Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nuôi cấy bao phấn lúa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI





NGUYỄN KIM OANH


NGHIÊN C
ỨU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH
NUÔI C
ẤY BAO PHẤN LÚA






LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP


Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Mã số: 60.42.02.01

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. PHAN HỮU TÔN

HÀ NỘI – 2013
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


i

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này
là trung thực và chưa hề ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào.
Tôi xin cam ñoan mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn ñã
ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñã ñược chỉ rõ
nguồn gốc.
Hà Nội, ngày 25 tháng 3 năm 2013
Tác giả luận văn



Nguyễn Kim Oanh
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


ii

LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành ñề tài luận văn cao học này, ngoài sự nổ lực cố gắng
của bản thân, tôi ñã nhận ñược sự giúp ñỡ tận tình của thầy cô, bạn bè và
người thân.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo trong bộ môn Sinh học
phân tử và Công nghệ sinh học ứng dụng ñã tận tình giúp ñỡ trong quá trình
thực tập.
ðặc biệt tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới thầy giáo hướng
dẫn PGS.TS Phan Hữu Tôn - Trưởng Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ
sinh học ứng dụng - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, ñã tận tình hướng
dẫn, chỉ bảo, giúp ñỡ và ñộng viên tôi trong suốt quá trình thực hiện ñề tài.
Qua ñây tôi cũng xin gửi lời cảm ơn ñến Trung tâm Bảo tồn và Phát
triển nguồn gen cây trồng - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã tạo ñiều
kiện và giúp ñỡ tôi trong quá trình thực hiện ñề tài.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành ñến gia ñình, người thân
và toàn thể bạn bè ñã ñộng viên và khích lệ ñể tôi trong suốt quá trình học tập
và hoàn thiện luận văn.
Xin chân thành cảm ơn !

Hà Nội, ngày 25 tháng 3 năm 2013
Học viên



Nguyễn Kim Oanh
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


iii

MỤC LỤC

Lời cam ñoan i
Lời cảm ơn ii

Mục lục iii
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt vi
Danh mục bảng vii
Danh mục hình viii
1 MỞ ðẦU 1
1.1 ðặt vấn ñề 1
1.2 Mục ñích của ñề tài 2
1.3 Yêu cầu của ñề tài 2
2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Giới thiệu về phương pháp nuôi cấy bao phấn trong chọn tạo
giống cây trồng 3
2.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy bao phấn lúa 7
2.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 7
2.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 9
2.3 Các yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình nuôi cấy bao phấn lúa 11
2.3.1 Kiểu gen của cây cho bao phấn 11
2.3.2 Giai ñoạn phát triển của hạt phấn 13
2.3.3 ðiều kiện sinh lý của cây cho bao phấn 14
2.3.4 Nhiệt ñộ và thời gian xử lý ñòng 15
2.3.5 ðiều kiện nuôi cấy 16
2.3.6 Thành phần môi trường nuôi cấy 16
2.3.7 Qúa trình phân hoá callus 20
2.3.8 Hiện tượng bạch tạng 21
2.4 Cây ñơn bội và ñặc ñiểm di truyền của cây ñơn bội 22
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


iv

3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

3.1 Vật liệu và phạm vi nghiên cứu 24
3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 24
3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 24
3.2 ðịa ñiểm và thời gian tiến hành 24
3.2.1 ðịa ñiểm nghiên cứu 24
3.2.2 Thời gian tiến hành: 25
3.3 Nội dung nghiên cứu 25
3.4 Phương pháp nghiên cứu 25
3.4.1 Lấy mẫu và xử lý mẫu 26
3.4.2 Cấy bao phấn ñể tạo callus 26
3.4.3 Tái sinh cây từ callus 27
3.4.4 Môi trường nuôi cấy 27
3.5 Bố trí thí nghiệm 27
3.5.1 Thí nghiệm 1 27
3.5.2 Thí nghiệm 2 27
3.5.3 Thí nghiệm 3 28
3.5.4 Thí nghiệm 4 29
3.5.5 Thí nghiệm 5 29
3.5.6 Thí nghiệm 6 30
3.5.7 Thí nghiệm7 30
3.5.8 Thí nghiệm 8 31
3.6 Phương pháp ñánh giá và xử lý số liệu 31
3.6.1 Phương pháp ñánh giá 31
3.6.2 Phương pháp xử lý số liệu 32
4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33
4.1 Giai ñoạn Tạo callus 33
4.1.1 Phản ứng của bao phấn trong quá trình nuôi cấy 33
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

v

4.1.2 Ảnh hưởng của kiểu gen tới sự hình thành callus 35
4.1.3 Ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh ñến khả năng tạo callus 39
4.1.4 Ảnh hưởng của nồng ñộ chất khử trùng ñến tỷ lệ sống của mẫu cấy 43
4.1.5 Ảnh hưởng của môi trường MS và N6 ñến khả năng tạo callus
của mẫu cấy 45
4.1.6 Ảnh hưởng của nồng ñộ 2,4D ñến khả năng hình thành callus của
bao phấn
47
4.2 Giai ñoạn tái sinh chồi 50
4.2.1 Ảnh hưởng chất lượng callus ñến khả năng tái sinh cây 50
4.2.2 Ảnh hưởng của nồng ñộ BAP ñến khả năng tái sinh chồi 54
4.3 Giai ñoạn ra rễ hình thành cây hoàn chỉnh 57
4.3.1 Ảnh hưởng của nồng ñộ NAA ñến khả năng ra rễ của cây tái sinh 57
4.3.2 Ảnh hưởng của môi trường thuần dưỡng ñến khả năng sinh
trưởng của cây
63
5 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 70
5.1 Kết luận 70
5.2 ðề nghị 70
TÀI LIỆU THAM KHẢO 72
PHỤ LỤC 1



Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


vi

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT


2,4D Acid 2,4 dichlorophenoxy axetic
Cs Cộng sự
CT Công thức
BAP 6- Benzylaminopurine
Kinetin 6- Furfurylaminopurine
MS Murashige and Skoog, 1962
N6 Chu & Cs, 1976
NAA Naphlene axetic acid
NCBP Nuôi cấy bao phấn
NXB Nhà xuất bản

