Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 21 123

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
m
HOÀNG THỊ HỔNG CẨM
GÓP PHẦN NGHIÊN cứu SINH TổNG HỢP KHÁNG
SINH T ừ STREPTOMYCES 21.123
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DUỢC sĩ KHOÁ 2001 - 2006)
Người hướng dẫn: PGS.TS Cao Vãn Thu.
Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh - Sinh học.
Trường Đại học Dược Hà Nội
Thời gian thực hiện 2 - 5/2006.
HÀ NỘI, THÁNG 5/2006
KL^jù2^
£ Ờ 3 ^ © c  M ( ỹ ì l
^Đầu tỉỀn tồ ỉ ætn íùiụ. ÌẦ i&nfj, h ỉê í fi*t ehătL t h à n h tìà iíì u ếMC itèn
tk ầ ụ ạ ìá ii ^ aơ ('Oătt ^hiMr n ự itò ỉ thầụ . ỉtã irưtt t ìỉ ịt h ư ổ n ạ đ ẫ n
tồ i t h u ’e hiÌM ũĩt Ịttìàn Ih àn h U iìú á lu ậ n nttụ,.
Ç îê i æ in eh tìn th ù n k etíJtt íờt ^ hS- O tạM ụễ n ^Đình Măiựền. — mÄ*t
^ĩmạ^ n g h iỊệ i ^ưỢ4Lf Q íạ iíự ỉt i OụoMạ^ ^ ạ l — m ô n
'3ỉ)ữu etỉ itá lă n tìn h g jú fi it ĩi i i h e à n th à n h k h o ú iu ả n n à ụ ,
Ç îê i æin ựủ'l í è i etỉm tổ i eắíi ihẵtỊ, eồ qiAtì^ oán Ịĩê kíỊ th u ậ t tĩiên
đ a n ạ ạ iả ttụ doij^^ ià n t OÌẾẨÍ t a i bA m ồ n tt^fhiê^ ^Oứiỉe, hê n tôn 'Jùoá
h ữ u f(íf, ỉm mú4t íT^i* s itih -S in h twe o il ^ h ò * iạ . t h í »tạ hiĩnt tắ m đ ã
ụ ỉÚ Ịi ĩtẽ' t ô i irfttig th ồ i ạ iu n là m thựA ttạh lè m . Q th íìn dịp, HÙự t ồ i >0^1» ạ ử i
iồ'i eấm tĩrt đếtt (B an ạ ỉÁ n t h iỀ ií eitnụ tũ iin ÌhỀ thầ ụ . eA ạJá ti t^ưòHq.
^ ạ i "^€Uỉ lỉf)à Q iệ i đ ã ta ơ đ iề u kiê n th u ậ n l ờ i ehjfi tồ ì ÍF^utq. iẦiết
th ò i q ia n ỉt!Ỡíf táp, t ạ i
ÇJêi æin Ịùtự. tẨ iồnq , h ỉỉ í ifn tẫ i q ia đ ìn h , h a n h ỉ ĩtã ụ lÚ Ịi ú ìi ủnạ.
h ộ t ô i tm n ạ it t ứ t h à i ạ itm thự ít h ì in k h tìá lu ậ n .
^ )ê i íh ở i ffiart thư n ttạ h ỉỉiv t ũé han^ eh ẳií eh ắn U ltoá lu â n eĂM n hiề u
th iê u iM . ÇÎÂi r ú i ntũnụ^ đ ư ốíí i ư ợép, ụ. eủa ih tìụ . ỊuLn h i đầềtạ. nụhÌỀặi

¿tề k h oă íutÌH hfiù n tít iỉn Ufỉ*t.
Ç îà i ætn tfhùn fh íin it eảtn tín.
'JÔCL Qtệi^ *iụÁỊf. 19 tháng. 5 năm 2006.
S in h oiiềt.
'Xíoănạ. '^ềnjạ. ^ẩền.
MỤC LỤC
Trang
Đạt vẩn đ é 1
PHẨN 1 : TỔNG Q U A N 1
1.1. Đại cương về kháng sinh 2
1.1.2. Phân loại kháng sinh 2
1.1.3. Cơ chế tác dụng của kháng sin h 2
1.1.4. ứng dụng của kháng sinh
3
1.2. Đạỉ cương về xạ khuẩn 4
1.2.1. Lớp xạ khuẩn (Actinomycetes) 4
1.2.2. Đặc điểm xạ khuẩn chì Streptomyces
5
1.3. Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn

6
1.3.1. Chọn chủng có hoạt tính cao bằng phép chọn lọc tự n hiên 6
1.3.2. Đột biến cải tạo giống xạ khuẩn sinh kháng sinh 6
1.3.3. Bảo quản giống xạ khuẩn 7
1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh
8
lA l. Giống v s v 8
1.4.2. Lên men 8
1.5. Chiết, tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên m en
9

1.5.1. Chiết x uất 10
1.5.2. Tách sản phẩm 10
1.5.3. Tinh chế 11
1.6. Quang phổ hồng ngoại (IR) 12
1.7. Một sô nghiên cứu mới về kháng s in h 12
PHẨN 2: THỰC N GHIỆM VÀ K ẾT Q U Ả

15
2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm
15
2.1.1. Nguyên vật liệu 15
2.1.2. Các phưcttig pháp thực nghiệm 18
2.2. Kết quả thực nghiêm và nhận xét 24
2.2.1. Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên 24
2.2.2. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1
25
2.2.3. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2
27
2.2.4. Kết quả lên men sinh tổng hçfp kháng sin h

29
2.2.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền vững của kháng sinh
31
2.2.6. Kết quả chiết xuất kháng s in h
31
2.2.7. Kết quả sắc ký lớp mỏng 32
2.2.8. Kết quả kiểm tra sự biến đổi của bột kháng sinh th ồ

33
2.2.9. Kết quả sắc ký lỏng trên cột 34

2.2.10. Kết quả kiểm tra sự biến đổi của kháng sinh đã tinh ch ế

35
2.2.11. Kết quả xác định nhiệt độ nóng chảy của kháng sinh đã tinh chế 38
2.2.12. Kết quả phân tích phổ hổng ngoại 38
PHẨN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ X UẤT
39
3.L K ết luận 39
3.2. Đề xuất 40
TÀI LIỆU TH AM KHẢO.
PHẦN PH Ụ LỤC,
ADN
ARN
B.subtilis
P. mirabilis
£)(mm)
Gr(-)
Gr(+)
KS
MT
MT dd
PL
PTL
s
SKLM
v s v
CHÚ G IẢI CHỮ V IÊT TẮT
Acid deoxyribonucleic.
Acid ribonucleic.
Bacillus subtilis ATCC 6633.

