phân lập gen ORCA3 liên quan đến sự tổng hợp alkaloid từ cây dừa cạn (catharanthus roseus (l ) g don)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu




ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM






TRẦN THỊ THANH HƢƠNG






PHÂN LẬP GEN ORCA3 LIÊN QUAN ĐẾN SỰ
TỔNG HỢP ALKALOID TỪ CÂY DỪA CẠN
(Catharanthus roseus (L.) G. Don)




LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

- 8/ 2014


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu




ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM





TRẦN THỊ THANH HƢƠNG

PHÂN LẬP GEN ORCA3 LIÊN QUAN ĐẾN SỰ
TỔNG HỢP ALKALOID TỪ CÂY DỪA CẠN
(Catharanthus roseus (L.) G. Don)


Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60.42.01.21



LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC













- 8/ 2014
i

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

LỜI CAM ĐOAN

. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ
nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa
từng ai công bố trong một công trình nào khác.

Thái Nguyên, ngày 20 tháng 8 năm 2014
Tác giả


Trần Thị Thanh Hƣơng












ii

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới GS.TS Chu Hoàng Mậu đã tận
tình hƣớng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình
nghiên cứu này.
- KTNN đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá
trình học tập và hoàn thành luận văn.
.
.
-
- .

Tác giả


Trần Thị Thanh Hƣơng




iii

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu




CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ORF: Open read frame
ORCAs: Octadecanoid - responsive Catharanthus AP2/ERF domain
MIA: Monoterpenoid indole alkaloids
DNA: Deoxyribonucleic acid
RNA: Ribonucleic acid
TIA: Terpenoid indole alkaloids
FDA: Food and Drug Administration
JA: Jasmonic acid
MeJA: Methyl ester jasmonic acid
JRE: Jasmonate responsive element
ERF: Ethylene response factor
PCR: Polymerase chain reaction











iv

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan i
Lời cảm ơn ii
Những chữ viết tắt iii
Mục lục iv
Danh mục các bảng trong luận văn vi
Danh mục các hình trong luận văn vii
MỞ ĐẦU 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. CÂY DỪA CẠN 3
1.1.1. Giới thiệu chung 3
4
1.2. NGHIÊN CỨU ALKALOID Ở THỰC VẬT VÀ Ở CÂY DỪA CẠN 5
1.2.1. Alkaloid ở thực vật 5
1.2.1.1. Trạng thái thiên nhiên 5
1.2.1.2. Sự phân bố. 5
6
6
1.2.2. Alkaloid ở cây dừa cạn 8
1.2.2.1. Các vinca alkaloid chính 8
1.2.2.2. Một số gen chức năng liên quan đến quá trình tổng hợp alkaloid ở cây
dừa cạn 11
1.2.2.3. A 12
3 16
1.3.1. ORCA3 16
1.3.1.1. Con đƣờng sinh tổng hợp TIA 17
1.3.1.2. Cơ chế điều khiển của ORCA3 19
v

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu




1.3.1.3. Cấu trúc protein ORCA3 21
3 22
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27
27
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu 27
2.1.2. Hóa chất và thiết bị 27
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27
2.2.1. Phƣơng pháp thu mẫu 27
2.2.2. Các phƣơng pháp sinh học phân tử 27
2.2.2.1. Phƣơng pháp tách chiết mRNA 27
28
2.2.2.3. Phƣơng pháp nhân gen ORCA3 bằng kĩ thuật RT-PCR 28
2.2.2.4. Kĩ thuật tách dòng gen 29
3 31
31
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32
DỪA
ÊN 32
ORCA3 32
3.1.2. Kết quả nhân đoạn gen ORCA3 từ mRNA 33
3.1.3. Kết quả tách dòng đoạn gen ORCA3 34
35
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

vi

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu




DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR nhân gen ORCA3 28
Bảng 2.2. Thành phần ph 29
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng colony – PCR 30
Bảng 3.1. Cặp mồi nhân gen ORCA3 33
Bảng 3.2.
ORCA3 37
Bảng 3.3. Tỷ lệ và số lƣợng từng loại amino acid
1 39
Bảng 3.4. Các vị trí sai khác giữa trình tự amino acid
96899, ABW77571 40

vii

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu




DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Sinh tổng hợp vinca alkaloid 10
Hình 1.2. Con đƣờng sinh tổng hợp TIA ở dừa cạn 19
Hình 1.3. Mô hình biểu hiện gen STR đƣợc cảm ứng bởi JA thông qua yếu tố
phiên mã ORCA3 ở cây dừa cạn 20
Hình 1.4. Tổng quan về các phân tử tín hiệu thực vật 21
3.1.
(TN1) 33
3.2. -
35
Hình 3.3.
.36
Hình 3.4.
Thái Nguyê
38
Hình 3.5. Vùng AP-2 của protein ORCA3 bám DNA 41
viii