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


vii

DANH MỤC BẢNG

STT Tên bảng Trang

4.1 Ảnh hưởng của kiểu gen ñến sự hình thành callus 35
4.2 ðộng thái hình thành callus sau 5 tuần theo dõi 38
4.3 Ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh ñến khả năng tạo callus 40
4.4 Ảnh hưởng của nồng ñộ chất khử trùng ñến tỷ lệ sống của các
dòng nghiên cứu 43
4.5 Ảnh hưởng của môi trường ñến khả năng tạo callus từ bao phấn lúa 46

4.6 Ảnh hưởng của nồng ñộ 2,4D ñến tỷ lệ tạo thành callus và tỉ lệ
chết của các dòng nghiên cứu
48
4.7a Ảnh hưởng của nồng ñộ BAP ñến khả năng tái sinh chồi ở các
công thức nghiên cứu thuộc dòng N39 54
4.7b Ảnh hưởng của nồng ñộ BAP ñến khả năng tái sinh chồi ở các
công thức nghiên cứu thuộc dòng N13
56
4.8 Ảnh hưởng của nồng ñộ NAA ñến khả năng ra rễ của mẫu cấy ở
các công thức thí nghiệm 2 dòng N39 và N13
59
4.9 Ảnh hưởng của các môi trường thuần dưỡng ñến tỷ lệ sống của
cây lúa
63
4.10 Ảnh hưởng của một số môi trường thuần dưỡng ñến chiều dài rễ,
chiều cao cây, số lá và số nhánh
64
4.11 Khả năng sống của cây in vitro trong ñiều kiện tự nhiên 68


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


viii

DANH MỤC HÌNH

STT Tên hình Trang

4.1 Hình ảnh callus 34
4.2 Ảnh hưởng của kiểu gen ñến khả năng hình thành callus 37
4.3 Mối tương quan giữa tỷ lệ bao phấn chết và tỷ lệ bao phấn tạo callus 37
4.4a Ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh ñến khả năng tạo callus và tỷ
lệ chết của mẫu cấy dòng N39 41
4.4b Ảnh hưởng của thời gian xử lý lạnh ñến khả năng tạo callus và tỷ
lệ chết của mẫu cấy dòng N13
41
4.5a Ảnh hưởng của nồng ñộ chất khử trùng ñến tỉ lệ sống và tỷ lệ
chết của mẫu cấy dòng N39 44
4.5b Ảnh hưởng của nồng ñộ chất khử trùng ñến tỉ lệ sống và tỷ lệ
chết của mẫu cấy dòng N13
44
4.6 Ảnh hưởng của môi trường ñến khả năng tạo callus từ bao phấn
lúa 2 dòng N39 và N13 (sau 4 tuần theo dõi)
46
4.7a Ảnh hưởng của nồng ñộ 2,4D ñến tỷ lệ tạo thành callus và tỉ lệ
chết ở các công thức dòng N39
49
4.7b Ảnh hưởng của nồng ñộ 2,4D ñến tỷ lệ tạo thành callus và tỉ lệ
chết ở các công thức dòng N13
49
4.8 Ảnh callus chấm xanh 52
4.9 Ảnh tái sinh cây xanh 52
4.10 Ảnh rễ cây ăn lan vào môi trường thạch 52
4.11 Ảnh callus tái sinh một cây xanh và một cây bạch tạng 53
4.12 Ảnh rế ức chế chồi phát triển 53
4.13 Ảnh tái sinh cây bạch tạng 53
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

ix

4.14a Ảnh hưởng của nồng ñộ BAP ñến khả năng tái sinh chồi ở các
công thức nghiên cứu thuộc dòng N39
55
4.14b Ảnh hưởng của nồng ñộ BAP ñến khả năng tái sinh chồi ở các
công thức nghiên cứu thuộc dòng N13 56
4.15 Chồi xanh tái sinh từ callus sau 25 ngày nuôi cấy 57
4.16 Chồi lúa mới ñược cấy trên môi trường ra rễ 58
4.17a Ảnh hưởng của nồng ñộ NAA ñến khả năng ra rễ của mẫu cấy ở
các công thức nghiên cứu dòng N39 60
4.17b Ảnh hưởng của nồng ñộ NAA ñến khả năng ra rễ của mẫu cấy ở
các công thức nghiên cứu dòng N13
60
4.18 Cây lúa N39 sau 10 ngày cấy trên môi trường ra rễ 61
4.19 Ảnh ra rễ trong môi trường thạch của cây tái sinh 61
4.20a Ảnh hưởng của các môi trường thuần dưỡng ñến khả năng sinh
trưởng của cây lúa dòng N39
65
4.20b Ảnh hưởng của các môi trường thuần dưỡng ñến khả năng sinh
trưởng của cây lúa dòng N13 65
4.21 Ảnh cây in vitro ñạt tiêu chuẩn ra cây 69
4.22 Ra cây ngoài tự nhiên 69