Proteus mirabilis BV 108.
Đường kính trung bình vòng vô khuẩn.
Gram âm.
Gram dương.
Kháng sinh.
Môi trường.
Môi trường dung dịch.
Phần phụ lục.
Phân tử lượng.
Độ lệch thực nghiêm chuẩn đã hiệu chỉnh.
Sắc ký lớp mỏng.
Vi sinh vât.
ĐẶT VÂN ĐỂ
«
Việc phát hiện ra kháng sinh đánh dấu một bước ngoặt to lớn đối với
đời sống con người ở thế kỉ 20, Trong y học kháng sinh được xem như là
“thần dược ” giúp cho nhân loại thoát khỏi các vụ dịch, các bệnh nhiễm trùng
hiểm nghèo. Một số kháng sinh còn được sử dụng rất hiệu quả trong nhiều
ngành kinh tế khác và trong nghiên cứu khoa học. Song do nhiều nguyên nhân
khác nhau nên hiện nay nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh đã kháng lại kháng
sinh, cho nên những kháng sinh kinh điển không còn tác dụng đối với một số
bệnh nhiễm trùng nữa. Do đó, việc nghiên cứu tìm ra các kháng sinh mới bổ
sung tác dụng, thay thế kháng sinh cũ không còn tác dụng nữa là rất cần thiết.
Các kháng sinh có thể có nguồn gốc khác nliau như từ xạ khuẩn, nấm,
vi khuẩn, trong đó chủ yếu có nguồn gốc từ xạ khuẩn. Từ các chủng xạ khuẩn
thuộc chi Streptomyces các nhà khoa học đã phát hiện ra nhiều loại kháng
sinh có hiệu quả cao trong điều trị. Hiện nay việc nghiên cứu xạ khuẩn, nhất
là chi Strepĩomyces để tạo ra kháng sinh luôn thu hút sự quan tâm của cấc nhà
khoa học thuộc các lĩnh vực khác nhau.
ở Việt Nam, nghiên cứu Strepíomyces đang được tiến hành một cách

rộng rãi nhằm phục vụ cho việc tìm kiếm những kháng sinh mới.
Do đó chúng tôi chọn đề tài : “ Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp
kháng sinh từ Streptomyces 21.123 ” với những mục tiêu sau;
- Nghiên cứu cải tạo giống nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng
sinh,
- Bước đầu xây dựng quy trình chiết tách và tinh chế kháng sinh,
- Xác định một số tính chất vật lý của kháng sinh do Streptomyces
2Ỉ.Ỉ23 sinh tổng hợp,
- Sơ bộ dự đoán một số nhóm chức trong cấu Irúc phân tử của kháng sinh
đo
Streptomyces 2Ỉ.Ỉ23
sinh tổng hợp.
PHẦNl
TỔNG QUAN
1.1. ĐẠI CƯƠNG VỂ KHÁNG SINH:
1.1.ỉ. Định nghĩa kháng sinh [9],[10].
Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ vi sinh vật hay các
nguồn tự nhiên khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu
diệt một cách có chọn lọc lên một nhóm vi sinh vật xác định (vi khuẩn, nâừn,
nguyên sinh động vật v.v ) hay tế bào ung thư ở nồng độ thấp.
1.1.2. Phân loại kháng sinh [3],[4],[10].
Có thể phán loại kháng sinh theo nguồn gốc (kháng sinh do xạ khuẩn,
vi khuẩn, nấm) tạo ra; theo cơ chế tác dụng (kháng sinh lác dụng lên thành tế
bào, lên tổng hợp protein, tổng hợp ADN, ARN v.v ) và phân loại theo cấu
trúc hoá học. Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hoá học là khoa học nhất,
gồm các nhóm:
- Nhóm beta lactam.
- Nhóm aminoglycosid (aminosid).
- Nhóm macrolid.
- Nhóm lincosamid.

- Nhóm phenicol.
- Nhóm letracyclin.
- Nhóm peptid.
- Nhóm quinoỉon.
- Nhóm co-trimoxazol.
- Các kháng sinh khác: Riíamicin, kháng sinh chống nấm, chống ung thư.
1.1.3, Cơ chế tác dụng của kháng sinh: [3].
Các kháng sinh thường tấc dụng lên vi khuẩn theo các cơ chế sau:
- Úc chế tổng hợp vách tế bào vi khuẩn.
- ức chế tổng hợp protein của vi khuẩn.
- Úc chế tổng hợp acid nhân.
- Thay đổi tính thấm của màng.
- Kháng chuyên hoá (úc chế tổng hợp acid folic).
- Úc chế trao đổi chất hô hấp.
1.1.4. ứng dụng của kháng sinh [1],[2],[9],[10],
❖ ứng dụng kháng sinh trong lĩnh vực y học:
Trong lĩnh vực ỵ học, kháng sinh được sử dụng phổ biến để điều trị các
bệnh nhiễm khuẩn hiểm nghèo. Từ nửa cuối thế kỷ 20, với sự phát minh ra
vaccin và đặc biệt là kháng sinh, là vũ khí hữu hiộu tiêu diệt các vi khuẩn,
virus, tuổi thọ của con người đã tăng từ 35 lên đến khoảng 70 tuổi. Do đó, viộc
sử dụng các chất kháng sinh vào y học để phòng và điều trị các bệnh nhiễm
trùng có ý nghĩa thực tiễn lớn hcm bất kì một ứng dụng nào khác.
❖ ứng dụng kháng sinh ngoài ỉĩnh vực J học:
- Kháng sinh dùng trong chăn nuôi:
+ ứng dụng kháng sinh để điều trị các bệnh đo v s v gây ra cho động
vật. Kháng sinh griseoviriđin dùng điều trị bệnh viêm phổi cấp, viêm vú của
trâu, bò.
+ Kháng sinh còn được sử dụng làm chất kích thích tăng trọng cho đàn
gia súc, gia cầm, giảm chi phí thức ăn; kích thích tăng sản lượng trứng ở gà,
vịt. Mỹ, các nước Tây Âu và Nhậl dùng bacitracin, flavomycin, avoparxin,

