chịu ảnh hưởng lớn bởi
thành phần nền ngoại bào (ECM – extracellular matrix) của khung nâng đỡ đó. Sự
hiện diện hay vắng mặt một số phân tử ECM như collagen, laminin, fibronectin, và
vitronectin sẽ gây ảnh hưởng lớn đến sự bám dính, tăng trưởng, di cư của các tế bào
nằm trên. Các phân tử ECM này đóng vai trò phối tử bám dính, cho phép truyền tín
hiệu thông qua quá trình tương tác với các thụ thể bề mặt tế bào. Do vậy, tế bào phụ

thuộc rất nhiều vào những đặc điểm của ECM như thành phần, độ cứng cơ học, tổ
chức không gian [62].
Các thụ thể xuyên màng trên bề mặt của tế bào tương tác với ECM chủ yếu
là integrin. Integrin có một vùng ngoại bào gắn lên ECM và một vùng nội bào gắn