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


1

1. MỞ ðẦU

1.1. ðặt vấn ñề
Cây lúa (Oryza sativa.L) là cây lương thực giữ vai trò rất quan trọng,
thuộc nhóm cây tự thụ phấn. ðể tạo ra một giống mới ñối với cây tự thụ phấn
thường người ta tiến hành lai hữu tính sau ñó cho các thế hệ ñời sau tự thụ.
Tuy nhiên, ñể tạo ñược dòng thuần ñồng hợp tử tất cả các gen theo cách này
thường phải mất từ 7 ñến 8 ñời. Nếu bố mẹ khác xa nhau về mặt di truyền thì
số ñời tự thụ cần thiết có thể phải dài hơn nhiều, khi cần tự thụ liên tục trên 10
thế hệ thậm chí vẫn còn phân ly. ðể rút ngắn thời gian tạo dòng thuần, hiện
nay người ta ñã tiến hành kỹ thuật nuôi cấy bao phấn, hoặc bào tử hạt phấn
thường là từ cây F1 và F2 ñể tạo ra cây ñơn bội, sau ñó lưỡng bội hoá bằng xử
lý Colchicine ñể tạo cây nhị bội, ñồng hợp tử về hầu hết các gen.
Như vậy, nuôi cấy bao phấn là một kỹ thuật hữu hiệu ñể tạo ra các
dòng ñồng hợp tử ngay từ thế hệ ñầu tiên (dòng ñơn bội kép), do ñó tiết kiệm
nguồn lực và rút ngắn thời gian cần thiết ñể tạo ra giống mới (Javed,
2007)[32].
Trên thế giới cũng như tại Việt Nam, kỹ thuật nuôi cấy bao phấn ñã
thành công ở nhiều ñối tượng cây trồng trong ñó có cây lúa.Tuy nhiên, hiệu
quả của quá trình nuôi cấy bao phấn lúa phụ thuộc nhiều yếu tố: kiểu gen của
cây ñưa vào nuôi cấy, yếu tố môi trường: nhiệt ñộ, ánh sáng, thành phần các
chất trong môi trường nuôi cấy và các kỹ thuật xử lý trước và sau khi nuôi cấy
bao phấn (Trần Duy Quý, 1999; Asoliman, 2007) [13] [23]. Trong nhiều năm
qua ñã có hàng loạt những nghiên cứu về vấn ñề này, tập trung vào hai hướng
chính là cải tạo về mặt di truyền phản ứng trong nuôi cấy bao phấn thông qua
chọn lọc, lai tạo (Herath, 2007) [31] và tối ưu hóa môi trường nuôi cấy
(Bidhan, 2005; Chen, 2007) [24] [27]. Có nhiều nghiên cứu về nuôi cấy bao
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

2

phấn lúa ñã ñược công bố nhưng còn chưa thống nhất.
Chính vì vậy ñể khẳng ñịnh lại những yếu tố ảnh hưởng tới kết quả
nuôi cấy bao phấn lúa và ứng dụng chúng trong chọn tạo dòng thuần chúng
tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: “Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nuôi cấy
bao phấn lúa”.
1.2. Mục ñích của ñề tài
Xác ñịnh ñược ñiều kiện nuôi cấy tối ưu nhất cho quá trình tạo callus
và tái sinh cây xanh.
Hoàn thiện quy trình kỹ thuật nuôi cấy bao phấn lúa.
1.3. Yêu cầu của ñề tài
Nghiên cứu 3 giai ñoạn:
Giai ñoạn tạo callus: Nghiên cứu ảnh hưởng của kiểu gen, thời gian xử
lý lạnh, nồng ñộ chất khử trùng, loại môi trường và nồng ñộ chất kích thích
sinh trưởng (2,4D) ñến khả năng tạo callus của mẫu cấy.
Giai ñoạn tái sinh cây: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ BAP ñến
khả năng tái sinh chồi xanh.
Giai ñoạn ra rễ hình thành cây hoàn chỉnh: Nghiên cứu ảnh hưởng của
nồng ñộ NAA ñến khả năng ra rễ của cây tái sinh và ảnh hưởng của môi
trường thuần dưỡng ñến khả năng sinh trưởng của cây.


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


3

2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Giới thiệu về phương pháp nuôi cấy bao phấn trong chọn tạo giống
cây trồng
Nuôi cấy mô tế bào và bộ phận cơ quan thực vật trong môi trường dinh
dưỡng vô trùng nhằm tạo cây hoàn chỉnh là một hướng nghiên cứu cơ bản và
ứng dụng quan trọng trong công tác chọn tạo và nhân giống cây trồng. Ý
tưởng này ñược ñề xuất vào năm 1838 – 1839 trong nội dung học thuyết tế
bào của Schleiden và Schwann. Tuy nhiên, vẫn chưa ñược ứng dụng cho ñến
ñầu thế kỷ 20 Haberlant – nhà sinh lý học thực vật người ðức nhấn mạnh tính
toàn năng của tế bào thực vật. Theo ông thì mỗi tế bào của cơ thể sinh vật nào
cũng ñều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và ñầy ñủ của sinh
vật ñó. Vì vậy, khi gặp ñiều kiện thích hợp mỗi tế bào ñều có thể phát triển
thành cá thể hoàn chỉnh. ðiều này ñã thu hút nhiều nhà khoa học trên thế giới
quan tâm chú ý ñến hướng nghiên cứu này và họ ñã thu ñược nhiêù thành tựu
to lớn. [17]
Nuôi cấy bao phấn là kỹ thuật nuôi cấy invitro bao phấn chứa các bào
tử hoặc các hạt phấn chưa chín trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo nhằm tạo
cây ñơn bội. Số lượng nhiễm sắc thể (NST) của cây ñơn bội ñược lưỡng bội
hoá lên bằng thủ thuật thích hợp tạo cây lưỡng bội ñồng hợp tử hoàn toàn gọi
là cây nhị bội hoá [17]. Nuôi cấy bao phấn thành công ñầu tiên vào năm 1950
do Morel người Pháp thực hiện thành công trên cây Khoả tử (cây một lá
mầm), trên môi trường có bổ sung nước dừa tạo thành mô sẹo. ðến năm 1964
hai nhà khoa học người Ấn ðộ là Guha và Maheshawari nuôi cấy thành công
cây cà ñộc dược (Datura innoxia) [9], hình thành phôi và từ phôi này cho cây
hoàn chỉnh. Thành công này ñã khởi ñầu cho nhiều nghiên cứu về nuôi cấy
hạt phấn của các lòai thực vật hạt kín khác.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


