Góp phần nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ streptomyces 155.29

B Y T
TRƯNG ĐI HC DƯC H NI



LÊ HỮU NGHỊ

GÓP PHẦN NGHIÊN CU LÊN MEN
TNG HP KHNG SINH NH
STREPTOMYCES 155.29

KHA LUN TT NGHIP DƯC S





H NI - 2013

B Y T
TRƯNG ĐI HC DƯC H NI




LÊ HỮU NGHỊ



GÓP PHẦN NGHIÊN CU LÊN MEN

TNG HP KHNG SINH NH
STREPTOMYCES 155.29

KHA LUN TT NGHIP DƯC S

Ngưi hưng dn: TS. Bùi Quang Phúc
ThS. Lê Thị Thu Hương

Nơi thc hin: B môn Vi sinh& Sinh hc
Trưng Đại hc Dưc H Ni
Viện sốt rét -KST-CT TW



H NI - 2013



LI CẢM ƠN

Tôi xin gi li cm ơn sâu sc nht đn Thạc sĩ Lê Thị Thu Hương và Tin sĩ
Bùi Quang Phúc đ tn tnh hưng dn tôi t nhng bưc đu tiên cho đn khi tôi
hoàn thin kha lun này.
Tôi xin chân thành cm ơn cc thy cô gio , cc cn b, k thut viên ging
dạy, công tc tại B môn Vi sinh - Sinh hc, B môn Công nghip dưc trưng Đại
hc Dưc Hà Ni, Vin sốt rét KST-CT TW đ gip đ tôi trong thi gian làm thc
nghim.
Cũng nhân dịp này tôi cũng xin gi li cm ơn đn Ban gim hiu cng toàn
th cc thy cô gio trưng Đại hc Dưc Hà N i đ dạy d và tạo mi điu kin
thun li cho tôi trong thi gian tôi hc tp tại trưng.

Và cuối cng là li cm ơn tôi gi ti gia đnh và bạn b đ đng viên , giúp
đ tôi trong suốt thi gian thc hin kha lun.
Do thi gian làm thc nghim cũng như kin thc ca bn thân c hạn , khóa
lun này cn c nhiu thiu st . Tôi rt mong nhn đưc s gp  ca cc thy cô ,
bạn b đ kha lun đưc hoàn thin hơn.
Tôi xin chân thành cm ơn!


Hà Ni, ngày 15, tháng 5, năm 2013
Sinh viên

Lê Hu Nghị


MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG I: TNG QUAN 2
1.1. Đại cương về kháng sinh 2
1.1.1. Định nghĩa kháng sinh 2
1.1.2. Phân loại kháng sinh 2
1.1.3. Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh 3
1.1.4. Cơ chế tác dụng của kháng sinh 4
1.1.5. Khái nim về tính kháng kháng sinh 5
1.1.6. Các ứng dụng của kháng sinh 5
1.2. Đại cương về xạ khuẩn 6
1.2.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn 6
1.2.2. Phân loại xạ khuẩn 6
1.2.3. Đặc điểm của xạ khuẩn chi streptomyces 7
1.3. Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn 8

1.3.1. Mục đích 8
1.3.2. Chọn chủng có HTKS cao bằng phép chọn lọc ngu nhiên 8
1.3.3. Đột biến cải tạo giống 8
1.3.4. Bảo quản giống xạ khuẩn
9
1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 9
1.4.1. Khái nim lên men 9
1.4.2. Các phương pháp lên men 10

1.4.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 11
1.5. Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men 11
1.5.1. Mục đích 11
1.5.2. Các phương pháp chiết tách 12
1.6. Bưc đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh 13
1.6.1. Phổ hồng ngoại 13
1.6.2. Phổ tử ngoại 13
1.6.2. Phổ khối 13
1.7. Một số nghiên cứu liên quan 14
1.7.1. Quy định phân tử của sinh tổng hợp kháng sinh trong
Streptomyces 14
1.7.2. Một chủng đầy hứa hẹn của streptomyces sp. vi những đặc
điểm thúc đẩy tăng trưởng và quản lý dịch bnh trong nông nghip
14
1.7.3. Nghiên cứu mi trong sản xuất kháng sinh từ S. hygroscopius
D1.5 15
CHƯƠNG II: ĐI TƯNG V PHƯƠNG PHP NGHIÊN CU 16
2.1. Nguyên vật liu, thiết bị 16
2.1.1. Nguyên vật liu 16
2.1.2. Máy móc thiết bị
18

