Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 155 21

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI



NGUYỄN HUY TRÌNH

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN
TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ
STREPTOMYCES 155.21

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ



Hà Nội, 05/2013

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN HUY TRÌNH


GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU LÊN MEN
TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ
STREPTOMYCES 155.21

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Giáo viên hướng dẫn : PGS.TS Cao Văn Thu
Nơi thực hiện : Bộ môn Vi Sinh – Sinh Học
Trường Đại Học Dược Hà Nội



Hà Nội, 05/2013


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gi li cm ơn sâu sc nht đn thy gio PGS -TS Cao Văn Thu -
ngưi đ tn tnh hưng dn tôi t nhng bưc đu tiên cho đn khi tôi hon thin
kha lun ny.
Tôi xin chân thnh cm ơn cc thy cô gio , cc cn b, k thut viên ging
dy, công tc ti B môn Vi sinh - Sinh hc, B môn Công nghip dưc trưng Đi
hc Dưc H Ni , B môn Hóa vt liu - khoa Ha trưng Đi hc Khoa hc tự
nhiên Hà Ni đ gip đ tôi trong thi gian lm thực nghim.
Nhân dp ny tôi cng xin gi li cm ơn đn Ban gim hiu cng ton th
cc thy cô gio trưng Đi hc Dưc H Ni đ dy d v to mi điu kin thun
li cho tôi trong thi gian tôi hc tp ti trưng.
V cui cng l li cm ơn tôi gi ti gia đnh v bn b đ đng viên , giúp
đ tôi trong sut thi gian thực hin kha lun.
Do thi gian lm thực nghim cng như kin thc ca bn thâ n còn c hn,
kha lun ny cn c nhiu thiu st. Tôi rt mong nhn đưc sự gp  ca cc thy
cô, bn b đ kha lun đưc hon thin hơn.
Tôi xin chân thnh cm ơn!
H Ni, ngày 16, tháng 5, năm 2013.
Sinh viên

NGUYỄN HUY TRÌNH

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2
1.1. Đi cương v kháng sinh 2
1.1.1. Đnh ngha khng sinh 2
1.1.2. Phân loi khng sinh 2
1.1.3. Sơ đ tng qut sản xuất kháng sinh 3
1.1.4. ng dng ca khng sinh 4
1.2. Đi cương v x khun (Actinomycetes) 4
1.2.1. Đc đim hnh thi x khun 5
1.2.2. Đc đim cấu to t bo x khun 5
1.2.3. Phân loi x khun 6
1.3. Phương php phân lp vi sinh vt sinh khng sinh 6
1.4. Tuyn chn, ci to, bo qun ging x khun 7
1.4.1. Chn chng c hot tnh cao nhờ sng lc ngu nhiên 7
1.4.2. Đt bin cải to ging 7
1.4.3. Bảo quản ging x khun 8
1.5. Lên men sinh tng hp kháng sinh 8
1.6. Chit tách v tinh ch sn phm 9
1.7. Một s phương pháp ph đ xác định cấu trúc kháng sinh 10
1.7.1. Ph hng ngoi (IR) 10
1.7.2. Ph tử ngoi (UV) 10
1.7.3. Khi ph (MS) 11

1.8. Một s nghiên cứu liên quan 11

1.8.1. Ti ưu ha thng kê ca qu trnh lên men đ tăng cường hot tính kháng sinh ca
Streptomyces sp.CS392. 11
1.8.2. Mt chng Streptomyces sp với nhiều đc đim mới hứa hẹn thúc đy sự phát
trin cúa nông nghiệp dch bệnh. 12
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13
2.1. Nguyên vt liệu, thit bị 13
2.1.1. Nguyên vt liệu 13
2.1.2. Máy móc, thit b, dng c 15
2.2. Nội dung nghiên cứu 15
2.3. Phương pháp thực nghiệm 16
2.3.1. Phương php nuôi cấy v gi ging 16
2.3.2. Đnh gi hot tnh khng sinh bng phương php khuch tn 16
2.3.3. Phương php xc đnh môi trường nuôi cấy thch hp 17
2.3.4. Phương php chn chng c hot tnh cao bng sng lc ngu nhiên 17
2.3.5. Phương php đt bin 18
2.3.6. Phương php lên men mẻ 19
2.3.7. Phương php xc đnh đ bền nhiệt, bền pH ca khng sinh trong dch lên men 20
2.3.8. Phương php chit khng sinh t dch lc bng dung môi hu cơ 20
2.3.9. Phương php tch khng sinh bng sc k 20
2.3.10. Phương php thu tinh th khng sinh tinh khit 22
2.3.11. Phương php xc đnh cấu trúc khng sinh tinh khit thu đưc 22
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 23
3.1. Kt qu quá trnh chn lc ngẫu nhiên 23
3.2. Kt qu đột bin ci to ging ln 1 24

3.3. Kt qu đột bin ci to ging ln 2 25
3.4.Kt qu ci to ging ln 3 bằng tác nhân hóa hc 27

3.5. Kt qu lên men sinh tng hp kháng sinh 28
3.6. Kt qu đánh giá nh hưởng của pH v nhiệt độ đn độ bn của kháng sinh
trong dịch lc 30
3.7. Kt qu chn dung môi chit xuất kháng sinh 31
3.8. Kt qu sắc ký lớp mỏng chn hệ dung môi 32
3.9. Kt qu sắc ký cột 33
3.10. Kt qu đo nhiệt độ nóng chy v sơ bộ xác định các nhóm chức đặc trưng
của kháng sinh thu đưc 40
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO














DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADN Acid 2’- deoxyribonucleic
CLNN Chn lc ngu nhiên
CW Thành t bào - Cell wall
DMHC Dung môi hu cơ
ĐB Đt bin

Gr Gram
IR Hồng ngoi - Infrared
KH Khoa hc
KS Kháng sinh
L-DAP L - diaminopimelat
MTdt Môi trưng dch th
MTth Môi trưng thích hp
TB T bào
TĐC Trao đổi cht
VK Vi khuẩn
VSV Vi sinh vt
UV T ngoi – Ultraviolet
B. subtilis Bacillus subtilis
P. mirabilis Proteus mirabilis
G(+) Gram dương
G(-) Gram âm
SK Sc ký


DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH
Bng 1: Phân loi cc cht khng sinh dựa theo cu trc ha hc.
Bng 2: Cc môi trưng nuôi cy x khuẩn.
Bng 3: Cc môi trưng kim đnh.
Bng 4: Cc dung môi đ s dụng.
Bng 5: Kt qu chn lc ngu nhiên Streptomyces 155.21.
Bng 6: Kt qu hot tính KS sau đt bin UV ln 1.
Bng 7: Kt qu hot tính KS sau đt bin UV ln 2.
Bng 8:Kt qu hot tính KS sau đt bin ha hc.
Bng 9: Kt qu chn môi trưng lên men.
Bng 10: Kt qu lên men ca cc dng chng, bin chng trên MT2dt.

Bng 11: Ảnh hưởng ca nhit đ đn đ bn ca khng sinh trong dch lc.
Bng 12: Ảnh hưởng ca pH đn đ bn ca KS sau 1 ngy v sau 5 ngy.
Bng 13: Kt qu chit khng sinh bằng 4 DMHC ở 5 pH khc nhau.
Bng 14: Kt qu SK lp mỏng chn h dung môi (hin hnh VSV bằng P.
mirabilis)
Bng 15: Kt qu th hot tính KS ca cc phân đon sau chy ct ln 1.
Bng 16: Kt qu SK lp mỏng cc phân đon 1-15 (hin hnh bằng P. mirabilis)
Bng 17: Kt qu th hot tính KS ca cc phân đon sau chy ct ln 2.
Bng 18: Kt qu SK lp mỏng cc phân đon 1-15 (hin hnh bằng P. mirabilis)
Bng 19: Kt qu th hot tính KS ca cc phân đon sau chy ct ln 3.
Bng 20: Kt qu SK lp mỏng cc phân đon 1-10 (hin hnh bằng P. mirabilis)
Bng 21: Kt qu th hot tính khng sinh sau chy ct ln 4.
Bng 22: Kt qu SK lp mỏng cc phân đon t 1-4 ( hin hnh bằng P.mirabilis).
Hình 1: Sơ đồ tổng qut sinh tổng hp khng sinh.



PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Bin chng Streptomyces 155.21 đưc cy zizag trên ng thch nghiêng
vo đĩa Petri cho vào t m v đĩa Petri cha bin chng Streptomyces 155.21 sau 6
ngày nuôi cy trong t m.
Phụ lục 2: Kt qu th hot tính kháng sinh bằng phương php khi thch và
phương php ging thch.
Phụ lục 3: Bnh lên men đưc đặt trong máy lc khi bt đu quá trình nhân ging
cp 1, bình nhân ging cp 1 và bình cha sn phẩm lên men khi kt thúc quá trình
lên men.
Phụ lục 4: Ct sc ký trong quá trình chy ct ln 1 và kt qu th hot tính kháng
sinh sau quá trình chy ct.
Phụ lục 5: Phổ MS cht kháng sinh KS1 phân lp đưc.

Phụ lục 6: Phổ UV cht kháng sinh KS1 phân lp đưc.
Phụ lục 7: Phổ IR cht kháng sinh KS1 phân lp đưc.





1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Tác dụng ca kháng sinh đưc phát hin vào tháng 10/1928 và Penicillin
đưc s dụng vo năm 1943, đ mở ra kỷ nguyên mi trong y hc lâm sàng và
ngành công ngh lên men sn xut kháng sinh.
Ngoi đưc s dụng trong dự phng v điu tr các bnh nhiễm khuẩn,
nhiễm nm, bnh ung thư cho ngưi, khng sinh cn đưc dng trong chăn nuôi,
trồng trt và trong công nghip thực phẩm. Do đưc s dụng tràn lan và không
đng cch nên tnh trng kháng kháng sinh ngày càng trở nên nghiêm trng.
Kháng sinh là lp hot cht hu ích có tác dụng sinh hc rt mnh, đưc
tổng hp t vi khuẩn, x khuẩn, vi nm hoặc t mt s thực vt bc cao. Ngày nay,
vi sự phát trin mnh mẽ ca sinh hc hin đi cùng sự h tr ca nhiu ngành
khoa hc khác giúp cho vic tìm kim và ng dụng khng sinh đt đưc nhng
thành tựu rực r. Con ngưi không chỉ tìm kim nhng chng vi sinh vt sinh
kháng sinh t tự nhiên mà còn ci to chúng bằng nhiu phương php như dng k
thut di truyn, công ngh gen, gây đt bin đnh hưng, chn dòng gen sinh tổng
hp Trong s hơn 15000 khng sinh hin nay đ đưc bit đn trên th gii thì
khong 60% là do x khuẩn to ra, trong đ khong 55% do chi Streptomyces sn
xut. Đây l chi x khuẩn ln, gồm nhiu vi sinh vt có kh năng sinh tổng hp
kháng sinh, mt s loài có kh năng sinh tổng hp các cht cha ung thư, điu tr
HIV Do đ, chi x khuẩn ny đang đưc trong nưc và th gii tp trung nghiên
cu.