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

MỞ ĐẦU

1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, cả thế giới đang phải đối mặt với bệnh ung thƣ, một căn bệnh
đang trở thành hiểm họa cho cuộc sống chúng ta và có xu hƣớng ngày càng gia
tăng. Theo thống kê, thế giới sẽ có 21,4 triệu ngƣời đƣợc phát hiện mới mắc
bệnh ung thƣ và hơn 13,2 triệu ngƣời chết vì căn bệnh này vào năm 2030. Tỷ lệ
này sẽ có nguy cơ tăng dần so với thời gian. Trong khi đó, các loại thuốc chữa trị
ung thƣ chƣa nhiều và giá thành của chúng khá đắt. Xu hƣớng của thế giới hiện
nay là nghiên cứu phƣơng pháp
.
Thực vật bậc cao đƣợc coi là nguồn nguyên liệu quý giá có thể cung cấp
các hợp chất thứ cấp, đặc biệt là các alkaloid. Những chất này đóng vai trò quan
trọng đối với ngành công nghiệp dƣợc phẩm trong việc sản xuất các loại thuốc có
giá trị, trong số đó quan trọng nhất là nhóm dƣợc phẩm điều trị ung thƣ. Trong
những năm gần đây, tình hình nghiên cứu về hợp chất thứ cấp thực vật ngày càng
phát triển. Các hợp chất thứ cấp đƣợc chiết xuất từ thực vật có hoạt tính và rất có
giá trị đối với cuộc sống. Một số hợp chất thuộc các nhóm alkaloid, terpenoid,
phenolic, saponin đƣợc biết đến nhƣ là các hợp chất có khả năng trị bệnh ung thƣ.
Cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don) là một trong các loại thực
vật có khả năng sản xuất các alkaloid - có dƣợc tính quan trọng trong chế tạo
thuốc chữa ung thƣ nhƣ vinblastine và vincristine. Các alkaloid này trong cây
dừa cạn có hàm lƣợng rất nhỏ (khoảng 1 phần vạn trong lá dừa cạn khô đối với
vinblastin còn đối với vincristin thì ít hơn 10 lần nữa) và không thể tổng hợp
bằng con đƣờng hóa học do có cấu trúc phức tạp [1]. Do vậy, tiếp cận con đƣờng
tổng hợp các alkaloid từ góc độ là một hƣớng nghiên cứu đầy

ix

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu




triển vọng, đã và đang đƣợc quan tâm nghiên cứu bởi nhiều nhà khoa học trên
thế giới.
Trong những năm gần đây, nhờ sự phát triển của kỹ thuật di t
đƣờng sinh
-
vụ điều hòa biểu hiện gen và truyền tín hiệu.
Gen ORCA3 (Gen vùng AP2 đáp ứng với dẫn xuất octadecanoid) thuộc
nhóm gen quy định nhân tố phiên mã, đƣợc công bố và phân lập đầu tiên bởi
Van der Fits và Memelink (2000) trên đối tƣợng cây dừa cạn (Catharanthus
roseus L). Các nghiên cứu về gen ORCA3 tập trung vào mối liên
quan giữa gen ORCA3 tới quá trình sinh tổng hợp alkaloid trong cây dừa cạn.
.
chúng tôi lựa chọn đề tài: “Phân lập gen
ORCA3 liên quan đến sự tổng hợp alkaloid từ cây dừa cạn (Catharanthus
roseus (L.) G. Don)”.
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
ORCA3
.
3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
ORCA3
. K và tách dòng cDNA của gen ORCA3.
x

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu




(2) Phân tích trình tự cDNA của gen ORCA3 và so sánh với trình tự gen ORCA3
phân lập đƣợc .
1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu




Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. CÂY DỪA CẠN
1.1.1. Giới thiệu chung
Giống Catharanthus gồm có 8 loài, hầu hết là cây thân thảo lâu năm.
Trong đó, có loài Catharanthus pusillus có nguồn gốc từ Ấn Độ, còn tất cả các
loài còn lại có nguồn gốc từ Madagasca, số lƣợng nhiễm sắc thể cho tất cả các
loài Catharanthus đều là 2n=16. Dừa cạn có tên khoa học là Catharanthus
roseus (L) G. Don, tên gọi khác là bông dừa, hoa hải đằng, trƣờng xuân
hoa…thuộc họ Apocynaceae, bộ Gentianales [1].
Ngoài việc đƣợc biết đến nhƣ một loài cây cảnh, từ lâu dịch chiết alkaloid
từ Catharanthus roseus đã đƣợc sử dụng trong y học dân gian nhƣ một loài thuốc
chống đái tháo đƣờng, lợi tiểu, chữa tiêu chảy, xuất huyết, giúp vết thƣơng mau
lành… và ngày nay ngƣời ta còn tìm đƣợc một công dụng hết sức quan trọng của
loài Catharanthus roseus đó là khả năng trị bệnh ung thƣ rất hiệu quả [1].