2.2. Nội dung nghiên cứu 19
2.2.1. Chọn lọc, cải tạo giống 19
2.2.2. Lên men, chiết tách kháng sinh tối thích 19
2.2.3. Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được 20

2.3. Phương pháp thc nghim 20
2.3.1. Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn 20
2.3.2. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán
20
2.3.3. Sàng lọc ngu nhiên 21
2.3.4. Đột biến 22
2.3.5. Lên men chìm tổng hợp kháng sinh 23
2.3.6. Xác định độ bền của kháng sinh trong dịch lên men 24
2.3.7. Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ 24
2.3.8. Tách các thành phần trong kháng sinh bằng sắc ký lp
mỏng 25
2.3.9. Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay 26
2.3.10. Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột 26
2.3.11. Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được 26
CHƯƠNG III: KT QUẢ THỰC NGHIM VÀ NHN XÉT 27
3.1. Kết quả sàng lọc ngu nhiên 27
3.2. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1 27
3.3. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2
28
3.4. Kết quả đột biến cải tạo giống bằng phương pháp hóa học 29
3.5. Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh 30
3.5.1. Kết quả chọn môi trưng lên men chìm 30
3.5.2. Kết quả chọn chủng lên men 31
3.6. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của pH và nhit độ đến độ bền của
kháng sinh trong dịch lọc 32

3.7. Kết quả chọn dung môi và pH chiết 33
3.8. Kết quả sắc ký lp mỏng chọn h dung môi 34
3.9. Kết quả sắc ký cột 34
3.10. Kết quả đo nhit độ nóng chảy và bin giải phổ xác định sơ bộ
các nhóm chức đặc trưng của kháng sinh thu được 36
KT LUN VÀ KIN NGHỊ 37

DANH MỤC CÁC CHỮ VIT TẮT


ADN Acid 2’- deoxyribonucleic
CW Thành t bào- Cell wall
DMHC Dung môi hu cơ
ĐB1 Đt bin 1
ĐB2 Đt bin 2
Gr Gram
IR Hồng ngoại- Infrared
ISP Chương trnh Streptomyces quốc t- International Streptomyces
Project
KS Kháng sinh
MS Phổ khối- Mass Spectrometry
MT Môi trưng
MT2dt Môi trưng dịch th 2
SLNN Sàng lc ngu nhiên
TB T bào
TĐC Trao đổi cht
VK Vi khuẩn
VSV Vi sinh vt
UV T ngoại- Ultraviolet

DANH MỤC CÁC BẢNG


Bng 1: Phân loại các cht kháng sinh da theo cu trúc hóa hc.
Bng 2.1: Cc vi khuẩn kim định.
Bng 2.2: Cc MT nuôi cy xạ khuẩn.
Bng 2.3: Các MT nuôi cy VSV kim định.
Bng 2.4: Cc dung môi đ s dụng.
Bng 3.1: Kt qu th HTKS sàng lc ngu nhiên.
Bng 3.2: Kt qu th HTKS đt bin ln 1.
Bng 3.3: Kt qu th HTKS đt bin ln 2
Bng 3.4: Kt qu th HTKS đt bin hóa hc.
Bng 3.5: Kt qu chn môi trưng lên men (trên P.mirabilis).
Bng 3.6: Kt qu chn chng lên men chìm.
Bng 3.7: Ảnh hưởng ca pH đn đ bn kháng sinh (trên P.mirabilis).
Bng 3.8: Ảnh hưởng ca nhit đ đn đ bn kháng sinh (trên P.mirabilis).
Bng 3.9: Kt qu chn dung môi và pH chit (trên P.mirabilis ).
Bng 3.10: Kt qu chn h dung môi chạy sc ký.
Bng 3.11: Kt qu chạy sc kí ct ln 1 (trên P.mirabilis ).
Bng 3.12: Kt qu chạy sc kí ct ln 2 (trên P.mirabilis ).
Bng 3.13: Phổ IR.