Ti B môn Vi sinh- Sinh hc trưng ĐH Dưc Hà Ni, chng tôi đ chn
đ tài “Góp phn nghiên cứu lên men tng hp kháng sinh nhờ Streptomyces
155.21” vi các mục tiêu như sau:
- Nghiên cu ci to ging theo hưng tăng sinh tổng hp kháng sinh và lựa
chn môi trưng lên men thích hp ca chng Streptomyces 155.21.
- Nghiên cu mt vi đặc tính ca khng sinh đ sinh tổng hp đưc.
2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Đi cương v kháng sinh
1.1.1. Đnh ngha khng sinh
C rt nhiu đnh nghĩa khc nhau v khng sinh.
Theo đnh nghĩa kinh đin hẹp: Khng sinh l nhng hp cht ha hc do vi
sinh vt tit ra c tc dụng c ch sự pht trin hay tiêu dit mt cch chn lc mt
nhóm vi sinh v t xc đnh (vi khuẩn, nm, x khuẩn, protozoa, virus…) hay c t 
bo ung thư, ở nồng đ thp. [6]
Đnh nghĩa rng hơn: Khng sinh phi bao hm c  cc cht tổng hp bằng
ha hc c tc dụng dit khuẩn như cc dn cht quinolon (pefloxacin,
norfloxacin…).[7]
1.1.2. Phân loi khng sinh
C nhiu cch đ phân loi cc khng sinh : theo nguồn gc theo phổ tc
dụng (phổ rng hay chn lc), theo cơ ch tc dụng, theo cu trc ha hc…
Cc cht khng sinh đưc phân loi theo cu trc ha hc (bng 1)
Bng 1: Phân loi các chất kháng sinh dựa theo cấu trúc hóa hc [3]
Nhóm KS
KS cụ th
β- lactam
Penicillin, Cephalexin
Phenicol
Chloramphenicol

Aminosid
Streptomycin, Tobramycin
Macrolid
Erythromycin, Clarithromycin
Lincosamid
Lincomycin, Lindamycin
Tetracyclin
Tetracyclin, Doxycyclin
Peptid
Vancomycin, Polymycin
Quinolon
Floxacin, Levofloxacin
Cotrimoxazol
Cotrimoxazol
3

1.1.3. Sơ đ tng qut sản xuất kháng sinh
Hình 1 : Gii thiu sơ đồ tổng qut lên men sn xut khng sinh. [6]








Lc, ly tâm

Chit bằng dung môi hu cơ
Dng ct trao đổi ion…

Cô, tinh ch

Kim nghim

Đng gi


Hình 1: Sơ đ tng quát sn xuất kháng sinh



Sn phẩm tinh ch
Dch chit
Dch lc
Nhân ging trong thit b nhân ging
Nhân ging quy mô thí nghim
Ging x khuẩn lưu gi trong phng thí nghim
Sinh khi
Lên men tổng hp kháng sinh
Dch lên men
Dch chit sinh khi
Sn phẩm đ đưc kim nghim
Sn phẩm đng gi
4

1.1.4. ng dng ca khng sinh
 Trong lĩnh vực y hc: Khng sinh dng đ điu tr cc bnh do vi khuẩn, nm
gây ra. Ngày nay, mt s khng sinh cn đưc dng trong điu tr bnh ung thư (
mitoxantrone, actinomycin D……) [15]

 Ngoi lĩnh vực y hc: Khng sinh cn đưc s dụng trong cc lĩnh vực khc.
 Trong chăn nuôi: Khng sinh đưc dng đ điu tr cc bnh cho đng vt
(Griseoviridin tr bnh viêm phổi cp , viêm vú trâu , bò. Metimyxin hoặc
chloramphenicol dng điu tr cc bnh do Brucella gây ra…). Khng sinh đưc s
dụng như cht kích thích tăng trng đn gia sc, gia cm, gim chi phí thc ăn, kích
thích tăng sn lưng trng ở g, vt.
 Trong trồng trt : Đ x l ht , đt trồng. Ngâm ht ging trong dung dch
khng sinh trưc khi gieo đ kích thích ht n y mm v tiêu dit nm v cc VK
gây bnh cho cây trồng (validamycin, blastixidin, kasugamycin,…).
 Khng sinh dng trong công nghip thực phẩm : Thực phẩm đng hp dng
cht kháng sinh đ bo qun gip gim thi gian kh trng bằng nhit, nhit đ kh
trng gim xung lm cho cht lưng sn phẩm tt hơn , cc vitamin không b ph
hy, hương v ít b bin đổi (subtilin, nisin).[6]
1.2. Đi cương v x khun (Actinomycetes)
X khuẩn (Actinomycetes) thuc nhóm VK tht (Eubacteria) phân b rt
rng rãi trong tự nhiên. Chng c trong đt, nưc, rác, phân chuồng, bùn, thm chí
c trong cơ cht mà vi khuẩn và nm mc không phát trin đưc. Theo Waksman
trong 1 g đt có khong 29000 - 2400000 x khuẩn, chim 9 - 45% tổng s VSV.
X khuẩn l cc vi khu ẩn Gr(+), c tỷ l G +C >55% trong ADN, hiu khí,
hoi sinh, c cu to dng si phân nhnh.
X khuẩn c th sinh tổng hp đưc nhiu sn phẩm trao đổi cht quan trng
như kháng sinh, vitamin, acid hu cơ , cc enzym…nên đưc cc nh khoa h c
nghiên cu rt nhiu. [7]