monenzin làm chất kích thích tăng trọng.
- Kháng sinh dùng trong trồng trọt:
Kháng sinh dùng để tiêu diệt nấm và vi khuẩn gây bệnh cho cây trồng
như bệnh khô vằn, vàng lụi ở lúa (vandimycin, blasticidin, kasugamycin,
v.v ) Kháng sinh còn kích thích nảy mầm của hạt. Thưòíng ngâm hạt trong
dung dịch kháng sinh trước khi gieo vừa để kích thích nảy mầm, vừa tiêu diệt
mầm bệnh có trong hạt. Có thể phun dung dịch kháng sinh cho cây trồng đang
bị bệnh, hoặc trộn các v s v sinh kháng sinh vào trong đất để tiêu diệt mầm
bệnh có trong đất.
- Kháng sinh dùng trong công nghiệp thực phẩm:
Dùng kháng sinh trong thực phẩm đóng hộp sẽ bảo quản được lâu hơn,
khử trùng ở nhiệt độ thấp hơn nên chất lượng thực phẩm giữ được tốt hcm.
Kháng sinh lisin thường được dùng để bảo quản thực phẩm đóng hộp như cà
chua, đậu xanh, bắp cải, và các loại rau khác và đặc biệt là phomat.
1.2. ĐẠI CƯƠNG VỂ XẠ KHUẨN:
1.2.1. Lớp xạ khuẩn {Actínomycetes) [6],[7],[13].
> Đặc điểm chung:
Xạ khuẩn là một nhóm vi khuẩn thật {Eubacíerìa), phân bố rất rộng rãi
trong tự nhiên. Phần lớn xạ khuẩn là các tế bào Gram(+), hiếu khí, hoại sinh,
phát triển tốt ở nhiệt độ 24-32^’C. Xạ khuẩn có khả năng sản sinh nhiều sản
phẩm trao đổi chất quan trọng như: kháng sinh, enzỵm, một số vitamin và acid
hữu cơ. Phần lớn xạ khuẩn không gây bệnh cho người và động vật.
> Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn:
Xạ khuẩn phát triển ờ dạng sd nhỏ, dài, phân nhánh gọi là khuẩn ty. Hệ
sợi của chúng chia thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh. Loại khuẩn ty
không mang bào tử gọi chung là khuẩn ty dinh dưỡng. Khuẩn ty của xạ khuẩn
không có vách ngăn và không tự đứt đoạn, màu có thể là tráng, vàng, da cam,
đỏ, hoặc tím nâu, đen Khuẩn ty cơ chất có thể tiết ra môi trường một số
loại sác tố có thể tan trong nước hoặc chí tan trong dung môi hữu cơ. Khuẩn ty
cơ chất phát triển một thời gian thì dài ra trong không khí thành khuẩn ty khí

sinh. Sau một thời gian trên đỉnh khuẩn ty xuất hiện các sợi bào tử có thể có
nhiều hình dạng : thẳng, lượn, sóng, mọc đcm, mọc vòng Một số xạ khuẩn
có sinh nang bào tử bên trong có chứa các bào tử nang.
Khuẩn lạc của xạ khuẩn không trơn ướt mà có dạng thô ráp, dạng phấn,
khồng trong suốt, có các nếp toả ra theo hình phóng xạ,
Đặc điểm cấu tạo tế bảo:
- Thành tế bào: dạng lưới, dày khoảng 10-12cm.
- Màng tế bào chất: chủ yếu là phospholipid và protein, dày 7,5-10 nm.
- Mezosom: hình phiến, hình bọng hay hình ống.
- Các thể ẩn nhập trong tế bào chất :gổm các hạt polyphosphat, các hạt
polysaccarid.
1.2.2. Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces [6],[7]^[19].
> Đặc điểm hình thái: Có các đạc điểm của hình thái lớp xạ khuẩn
Actinomycetes ở trên.
> Đậc điểm sinh ìỷ:
Streptomyces ỉà v s v dị dưỡng, nguồn cacbon thường dùng là đường,
tinh bột và nhiêu chất hữu cơ khác; nguồn nitơ hữu cơ là protein, pepton, cao
ngô, cao nấm men; nguồn nitơ vô cơ ỉà nitrat, muối amoni, Khả năng đổng
hoá ở các loài khác nhau là khác nhau.
Strepĩomyces là loài xạ khuẩn hô hấp hiếu khí. Nhiệt độ tối im của
chúng ihường là 25‘*c - 30^’c, một số loài có thể mọc tốt ở nhiệt độ cao hơn,
pH tối ưu thường tù 6,8 - 7,5.
> Khả nãng tạo sắc tố: sắc tố được tạo thành từ Streptomyces được chia
làm 4 loại: sắc tố hoà tan, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố của khuẩn ty cơ
chất và sắc tố melanoid.
> Pháìi h ại Streptomyces:
Hội nghị vi sinh vật thế giới lần thứ 10 được tổ chức tại Mêxicô vào
năm 1970 chọn khoá phân loại của E.B Shirling & D.Gottlieb làm khoá phân
loại chính để phân loại chi Sírepĩomyces và đặt tên là Internationa!
Síreptomyces Project (ISP).