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1: Sơ đồ tổng qut sinh tổng hp sn xut kháng sinh.
Hình 2: Khuẩn lạc xạ khuẩn.
Hình 3: Sơ b phân loại xạ khuẩn.
Hình 4: Đưng cong sinh trưởng phát trin ca xạ khuẩn.
Hình P1: Th HTKS bằng phương php khối thạch.
Hình P2: Th HTKS bằng phương php ging thạch.
Hình P3: Th HTKS bằng phương php khoanh giy lc.
Hình P4: Phát hin vt sc ký bằng phương pháp hin hình VSV.
Hình P5: Tinh ch kháng sinh bằng sc ký ct.
Hình P6: Phổ t ngoại ca kháng sinh.
Hình P7: Phổ hồng ngoại ca kháng sinh.
Hình P8: Phổ khối (MS).


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Lưng thuốc kháng sinh mà các quốc gia trên th gii s dụng trong thi gian qua đ
tăng mạnh. Dù B Y t ca nhiu quốc gia đ ban hành nhng quy định cụ th nhằm hạn
ch vic lạm dụng thuốc khng sinh nhưng thị trưng thuốc kháng sinh ca th gii vn
liên tục phát trin. Thị trưng thuốc kháng sinh ca Vit Nam không nằm ngoài quy lut
này.
Nhu cu s dụng cao dn đn vic s dụng kháng sinh tràn lan, khó kim sot đ dn
đn tình trạng kháng thuốc ca các vi sinh vt gây bnh, thuốc kháng sinh mt dn tác
dụng đang ngày trở nên nghiêm trng, trong khi lại có quá ít các loại thuốc thay th. Vì
vy vic nghiên cu tìm ra kháng sinh mi, các kháng sinh có hoạt tính cao, đc tính
thp, ít bị kháng khuốc là vn đ đưc các nhà khoa hc trên th gii và trong nưc quan
tâm.
Hin nay xu hưng trên th gii là tìm kim kháng sinh mi có nguồn gốc t vi sinh
vt, như tm kim kháng sinh mi dưi lng đại dương ca các nhà khoa hc Scotland,

hay t các loài nm rng ca các nhà khoa hc M và Hà Lan,…hay là t chi xạ khuẩn
Streptomyces loài vi sinh vt thưng sống ở đt, chng cũng sn xut hơn mt na số
thuốc kháng sinh ca th gii và đ là nhng sn phẩm có giá trị ln trong lĩnh vc y t
(như : thuốc kháng sinh, thuốc chống nm, thuốc chống ung thư, thuốc c ch miễn
dịch,…) . Chính vì vy, chúng tôi la chn đ tài: “Góp phần nghiên cứu lên men tổng
hp kháng sinh nh Streptomyces 155.29” làm khóa lun tốt nghip. Khóa lun mong
muốn đạt đưc các mục tiêu sau đây:
- Nghiên cu các bin pháp nâng cao hiu sut sinh khng sinh thu đưc.
- Nghiên cu điu kin nuôi cy, lên men, chit tách kháng sinh tối thích.
- Nghiên cu mt vài đặc tính ca khng sinh đ sinh tổng hp đưc.






2

CHƯƠNG I: TNG QUAN
1.1. Đại cương về kháng sinh
1.1.1. Định nghĩa kháng sinh [18], [21], [22]
Có nhiu định nghĩa khc nhau v khng sinh.
Theo nghĩa hẹp: Kháng sinh là nhng hp cht ha hc do vi sinh vt tit ra c tc
dụng c ch s pht trin hay tiêu dit mt cch chn lc mt nhm vi sinh v t xc định
(vi khuẩn, nm, xạ khuẩn, protozoa, virus…) hay c t bào ung thư, ở nồng đ thp.
Theo nghĩa rng: Khng sinh phi bao hàm c cc cht tổng hp bằng ha hc c
tc dụng dit khuẩn như cc dn cht quinolon (pefloxacin, norfloxacin…).
Cn phân bit mt số cht cũng do vi sinh vt tạo ra nhưng không đưc gi là
khng sinh (rưu ethylic, các acid hu cơ, …) v chng tc dụng lên vi sinh vt khác
không mang tính chn lc và ở nồng đ cao.