5

1.2.1. Đc đim hnh thi x khun
H si ca x khuẩn chia thnh khuẩn ty cơ cht v khuẩn ty khí sinh. Khuẩn
ty cơ cht l khuẩn ty cơ bn cn k huẩn ty khí sinh pht trin mnh hay yu , thm
chí hu như không pht trin ty tng chi, tng loi.

Đưng kính khuẩn ty x khuẩn thay đổi t 0,3-1,0 µm đn 2-3 µm. Đa s
khuẩn ty x khuẩn không c vch ngăn . Mu sc khuẩn ty x khuẩn rt phong ph ,
c th gặp cc mu trng, vàng, xám, da cam, đen, đỏ, lục lam, nâu…Khuẩn ty cơ
cht c th tit vo môi trưng mt s loi sc t , c sc t tan trong nưc , c loi
phụ thuc pH, c loi chỉ tan trong dung môi hu cơ. Trong môi trưng đặc hiu, có
loi x khuẩn c th to ra sc t melanoid sm đen.
Khuẩn ty cơ cht pht trin mt thi gian th di ra trong không khí thnh cc
khuẩn ty khí sinh . Ngưi ta gi khuẩn ty khí sinh l khuẩn ty th cp đ phân bit
vi khuẩn ty sơ cp bt đu pht trin t cc bo t ny mm.
Khuẩn lc x khuẩn l tp hp mt nhm x khuẩn pht trin riêng rẽ. Khuẩn
lc x khuẩn thưng chc , xù xì, c dng da , dng vôi, dng nhung tơ hay dng
mng do, c cc np gp tỏa ra theo hnh phng x.
Đi vi cc x khuẩn thuc h Streptomycetaceae sau mt thi gian pht
trin trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xut hin cc chu i bo t. Cc chui bo t c
th mc đơn hay mc vng gồm cc hnh thi cơ bn như: thng, un cong, móc câu
- đơn hoặc kp, v xon l xo . Bo t trn ca h x khuẩn ny c cc hnh dng :
hnh cu, hnh bu dục, hnh trụ…B mặt b o t c th l nhn , sn sùi da cóc, có
gai hoặc c tc. [7]
1.2.2. Đc đim cấu to t bo x khun
X khuẩn c cu trc t bo tương tự VK Gr(+), c mt s khc bit sau:
 Thnh TB x khuẩn c kt cu dng lưi , dy khong 10-20 nm, c chc
năng duy tr hnh dng ca khuẩn ty v bo v t bào. Căn c vo thnh phn ha
hc thnh t bào x khuẩn đưc chia thnh 4 nhóm: CW1, CW2, CW3. CW4. Các
6

x khuẩn chi Streptomyces đưc xp vo nhm CW 1, thành t bào c cha L-DAP
và glycin.[7]
 Màng t bào cht ca x khuẩn dy khong 7,5-10 nm, c cu trc v chc
năng như ca vi khuẩn nói chung.
 Mezosom nằm ở phía trong ca t bào cht, có hình phi n, hnh bng hay

hnh ng. Mezosom lm tăng din tích tip xc ca mng t bào cht v qua đ lm
tăng hot tính enzym, tăng vn chuyn đin t…
 Cc vt th ẩn nhp trong t bào cht ca x khuẩn gồm c cc ht phosphat
(hnh cu, bt mu vi thuc nhum Sudan III ), cc ht polysacharid (bt mu vi
dung dch Lugol).[12]
1.2.3. Phân loi x khun
C nhiu kha phân loi x khuẩn đ đưc cc nh KH nghiên cu pht trin
đ phân loi x khu ẩn, phi k đn kha phân loi ca Waksman , kha phân loi
Krassilnhikov, kha phân loi ca Gauze…Cc kha phân loi chia lp x khuẩn
(Actinomycetes) thnh b Actinomycetales v cc VSV ging x khuẩn . B
Actinomycetales đưc c hia thnh cc h : Actinoplanaceae, Actinomycetaceae,
Streptomycetaceae, Micromonosporaceae, Nocardiaceae…[7]
Kha phân loi Streptomyces thuc chương trnh Streptomyces quc t (ISP)
do Shirling v Gotlieb đ xut năm 1970 đưc s dụng rng ri đ phân loi cc x
khuẩn thuc chi Streptomyces trong h Streptomycetaceae. Trong kha phân loi
này, cc đặc trưng phân loi đưc s dụng bao gồm : mu sc khuẩn lc, mu khuẩn
ty cơ cht , sc t melanoid , sc t ha tan , hnh dng chui bo t , b mặt bo t ,
kh năng tiêu thụ cc nguồn hydratcarbon.[13]
1.3. Phương pháp phân lp vi sinh vt sinh kháng sinh
Đ phân lp VSV sinh KS ngưi ta phi ly mu t cc nguồn cơ cht khc nhau :
đt ở rung, đt quanh rễ cây, đt nn ở chuồng gia sc, gia cm, bùn, nưc ở sông,
hồ…T cc mu trên đem phân lp thun khit nhng VSV sinh kháng sinh mà ta
7