Catharanthus roseus là nguồn giàu alkaloid thuộc chủng loại alkaloid
terpenoid indole, gồm 3 giống cây khác nhau: „roseus‟ với hoa màu tím hoặc
màu hồng, „albus‟ với hoa trắng, „ocellatus‟ với hoa màu trắng nhị đỏ [1].
Thân cỏ nhỏ, mọc đứng, phân nhiều cành, cao 40-60 cm. Lá đơn nguyên,
mọc đối chéo chữ thập, hình trứng, đầu hơi nhọn, dài 4-7 cm, rộng 2-3 cm, mặt
trên sẫm, mặt dƣới nhạt, có lông…Cụm hoa: hai hoa ở kẽ lá. Hoa đều, lƣỡng tính,
mẫu 5. Bao phấn hình mũi tên, hƣớng trong, khai dọc, đính đáy, các bao phấn
chụm trên đầu nhụy. Hạt phấn rời, hình chữ nhật, có rãnh dọc. Quả gồm hai đại,
dài 2-4 cm, rộng 2-3 cm, mọc thẳng đứng, hơi ngả sang hai bên [1].
Chi Catharanthus G. Don có nguồn gốc ở Madagascar. Loài dừa cạn đƣợc
di nhập sang nhiều nƣớc nhiệt đới ở Nam Á cũng nhƣ Đông Nam Á. Trong đó
2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu




có Việt Nam và Đảo Hải Nam Trung Quốc. Ở Việt Nam, dừa cạn là cây hoang
dại, có vùng phân bố tự nhiên tƣơng đối đặc trƣng từ tỉnh Quảng Ninh đến Kiên
Giang dọc theo vùng ven biển, tập trung ở các tỉnh thành miền Trung nhƣ Thanh
Hóa, Nghệ An, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng, Bình Định và Phú Yên.
Dừa cạn còn đƣợc trồng khắp nơi trong nƣớc để làm cảnh và làm thuốc [1].

Trong tất cả các bộ phận của cây dừa cạn đều chứa alkaloid, alkaloid toàn
phần có ở lá dừa cạn với hàm lƣợng 0,37-1,15%, thân 0,4%, rễ chính 0,7-2,4%,
rễ phụ 0,9-3,7%, hoa 0,14%, hạt 0,18%. Ngƣời ta đã chiết, phân lập ra trên 70
alkaloid khác nhau [1]. Căn cứ vào cấu tạo hóa học, alkaloid trong cây dừa cạn
đƣợc chia làm ba nhóm chính:
(1) Nhóm alkaloid nhân indol: perivine, peviridine, perosine, catharanthine,

cavicine, ajmalicine
(2) Nhóm alkaloid nhân indolin: vindoline, ajmaline, lochnericine, lochneridine,
lochrovine
(3) Nhóm alkaloid có 2 vòng indol hoặc một vòng indol và một vòng indolin
nhƣ leurosine, leubcosidine và đặc biệt là các alkaloid có tác dụng chữa bệnh
ung thƣ nhƣng có hàm lƣợng rất thấp nhƣ: vinblastine (vincaleucoblastine)
0,005-0,015% trong lá, vincristine (leucocristine) 0,003-0,005% trong lá [9].
Sự phân bố các alkaloid khác nhau ở các bộ phận khác nhau của cây dừa
cạn tùy thuộc vào nhiều yếu tố liên quan đến sinh tổng hợp của cây. Sự hình thành
alkaloid ở lá, thân, rễ tùy thuộc vào bƣớc sóng ánh sáng chiếu vào cây. Quá trình
tạo alkaloid trong rễ không có phản ứng quang hợp nhƣ các bộ phận trên mặt đất
của cây nên các alkaloid trong rễ là indol alkaloid không chứa nhóm methoxy nhƣ
ajmalicin, cathidine, serpentine, perivin, alstonin, tretrahydroalstonin. Các alkaloid
ở lá có chứa nhóm methoxy nhƣ anhydrovinblastine, catharanthine, leusosine,
3

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu




leurosidin, vinblastine, vincristine, vindoline, ở hạt thì có vinsedicin, vincedine,
còn có ở hoa chỉ có vinblastine dạng vết [27].

1.2. NGHIÊN CỨU ALKALOID Ở THỰC VẬT VÀ Ở CÂY DỪA CẠN
1.2.1. Alkaloid ở thực vật
1.2.1.1. Trạng thái thiên nhiên
Alkaloid phân bố ở cả động vật và thực vật, phần lớn alkaloid có trong
thực vật. Ở cây hai lá mầm alkaloid tập trung ở một số họ nhƣ họ cà phê, họ
thuốc phiện, họ mã tiền, họ trúc đào, họ cà…; ở cây một lá mầm phần lớn