1.1.2. Phân loại kháng sinh [2], [3], [4], [8]
C nhiu cch khc nhau đ phân loại cc khng sinh : Phân loại theo nguồn gốc
(khng sinh c nguồn gốc t nhiên , khng sinh bn tổng hp ), theo phổ tc dụng (phổ
rng hay chn lc), theo cơ ch tc dụng (c ch tổng hp vch t  bào, tc dụng lên qu
trnh tổng hp protein, c ch tổng hp acid nhân, thay đổi tính thm màng t bào, c ch
tổng hp acid folic), theo cu trc ha hc…
Song cch phân loại KS theo cu trc ha hc là khoa h c nht v n gip cho cc
nhà nghiên cu nhanh chng định hưng đưc cc đặc đim ca cht khng sinh mi
pht hin khi bit đưc công thc hóa hc ca n.
Cc cht khng sinh đưc phân loại theo cu trc ha hc (bng 1).




3



Bảng 1: Phân loại các chất kháng sinh da theo cấu trúc hóa học
Phân loại
Nhóm kháng sinh
Khng sinh cụ th

1. KS c cha đưng trong
phân t
Aminoglycosid
Streptomycin, neomycin
Orthosomycin
Everninomycin
N-glycosid

Streptothrinin
C-glycosid
Vancomycin
Glycolipid
Moenomycin

2. KS cha vng lacton ln
(macrocyclic lacton)
KS macrolid
Erythromycin
KS polyen
Candicidin, nystatin
Asamycin
Rifamycin
Macrotetrolid
Tetralactin

3. Quinon và các KS cùng
h
Anthracyclin
Adriamycin
Naphthoquinon
Actinortidin
Benzoquinon
Mitomycin
Các tetracyclin
Tetracyclin, terramycin


4. Các KS amino acid và

peptid
Dn xut aminoacid
Cycloserin
KS β-lactam
Penicilin, cephalosporin
KS peptid
Bacitracin, polymycin
Chromopeptid
Actinomycin
Depsipeptid
Valinomycin
5. KS dị vng cha N
Các KS nucleotid
Polyoxin
6. KS dị vng cha O
Các KS polyether
Mononsin
7. Cc KS nhân thơm
Dn xut benzen
Chloramphenicol
Cc ether thơm
Novobiocin
1.1.3. Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh [3], [8], [21]
Cc bưc cơ bn trong quá trình lên men sn xut kháng sinh t xạ khuẩn đưc
th hin trong hnh 1 dưi đây.

4

Lc, ly tâm

Chit bằng dung môi hu cơ
Dng ct trao đổi ion…

Cô, tinh ch

Kim nghim

Đng gi


Hình 1: Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp sản xuất kháng sinh
1.1.4. Cơ chế tác dụng của kháng sinh [16], [22]
Các kháng sinh tác dụng ch yu qua vic c ch các phn ng tổng hp khác
nhau ca t bào vi sinh vt gây bnh bằng cách gn vào các vị trí chính xác hay các phân
Sn phẩm tinh ch
Dịch chit
Dịch lc
Nhân giống trên thit bị nhân giống

Nhân giống trong phng thí nghim
Giống truyn  trong phng thí nghim
Sinh khối
Lên men tạo khng sinh
Dịch lên men
Dịch chit sinh khối
Sn phẩm đ đưc kim nghim
Sn phẩm đng gi

5

t đích ca t bào vi sinh vt, làm bin đổi các phn ng đ. Mi nhóm kháng sinh tác
dụng lên cc đích khc nhau. C 6 kiu ch yu:
• Tác dụng lên vic tổng hp thành t bào
• Tác dụng lên màng nguyên sinh cht
• Tác dụng lên s tổng hp ADN
• Tác dụng lên s tổng hp protein
• Tác dụng lên s trao đổi hô hp
• Tác dụng lên s trao đổi cht trung gian
1.1.5. Khái nim về tính kháng kháng sinh [22]
Kháng thuốc là hin tưng vi sinh vt mt đi tính nhạy cm ban đu ca nó trong
mt thi gian hay vĩnh viễn vi tác dụng ca kháng sinh hay hóa trị liu.
Có 2 kiu kháng thuốc: kháng thuốc t nhiên và kháng thuốc mi nhn. Kháng
thuốc t nhiên là đặc trưng ca tng nòi sinh vt nht định đối vi mt số kháng sinh
nht định nào đ. Khng thuốc mi nhn có th do thay đổi tính thm thành t bào, do
các enzyme vô hiu ha khng sinh, thay đổi phân t đích hoặc do hoạt hóa các con
đưng trao đổi cht thay th khác mà hoạt cht không tác dụng.
1.1.6. Các ứng dụng của kháng sinh [8], [21]
• Trong lĩnh vc y hc : Khng sinh dng đ điu trị cc bnh do vi khuẩn , nm
gây ra. Ngày nay, mt số khng sinh cn đưc dng trong điu trị bnh ung