Khoá phân loại này dựa trên các đặc điểm:
- Đặc điểm hình thái học của xạ khuẩn : màu sắc khuẩn ty cơ chất, hình
dạng chuỗi bào tử và bề mặt bào tử.
- Đặc điểm sinh lý học : khả năng tạo sắc tố hoà tan, khả năng tạo sắc tố
melanoid và khả năng sử dụng các nguồn đường của xạ khuẩn.
1.3. TUYỂN CHỌN, CẢI TẠO VÀ BẢO QUẢN GIỐNG XẠ KHUẨN .
1.3.1. Chọn chủng có hoạt tính cao bằng phép chọn lọc tự nhiên [9],[10].
Các v s v có sự đột biến tự nhiên theo tần số khác nhau trong ống giống
thuần khiết, có cá thể có hoạt tính kháng sinh mạnh hơn 10-20% những cá thể
khác. Một trong những nguyên nhân của đột biến tự nhiên là do sai sót khi bát
cặp nucleotid trong quá trình sao chép gây nên bởi sự chuyển hoá tautome của
các electron trong một base. Cần phải chọn lấy những cá thể có hoạt tính cao
nhất để nghiên cứu tiếp,
1.3.2. Đột biến cải tạo giông xạ khuẩn sính kháng sinh [6],[9],[10]^[15].
Các chủng xạ khuẩn khi mới phân lập, kể cả các chủng sau chọn lọc
ngẫu nhiên thường có hoạt tính kháng sinh thấp và hiệu suất sinh tổng hợp
không cao. Do đó, để gây tạo chủng có hoạt tính cao đáp ứng yêu cầu của sản
xuất công nghiệp cần cải tạo giống
v sv . Vì tiêu chuẩn chủng có hoạt tính cao
chịu ảnh hưởng nhiều bởi gen nên thường phải qua nhiều bước gây đột biến và
chọn giống mới có thể làm tăng hoạt tính một cách đáng kể. Ngoài ra, đột
biến còn nhằm mục đích tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh; cải tạo các
đặc tính lên men theo chiều hướng tốt hơn, rút ngắn thời gian lên men, ít tạo
bọt hcfn ;chỉ sinh tổng hợp một sản phẩm để chiết tách, tinh chế thuận lợi
hơn; sinh tổng hợp được các sản phẩm mới, tạo các liên kết mới, nhóm chức
mới.
Tác nhân gây đột biến có thể là hoá học (hydroxylamin, các acridin )
hoặc vật lý (ánh sáng u v , tia gamma, tia X )- Các tác nhân trên với liều
lượng và thời gian thích hợp sẽ giết chết các v s v . Những cá thể nào nếu còn
sống sót sẽ biến đổi nhiễm sắc thể, làm thay đổi các tính trạng dẫn đến hoặc là

làm mất khả năng tạo kháng sinh (đội biến ám tính) hoặc là làm tăng hiệu suất
sinh tổng hợp kháng sinh lên nhiều lần (đột biến dương tính).
Đột biến bằng ánh sáng u v được sử dụng phổ biến trong di truyền
chọn giống v s v , Ánh sáng u v tác dụng chủ yếu lên acid nucleic, mạnh nhất
là vùng 260nm, dẫn đến hiện tượng dime hoá tim ìn, ở đây 2 timin gần nhau
được liên kết cộng hóa trị với nhau ở nguyên tử c sô' 5 và 6. Hậu qủa là sao
chép bị sai lầm vì ADN-polymerase dễ lắp một niicleotid không chính xác vào
vị trí trên. Do tác dụng của ánh sáng u v trên sợi ADN xuất hiên một dime
pyrimidin khác gọi là quang sản phẩm 6-4, ở đây C-6 của pyrimidin 5’ (T
hoặc C) được liên kết với C-4 của pỵrimidin 3’ (thường là C). Sản phẩm này là
nguyên nhân chủ yếu của đột biến gây nên bởi ánh sáng u v .
Các yếu tố ảnh hưởng đến tác dụng gây chết và tần số phát sinh đột
biến:
- Liều lượng chiếu: Được đặc trưng bởi 3 tham số là thời gian chiếu,
khoảng cách chiếu và độ pha loãng bào tử. Thưèmg thì đột biến dưoíng sẽ xuất
hiện ở những liều lượng chiếu có độ sống sót bào tử từ 0,1%-1 %, còn đột biến
âm sẽ xuất hiện ở những liều lượng chiếu cao hcm.
- Ánh sáng thường: Sau khi đột biến bàng ánh sáng tử ngoại, nếu đem
chiếu ánh sáng thường (bước sóng 320nm- 480nm) trở lại thì sẽ có khoảng
50%-80% tế bào được phục hồi do tác dụng cùa men photolyase. Hiện tượng
này được gọi là quang phục hoạt.
- Các yếu tố khác: Ngoài các yếu tố trên thì nhiệt độ, pH, thành phần môi
trường, trạng thái sinh lý của v s v đem đột biến cũng ảnh hưỏíng đến hiệu quả
chiếu ánh sáng u v .
1.3.3. Bảo quản giông xạ khuẩn [2],[16].
Để duy trì hoạt tính của các chủng sản xuất, chủng giống khổng bị tạp
nhiễm do các v s v khác và phage, có tỉ lệ sống sót cao cần phải giữ giống cẩn
thận.
Có nhiều phương pháp khác nhau để giữ giống v s v . Trong quy mô
phòng thí nghiệm, giống xạ khuẩn Ihường được giữ trên môi trường thạch

nghiêng trong tủ lạnh (nhiệt độ 2- 4“C) định kỳ 3 - 6 tháng cấy truyền.
1.4. LÊN MEN SINH TổNG HỢP k h á n g s in h [2],[9],[10],[12].
Là giai đoạn nuôi v s v để chúng tạo ra sinh khối v s v hoặc các sản
phẩm trao đổi chất bậc 1,2. Thường lên men với các điều kiện về dinh dưỡng,
về pH, nhiệt độ, thời gian tốt nhất để v s v sinh trưởng và phát triển, nhằm
tạo ra được tối đa sản phẩm mong muốn.
1 A l. Giống vsv.
Giống v s v trước khi đem gieo cấy vào các bình lên men phải được
tuyển chọn cẩn thận. Chỉ những cá thể có hoạt tính như mong muốn mới được
truyền giống và nhân lên trong các bình giống cấp 1, 2, 3.
1.4.2. Lên men.
Có 2 kiểu lên men chính là lên men bề mặt và lên men chìm:
- Lên men bề mặt: là thực hiện nuôi cấy v s v trên bề mặt môi trường
dịch thể hoặc môi trường bán rán. Các cá thể tổn tại ở bề mặt môi trường, hấp
thụ các chất của môi trường và hướng về khoảng khôQg khí được cung cấp đầy
đủ oxi.
- Lên men chìm: là kiểu lên men mà v s v phái triển trong không gian 3
chiều của môi trường lỏng. Giống dùng trong quá trình lên men phải là các tế
bào sinh dưỡng đang ở giai đoạn phát triển mạnh và có khả năng đồng hoá vật
chât cao nhất. Do đó trước khi lên men phải tiến hành tạo giống.
Tỉ lệ giớng trong mồi trường lên men là 1%-10%. Trong khi lên men
có thể phải cho thêm các chất phá bọt (mỡ cá voi, dầu thực vật ), chất điều
chỉnh pH hay đệm pH nhằm đảm bảo điều kiện thuận lợi cho quá trình lên
men. Tuỳ thuộc vào sản phẩm mà thời gian lên men có thể từ 50h-120h, tuy
nhiên hiệu quả lên men tăng lên khi thời gian lên men giảm xuống.
Lên men chìm được chia thành các kiểu sau;
+ Lên men gián đoạn (hay ỉên men chu kỳ): Là quá trình lên men được
coi như một hộ thống đóng kín. Trong suốt thời gian lên men không có bất cứ
một tác động bổ sung nào vào hệ thống ngoại trừ việc thông khí, dùng chất
phá b ọ t, chất điều chỉnh pH. v s v phát triển theo 4 giai đoạn được gọi là các