alkaloid tập trung ở họ hành tỏi; trong thực vật bậc thấp alkaloid tập trung ở một
số loài nấm [29].
Alkaloid tập trung ở một số bộ phận nhất định của cây nhƣ: ở hạt của cây
mã tiền, cà phê, cola…; ở quả ớt, hồ tiêu, thuốc phiện…; ở hoa cà độc dƣợc; ở lá
chè, thuốc lá…; ở thân và vỏ thân ma hồng, canhkina…; ở rễ: lựu, ba gạc…; ở
củ: bình vôi, ô dầu… Trong cây thƣờng chứa hỗn hợp alkaloid, rất ít khi chỉ có
một alkaloid duy nhất [9].
Hàm lƣợng alkaloid trong cây thƣờng rất thấp cỡ 1-3% trừ một số trƣờng
hợp nhƣ trong cây thuốc phiện hàm lƣợng cỡ 20-30%, trong cây canhkina hàm
lƣợng cỡ 7-10%. Hàm lƣợng alkaloid trong cây phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ
khí hậu, thổ nhƣỡng, ánh sáng, giống cây, bộ phận của cây và thời kỳ thu hái [9].
1.2.1.2
Alkaloid thƣờng chứa trong các bộ phận của cây nhƣ hoa, lá, rễ, hạt, vỏ.
Đôi khi trong cùng một cây thì bộ phận này giàu alkaloid nhƣng bộ phận khác lại
không có. Lƣợng alkaloid và tỷ lệ thành phần các alkaloid trong cây có thể thay
đổi tùy theo mùa thu hái, tuổi của cây, điều kiện khí hậu thổ nhƣỡng… [9].
Trong một cây thƣờng chứa các alkaloid có cấu trúc hóa học gần giống
nhau, đặc biệt trong một số cây có chứa vài chục alkaloid nhƣ cây thuốc phiện,
4

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu




cây canhkina. Các alkaloid trong cây tồn tại dƣới dạng muối với các hợp chất
hữu cơ nhƣ succinic, acid oxalic, acid malic, acid meconic. Tỷ lệ phần trăm các
alkaloid trong các bộ phận của cây có thể rất cao từ 10% đến 15% hoặc rất thấp
vài phần nghìn thậm chí vài phần vạn [9].

Trƣớc đây ngƣời ta cho rằng nhân cơ bản của các alkaloid là do các chất
đƣờng hay thuộc chất của đƣờng kết hợp với amoniac để có nitơ mà sinh ra.
Ngày nay bằng phƣơng pháp dùng các nguyên tử đánh dấu (đồng vị phóng xạ)
ngƣời ta chứng minh đƣợc các alkaloid tạo ra từ các amino acid và đã có nhiều
nghiên cứu tổng hợp alkaloid từ amino acid. Ngoài các alkaloid là dẫn xuất của
các amino acid, một số alkaloid khác lại bắt đầu từ một số tiền chất riêng. Bằng
phƣơng pháp dùng amino acid có nguyên tố đồng đánh dấu ngƣời ta đã chứng
minh rõ ràng về các tiền chất alkaloid [36].
Có thể nói giai đoạn quan trọng đầu tiên trong sự chuyển hóa amino acid
thành alkaloid là sự khử cacboxyl thành một amin và tiếp đến là sự oxy hóa amin
này thành aldehyt bởi enzyme oxydaza amin. Việc ngƣng tụ một nhóm amin bởi
aldehyt dẫn đến tạo các vòng đặc trƣng cho alkaloid [36].
Qua định tính và định lƣợng các alkaloid trong các bộ phận khác nhau của
cây và theo dõi sự phát triển của chúng trong quá trình phát triển của cây ngƣời
ta thấy nơi tạo ra alkaloid không phải là nơi tích tụ alkaloid. Nhiều alkaloid đƣợc
tạo ra ở rễ lại vận chuyển lên phần trên mặt đất của cây, sau khi thực hiện những
biến đổi thứ cấp chúng đƣợc tích lũy ở lá, quả và hạt. Ngoài ra, hàm lƣợng của
alkaloid trong cây cũng phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ khí hậu, ánh sáng, chất
lƣợng đất, giống cây và bộ phận thu hái [24].

Ngay từ những năm 1971, Wani và cộng sự đã tìm ra một diterpen amide
mới có khả năng chống ung thƣ gọi là taxol chiết từ cây thông đỏ Pacific (Taxus
5