mong mun bằng cc phương php đặc trưng v trên cc môi trưng chn lc
(MT1, MT2 đi vi x khuẩn). [6]
 Cc phương php phân lp x khuẩn:
 Phương php cy dch chit đt lên b mặt thch.
 Phương php cy đt trực tip lên b mặt thch đ cha VSV kim đnh.
 Phương php lm giu đt bằng VSV kim đnh.

 Phương php thêm KS vo trong MT phân lp.
1.4. Tuyn chn, ci to, bo qun ging x khun
VSV tổng hp KS phân lp đưc t cơ cht tự nhiên thưng c hot tính rt
thp. V vy đ thu đưc cc chng c kh năng siêu tổng hp khng sinh đưa vo
sn xut đi hỏi phi ci to , chn ging bằng cc phương php khc nhau v
nghiên cu điu kin nuôi cy thích hp.
1.4.1. Chn chng c hot tnh cao nhờ sàng lc ngu nhiên
Các VSV c sự đt bin tự nhiên vi tn s khong 10
-10
- 10
-5
trong ng
ging thun khit to ra cc bin chng khc nhau . Trong đ c bin chng c hot
tính khng sinh mnh hơn 20-30 % nhng c th khc. Cn phi chn ly c  th c
hot tính cao nht trong ng ging đ nghiên cu tip.[6]
1.4.2. Đt bin cải to ging
 Trong thực t vic chn lc ngu nhiên cc c th c hot tính cao chỉ đ
nghiên cu ban đu, chưa c gi tr p dụng vo sn xut. Đ thu đưc nhng chng
c kh năng siêu tổng hp kháng sinh cn p dụng phương php đt bin nhân
to.[6]
 Cc tc nhân gây đt bin bao gồm:
 Cc tc nhân ha hc : acid nitrơ (HNO
2
), ethylenimin (CH
2
NHCH
2
),
dimethyl sulfat ((CH3)
2

SO
4
), hydroxylamin (H
3
NO),…
 Cc tc nhân vt l : Ánh sáng UV, tia Rơnghen v cc bc x ion ha khc .
Kh năng gây đt bin c a nh sng UV phụ thuc vo cưng đ bc x , khong
cch chiu v thi gian chiu.
8

 Các tác nhân sinh hc: Các yu t di truyn vn đng : TnA, đon xen hay IS
(insertion sequene), phc hay gen nhy (tranposon).[18]
 Đ to ra cc bi n chng c hiu sut sinh tổng hp KS cao phi tin hnh
đt bin bc thang , kt hp vi cc ph ương php di truyn phân t như ti tổ hp
gi hu tính các gen, k thut to v dung hp TB trn.
Sau khi chu tc đng ca cc tc nhân đt bin , phn ln cc VSV cht . Trong
s cc bin chng sng st c bin chng c h iu sut sinh tổng hp KS tăng (đt
bin dương), c bin chng c hiu sut gim (đt bin âm). Cn chn lc ra nhng
bin chng c hiu sut sinh KS tăng cao, chn lc đ nghiên cu tip.[6]
1.4.3. Bảo quản ging x khun
Vic ci to thnh công chng VSV sẽ không c  nghĩa nu chng ging
không đưc bo qun tt đ c th sng st v duy tr cc tính trng thu đưc . Do
đ vic bo qun ging VSV l vic c  nghĩa ht sc quan trng. [19]
Cc phương php bo qun ging VSV c th k đn như : Bo qun lnh,
cy chuyn, làm khô, đông khô, đông lnh. [20]
1.5. Lên men sinh tng hp kháng sinh
Có 2 phương php lên men chính:
 Lên men b mặt : Trong phương php ny, vi sinh vt đưc nuôi cy trên b
mặt cơ cht rn, bn rn hoặc lỏng.
 Ưu đim: Thao tc đơn gin , dễ thực hin , dễ x l cục b , không đi hỏi

thit b phc tp.
 Nhưc đim: Kh cơ gii ha , tự đng ha, khó vô trùng, tn din tích, tn
nhân công, hiu sut s dụng trưng không gian thp, tiêu hao ln.[6]
 Lên men chìm: Vi sinh vt (hiu khí v k khí) đưc nuôi cy trong toàn b
môi trưng lỏng.
 Ưu đim: Dễ cơ gii ha, tự đng ha, dễ kim sot ton b qui trnh , tn ít
din tích, chi phí nhân lực thp, hiu sut qu trnh lên men cao.
 Nhưc đim: Đu tư trang thit b k thut ban đu ln.[10]
9