pha: pha tiềm tàng, pha log, pha dừng, pha suy tàn. Kết thúc quá trình ở giai
đoạn nào là luỳ thuộc vào việc sinh tổng hợp hoạt chất bị đình chỉ ở pha nào
trong chu kỳ sinh trưỏíng của v s v hoặc việc sinh tổng hợp đã chậm lại và
việc duy trì tiếp tục quá trình lên men không còn kinh tế nữa. Phương pháp
này được ứng dụng để sản xuất nhiều hoạt chất quan trọng như acid amin, các
kháng sinh
+ Lên men cố bổ sung: Thực chất là kỹ thuật kéo dài chu kì phát triển
của v s v khi cho thêm môi trưòíng mới vào dịch lên men một cách ổn định,
thay đổi hay định kì nhưng không lấy bớt địch lên men ra.
+ Lên men ìiên ĩục: Trong quá trình lên men, khi v s v phát triển đến
một giai đoạn nào đó, người ta lấy đi một thể tích môi ừường lên men cùng tế
bào và sản phẩm trao đổi chất của chúng, đồng thời bổ sung đúng một thể tích
môi trưòng dinh dưỡng mới vào bình nuôi cấy, lúc đó ta có được trạng thái
cán bằng động.
+ Lên men bán liên tục: Trong quá trình lên men, việc lấy đi một thể
tích môi trường lên men và bổ sung môi trường dinh dưỡng mới vào không
xảy ra liên tục mà sau những khoảng thời gian xác định.
1.5. CHIẾT, TÁCH VÀ TINH CHẾ KHÁNG SINH TỪ DỊCH LÊN
MEN:[5],[11],[14].
Kháng sinh là sản phẩm trao đổi thứ cấp, đo đó kết thúc quá trình lên
men kháng sinh có thể nằm trong sinh khối hoặc trong dịch lên men đồng thời
có thể có nhiều thành phần kháng sinh khác nhau và bị lẫn nhiều tạp chất
khác. Vì vậy, cần phải chiết tách để lấy kháng sinh linh khiết.
1.5.1. Chiết xuất:
Định nghĩa: Chiết là phương pháp dùng một dung môi (đơn hay hỗn
hợp) để tách lấy một chất hay một nhóm chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu.
Nguyên rắc: Dựa vào sự phân bố chất tan giữa hai pha không hoà lẫn
được vào nhau.
Tuỳ theo tính chất và ban chất hóa học của của kháng sinh mà ta chọn
các phương pháp chiết xuất và tinh chế thích hợp, có thể chiết bằng dung môi

hữii cơ, bằng trao đổi ionid hoặc bàng phưcmg pháp kết tủa.
1.5.2. Tách sản phẩm:
Định nghĩa: Tách là một nhóm các phương pháp hoá học, vật lý và hoá
lý nhằm đi từ hỗn hợp phức tạp đến những hỗn hợp đofn giản và hỗn hợp đơn
giản tách riêng từng chất.
Phưoíng pháp tách hỗn hợp đồng nhất thường dùng nhất là phưomg pháp
chuyển pha: Để chuyển một chất hay một số chất từ pha này sang pha khác,
người ta thường dùng một dung môi thích hợp. Trong nhóm này có các
phương pháp : chiết, thẩm thấu và các phưcmg pháp sác ký.
Quá trình rách sắc ký:
Sắc ký là một nhóm các phương pháp hoá lý dùng để tách các thành
phần của một hỗn hợp. Sự tách sắc ký được dựa trên sự phân chia idiác nhau
của các chất khác nhau vào hai pha luôn tiếp xúc và không hoà lẫn vào nhau:
một pha tĩnh và một pha động. Quá trình tách sắc ký thường qua 3 giai đoạn
chính: đưa hỗn hợp lên pha tĩnh, cho pha động chạy qua pha tĩnh và phát hiện
các chất.
Sắc ký ỉớp mỏng\ SKLM thường được tiến hành trên một bản kim loại
có rải một lớp mỏng dính chắc của các hạt bột mịn. Lớp mỏng này thường
được dùng làm pha tĩnh. Pha động là chất lỏng sẽ thấm và chạy trên lớp mỏng
do tác động của lực mao dẫn và đôi khi cả trọng lực và điện thế.
1.5.3. Tinh chế:
Mục đích: Tiến hành tinh chế để thu lấy kháng sinh tỉnh khiết cho các
nghiên cứu tiếp theo, ở đây chúng tôi ứng dụng quá trình tách bằng sác ký cột
để tinh chế.
Sắc ký cột là sắc ký trong đó chất hấp phụ hoặc chất làm nền cho pha
tĩnh được nhồi trong ống hình trụ gọi là cột, nhờ vây mà có thể khai triển dung
môi liên tục vói nhiều hệ dung môi khác nhau từ phân cực yếu đến phân cực
mạnh.
Cột trong phòng thí nghiệm là những ống hình trụ bàng thuỷ tinh dài 30
- 70 cm, đường kính 1 -5 cm, đầu dưới có vòi và một khoá điều chỉnh tốc độ.