thư.
• Ngoài lĩnh vc y hc, khng sinh cn đưc s dụng rng rãi trong nhiu lĩnh
vc khác nhau:
- Trong chăn nuôi: Bc sĩ th y dng khng sinh đ cha bnh cho đng vt:
Griseoviridin điu trị viêm phổi cp, viêm vú cho trâu bò… Kháng sinh
cn đưc s dụng như cht kích thích tăng trng đàn gia sc, gia cm, gim
chi phí thc ăn, tăng sn lưng trng ở gà, vịt.
- Trong trồng trọt: Khng sinh đưc s dụng đ dit nm, vi khuẩn, virus
gây bnh cho cây trồng: Validamycin dng đ dit nm Rhizostonia solani
gây bnh khô vằn hại lúa rt hiu qu.

6

- Trong công nghiệp thực phẩm: Khng sinh đưc dng đ bo qun thc
phẩm nh tác dụng tiêu dit vi sinh vt có trong thc phẩm: kháng sinh
subtilin (do Bacillus subtilis tạo ra), nisin (do Bacillus licheniformis tạo ra).

1.2. Đại cương về xạ khuẩn [4], [5], [9], [22]
Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuc nhóm vi khuẩn tht (Eubacteria) phân bố rng
rãi trong t nhiên, là các vi khuẩn Gram dương, c tỷ l G+C>55%. Trong mi gam đt
ni chung thưng có cha hàng triu xạ khuẩn. Đại đa số các xạ khuẩn là các vi sinh vt
hiu khí, hoại sinh, có cu tạo si dạng phân nhánh. Do có th sinh tổng hp đưc nhiu
sn phẩm trao đổi cht quan trng nên các xạ khuẩn đưc các nhà khoa hc quan tâm
nghiên cu rt nhiu.
Trong số hơn 16.000 kháng sinh hin đ đưc bit trên th gii thì khng 60% là
do xạ khuẩn tạo ra. Xạ khuẩn cn đưc s dụng đ sn xut nhiu loại enzyme (amylase,
celllulase, protease…), cũng như cc hp cht khác.
1.2.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn [22]
Xạ khuẩn thuc nhóm các vi khuẩn tht nhưng pht
trin thành dạng si, h si ca xạ khuẩn chia thành khuẩn

ty cơ cht và khuẩn ty khí sinh. Khuẩn lạc xạ khuẩn khá
đặc bit: không trơn ưt như vi khuẩn, nm men mà
thưng có dạng thô ráp, dạng phn, không trong suốt, có
các np gp tỏa ra theo hình phóng xạ. (Hình 2)

Đưng kính khuẩn ty xạ khuẩn thay đổi trong
khong 0,3-1,0 μm đn 2-3 μm. Đa số khuẩn ty xạ khuẩn không c vch ngăn. Màu sc
khuẩn ty xạ khuẩn ht sc phong ph: da cam, đen, đỏ, nâu, trng, vàng, xám…
1.2.2. Phân loại xạ khuẩn [6], [22]
C nhiu kha phân loại xạ khuẩn đ  đưc cc nhà KH nghiên cu pht trin đ
phân loại xạ khuẩn , phi k đn kha phân loại ca Waksman , kha phân loại
Krassilnhikov, kha phân loại ca Gauze…Cc kha phân loại chia lp xạ khuẩn
(Actinomycetes) thành b Actinomycetales và cc VSV giống xạ khuẩn . B
Hình 2: Khuẩn lạc xạ khuẩn

7

Actinomycetales đưc chia thành cc h : Actinoplanaceae, Actinomycetaceae,
Streptomycetaceae, Mocromonosporaceae, Nocardiaceae…
Xạ khuẩn đưc phân loại sơ b theo hình 3.