 Cc phương php lên men chm: Lên men m, lên men có bổ sung, lên men
bán liên tục, lên men liên tục.[15]
1.6. Chit tách v tinh ch sn phm
 Khng sinh l nhng sn phẩm trao đổi cht th cp . Ty theo đặc tính ca
loi m KS đưc tit vo môi trưng nuôi cy hay gi li trong TB . Đ thu ly cc
cht c đ tinh khit cao cn tm phương php chit tch thích hp.
 Mt s phương php chit tch, tinh ch thưng dng:[1]
 Phương php chit bằng dung môi hu cơ.
 Cc phương php sc ký (sc ký ct, sc ký lp mỏng,…).
 Phương php to phc kt ta.
 Chit xut:
Chit xut l phương php tch mt hoặc mt s cht ra khỏi hn hp. Đ l qu
trình phân b các cht gia hai pha không trn ln vào nhau: mt pha lỏng và mt
pha rn (cân bằng lỏng-rn) hoặc gia hai pha lỏng (cân bằng lỏng-lỏng, thưng
mt pha l nưc, pha còn li l dung môi c đ phân cực phù hp). [6]
 Phương php sc ký:
 Là mt nhm cc phương php ha l dng đ tách các cht riêng rẽ t mt
hn hp nhiu thành phn. Nguyên lý tách chung là mu phân tích đưc hòa tan
trong mt pha đng, đưc cho qua pha tĩnh mt cách liên tục và không hòa ln vi
n. Pha tĩnh đưc c đnh trên ct hay trên b mặt cht rn. Các cht tan là thành

phn ca mu sẽ di chuyn qua pha tĩnh vi tc đ khác nhau phụ thuc tương tc
gia pha tĩnh, pha đng và cht tan. Nh tc đ di chuyn khác nhau các thành phn
ca mu sẽ đưc tách riêng bit thành di trên sc ký đồ, lm cơ sở cho phân tích
đnh tính hay đnh lưng.[8]
 Cơ ch ca sự chia tách có th l cơ ch hp phụ, phân b, trao đổi ion, sàng
lc phân t hay sự phi hp đồng thi ca nhiu cơ ch tùy thuc vào tính cht ca
cht lm pha tĩnh v dung môi lm pha đng.
10

 Cc phương php sc k thưng dùng trong nghiên cu sinh tổng hp kháng
sinh:
- Sc ký lp mỏng (TLC): Pha tĩnh l cht hp phụ, đưc c đnh trên bn
mỏng (bn kính, bn nhôm, ). Pha đng là mt h dung môi đa thnh phn đưc pha
theo tỷ l. Pha đng di chuyn qua bn mỏng nh lực mao dn hoặc tc đng ca
trng lực. [17]
- Sc ký ra gii trên ct (CC): Pha tĩnh đưc gi trên ct, pha đng đi qua
pha tĩnh nh áp sut hoặc trng lực. Quá trình ra gii đưc thực hin bằng cách
thêm liên tục lưng mi ca pha đng.[9]
1.7. Một s phương pháp ph đ xác định cấu trúc kháng sinh
1.7.1. Ph hng ngoi (IR)
 Nguyên tc: Trong phân t khi có nhóm nguyên t no đ hp thụ năng
lưng v thay đổi trng thi dao đng thì to nên mt di hp thụ trên phổ IR.
 Phổ hồng ngoi l phương php đo sự hp thụ bc x hồng ngoi (IR) khi nó
đi qua mt lp cht cn th ở các s sóng khác nhau. Có mi tương quan gia nhóm
nguyên t và di hp thụ nên có th dựa vào sự có mặt ca di hp thụ đ nhn bit
mt nhóm chc no đ. Nhiu nhóm chc có các di phổ hp thụ đặc trưng, đây l
cơ sở ca vic phân tích cu trúc bằng phổ IR.[4]
1.7.2. Ph tử ngoi (UV)
 Nguyên tc: Quá trình hp thụ các bc x t ngoi gây ra bin đổi năng
lưng đin t ca phân t. Cc đin t ở trng thi cơ bn E

0
chuyn sang trng thái
kích thích E
1
, E
2
. Đưng cong biu diễn sự phụ thuc đ hp thụ bc x UV vào
bưc sóng hay s sóng là phổ t ngoi.[5]
 Các electron tham gia vào hiu ng này có th là các electron trong liên kt
đơn, liên kt bi, h thng thơm…, hay cặp electron tự do không tham gia liên kt
ca O, N, các halogen.[1]


11

1.7.3. Khi ph (MS
)
 Nguyên tc: Khi phổ là k thut đo trực tip tỷ s khi lưng v đin tích
ca ion (m/z) đưc to thành trong pha khí t phân t hoặc nguyên t ca mu.
Dng chm đin t c năng lưng trung bình (50-100eV) đ bn phá phân t hu
cơ ở chân không cao (10
-6
mmHg). Trong qu trnh đ cht hu cơ b ion hóa và b
phá v thành mnh. Các tín hiu thu đưc tương ng vi các ion sẽ th hin bằng
mt s vch (pic) c cưng đ khác nhau tp hp thành mt khi phổ đồ. [9]
 Nó cung cp thông tin đnh tính (khi lưng phân t, nhn dng các cht)
xc đnh cu trc v đnh lưng các cht.
1.8. Một s nghiên cứu liên quan
1.8.1. Ti ưu ha thng kê ca qu trnh lên men đ tăng cường hot tnh
khng sinh ca Streptomyces sp.CS392. [23]