Hoá chất dùng để nhồi cột có thể là cellulose, gel của acid silic không
hoạt hóa, oxit nhôm, Silicagel, CaCO^ Các chất dùng cho sắc ký cột đều phải
được chuẩn hoá để việc sử dụng được dễ dàng thuận lợi.
Dung môi : Nói chung các hệ dung môi dùng cho sắc ký lófp mỏng và
sác ký giấy đều có thể sử dụng vào sắc ký cột.
Để thiết kế một cột sác ký dùng tách một hỗn hợp chất thử trước hết
phải giải đáp những câu hỏi sau:
- Dùng chất hấp phụ gì, kích thước cột.
- Dùng dung môi rửa nào, thể tích mỗi loại, thể tích mỗi phân đoạn hứng,
tốc độ chảy
Các vấn đề trên được giải quyết dựa trên thực nghiệm bằng cách thăm
dò bằng SKLM trước khi tiến hành trên cột. Để chọn chất hấp thụ và dung
môi, dựa vào hợp chất đang nghiên cứu và tài liệu tham khảo để chọn ra một
số chất hấp phụ và dung môi, sau đó tiến hành thăm dò bằng SKLM để tìm ra
chất và hệ dung mồi tách tốt nhất. Khi đã chọn được chất hấp phụ và hệ dung
môi thích hợp, để đảm bảo việc tách lượng lớn nên làm thử các cột bé và tách
một lượng chất thử ít.
1.6. QUANG PHỐ HỔNG NGOẠI (IR) [5],[8],[18],[20]:
Sự hấp thụ của phản íử: Năng lượng của mội phán tử E,-ng bao gồm
năng lượng của chuyển động tịnh tiến của phân tử Et, năng lượng của điện tử
Ee, năng lượng của chuyển động dao động Ev và nãng lượng của chuyển động
quay Er: Et + Ee + Ev + Er. trong đó Ee » E v » E t.
Sự hấp thụ bức xạ hồng ngoại làm thay đổi mức năng lượng của chuyển
động dao động và chuyển động quay của phân tử.
Quang phổ hồng ngoại: là phương pháp đo quang phổ hấp phụ phân tử.
Phân tử hấp thụ năng lượng của bức xạ hồng ngoại, bị thay đổi trạng thái dao
động,
Trong phân tử khi một nhóm nguyên tử nào đó hấp thụ năng lượng và
thay đổi trạng thái dao động thì tạo nên một dải hấp thụ (đỉnh hấp thụ) trên
phổ IR. Như vậy, có sự tưcmg quan giữa nhóm nguyên tử và dải hấp thụ.

Người ta có thể dựa vào sự có mặt của dải hấp thụ để nhận biết một nhóm
chức nào đó.
1.7. MỘT SỐ NGHIÊN CÚtJ MỚI VỂ KHÁNG SINH :
1.7.1. Bất động enzym GIutaryl-7-aminocephalosporanic acid acylse lẽn
Silica Gel và tăng tính ổn định của enzyni này [23].
7-Aminocephalosporanic acid (7-ACA) là một chất trung gian để bán
tổng hợp các kháng sinh cephalosporin. Gần đáy, người ta tổng họíp 7-ACA từ
Glutaryl-7-aminocephalosporanic acid (GL-7-ACA) bàng phương pháp bất
động enzym GL-7-ACA acylase, một enzym xúc tác cho quá trình biến đổi
GL-7-ACA thành 7-ACA.
Người ta tiến hành bất động enzym GL-7-ACA acỵlase trên Silica gel
đã được làm biến đổi bằng 3-aminopropyltrieihoxysilane và được gắn bởi
glutaraldehyđ để sản xuất 7-ACA. Sau đó nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho
sự bất động enzym GL-7-ACA acylase bằng các thí nghiệm khảo sát và
phương pháp thống kê. Hoạt tính cao nhất mà enzym GL-7-ACA acylase bất
động có được là ở các điều kiện sau: dung dịch đệm phosphat ở nồng độ 1,1M
và pH 8,3, nhiệt độ phản ứng 20‘’c và thời gian phản ứng là 120 phút.
Người ta dùng glutaraldehyd để gắn enzym này vào Silica gel. Tuy
nhiên, glutaraldehyd gây độc đối với enzym. Do đó, cần phải loại các nhóm
aldehyd không liên kết bằng phản ứng với các chất có PTL thấp như L-lysin,
glycerin và ethanolamin sau khi bất động để tăng hoạt tính cua enzym GL-7-
ACA acylase bất động. Nói chung, hoạt tính cao nhất của enzym này có được
khi xử lỵ với 0,4%(v/v) ethanolamin. Natri cyanoborohydrid là yếu tố làm
tăng tính ổn định của liên kết giữa enzym này và chất mang silica gel. Hoạt
tính của enzym GL-7-ACA acylase bất động đã được xử lý với 4%(w/w) vẫn
được duy trì hầu như 100% sau 20 lần tái sử dụng.
1.7.2. Tối ưu hoá mòi trường nuôi cấy và các điều kiện sản xuất Penicillin
Acylase từ Streptomyces lavendulae ATCC 13664 [22].
Strepĩomyces Ịavenduỉae là xạ khuẩn sinh tổng hợp penicillin acỵlase
ngoại bào. Enzym này có hoạt tính thuỷ phân đối với penicillin V và các