4

Năm 1967 với công trình của Bouirgin và Nistch, ñã nuôi cấy thành
công bao phấn cây thuốc lá (Nicotiana) tạo thành cây ñơn bội.
ðặc biệt, năm 1968 Niizeki và Oono thu ñược cây ñơn bội từ bao phấn
lúa (Oryza sativa), ñã tạo ra khả năng ứng dụng lớn cho công nghệ chọn tạo
giống lúa.
Nuôi cấy bao phấn là phương pháp hữu hiệu tạo dòng ñồng hợp tử
tuyệt ñối, hoàn toàn không phân ly trong các thế hệ sau. Bên cạnh ñó, thông
qua kỹ thuật nuôi cấy bao phấn có thể cố ñịnh ñược ưu thế lai và các gen hữu
tính từ con lai F1, có ưu thế lai cao, làm tăng năng suất lúa
(M.S.Swaminathan, 1995; Chen et al, 1978; Narayanan et al,1996; Siddiq et
al, 1994; Zhu De Yao, 1998) [36]. Mặt khác, trong quá trình nuôi cấy có thể
phát sinh tạo các ñột biến, các ñột biến này cung cấp nguồn nguyên liệu cho
chọn lọc. ðây là lối thoát kỳ diệu ñối với lĩnh vực ứng dụng cây ñơn bội vào
công tác chọn giống cây trồng.
Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật thực
chất là kết quả của quá trình phân hoá và phản phân hoá của tế bào. Vì vậy kỹ
thuật nuôi cấy bao phấn cũng chính là kỹ thuật ñiều khiển sự phát sinh hình
thái của tế bào thực vật một cách có ñịnh hướng dựa vào quá trình phân hoá
và phản phân hoá của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật
Trong quá trình nuôi cấy có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng tới sự phân hoá tế bào
và mô thực vật, trong ñó nhân tố chủ yếu là chất ñiều hoà sinh trưởng thuộc 2
nhóm là auxin và cytokinin.
Qúa trình nuôi cấy bao phấn trải qua 2 giai ñoạn là giai ñoạn mô sẹo và
giai ñoạn tái sinh cây.
Ở giai ñoạn 1: Các tế bào xảy ra quá trình phản phân hóa, các tiểu bào
tử phân chia hình thành mô sẹo, ở giai ñoạn 2: Các mô sẹo phân chia liên tục
và có khả năng phân hóa thành phôi, chồi và cây hoàn chỉnh (thân, lá và rễ).
Mỗi giai ñoạn có những ñặc ñiểm khác nhau và yêu cầu về ñiều kiện nuôi cấy
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

5

khác nhau. Kết quả của quá trình nuôi cấy ta nhận ñược cây ñơn bội hoặc cây
tự lưỡng bội hóa. Tỷ lệ cây ñơn bội nhận ñược phụ thuộc vào các yếu tố như:
giai ñoạn phát triển của hạt phấn và thời gian duy trì ở giai ñoạn mô sẹo (tuổi
mô sẹo). Kết quả nghiên cứu cho thấy các hạt phấn ở giai ñoạn mitos ñầu cho
tỷ lệ cây ñơn bội cao nhất. ðối với tuổi của mô sẹo thì mô sẹo càng sớm cấy
chuyển sang môi trường tái sinh cây và thời gian tái sinh cây ngắn thì tỷ lệ
cây ñơn bội càng cao.
ðể tạo những cây nhị bội từ mô hoặc cây ñơn bội, có 2 phương pháp
thường dùng là xử lý mô hoặc cây ñơn bội với colchicine. Các thể nhị bội thu
ñược ñều ở dạng ñồng hợp tử.
Nuôi cấy bao phấn hoặc hạt phấn ñược sử dụng ñể tạo dòng thuần,
nghiên cứu thể hiện các gen lặn vì các gen lặn không thể hiện ở cơ thể dị hợp,
ở các cơ thể ñồng hợp tử mang gen lặn thì các gen lặn ñược biểu hiện. Ngoài
ra những cây ñơn bội nhận ñược từ NCBP và hạt phấn là những nguyên liệu
tốt cho chọn dòng tế bào.
Phương pháp nuôi cấy bao phấn ñã góp phần rút ngắn ñược nhiều thời
gian chọn tạo ra một giống mới, làm tăng hiệu quả chọn lọc bởi khả năng biểu
hiện sớm của các gen lặn [33]. Giúp khắc phục tính bất dục ở mức ñộ cao của
các dòng lai xa F1. Chính vì vậy phương pháp này ñang ñược áp dụng rộng
rãi trong chọn tạo giống lúa trên thế giới và ở Việt Nam.
Tuy nhiên, hiện nay NCBP vẫn còn tồn tại những hạn chế, số lượng cây
xanh ñạt ñược thông qua NCBP vẫn chưa ñáp ứng ñược nhu cầu cải thiện di
truyền. Một số yếu tố ảnh hưởng ñến NCBP ñã ñược nghiên cứu như kiểu gen
của mẫu cấy, tốc ñộ tăng trưởng, ñiều kiện của cây cho bao phấn, phương
pháp nuôi cấy (Woo & Chen, 1982) [41]. Mặc dù, các phương thức khác nhau
ñã ñược ñề xuất ñể cải tiến hiệu quả của NCBP nhưng cây xanh tái sinh tần số
vẫn còn rất thấp ñặc biệt là các giống lúa thơm và giống lúa cao sản.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


6

Sơ ñồ ứng dựng kỹ thuật nuôi cấy bao phấn

Chọn dòng
thuần tốt

Dòng thuần

Cây lưỡng bội
2n
Mô sẹo ñơn bội 1n Cây ñơn bội 1n
Tự lưỡng bội Xử lý Colchicine
Khử trùng
Nuôi cấy
Giống mới
Bao phấn hoặc hạt
phấn ở giai ñoạn
1 nhân
Xử lý lạnh
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