Nghiên cu mt chng vi sinh vt đt mi đưc phân lp là Streptomyces
sp. CS392 cho thy n c hot tính khng sinh trên mt s vi khuẩn Gr(+) như
Staphylococcus aureus và Enterococcus. Hot tính kháng sinh ca cc chng đưc
ti ưu hóa bằng cch s dụng mt chương trnh ti ưu ha thng kê đa bin, hai giai
đon dựa trên phương php lên men b mặt ở quy mô phng thí nghim. Nhiu
thnh phn dinh dưng ca dch lên men đ đưc ti ưu ha cng nhau trong giai
đon đu tiên, trong khi cc điu kin nuôi cy lên men đưc ti ưu ha trong giai
đon tip theo. Dựa trên mô hnh thực nghim bt nguồn t khung ti ưu ha thng
kê hai giai đon, hot tính khng sinh đ tăng thêm 39,79% vi cc thông s ti ưu
ca qu trnh lên men: thnh phn cht dinh dưng ti ưu: 29,82g glucose, 7,6g
peptone, 4,678g MgCl
2
và 0,5005g / l axit casamino v điu kin lên men ti ưu:
Thi gian lên men 47,55 h;  nhit đ 29,15°C và pH 8,36.
Đây l hưng nghiên cu mở ra cho vic nghiên cu sâu v chng
Streptomyces 155.21 sau này đ tăng cưng hot tính khng sinh bằng quy trnh ti
ưu ha thnh phn dinh dưng v điu kin tham gia qu trnh lên men.
12

1.8.2. Mt chng Streptomyces sp. với nhiều đc đim mới hứa hẹn thúc đy
sự pht trin cúa nông nghiệp dch bệnh. [22]
Chng x khuẩn Streptomyces sp. CIMAP-A1 đưc phân lp t rễ Phong l
và đ đưc xc đnh bằng các đặc đim hình thái, sinh lý, sinh hóa và phân tích gen
(trình tự gen 16S rDNA). Theo sơ đồ cây di truyn, chng CIMAP-A1 có mi liên
h chặt chẽ nht vi x khuẩn S. vinacendrappus, bin chng NRRL-2363 (trùng
khp 99% trình tự gen). Qua nghiên cu in-vitro chng CIMAP-A1 có hot tính
kháng sinh tim năng chng li nhiu loi nm thực vt như Stemphylium sp,
Botrytis cinerea, Sclerotina sclerotiorum, Colletotrichum spp, Curvularia spp,
Corynespora casicola, Thielavia basicola. Các cht chuyn hóa trung gian ngoi
bo đưc to ra bởi chng trong dch lc lên men c ch đng k sự ny mm bào

t, phát trin ca ng mm ca các bào t ny mm và quá trình phát trin xuyên
tâm ca Alternaria alternata, Colletotrichum acutatum, Curvularia andropogonis
và Fusarium moniliforme. Vic chit xut t dch lc lên men vi các dung môi và
lc bằng phương php VLC và phương php PTLC đ tch đưc mt lưng nhỏ ca
10 hp cht có hot tính chng li nhiu loi nm gây bnh trên thực vt. Bin
chng có th to ra siderophores và axit indole-3-acetic. Cng nghiên cu này cho
thy chng CIMAP-A1 đ tăng cưng sự tăng trưởng và sn xut sinh khi ca
Phong l. Nó đ lm tăng 11,3% sinh khi chồi tươi ca Phong l và 21,7% sn
lưng du cn thit.
T nghiên cu này cho thy có th s dụng x khuẩn đ tăng cưng sc đ
khng cng như tăng năng sut thu hoch cho mt s thực vt. Đây l mt gi ý mở
ra cho vic trồng cây không dùng thuc tr sâu cng như thuc kích thích tăng
trưởng, gim gi thnh đồng thi nâng cao đưc sc khỏe cho con ngưi.



13

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vt liệu, thit bị
2.1.1. Nguyên vt liệu
 Chng x khuẩn nghiên cu: Chng x khuẩn Streptomyces 155.21 đ đưc
phân lp và hin nay đưc lưu gi ti B môn Vi sinh - Sinh hc, trưng Đai hc
Dưc Hà Ni.
 Ging VSV kim đnh: Các chng VSV kim đnh do B môn Vi sinh - Sinh
hc, trưng Đi hc Dưc H Ni cung cp.
Vi khuẩn Gram(+): Bacillus subtilis ATCC 6633
Vi khuẩn Gram(-): Proteus mirabilis BV 108
 Môi trưng nuôi cy: Gồm các môi trưng nuôi cy x khuẩn (Bng 2), môi
trưng nuôi cy VSV kim đnh (Bng 3)

Bng 2: Các môi trường nuôi cấy x khun
MT
Thnhphn
MT1 MT2 MT5
Tinh bt
2
2
2,4
Glucose


1
Cao tht


0,3
Pepton


0,3
KNO
3

0,1


KCl

0,05

NaNO
3


0,2

CaCO
3


0,4
K
2
HPO
4

0,05
0,1

MgSO
4
.7H
2
O
0,05
0,05

NaCl
0,05

Thch
1,8
2
2
Nưc my (ml)
100
100
100
pH
6,8-7,2

14

Bng 3: Các môi trường nuôi cấy VSV kim định
Thnh phn
MT
NaCl Cao tht Pepton Thch
Nưc
(ml)
pH
Canh thang 0,5 0,3 0,5 0 100
7,0-7,4
Thch thưng 0,5 0,3 0,5 1,6-1,8 100
Chú thích: - Đơn v tính theo gram.
- Tit khuẩn môi trưng bằng hơi nưc ở 120°C/20 phút.
- Cc môi trưng lên men dch th  (MTdt): thnh phn tương ng như
môi trưng nuôi cy x khuẩn nhưng không c thch.
 Dung môi s dụng (Bng 4) đưc mua ti các công ty hóa cht đt tiêu chuẩn
phân tích.