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu




brevifolia) [2]. Đến năm 1983, taxol đƣợc Cục Quản lý Dƣợc phẩm và Thực

phẩm Hoa Kỳ (FDA) đồng ý đƣa vào thử nghiệm ở giai đoạn I điều trị cho ung
thƣ buồng trứng [19]. Sau đó FDA đã cho phép sử dụng taxol trong điều trị các
trƣờng hợp ung thƣ buồng trứng và ung thƣ vú. Ngoài ra, taxol còn có tác dụng
đối với các bệnh nhân có khối u ác tính, ung thƣ phổi và các dạng u bƣớu khác
và nó đƣợc xem là chất đầu tiên của một nhóm mới trong hóa trị liệu ung thƣ
[19]. Tuy nhiên, sử dụng taxol trong điều trị bị hạn chế do chỉ tách đƣợc một
lƣợng rất ít từ vỏ của cây thông đỏ tự nhiên. Do đó cần có những nguồn khác để
thay thế mới đáp ứng đƣợc nhu cầu sử dụng ngày càng tăng trong y học. Nuôi
cấy tế bào các loài Taxus đƣợc xem là một trong các phƣơng pháp ƣu thế để
cung cấp ổn định nguồn taxol và dẫn xuất taxal. Fett-Netto và cộng sự (1994) đã
nghiên cứu ảnh hƣởng của các chất dinh dƣỡng và một số yếu tố khác lên sự tích
lũy taxol trong nuôi cấy tế bào T. Cuspidata. Srinivasan và cộng sự (1995) đã
nghiên cứu quá trình sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào của T. Baccata [2].
Yel và cộng sự (1994) đã nghiên cứu sản xuất diosgenin bằng nuôi cấy tế
bào huyền phù của cây Dioscorea doryophola. Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng
nhƣ một cách để thay thế quá trình tổng hợp steroid [2].
Miyasaka và cộng sự (1989) đã nghiên cứu sản xuất cryptotanshinone từ
nuôi cấy callus cây Salvia miltiorhiza. Nồng độ cao nhất của cryptotanshinone
thu đƣợc trong callus nuôi cấy trên môi trƣờng có 0.2 mg/l BA trong 6 ngày là
4.59 mg/g khối lƣợng khô [2].
Shikonin, một loại sắc tố có khả năng diệt khuẩn, có trong rễ cây
Lithospermum erythrrorhizon. Ngƣời ta đã tạo đƣợc dòng tế bào rễ cây
Lithospermum có khả năng tích lũy đến 15% shikonin và đã hoàn chỉnh công
nghệ nuôi cấy tế bào sản xuất shinkonin [2].
Việc sản xuất các hợp chất thứ cấp đã tạo ra một bƣớc tiến xa trong khoa
học thực vật. Việc phát triển và sử dụng các công cụ di truyền cũng nhƣ sự hiểu
6

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

biết ngày càng sâu sắc hơn về bản chất của tế bào và các phƣơng thức điều hòa
quá trình chuyển hóa trao đổi chất thứ cấp là cơ sở cho việc sản xuất chúng ở
quy mô thƣơng mại [19].
Ở Việt Nam, công nghệ tách chiết các hợp chất thứ cấp chủ yếu gắn liền
với công nghệ nuôi cấy tế bào và chúng phát triển vào những năm 1970. Từ đó
đến nay đã đạt đƣợc nhiều thành công, đáng kể nhất là quy trình sản xuất sâm
Ngọc Linh do Học viện Quân y khai thác. Phƣơng pháp sản xuất sinh khối tế bào
rễ nhân sâm Ngọc Linh đƣợc cấp bằng độc quyền sáng chế số 7523 vào ngày
11/2/2009 tại Việt Nam [2].
Việt Nam cũng đang triển khai các dự án nuôi cấy và chiết xuất taxol từ
cây thông đỏ ở Lâm Đồng. Ngoài ra còn có nghiên cứu sản xuất arteminisin dùng
kỹ thuật nuôi cấy tế bào từ cây thanh hao hoa vàng của Viện sinh học Nhiệt đới
trong nghị định thƣ hợp tác với Malaysia (2007-2010) hay Đại học Huế nghiên
cứu khả năng tích lũy glycoalkaloid ở callus cây cà gai leo Solanum hainanense.
Tuy nhiên, những dự án nói trên vẫn ở quy mô phòng thí nghiệm [2].
1.2.2. Alkaloid ở cây dừa cạn
1.2.2.1. Các vinca alkaloid chính
Ở cây dừa cạn vinblastine và vincristine là hai vinca alkaloid chính có giá
trị điều chế thuốc chống ung thƣ. Vinblastine và vincristine là các terpenoid
indole alkaloid (TIA). TIA là một nhóm bao gồm hơn 300 hợp chất có hoạt tính
sinh học mạnh và là tiềm năng ứng dụng trong y học. TIA gồm có hai thành
phần: một nhóm indole lấy từ tryptamine và một nhóm terpenoid có nguồn gốc
secologanin. Đối với thực vật, các TIA đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bảo
vệ cây chống lại sâu hại và các mầm bệnh [3].
Vinbastine
Công thức nguyên: C
46

H
58
O
9
N
4
[27].
7

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu





Đặc điểm là tinh thể hình kim (kết tinh từ methanol), điểm chảy 211-216
o
.
Không tan trong nƣớc, ether dầu hỏa, tan trong alcol, aceton, ethyl acetat,
chloroform [27].
Vincristine
Công thức nguyên: C
46
H
56
N
4
O
10
[27].