7

2.2. Tình hình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy bao phấn lúa

2.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trong công tác chọn giống, dòng ñồng hợp t ử ñóng vai trò quan trọng.
ðể tạo ñược dòng dồng hợp tử, các nhà chọn giống phải mất 8 – 10 thế hệ
mới tạo ra dòng ñồng hợp tử thông qua phương pháp tự thụ. ðể rút ngắn chu
kỳ chọn tạo người ta ñã sử dụng phương pháp nuôi cấy bao phấn, hạt phấn ñể
nhanh chóng tạo ra dòng thuần và nhân nhanh các dòng phục vụ công tác
chọn tạo giống. Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn invitro kích thích tiểu bào tử phát
triển thành cây ñơn bội trong môi trường nuôi cấy bao phấn, hạt phấn sau ñó
lưỡng bội hóa bằng Colchicine sẽ tạo ra cây lưỡng bội ñồng hợp tử tất cả các
kiểu gen. ðây là công cụ hữu ích, cần thiết cho phát triển một giống mới, ñưa
nhanh vật liệu di truyền ra thực tiễn. Các tác giả người Pháp E.Toulé và
Y.Demarly (1998) cho rằng: bình quân con người tiết kiệm ñược 5 năm khi sử
dụng kỹ thuật ñơn bội vào việc tạo giống mới.
Cây lúa mỳ ñơn bội ñược phát hiện thấy ñầu tiên là con lai khác loài
Triticum conpactum và Aegilops Cylindrica (Aase, 1926) [17]. Kể từ ñó, hiện
tượng ñơn bội ñã ñược ghi nhận ở nhiều loài khác thuộc nhóm lúa mỳ:
T.monococcum (Kihara và Kytajma, 1993), T.urgidum (Nakajima, 1935),
T.Vulgare (Yamasaki, 1934) [17].
Năm 1964 Guha - Maheswari ñã tiến hành nuôi cấy bao phấn ở cà ñộc
dược (Datura inoxia) và công trình này ñã thu ñược những kết quả ñầu tiên.
Thành công này ñã khởi ñầu cho nhiều nghiên cứu về nuôi cấy bao phấn, hạt
phấn các loài thực vật. Tiếp sau ñó Nisch, 1967 tạo thành công cây thuốc lá
ñơn bội từ NCBP thuốc lá (Nicotiana) [1].
Kỹ thuật NCBP lúa (Ozyza sativa) ñược Niizeki và Oono thực hiện
thành công ñầu tiên vào năm 1968. ðến nay kỹ thuật này ñược ứng dụng rộng
rãi ở nhiều nước: Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc…Các nhà khoa học IRRI,
Triều Tiên, Ấn ðộ ñều kết luận các giống lúa thuộc loài phụ Japonica tạo cây
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

8

ñơn bội tốt hơn loài phụ Indica.
Việc nghiên cứu về kỹ thuật ñược phát triển mạnh mẽ, ñến nay người ta
ñã thu ñược nhiều tiến bộ mới. ðó là tìm ra ñược một số môi trường và ñiều
kiện nuôi cấy thích hợp cho các loài phụ và giống khác nhau. Từ ñó rút ra
ñược quy trình NCBP hoàn chỉnh làm tăng tần suất tái sinh cây xanh lên rất
nhiều. Bên cạnh ñó nhiều nghiên cứu cơ bản về cơ chế di truyền, sự phát triển
và phân hóa của hạt phấn nuôi cấy, sự phân hóa thành cây con và các nhân tố
ảnh hưởng ñến hiệu quả nuôi cấy cũng ñạt nhiều thành tựu (Nguyễn Quang
Thạch, 1997) [14].
Ngày nay, kỹ thuật ñơn bội ñược ứng dụng rất rộng rãi ở hầu hết các
nước có công nghệ chọn tạo giống trên thế giới.
Ở Trung Quốc ñã có hàng chục ha lúa trồng các giống tạo ra bằng
phương pháp NCBP (Niizeki, 1999; ðỗ Năng Vịnh, 2002) [37] [20]. Riêng
ñối với lúa ñã có trên 100 giống thuần ñược tạo ra ở Trung Quốc thông qua
NCBP ñó là: Huayu - 1, Huayu - 2, Tanfong 1, Xin Xiu, Zhong Hua 8, Zhong
Hua 9, và các giống này ñồng thời cũng ñược chuyển gen Pi - zt chống ñạo ôn.
Giống Huayu - 1 có năng suất cao, chống bệnh bạc lá và có khả năng thích
ứng rộng. Giống Xin Xiu ñược trồng trên 10000ha ở phía ñông Trung Quốc
(trích theo Phan Hữu Tôn, 2005) [17].
Tại Triều Tiên, bằng kỹ thuật NCBP ñã tạo ra 42 giống lúa mới
(Zapata & cs, 1986) [35]. Lee & cs 1989 ñã tạo ra giống lúa thuộc loài phụ
Japonica là Hwacheongbyco thông qua NCBP cây F
1
của tổ hợp lai giữa
Suweon 298 với Milyang 64. Giống này chống ñược rầy nâu, ñạo ôn, bạc lá
lúa và trồng ở vùng ñồng bằng và vùng biển Tây Nam Triều Tiên (Phan
Hữu Tôn, 2005) [17].
Tại Mĩ với chiến lược chọn tạo giống lúa hạt dài cho miền Nam bằng

NCBP lúa, hàng năm họ ñã tạo ra ñược trên 8000 dòng thuần ñơn bội kép từ
NCBP các cây F
1
(Chu & cs, 1985) [29].
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


9

Ở Nhật những giống cây trồng mới cũng ñược tạo ra từ quá trình nuôi
cấy bao phấn (Li & cs, 1984) [34].
2.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Ở nước ta, việc nghiên cứu NCBP ñã ñược tiến hành từ những năm
1976 nhưng việc ứng dụng vào thực tế chọn giống còn rất hạn chế do chưa
ñược quan tâm, ñầu tư.
Hiện nay, kỹ thuật NCBP lúa ñã, ñang ñược nghiên cứu ở nhiều cơ
quan nghiên cứu và bước ñầu ñã thu ñược những kết quả ñáng khích lệ.
NCBP ngày càng ñược sử dụng rộng rãi trong chọn tạo giống do chọn tạo
nhanh các dòng ñơn bội thuần, rút ngắn thời gian tạo ra một giống mới so với
phương pháp truyền thống.
Theo công bố của Viện Công nghệ Sinh học, ñã tạo ra ñược 23 dòng
ñồng hợp tử từ các giống lúa lai, trong ñó có 2 dòng A12 và A17 có nhiều ñặc
tính tốt. Hai dòng này ñã ñược ñưa vào trồng với diện tích lớn tại Hải Phòng
và Thái Bình vụ xuân năm 1990-1991 [6].
Viện Di truyền Nông nghiệp kết hợp NCBP với chọn dòng biến dị ñã tạo
ra 50 dòng bất dục ñực nhân mẫn cảm với nhiệt ñộ (TGMS) mới, và tạo ra 12
dòng thuần có ưu thế lai tương ñương con lai F
1
là DT 26, DT 29, J1, AC 24 (ðỗ
Năng Vịnh, 2002) [120]. Thử nghiệm môi trường NCBP của 14 giống lúa,