Khóa phân loại Streptomyces thuc chương trnh Streptomyces quốc t (ISP) do
Shirling và Gotlieb đ xut năm 1970 đưc s dụng rng ri đ phân loại cc xạ khuẩn
thuc chi Streptomyces trong h Streptomycetaceae. Trong kha phân loại nà y, cc đặc
trưng phân loại đưc s dụng bao gồm : màu sc khuẩn lạc, màu khuẩn ty cơ cht , sc tố
melanoid, sc tố ha tan , hnh dạng chui bào t , b mặt bào t , kh năng tiêu thụ cc
nguồn carbon.
1.2.3. Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces [5], [7], [22]

Các loại xạ khuẩn thuc Streptomyces có kh năng tạo ra nhiu kháng sinh có cu
trúc phc tạp. Trong tổng số cc khng sinh đ đưc tìm thy do xạ khuẩn tổng hp thì
có ti 55% là t Streptomyces.
Đặc điểm hình thái: H si ca xạ khuẩn gồm có khuẩn ty cơ cht và khuẩn ty khí
sinh:
Khuẩn ty cơ cht: Mc sâu vào môi trưng nuôi cy, không phân ct trong suốt
quá trình phát trin, b mặt nhẵn hoặc sn sùi, có th tit ra môi trưng mt số loại sc tố,
có sc tố tan trong nưc, có sc tố chỉ tan trong dung môi hu cơ.
Actinomycetes
VSV giống xạ khuẩn
Actinomycetales
Actinoplanaceae
Streptomycetaceae
Actinomycetaceae
…
Streptomyces
Streptoverticulum
Themostreptomyces
…
Hình 3: Sơ bộ phân loại xạ khuẩn

8

Khuẩn ty khí sinh: Do khuẩn ty cơ cht phát trin dài ra trong không khí. Sau mt
thi gian phát trin trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xut hin các chui bào t.
Chui bào t (si bào t) có rt nhiu hình dạng khác nhau: thẳng, sóng, móc câu,
xon… Chui bào t phân ct tạo thành các bào t trn, là cơ quan sinh sn ch yu ca
xạ khuẩn. B mặt bào t có th có dạng trơn nhẵn (sm), xù xì da cóc (wa), có gai (sp)
hoặc có tóc (ha).
Đặc điểm sinh lý: Streptomyces là sinh vt dị dưng, c tính oxi ha cao. Đ phát

trin, chúng phân gii các hydratcarbon làm nguồn cung cp vt cht và năng lưng,
đồng thi thy phân các hp cht như gelatin, casein, tinh bt, kh nitrat thành nitrit.
Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hp hiu khí. Nhit đ tối thích ca chúng là 25-30°C,
pH tối thích thưng là 6,8-7,5.
Khả năng tạo sắc tố: Sc tố tạo thành t Streptomyces đưc chia làm 4 loại: sc tố
hòa tan, sc tố ca khuẩn ty cơ cht, sc tố ca khuẩn ty khí sinh, sc tố melanoid.
1.3. Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn
1.3.1. Mục đích [8], [13]
Các VSV thun chng đưc phân lp t các nguồn t nhiên (bn, đt, nưc, mô
thc vt…) thưng có HTKS không cao, hiu sut sinh tổng hp thp. Do đ, đ thu
đưc các chng c HTKS cao đưa vào sn xut đi hỏi phi ci tạo, chn giống bằng các
phương php khc nhau và nghiên cu điu kin nuôi cy, bo qun thích hp.
1.3.2. Chọn chủng có HTKS cao bằng sàng lọc ngu nhiên [13], [21]
Các vi sinh vt có s bin dị t nhiên theo tn số khác nhau trong ống giống thun
khit, có cá th có hoạt tính khng sinh tăng lên 20-30 % so vi nhng cá th khác. Cn
phi chn ly cá th có hoạt tính cao nht trong ống giống đ nghiên cu tip.
Trong thc t, vic chn lc t nhiên các cá th có HTKS cao chỉ đ nghiên cu
ban đu, nó không có giá trị áp dụng vào sn xut. Đ thu đưc nhng chng có kh
năng siêu tổng hp khng sinh, ngưi ta áp dụng cc phương php đt bin nhân tạo.
1.3.3. Đột biến cải tạo giống [8], [10]
Cc tc nhân gây đt bin có th đưc chia làm 3 nhóm:

9

Tác nhân hóa học: 5-bromouracil, ethylenimin, 2-aminopurin, dimethylsulfat,
hydroxylamin…
Tác nhân vật lý: Ánh sng UV, tia X, tia α hay tia β. Tác nhân vt l hay đưc
dùng nht là ánh sáng t ngoại (UV). Kh năng đt bin còn phụ thuc vào khong cách
chiu, thi gian chiu, cưng đ bc xạ.
Tác nhân sinh học: Tác nhân sinh hc các Tn, bacteriophage Mu,…

Các tác nhân vt lý và hóa hc vi liu lưng và thi gian thích hp sẽ git cht
hu ht các vi sinh vt. Nhng cá th nào còn sống sót sẽ có s đt bin gen, làm thay đổi
các tính trạng dn đn hoặc làm mt kh năng tạo khng sinh (đt bin âm) hoặc làm
tăng hiu sut sinh tổng hp kháng sinh lên nhiu ln (đt bin dương).
Đ tạo ra các chng có hiu sut sinh tổng hp kháng sinh cao phi tin hành đt
bin bc thang, kt hp cc phương php di truyn phân t như ti tổ hp gi hu tính,
k thut tách dòng gen, k thut tạo và dung hp t bào trn.
1.3.4. Bảo quản giống xạ khuẩn [8], [12], [15]
Bo qun gi giống VSV là mt vic cn thit do các giống rt dễ bị thoái hóa,
nhm ln, mt mát nu không đưc lưu gi mt cách khoa hc. Mục đích cụ th là: gi
giống VSV có tỷ l sống st cao, cc đặc tính di truyn không bị bin đổi và không bị tạp
nhiễm bởi các vi sinh vt lạ.
Thông thưng, có th s dụng 4 phương php sau đ bo qun các chng VSV:
bo qun lạnh - cy chuyn (bo qun lạnh trong l hoặc ống môi trưng, định kỳ cy
chuyn sang môi trưng mi), làm khô (trn t bào VSV vi giá mang và làm khô ở
nhit đ phng), đông khô (phân tn t bào VSV trong MT cht bo qun rồi đông lạnh,
làm khô mu đông lạnh), đông lạnh (huyn dịch t bào trong cht bo qun đưc đông
lạnh nhanh và bo qun ở nhit đ thp).
Đ gi giống xạ khuẩn trong phňng thí nghim, cch đơn gin nht là nuôi cy xạ
khuẩn trên môi trưng thạch nghiêng thích hp, ct ống thạch nghiêng trong t lạnh và
định kỳ 2-3 tháng cy lại 1 ln.
1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh
1.4.1. Khái nim lên men [8], [22]

10

Lên men là qu trnh trao đổi cht sinh hc đưc tin hành do hoạt đng ca vi
sinh vt nh s xúc tác ca các enzyme vi mục đích cung cp năng lưng và các hp
cht trung gian cho chúng.
Kháng sinh là mt trong nhng sn phẩm ca quá trình lên men xạ khuẩn. Cụ th

hơn, khng sinh là sn phẩm trao đổi bâc hai, đưc tạo thành gn vào lúc kt thúc quá
trnh sinh trưởng ca xạ khuẩn, thưng vào gn hoặc vào chính pha cân bằng.
Hình 4 : Gii thiu đưng cong sinh trưởng, phát trin ca vi sinh vt tri qua 4
giai đoạn nối tip: pha tim tàng, pha lũy tha, pha cân bằng và pha suy tàn.