Đặc điểm: là tinh thể hình phiến, điểm chảy: 218-220
0
[27].
Vinblastine và vincristine đƣợc tạo thành từ sự ghép nối của hai
monomer alkaloid: catharanthine (indole) và vindoline (dihydroindole), cả hai
đều xuất hiện tự do trong cây. Vincristine cũng có cấu trúc tƣơng tự nhƣ
vinblastine nhƣng thay nhóm formyl bằng một nhóm methyl trên phân tử
nitrogen indole của vindoline. Những alkaloid này đƣợc hình thành bởi sự kết
hợp của hai nửa: một nửa là indole và một nửa là dihydroindole. Vì thế, chúng
đƣợc biết đến với tên gọi là “dimer alkaloid” hoặc “bisindole alkaloid”. Sự khác
nhau của Catharanthus alkaloid phụ thuộc vào loại alkaloid terpenoid indole.
Chúng gồm hai nửa bắt nguồn từ hai quá trình chuyển hóa riêng biệt - quá
8

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu




trình mevalonate cho nửa không chứa tryptophan và nửa tryptophan nhận đƣợc
từ quá trình tryptophan. Cấu trúc phức tạp của những alkaloid này luôn có mặt
hai nguyên tử nitơ. Một là indole nitơ (nửa bắt nguồn từ tryptophan) và nguyên
tử nitơ thứ hai đƣợc tạo thành từ sự tách rời của hai carbon tại vị trí β của vòng
indole. Nửa không có tryptophan bắt nguồn từ acid mevalonic và nó là một C10
- geraniol (monoterpenoid). Geraniol đƣợc tạo thành thông qua một chuỗi
chuyển hóa sẽ chuyển thành dạng loganin và sau đó là secologanin (một
monoterpenoid glucoside) [15].
Chìa khóa trung gian trong thuyết phát sinh sinh học của những
alkaloid monoterpene indole là 3α (S)-strictosidine tạo thành từ sự ngƣng hoạt

tính enzyme của trytamine và secologanin. Enzyme chịu trách nhiệm cho phản
ứng quan trọng này là strictosidine synthase. Strictosidine sau đó sẽ hình thành
cấu trúc cathenamine (alkaloid loại coryanthe). Enzyme liên quan ở đây là
cathenamine synthase. Cathenamine sau đó phải trải qua một chuỗi các phản ứng
để dẫn đến sự hình thành catharanthin (alkaloid loại iboga) và vindoline
(alkaloid loại aspidosperma). Catharanthine và vindoline là các alkaloid
monomeric indole, xuất hiện tự do trong cây. 3‟,4‟-anhydrovinblastine là
chìa khoá trung gian từ sự ghép nối của catharanthine và vindoline, các enzyme
liên quan là những peroxidase. Sau đó nó đƣợc chuyển thành vinblastine [29].
9

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu





Hình 1.1. Sinh tổng hợp vinca alkaloid [11]

Vinblastine đƣợc tạo thành từ sự ghép nối của hai monomer alkaloid:
catharanthine (indole) và vindoline (dihydroindole). Mặc dù nhu cầu sử dụng
vincristine nhiều hơn so với vinblastine nhƣng cây lại sản xuất tỷ lệ vinblastine
nhiều hơn. May mắn thay, giờ đây ta có thể biến đổi vinblastine thành vincristine
bằng phƣơng pháp hóa học hay thông qua phƣơng pháp vi sinh
học “microbiological N-demethylation” sử dụng Streptomyces albogriseolus [27].
1.2.2.2. Một số gen chức năng liên quan đến quá trình tổng hợp alkaloid ở cây
dừa cạn
Đối với con ngƣời, alkaloid là nguồn nguyên liệu tự nhiên hữu ích để sản
xuất các loại thuốc. Cơ chế chính điều khiển sự sinh tổng hợp alkaloid ở tế bào
thực vật là kiểm soát sự phiên mã của các gen tham gia vào quá trình sinh tổng

hợp [29]. Rất nhiều nhân tố phiên mã liên quan đến quá trình sinh tổng hợp
alkaloid đã đƣợc phân lập và nghiên cứu. Một trong số các gen chức năng liên
10

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu




quan đến sinh tổng hợp alkaloid đƣợc biết đến ở cây dừa cạn là DAT, PRX,
TDC…
Gen DAT (deacetylvindoline 4- O-acetyl tranferase)
Gen DAT là gen mã hóa cho enzyme tham gia vào sinh tổng hợp vindoline.
Gen DAT đã đƣợc St-Pierre và cộng sự phân lập và xác định trình tự trên đối
tƣợng cây dừa cạn vào năm 1999 với mã số AF053307, gen DAT dài 1320
nucleotide mã hóa cho protein dài 439 amino acid [4].
Gen DAT mã hóa cho enzyme acetyl CoA: deacetylvindoline 4-O-acetyl
tranferase, nó xúc tác cho bƣớc cuối cùng của quá trình sinh tổng hợp vindoline.
ORF của gen DAT thể hiện sự tƣơng đồng cao về trình tự với 19 loại gen thực vật
khác, những gen này hầu hết vẫn chƣa đƣợc biết rõ về chức năng sinh hóa [4].
Các nghiên cứu đã cho thấy rằng, sự cảm ứng của mRNA DAT, sự tích lũy
protein và hoạt động của enzyme DAT xảy ra trong các mô đang diễn ra sự sinh
tổng hợp vindoline nhƣ lá, lá mầm, hạt… [4].
Sự biểu hiện của mRNA, của protein và hoạt động của enzyme DAT đã
đƣợc xác định ở các bào quan khác nhau trong cây dừa cạn. Enzyme DAT hoạt
động mạnh nhất ở các lá non, giảm 76% ở các lá to và lá già. Thân và hoa chỉ
chứa từ 5 đến 11% lƣợng enzyme này, trong khi ở rễ là không đáng kể [4].
Giữa hoạt động của enzyme và sự tích lũy protein DAT cũng có mối liên hệ
với nhau. Protein DAT rất phong phú ở những lá còn non và rất ít ở thân, hoa và
rễ. Tƣơng tự nhƣ vậy, sự tích lũy của mRNA cao nhất ở lá non, giảm đáng kể ở