Nguyễn Thị Thanh Huyền và cộng tác viên năm 2002 ñã xác ñịnh nguồn cacbon
thích hợp cho môi trường tạo mô sẹo từ túi phấn lúa là ñường lactoza và
saccharose, trong ñó ñường saccharose không những làm tăng tỷ lệ tạo mô sẹo
mà còn cải thiện rất rõ tỷ lệ tái sinh cây xanh. Nuôi cấy bao phấn lúa F
3
tổ hợp
lai P4/CS 94 (Nguyễn Tấn Hinh & cs, 1999) cũng ñã tạo thành công giống AC2
và ñang ñưa khảo nghiệm tại Viện cây lương thực và cây thực phẩm [7].
Nuôi cấy bao phấn các giống lúa thuần còn nhằm cải thiện một số ñặc
tính nông học hay phẩm chất cũng là phương pháp ñang ñược áp dụng tại
Viện cây lương thực và thực phẩm. Nguyễn Tấn Hinh & cs (1997) ñã tạo
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


10

ñược giống AC1 từ nuôi cấy bao phấn cải thiện ñược ñặc tính dễ rụng hạt của
giống lúa gốc là C70. Các giống lúa ñặc sản vùng ðồng bằng Sông Hồng có
phẩm chất cao và các giống lúa có hàm lượng protein cao cũng ñã ñược nuôi
cấy bao phấn và tạo ñược các dòng triển vọng như: TXD 12-1, 1XD12-2,
NX1 và một số dòng giàu protein như P3 -3, P3 -5, P5- 11…có ñặc tính ưu
việt hơn giống lúa gốc. Cũng bằng phương pháp nuôi cấy bao phấn con lai F5,
các nhà khoa học Viện Cây lương thực ñã tạo ra giống AC5, ñây là giống lúa
thơm chất lượng cao và khả năng chịu ngập rất tốt.
Bộ môn Công nghệ sinh học cây trồng, Viện cây lương thực, thực phẩm
Gia Lộc - Hải Dương ñã nghiên cứu và thu ñược nhiều dòng tốt từ phương pháp
này khi kết hợp lai và nuôi cấy bao phấn kết hợp gây ñột biến và cấy bao phấn,
ñồng thời bộ môn cũng ñã có chương trình chọn tạo giống lúa mới có năng suất
cao, chống chịu tốt, thời gian sinh trưởng ngắn, có chất lượng thương phẩm, dinh
dưỡng cao (Nguyễn Mạnh ðôn, Huỳnh Yên Nghĩa, 2000) [5].

Kết hợp với chỉ thị phân tử với nuôi cấy mô bao phấn, các nhà khoa
học ñã quy tụ ñược nhiều gen quý vào một giống. Nguyễn Hoàng và cs ñã
quy tụ ñược 4 gen kháng bệnh bạc lá lúa là Xa4, Xa5, Xa13 và Xa 21 vào
dòng IRBB60-2 và nhiều dòng mang 2-3 gen kháng bạc lá lúa. Hitalmania và
cs ñã quy tụ ñược 3 gen kháng ñạo ôn chính là Pi1, Pi2-5 và Pita vào giống
kháng ñạo ôn bèn vững ở lúa tạo dòng mẹ TGMS ổn ñịnh và chống chịu cao
với ñiều kiện hiện nay [11].
Võ Minh Tuyển (2002) ñã sử dụng hai loại môi trường MS và N6 ñể nuôi
cấy bao phấn lúa của bao tổ hợp lai TH1 (TGMS-VN7/AC2), TH2 (TGMS-
VN7/BOB), TH3 (TGMS-VN7/253) tạo dòng TGMS mới có ñộ thuần cao và
xác ñịnh ñược ngưỡng nhiệt ñộ chuyển hóa của các dòng TGMS mới [18].
Lê Hùng Lĩnh và Hồ Hữu Nhị ñã chọn lọc ñược 3 dòng TGMS mới
là Bio MS2, Bio MS7, Bio MS10 là những dòng có ñộ bất dục cao (98,8%
ñến 100%) và có nhiều ñặc tính nông sinh học tốt khi nuôi cấy tổ hợp lai
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


11

F1 và một dòng vật liệu chứa gen TGMS bằng phương pháp nuôi cấy bao
phấn lúa [10].
Viện Sinh học Nông nghiệp, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã
nuôi cấy bao phấn một số dòng TGMS: Peiai 64S. ðây là dòng TGMS có
nguồn gốc từ Trung Quốc, có gen tương hợp rộng cho phép lai xa giữa các
loài phụ ñể tạo ưu thế lai cao. Do ñó, các dòng tái sinh cây từ nuôi cấy bao
phấn dòng Peiai 64S là nguồn vật liệu có giá trị trong việc chọn tạo các dòng
TGMS mới (Nguyễn Thị Lý Anh và cs, 2004) [2].
2.3. Các yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình nuôi cấy bao phấn lúa
Thành công của nuôi cấy bao phấn chịu ảnh hưởng của rất nhiều yếu tố.
Một số yếu tố ảnh hưởng ñến NCBP ñã ñược nghiên cứu như: Kiểu gen của

mẫu cấy, tốc ñộ tăng trưởng, ñiều kiện của cây cho bao phấn, phương pháp
nuôi cấy, các chất ñiều hòa sinh trưởng ñược ñưa vào môi trường nuôi
cấy…(Chi- Chang- Cheng & Hsin- Sheng – Tsay, 1991; Niizeki, 1999; Phan
Hữu Tôn, 2005) [28] [37] [17].
2.3.1. Kiểu gen của cây cho bao phấn
Kiểu gen của cây cho bao phấn có ảnh hưởng rất lớn ñến kết quả nuôi
cấy, không chỉ trong phạm vi các chi, các loài, các loài phụ mà còn khác nhau
giữa các giống trong một loài phụ (Nitsh, 1969; Guha - Mukher Jee, 1973; Iri
- kura, 1975; Tomes & Collins, 1976; Phan Hữu Tôn, 2004) [39] [29] [16].
Với cây lúa các kiểu gen khác nhau có phản ứng rất khác nhau với ñiều kiện
nuôi cấy và sẽ cho kết quả nuôi cấy khác nhau (Guha - Mukher Jee, 1973; Lin
& cs, 1974; Oono, 1975; Chen & Linh, 1976; Nguyễn Mạnh ðôn, 1991,
1995). Theo Chen (1991), tần số mô sẹo và cây con từ NCBP là những tính
trạng di truyền số lượng [29] [5].
NCBP của lúa chịu ảnh hưởng của kiểu gen (theo Niizeki và Oono, 1986; Li,
1991) và có xu hướng chung ñược báo cáo như sau: Japonica/Waxy >
Japonica/Japonica > Indica/Japonica > Indica/Indica. Trước ñó báo cáo của
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