Bng 4: Các dung môi đã sử dụng
Dung môi Khi lưng riêng (g/ml) Nhit đ sôi (°C)
Aceton 0,79 56
Acetonitril 0,782-0,783 80-82
n-Butanol 0,81 116-118
Butylacetat 0,880-0,885 117-118
Dicloromethan 1,32 40
Dimethylformamid 0,95 153
Ethanol 0,789-0,791 78,3
Ethylacetat 0,889-0,901 70,4
NH
4
OH 25% 0,880 37,7 (25%)
Methanol
0,791-0,793
64,5
Triethylamin 0,726-0,728 90
n-Hexan 0,654 69
15

 Sc ký lp mỏng (TLC) đưc thực hin trên bn mỏng tráng sn DC-
Aluofolien 60 F
254
(Merck). Sc ký ct (CC) đưc tin hành vi cht hp phụ là
silica gel (Merck), c ht 0,040 – 0,063 mm.
2.1.2. Máy móc, thit b, dng c
- Tc nhân gây đt bin: nh sng UV (λ=254nm), nguồn Toshiba 60W, 220V.
- Máy lc Taitec Bio – Shaker BR 300 Lf.
- T m Memmert, Binder; T sy SL shellab.
- T lnh Samsung; Lò vi sóng Whirlpool.

- Nồi hp vô trùng Hirayama Model HL303; T cy vô trùng Aura VF 48.
- Cân k thut Sartorius TE 210; Cân phân tích Sartorius BP 121 S.
- Máy ct quay Buchi R220, bơm chân không Waterbath B480.
- Kính hin vi đin t.
- Thưc kẹp Palmer đ chính xác 0,02mm.
- Hp Petri đưng kính 9cm.
- My đo nhit đ nóng chy E2-Melt.
- Các dụng cụ khc như: Buret, bình chit, patuyn, pipet các loi, ng nghim,
bình nón, ng đong, cc có mỏ các loi, nút thy tinh, bông gc, giy lc, que cy,
giy th pH, đn cồn, đa thy tinh, kim mi mc,…
2.2. Nội dung nghiên cứu
 Chn lc, cải to ging
- Tin hành sàng lc ngu nhiên, lựa chn 3 dng chng có HTKS cao nht.
- Đt bin bằng ánh sáng UV kt hp bằng tác nhân hoá hc t 2 đn 3 ln đ
nâng cao kh năng sinh tổng hp kháng sinh ca chng x khuẩn gc.
 Lên men, chit tách kháng sinh
- T 3 MT lên men b mặt tt nht, chn 1 MT lên men chìm tt nht.
16

- Thực hin lên men t các dng chng và bin chng thu đưc, lựa chn bin
chng (dng chng) có kh năng lên men to kháng sinh mnh nht.
- Tìm pH và dung môi hu cơ chit xut dch lc ca dch lên men tt nht.
- Tìm h dung môi khai trin có kh năng tch hn hp kháng sinh tt nht.
- Tách, tinh ch kháng sinh t dch chit dung môi hu cơ
 Sơ b xc đnh mt s tính chất ca khng sinh thu đưc
- Xc đnh nhit đ nóng chy.
- Đo phổ IR, phổ UV, phổ MS.
2.3. Phương pháp thực nghiệm
2.3.1. Phương php nuôi cấy v gi ging
Chng Streptomyces 155.21 đưc cy zigzag trên ng thch nghiêng , cho

vo t m 28-30
0
C. Sau 6-10 ngy chng pht trin tt , cho cc ng ging vo t
lnh bo qun ở 2-4
0
C, đnh k 3-6 thng cy chuyn.
2.3.2. Đnh gi hot tnh khng sinh bng phương php khuch tn
 Nguyên tc: Cht khng sinh khuch t n vo môi trưng dinh dưng đặc đ
cy VSV kim đnh, to cc vng c ch VSV gi l vng vô khuẩn.
 Tin hnh:
 To hn dch VSV: Ly 1 vng que cy VSV kim đnh cy vo 2,5 ml môi
trưng canh thang, đ vo t 37
0
C trong 18-24h (đi vi vi khuẩn).
 Cy hn dch VSV vo môi trưng thch thưng đ tit khuẩn v đ ngui v
45-50
0
C vi tỉ l 2,5:100 (v:v). Lc đu, đổ vo cc đĩa Petri vô trng.
 Đưa mu th vo môi trưng kim đnh:
Có 3 phương php:
- Phương php khi thch: Đặt cc khi thch Φ=6,0 mm có VSV sinh kháng
sinh lên b mặt thch đ cy VSV kim đnh.
- Phương php ging thch (dùng cho mu dch lc nưc): Đục cc ging
thch Φ=6,0 mm trên môi trưng đ cy VSV kim đnh , nhỏ 0,05 ml mu th vo
mi ging thch.