lá già. Hoạt động của enzyme DAT cũng bị tác động bởi ánh sáng, khi liều lƣợng
ánh sáng thấp thì enzyme này cũng hoạt động yếu hơn hẳn [4].
Gen PRX (a novel stress-induced peroxidase)
Gen PRX đã đƣợc Kumar và cộng sự phân lập và xác định trình tự trên
đối tƣợng cây dừa cạn vào năm 2007 với mã số AY924306, mRNA của gen
PRX dài 1357 Nu với CDS từ Nu số 41 đến 1033, mã hóa cho protein dài 330
11

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu




amino acid. Gen PRX có chứa 3 intron mã hóa cho một enzyme tiết peroxidase
lớp 3. Bƣớc cuối cùng của con đƣờng sinh tổng hợp TIA là sự tổng hợp của một
alkaloid dimeric (vinblastine), nó đƣợc xúc tác bởi một enzyme peroxydase [23].
mRNA PRX và protein PRX đƣợc tìm thấy trong các bào quan đặc hiệu và
đƣợc điều khiển bởi các điều kiện stress khác nhau. Sử dụng hỗn hợp protein
huỳnh quang β-glucuronidase-green của protein PRX, ngƣời ta đã chứng minh
rằng hỗn hợp protein này đƣợc định vị trong biểu bì lá và thành tế bào bảo vệ
của cây thuốc lá chuyển gen [21]. Vì vậy, gen PRX cũng có liên quan đến sinh
tổng hợp thành tế bào và đƣợc cảm ứng bởi methyl jasmonate. Vùng mã hóa
đƣợc sàng lọc bằng thƣ viện cDNA đặc hiệu cho lá với đoạn dò CrInt1. Trình tự
nucleotide của CrPRX mã hóa cho một protein có chiều dài 330 amino acid với
20 amino acid là peptide tín hiệu, chứng tỏ rằng PRX là chất tiết tự nhiên [20].
1.2.2.3. A
Vinblastin và vincristin là những chất ức chế mạnh sự phân bào. Các
alkaloid này liên kết đặc hiệu với tobulin, là protein vi ống ở thoi phân bào
và ngăn cản sự kết hợp của những cấu trúc hình ống có ở trong nguyên sinh chất
của nhiều tế bào di động, ngăn cản sự tăng lên về số lƣợng trong kỳ giữa gián

phân của tế bào [27].
Năm 1958, Noble và cộng sự đã chiết đƣợc một alkaloid từ lá dừa cạn là
vincaleucoblastine (còn gọi là vinblastin). Sau đó 4 năm, Svoboda và cộng sự
cũng tìm thêm một alkaloid nữa là vincaleucocristin (còn gọi là vincristin). Hàm
lƣợng các alkaloid này trong dừa cạn rất nhỏ (khoảng 1 phần vạn trong lá dừa
cạn khô đối với vinblastin còn đối với vincristin thì ít hơn 10 lần nữa) [27].
Ngƣời ta thƣờng dùng hai alkaloid này làm thuốc chữa ung thƣ dƣới dạng
muối sulfat. Quá trình điều chế hai alkaloid này từ cây dừa cạn qua khá nhiều
công đoạn với giá thành cao nên thuốc khá đắt. Hiện nay ngƣời ta đã tìm cách
12

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu




sinh tổng hợp hoặc bán tổng hợp hai loại alkaloid trên để giảm giá thành của
thuốc [19].
Vinblastine hay còn gọi là vincaleucoblastine, là một chất ức chế cấu trúc
vi ống. Vinblastine đƣợc các nhà khoa học Canada tình cờ phát hiện tính chất ức
chế sự phân chia tế bào bạch cầu trên chuột khi nghiên cứu khả năng điều trị
bệnh tiểu đƣờng trên cây dừa cạn vào năm 1958 [19]. Vinblastine đƣợc đồng ý
đƣa vào điều trị bởi tổ chức Food and Drug Administration (FDA) năm 1961 và
đã trở thành một thành phần chính của phƣơng pháp hóa trị liệu điều trị các tế
bào mầm của tế bào ung thƣ, khối u ác tính và một số loại lymphoma cấp cao,
bao gồm u lymphoma Hodgkin, u lymphoma không Hodgkin, u sùi dạng nấm,
tế bào ung thƣ phổi nhỏ, ung thƣ vú, ung thƣ tinh hoàn tiến triển, bƣớu thịt
Kaposi, bệnh mô bào huyết, ung thƣ nhau, chriocarcinoma (một loại ung thƣ tử
cung)… [19]. Hiện nay, vinblastin đƣợc ứng dụng rộng rãi vào điều trị bệnh ung
thƣ ở ngƣời. Vinblastine hấp thu nhanh chóng theo đƣờng tiêm tĩnh mạch, thuốc