penicillin tự nhiên như penicillin K, penicillin dihydroF và penicillin F.
Người ta tiến hành tối ưu hoá môi trường lên men Streptomyces
iavendulae trên quy mô phòng thí nghiệm để làm tăng lượng sản phẩm
penicillin acylase. Các kết quả thực nghiệm đã cho thấy các yếu tố chính làm
tăng penicillin acỵlase là nồng độ cao nấm men và sự có mặt của các nguyên
tố vi lượng trong môi trường lên men. Khi nồng độ cao nấm men trong môi
trường lên men là 2,5% (w/v) và CuSO^.iHjO là 3|ag/ml thì sự sản xuất
acỵlase là tốt nhất. Trong môi trường lên men đã được tối ưu hoá, hiệu suất
quá trình lên men đạt được là 289IU/L sau 72giờ ở 20"c khi tỉ lệ thể tích môi
trường/thể tích bình là 0,4 và tốc độ lác là 300 vòng/phút. Sự có mặt của đồng,
đcín lẻ hay kết hợp với các kim loại khác sẽ kích thích sự tăng sinh khối và
penicillin acylase. Sự sản xuất penicillin acylase bị ức chế bởi glucose và
gỉỵcin, trong khi đó lactose thì ức chế ít hcfii.
1.7.3. Cơ chế nhảy của chuồi polyketid trong sinh tổng họfp kháng sinh
chòng ung thư dạng lai tạo Peptiđ-Polyketid khùng ribosom Leinamycin
ở Streptomyces atroolỉvaceus S-140 [21].
Đặc điểm nổi bật của enzym modul Polyketid (PKS) là có thể giúp dự
đoán chính xác mối liên hệ giữa trình tự vùng với các nhóm hoá chức của
polyketid tổng hçfp được. Đặc điểm sinh hoá của chùm gen sinh tổng hợp
Lcinamycin (LNM) từ Strepìomyces atrooỉivaceiis S-140 được thể hiện ở gen
LnmJ, gen mã hoá cho 5 modul PKS mà có 6 vùng protein mang acyl (ACP).
Modul LnmJPKS 6 chứa 2 vùng ACP, ACP(6)(-)( I ) và ACP(6)(-)(2), bị phân
cách bởi vùng C-metyltransferase. Những thử nghiệm đột biến định hướng vị
trí được tiến hành với mỗi vùng ACP để thử các cơ chế thay đổi về vai trò của
chúng trong kéo dài chuỗi polyketid. Các kết quả ị/i vivo đã cho thấy một kiểu
cơ chế “nhảy” mới của chuỗi polyketid mà ACP Ihoả đáng cho sinh tổng hợp
LNM. Đặc trưng sinh hoá in vừro cho thấy cả 2 vùng ACP này đều có thể gắn
với một đcfn vị ngoại biên malonat bởi LnmG acỵl transferase, tuy nhiên
ACP(6)(-)(2) được ưu tiên hơn bởi vì hiệu quả gắn của nó gấp 5 lần so với
ACP(6)(-)(1). Những kết quả này có mối quan hệ với ACP(6)(-)(2) đang được

sử dụng cho bước kéo dài chuỗi khởi phát với ACP(6)(-)(1) có liên quan đến
quá trình C-metyl hoá sau đó. Những phát hiện này cho cung cấp những quan
điểm mới về cơ chế nhảy sinh tổng hợp chuỗi polyketid đối với các modul
PKS.
PHẦN 2
THựC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THựC NGHIỆM:
2.1.1. Nguyên vật liệu:
> Giống xạ khuẩn :
Chủng xạ khuẩn Sírepiomyces 21.123 đã được phân lập và tuyển chọn
có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh, phổ tác dụng rộng trên vi khuẩn, cố
đặc tính di truyền ổn định. Chủng giống Síreptomyces 2LỈ23 do Bộ môn Vi
sinh-SÌnh học, trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp.
> Giống v s v kiểm định :
Giống v s v kiểm định do Bộ môn Vi sinh-Sinh học, trường Đại Học
Dược Hà Nội cung cấp.
Vi khuẩn Gr(-): Proreus mù abìHsBV 108.
Vi khuẩn Gr(+): BaciUus subĩÌUs ATCC 6633.
> Môi trường:
❖ Các môi trường nuôi cấy v s v kiểm định: (Bảng 1). Các môi trường này
được tiệt trùng bàng hcả nước ở latm/30 phút.
Bảng 1: Các môi trường nuôi cấy v s v kiểm định
\ ^ à n h phần
MT
NaCl
(%)
Cao thịt
(%)
Pepton
(%)

Thạch
(%)
pH
Canh thang 0.5
0,3 0,5
-
7,0-7,4
Thạch thường
0,5 0,3 0,5
1,8
7,0_7,4
♦> Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn: (Bảng 2). Các môi trường này được
tiệt trùng bằng hơi nước ở latm/30 phút.
❖ Các môi trường lên men (M Tdd): Có thành phần tương ứng môi trường
nuôi cấy xạ khuẩn nhưng bỏ thạch.
> Dụng cụ vá hoá chát:
❖ Các dung môi đã sử dụng được giới thiệu ở bảng 3.
Bảng 3: Các dung mỏi hữu cơ.
Dung môi
Khối lượng riêng
(g/cm)
Nhiệt độ sôi
("C)
Methanol 0,791 -0,793 64,5
NH4OH 25% 0,88
Ethanol 0,789-0,791 78,3
Dimetylformamid 0,95 153
Chloroform 1,470- 1,480 60- 62
Butylacetat 0,880-0,885 117- 118

n-Butanol
0,81 116-118
Aceton
0,79 56
Trietylamin 0,726 - 0,728 90
<♦ Vật liệu dùng trong sác ký:
Bản mỏng sắc ký: Silicagel 60 F254, Merck.
Hạt Silicagel 60 F254, Merck, cỡ hạt 0,06 -0,2 mm.
Dung môi chạy sắc ký; các dung môi trong bảng 3.
Bình chạy sắc ký.
Buret 25ml, mao quản.
*ỉ* Máy móc, thiết bị, dụng cụ:
Nồi hấp vô trùng Hiraỵama Model HL3030.
Tủ cấy Sanyo Clean Bench.
Tủ sấy.
Tủ ấm Trung Quốc 30‘’c, 37‘*c.
Cân kỹ thuật, cân phân tích.
t '
- Tác nhân gây đột biến ; ánh sáng ư v (À=254nm) nguồn phát Toshiba 60w ,
điện thế 220V.
- Máy ỉắc Taitec Bio-Shaker BR 300LF.
- Máy đo nhiệt độ nóng chảy Electrothermaỉ Digital ( Bộ môn Hoá hữu
Cơ-Trường ĐH Dược Hà Nội).
- Máy đo phổ hồng ngoại Perkin Elmer (Phòng thí nghiệm trung tâm- Trường
ĐH Dược Hà Nội).
- Máy cất quay Buchi WaterBath B480 ( Xưởng GMP- Bộ môn Công nghiệp
dược - Trường ĐH Dược Hà Nội).
- Pipet các loại, ống đong, cốc có mỏ, ống nghiệm, đèn cồn, hộp Petri
- Thước kẹp Panmer có độ chính xác 0,02mm.
2.1.2. Các phương pháp thực nghiệm:

> Phương pháp nuôi cấy và giữ giống:
Giống Streptomyces 2Ị. 123 được cấy trên ống thạch nghiêng MTl, ủ
cho phát triển ở 30”c, trong 7-10 ngày. Giống Streptomyces 21.123 sau khi
phát triển được cất giữ trong tủ lạnh định kỳ 3-6 tháng cấy truyền.
> Dánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuyếch tán:
Nguyên tắc. Mẫu thử được đưa lên lớp thạch dinh dưỡng đã cấy vi sinh
vậi kiểm định. Kháng sinh từ mẫu thử sẽ khuyếch lán vào môi trường thạch sẽ
ức chế sự phát triển của v s v kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn.
Tiến hành:
Chuẩn bị môi trường cấy v s v kiểm định :
Vi khuẩn kiểm định được cấy vào môi trường canh thang- Sau 24 gicf
nuôi cấy ở 36-37^’C, sẽ làm thành nhũ dịch vi khuẩn có nồng độ từ 10^-10^ tế
bào/ml.
Đưa nhũ dịch này vào môi trường thạch l hường đã tiệt trùng và làm
nguội đến 45-50”C với tỉ lệ 2,5:100. Lác đều, đổ vào đĩa Petri vô trùng với thể
tích 20 ml/đĩa. Để nguội ở nhiệt độ phòng trước khi đưa mẫu thử vào đĩa.
Đưa mẫu thử vào đĩa Petri chứa môi trường đã cấy vi khuẩn kiểm định :
Có 3 phưcmg pháp:
+ Phưomg pháp khối thạch: Đặt khối thạch đường kính 6mm có chứa xạ
khuẩn sinh kháng sinh lên bề mặt môi trường đã cấy vi khuẩn kiểm định.
+ Phương pháp khoanh giấy lọc: Khoanh giấy lọc có đường kính 6mm đã
tẩm ba lần dịch chiết dung môi hữu cơ của mẫu thử và sấy ở nhiệt độ dưới
50”c, được đặt lên bề mặt môi trường đã cấy vi khuẩn kiểm định.
+ Phưcmg pháp giếng thạch: Nhỏ đung dịch nước của mẫu thử vào các giếng
(đường kính 6mm) đã được đục trên bề mặt môi trường đã cấy vi khuẩn kiểm
định. Mỗi giếng nhỏ 0,05 ml.
Nuôi cấy: Các đĩa Petri chứa môi trường đã cấy vi khuẩn kiểm định và
mẫu thử được ủ trong tủ ấm 37"c trong 24h.
Đánh giá kết quả : Đo đường kính vòng vô khuẩn bằng Ihước kẹp
Panmer có độ chính xác đến 0,02 mm. Đánh giá đường kính vòng vô khuẩn

được xử lý theo công thức:
_ Ĩ A ị(D ,-D y
D

s = 1p !

n í «-1
D : Đường kính trung bình vòng vô khuẩn.
D : Đường kính vòng vô khuẩn thứ i.
s : Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh,
n : Số thí nghiêm làm song song.
> Phương pháp sàng lọc ngẫu nhiên:
Pha hỗn dịch bào tử: Chuẩn bị ] ống nghiệm chứa lOml nước cất vô
trùng, 5 ống nghiệm chứa 9ml nước cất vồ trùng và 1 pipet Iml. Lấy 1 vòng
que cấy bào lử Streptomyces 2Ị.123 từ ống giống cho vào ống nghiệm chứa
lOml nước cất vô trùng để được hỗn dịch bào tử có nồng độ 10'‘bào tử/ml. Sau
đó pha loãng thành các nồng độ
Cấy bào tử: Dùng pịpet vô trùng hút chính xác 0,lml hỗn dịch bào tử ở
các nồng độ từ lO '^-lO’^ nhỏ lên bề mặt MTl đã được tiệt trùng trong đĩa Petri.
Dùng que trang vô trùng giàn đều giọt hỗn dịch bào tử này. Mỗi nồng độ tiến
hành làm 3 đĩa song song. Sau đó ủ trong tủ ấm 30*’c trong 6 ngày để xuất
hiện các khuẩn lạc.
Tiến hành chọn lọc ngẫu nhiên: Chọn ngẫu nhiên các khuẩn lạc phát
triển tốt, mọc riêng rẽ, cấy zic zắc lên bề mặt MTl trong đĩa Petri. Sau 6 ngày
ủ trong tủ ấm 30‘*c, đem thử hoạt tính KS bằng phương pháp khối thạch.
> Phương pháp đột biến bằng ánh sáng UV:
Pha hỗn dịch bào tử: Chuẩn bị 1 ống nghiệm chứa lOml nước cất vô
trùng. Lấy 1 vòng que cấy bào tử Strepỉomyces 21.123 cho vào ống nghiệm
trên, lắc đều để tạo thành hỗn dịch bào tử có nồng độ 10 '(quy ước). Sau đó
lấy Iml hỗn dịch bào tử này pha loãng đến nồng độ 10’^ để làm mẫu chứng,

9ml còn lại đổ vào đĩa Petri vô trùng.
Đột biến bàng ánh sáng UV: 9ml hỗn dịch bào tử ở nồng độ 10 * trong
đĩa Petri vô trùng được chiếu bằng ánh sáng u v với khoảng cách 60cm và
thời gian chiếu là 5 phút. Sau đó để chỗ tối 2h rồi dùng pipet vô trùng pha
loãng đến nồng độ 10 ^.
Cấy bào tử: Dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,lm l mẫu chứng 10'^
nhỏ lên bể mặt MTl trong đĩa Petri và 0,lml hỗn dịch bào tử đã đột biến ở các
nồng độ 10 “^-10 ^ nhỏ lên bề mặt MTl trong đĩa Petri. Dùng các que trang vô
trùng giàn đều giọt hỗn dịch bào tử. Mỗi nồng độ làm 3 đĩa song song. Sau đó
ủ các đĩa trong tủ ấm 30*’c trong 6 ngày cho xuất hiện các khuẩn lạc. Lấy đĩa
ra và đếm các khuẩn lạc, xác định % sông sót Iheo công thức:
% sống sót = X100
N : Số khuẩn lạc sau đột biến.
ỉtt
: Sô khuẩn lạc trong mẫu chứng