12

Quimio và Zapata (1990) cho rằng: Kiểu gen ảnh hưởng tới sự kích thích
callus, tái sinh cây xanh và hiệu quả nuôi cấy. Gần ñây những nghiên cứu của
Chen (1991) cũng thông báo rằng tần số của bao phấn tạo callus, tỷ lệ cây
xanh/cây bạch tạng và số nhiễm sắc thể của cây tái sinh tất cả ñều liên quan
ñến kiểu gen của cây trồng cung cấp bao phấn.
Nguyên nhân gây ra phản ứng khác nhau của kiểu gen khi NCBP còn
chưa ñược thống nhất. Năm 1983, Zhou và cộng sự ñã nhận thấy có sự khác
nhau về hàm lượng alanine ở hạt phấn của các giống thuộc loài phụ Indica và

Japonica, khi bổ sung thêm alanine vào môi trường thì khả năng tạo mô sẹo
tăng cao (trích theo Chen, 1991) [29]. Theo Heberle Bors (1985), Balachan -
dran & cs (1996) thì sự phản ứng của các giống lúa khác nhau có liên quan
ñến yếu tố tế bào chất (trích theo Võ Thị Minh Tuyển, 2002) [18], nhưng
Quimio và Zapata lại cho rằng: “Sự hình thành mô sẹo và tái sinh cây ñược
ñiều khiển bởi gen lặn mà không liên quan tới yếu tố tế bào chất” (trích theo
Nguyễn Thị Thanh Huyền, 2008) [8] [41].
Kiểu gen ñóng vai trò quyết ñịnh sự thành công hay thất bại trong nuôi
cấy bao phấn. Tạo cây ñơn bội hạn chế ở một số loài, ngoài trong cùng một
loài khả năng tạo cây ñơn bội là khác nhau. NCBP lúa các giống thuộc loài
phụ Japonica ñạt tỷ lệ thành công cao hơn nuôi cấy các giống thuộc loài phụ
Indica (trích theo Phan Hữu Tôn, 2005)[17]. Theo Yamaghishi và cộng sự
cũng nhận thấy các giống lúa thuộc loài phụ Indica và các dòng lúa lai giữa
Japonica/Indica nói chung cho khả năng NCBP thấp hơn các giống thuộc loài
phụ Japonica. Ông cũng phát hiện ra một vùng nhiễm sắc thể số 1 kiểm soát
sự hình thành mô sẹo và vùng nhiễm sắc thể số 10 kiểm soát tỷ lệ tái sinh cây
xanh và cây bạch tạng [17].
Như vậy kiểu gen của cây cho bao phấn là yếu tố quyết ñịnh hình thành
mô sẹo và tái sinh cây xanh từ NCBP lúa.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


13

2.3.2. Giai ñoạn phát triển của hạt phấn
Bản chất của NCBP là kích thích tiểu bào tử phát triển thành cây ñơn
bội trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong ñiều kiện vô trùng. Vì vậy
giai ñoạn phát triển của hạt phấn tại thời ñiểm tách rời và nuôi cấy có ảnh
hưởng rất quan trọng ñến kết quả nuôi cấy (Phan Hữu Tôn, 2005) [17].
Kết quả nghiên cứu cho thấy các hạt phấn ở giai ñoạn mitos ñầu cho tỷ

lệ cây ñơn bội cao nhất. Theo Niizeki (1999), trong giai ñoạn hạt phấn một
nhân ñược chia ra làm 3 giai ñoạn nhỏ sau:
Giai ñoạn một nhân sớm: Các tiểu bào tử này có nhân to, nằm ở giữa
tế bào, nguyên sinh chất ñậm ñặc, không bào chưa phát triển, chưa có lỗ màng.
Giai ñoạn một nhân giữa: gồm những hạt phấn ñã hình thành lỗ màng,
có 2 lớp màng không bào hình thành, ñẩy nhân về một phía của tế bào chất,
hạt phấn gấp nếp.
Giai ñoạn một nhân cuối: các hạt phấn chuẩn bị phân chia lần một, có
hai lớp màng ñiển hình, hạt phấn căng tròn.
Rất nhiều loài cây trồng, tỷ lệ cây con cao nhất thường thu ñược khi
NCBP ở giai ñoạn trước và sau phân chia bào tử lần ñầu, bao phấn càng già tỷ
lệ thành cây càng thấp và tỷ lệ bạch tạng càng cao. Một số yếu tố hỗ trợ có thể
gây nên sự thay ñổi về giai ñoạn phản ứng tối ưu như hàm lượng ñường, ñiều
kiện xử lý lạnh trước khi nuôi cấy. ðối với lúa giai ñoạn phản ứng tối ưu là
trước và giữa giai ñoạn hạt phấn một nhân trong ñiều kiện nồng ñộ ñường
trong môi trường nuôi cấy từ 6 - 9% [17].
ðể xác ñịnh giai ñoạn phát triển của hạt phấn hiện có nhiều phương
pháp khác nhau như: Nhuộm màu rồi soi kính hiển vi, nhưng phương pháp
ñơn giản nhất là: (1) Dựa vào khoảng cách giữa lá ñòng và tai lá ñòng. (2) Dựa
vào màu sắc và kích thước hoa lúa, nhiều tác giả khuyên nên kết hợp 2 phương
pháp sẽ chính xác hơn (Phan Hữu Tôn, 2005)[16]. Nguyễn Văn Uyển & cs (1984)
cho rằng giai ñoạn phát triển của hạt phấn lúa thích hợp nhất cho nuôi cấy tương
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


14

ứng với lúc khoảng cách giữa tai lá cạnh lá ñòng và lá ñòng là 3 - 5 cm, vỏ hạt
lúa có màu xanh nhạt và chiều dài bao phấn nằm trong khoảng 1/3 -1/2 chiều
dài vỏ trấu [21].