phân bố nhanh vào các mô của cơ thể, liên kết nhiều với protein huyết tƣơng.
Vinblastine ít qua hàng rào máu não và không đạt nồng độ điều trị trong dịch
não tủy. Vinblatine đƣợc chuyển hóa nhiều, chủ yếu ở gan để thành
desacetyl vinblastine - là chất có hoạt tính mạnh hơn vincristine, tính trên cơ sở
khối lƣợng, thuốc thải trừ qua mật vào phân và nƣớc tiểu, một số đào thải dƣới
dạng thuốc không biến đổi. Theo ghi chú trong lịch sử sử dụng vinblastine thì
vinblastine có thể sử dụng một mình hoặc kết hợp với các tác nhân khác để chữa
bƣớu thịt Kaposi và ung thƣ bàng quang, ung thƣ vú và một vài loại u ác tính
não. Hoạt tính điều trị ung thƣ của vinblastine cũng hiệu quả nhƣ hoạt tính của
vincristine, song nó lại là một độc tố thần kinh. Desacetyl vinblastine (vindesine)
đƣợc xem nhƣ là dẫn xuất của vinblastine đƣợc bán tổng hợp bởi Potier và cộng
sự. Vinorelbine (5‟-norhydro vinblastine), có hoạt tính chống ung thƣ rộng hơn
và giảm phản ứng phụ là gây độc thần kinh. Nó là cấu trúc đƣợc sửa đổi trên
13

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu




nhân catharanthine, kết quả là tăng đáng kể lƣợng lipophilicity (chất có khả năng
hòa tan trong chất béo và dung môi không phân cực) hơn so với alkaloid vinca.
Nó có hiệu quả trong sự kết hợp với hóa trị liệu nhƣ anthracycline,
fluorouracil và taxol. Vinorelbine đã đƣợc chấp nhận ở Mỹ trong việc điều trị tế
bào ung thƣ phổi nhỏ, có thể sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp với cisplatin và cũng
đã đƣợc dùng cho bệnh nhân bị ung thƣ vú [19].
Viblastin sulfat là thuốc dùng trong liệu pháp phối hợp, đƣợc lựa chọn hàng
đầu để điều trị ung thƣ biểu mô tinh hoàn và đƣợc lựa chọn thứ hai trong liệu
pháp trị bệnh Hoggkin, ung thƣ nhau, ung thƣ biểu mô da đầu và ung thƣ biểu
mô thận. Lựa chọn hàng thứ ba để điều trị u nguyên bào thần kinh, ung thƣ vú,

ung thƣ cổ tử cung và ung thƣ dạng nấm da. Nó cũng đƣợc dùng chữa những
bệnh sarcom lympho, sarcom chảy máu Kaposi và sarcom tế bào lƣới. Thuốc có
tác dụng độc hại tại chỗ. Cần tránh sự tràn thuốc ra ngoài khi tiêm tĩnh mạch, vì
có thể gây viêm tĩnh mạch ở nơi tiêm. Vinblastin có thể gây độc hại cho thai, nên
chỉ dùng ở thời kì mang thai nếu tình trạng bệnh đe dọa tính mạng hoặc bệnh
nặng hơn mà các thuốc an toàn hơn không có tác dụng [19].
Vincristine hay còn gọi là leurocristine, thƣờng đƣợc dùng để điều trị khối
u ác tính ở trẻ em, nó có khả năng chống lại sự kết hợp rất nhạy cảm của bệnh
khối u ác tính ở trẻ em đối với vincristine và cho tác dụng tốt hơn khi dùng đúng
liều lƣợng dành cho trẻ em. Sau khi tiêm, vincristine nhanh chóng phân bố vào
các mô cơ thể và gắn với các yếu tố máu đã hình thành, đặc biệt là hồng cầu và
tiểu cầu. Vincristine không xâm nhập hệ thần kinh trung ƣơng với mức độ đáng
kể.

Vincristine đƣợc chuyển hóa nhiều ở gan. Con đƣờng thải trừ chính là qua
đƣờng mật đi ra phân. Một phần ba liều dùng có thể đƣợc phục hồi trong phân
trong vòng 24 giờ đầu và hai phần ba trong vòng 72 giờ. Chỉ có 12% liều đƣợc
bài tiết qua thận. Khoảng một nửa liều đƣợc phục hồi trong phân và nƣớc
tiểu dƣới dạng chất chuyển hóa.

Mặt khác, ở cả ngƣời lớn và trẻ em, vincristine