2.3.3. ðiều kiện sinh lý của cây cho bao phấn
Hiệu suất tạo cây ñơn bội từ NCBP phụ thuộc vào tình trạng sinh lý của
cây cho bao phấn. Hiệu suất này còn phụ thuộc vào mùa vụ khi cây ñược
trồng trong ñiều kiện tự nhiên [26]. Theo Chen và Lin (1976), Chen và Tsay
(1984) cho rằng bao phấn nào ñược lấy từ những bông trỗ sớm thì cho kết quả
nuôi cấy tốt hơn bao phấn ở bông trỗ muộn. Tỷ lệ tạo callus ở bao phấn lấy từ
nhánh cấp 3 thấp hơn bao phấn lấy ở nhánh mẹ, nhánh cấp 1, nhánh cấp 2. Lý
do bao phấn từ nhánh cấp 3 cho hiệu quả nuôi cấy kém hơn có thể là vì những
nhánh này thiếu dinh dưỡng, tuy nhiên không có sự sai khác rõ rệt giữa những
hoa ở các vị trí khác nhau trên bông (trích theo Phan Hữu Tôn, 2005) [17].
Theo Nguyễn Văn Uyển (1984), quang chu kỳ, cường ñộ ánh sáng và
nhiệt ñộ mà cây cho bao phấn sinh trưởng và phát triển cũng ảnh hưởng ñến
kết quả nuôi cấy [21] [29]. Có sự khác nhau giữa các cây trồng ở các tháng
khác nhau trong năm, theo Yeh và Tsay (1987) thì tỷ lệ % tạo callus của các
bao phấn lấy từ cây trỗ từ tháng 2 - tháng 4 biến ñộng từ 27% - 42%. Nếu bao
phấn lấy vào tháng 2 lúc nhiệt ñộ xuống 15
0
C sẽ không có khả năng tạo callus.
Biên ñộ ngày/ñêm khi cây trồng cho hạt phấn thấp 15
0
C/20
0
C có ảnh hưởng
nghiêm trọng hơn là nhiệt ñộ cao 30
0
C - 35
0
C, ñặc biệt ở giai ñoạn sinh
trưởng sinh thực, phân bào giảm nhiễm. Vì nhiệt ñộ thấp ñã ức chế việc hình
thành bào tử gây nên sự phân chia bất bình thường của lớp tế bào thành bao

phấn (tapetum) (Phan Hữu Tôn, 2005) [17].
Theo Hu & cs (1978) cho rằng: Nhiệt ñộ tới hạn ñối với cây cho bao
phấn là 18
0
C, nếu cây sống trong ñiều kiện nhà lưới có nhiệt ñộ cao hơn thì sự
hình thành mô sẹo vá tái sinh cây giảm, tỷ lệ bạch tạng tăng lên (trích theo
Nguyễn Thị Thanh Huyền, 2002) [8] [19]. Nhiều tác giả cho rằng ñiều kiện
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………


15

ngày dài có khả năng tạo cây từ bao phấn kém hơn so với cây ngày ngắn
(trích theo Nguyễn Văn Uyển, 1984) [21].
Như vậy, ñiều kiện sinh trưởng và tình trạng sinh lý của cây cho bao phấn
cũng như mối tương tác giữa yếu tố di truyền và môi trường bên ngoài ñều ảnh
hưởng ñến phản ứng của bao phấn trong nuôi cấy in vitro. Nhìn chung, cây trồng
sinh trưởng khỏe, ñiều kiện dinh dưỡng tối ưu, ánh sáng mạnh…thường cho tỷ lệ
tạo mô sẹo và tái sinh cây cao (Phan Hữu Tôn, 2005) [17].
2.3.4. Nhiệt ñộ và thời gian xử lý ñòng
ðể làm tăng hiệu quả tạo callus và tái sinh cây trong NCBP nhiều nhà
nghiên cứu ñã tiến hành xử lý mẫu trước khi nuôi cấy. Bản chất của hiệu quả
kích thích là do tác ñộng của lạnh: kích thích sự phân chia của bào tử ñể tạo
cây ñơn bội và tích lũy hạt phấn ñơn nhân (trích theo Lê Trần Bình) [3]. Theo
Nguyễn Văn Uyển (1984), xử lý nhiệt ñộ thấp trước khi nuôi cấy làm tăng tỷ
lệ tạo cây từ NCBP của hầu hết các loài trong ñó có cây lúa [21].
Tác dụng của xử lý lạnh trước khi nuôi cấy làm tăng hiệu quả của quá
trình NCBP. Tuy nhiên về cơ chế tác ñộng của xử lý lạnh vẫn còn chưa ñược
thống nhất. Theo Ledox (1974) và Zhao (1983), nhiệt ñộ thấp làm giảm hô
hấp và tiêu hao vật chất, do ñó kéo dài thời gian sống của bao phấn tạo ñiều

kiện ñể hạt phấn phát triển theo hướng sinh dưỡng (trích theo Niizeki, 1999)
[37]. Theo Nitch (1974), thì nhiệt ñộ thấp ñã ñịnh hướng lại sợi tơ vô sắc
trong phân bào, kết quả tạo ra 2 tế bào (hai bào tử) có nhân cân bằng. Những
bào tử này có khả năng phát triển thành phôi cao hơn những tế bào có nhân
phát sinh và phát triển. Tuy nhiên Sunderland (1980), lại cho rằng xử lý lạnh
ñã làm chậm quá trình già hóa của bào tử. Gần ñây, người ta cho rằng xử lý
lạnh ñã làm ngừng tác ñộng của một số gen hoặc ức chế sản phẩm của gen
(Enzym chịu trách nhiệm phát triển bào tử). Do ñó, những bào tử ñã ñược xử
lý nhiệt ñộ sẽ ít bị phân hóa và dễ dàng phát triển bào tử thể có 2 nhân cân
bằng (trích theo Phan Hữu tôn, 2005) [17].