1.4.2. Các phương pháp lên men [3], [8]
Phương pháp lên men bề mặt: MT dng trong phương php này ở th rn hay th
lỏng tùy loài VSV. VSV hp thu dinh dưng t MT và s dụng oxi không khí đ hô hp
trên b mặt MT. Phương php này tuy c ưu đim là thao tc đơn gin, không đi hỏi
thit bị quá tân tin nhưng lại c nhưc đim là tốn mặt bằng, hiu sut s dụng môi
trưng thp, khó t đng ha. Do đ, ngày nay chỉ s dụng phương php lên men b mặt
trong chn giống và gi giống.
Phương pháp lên men chìm: VSV đưc nuôi trong MT lỏng, phát trin c 3 chiu
nên khc phục đưc tt c cc nhưc đim k trên ca lên men b mặt nhưng đi hỏi đu
tư trang thit bị ban đu ln.
Hình 4: Đưng cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn

11

Có 4 kiu lên men chm như sau:
- Lên men mẻ (lên men chu kỳ): VSV đưc nuôi gii hạn trong bình lên

men vi 1 th tích MT xc định. VSV phát trin theo giai đoạn và tạo ra sn
phẩm. Kt thc qu trnh, ngưi ta thu ly sn phẩm.
- Lên men có bổ sung: Trong quá trình nuôi cy có bổ sung thêm môi
trưng dinh dưng đ làm cho mt đ t bào trong bnh tăng lên. Do đ, nâng sao
hiu qu s dụng bình lên men.
- Lên men liên tục: Thit bị đưc cu tạo đặc bit sao cho khi VSV đ pht
trin đn mt giai đoạn thích hp thì sẽ ly đi mt th tích dịch lên men và đồng
thi bổ sung thêm đồng lưng MT mi vào bình.
- Lên men bán liên tục: Trong quá trình lên men, vic bổ sung thêm MT
dinh dưng và rút bt dịch lên men không đưc thc hin liên tục mà định kỳ sau
nhng khong thi gian nht định.
1.4.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men [12]
pH môi trường: Ảnh hưởng đn quá trình lên men có th do tác dụng trc tip ca
các ion H
+
hay OH
-
đn tính cht keo ca t bào, hoạt lc ca enzyme hoặc là tác dụng
gián tip.
Độ hòa tan oxy và sự thông khí: Thiu oxy nht thi sẽ phá v trao đổi cht trong
t bào. Vì th, phi cung cp oxy sao cho tốc đ hòa tan oxy bằng tốc đ s dụng oxy ca
VSV. Đối vi nhiu VSV, s thông khí sẽ làm tăng tốc đ sinh trưởng, rút ngn pha tim
phát. Bên cạnh đ, nhu cu oxy ca VSV trong cc giai đoạn sinh trưởng cũng không
giống nhau: trong thi kỳ đu, sinh khối còn ít tốc đ hòa tan oxy ln nên thông khí
mạnh là tốt.
Như vy, trong sn xut, cn nghiên cu cụ th nh hưởng ca các yu tố ti quá
trnh lên men đ có th tối ưu ha qu trnh này nhằm tạo điu kin thun li nht cho
sinh tổng hp cht mong muốn.
1.5. Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men
1.5.1. Mục đích [8]

12

Đây là giai đoạn có vai trò rt quan trng bởi vì sn phẩm thu đưc sau quá trình
lên men thưng không bn vng, hàm lưng kháng sinh trong dịch lên men thưng thp.
Do đ, cn tách riêng kháng sinh khỏi các tạp cht khác và tinh ch sn phẩm đạt đưc
các tiêu chuẩn cn thit theo quy định dng điu trị. Công đoạn tinh ch sẽ góp phn
quyt định ti giá thành ca sn phẩm.
1.5.2. Các phương pháp chiết tách [1], [2], [11], [17], [21]
Mt số phương php chit tch thưng dng:
- Phương php chit bằng dung môi hu cơ.
- Cc phương php sc ký (sc k trao đổi ion, sc ký ra gii trên ct…).
- Phương php tạo phc kt ta.
- Phương php chưng ct.
Chiết xuất: Chit xut là phương php tch mt hoặc mt số cht ra khỏi hn hp.
Đ là qu trnh phân bố các cht gia hai pha không trn ln vào nhau: Mt pha lỏng và
mt pha rn (cân bằng lỏng- rn) hoặc gia hai pha lỏng (cân bằng lỏng- lỏng, thưng
mt pha là nưc).
Phương pháp sắc ký:
Là mt nhm cc phương php ha l dng đ tách các cht riêng rẽ t mt hn
hp nhiu thành phn. Nguyên lý tách chung là mu phân tích đưc hòa tan trong mt
pha đng, đưc cho qua pha tĩnh mt cách liên tục và không hòa ln vi n. Pha tĩnh
đưc cố định trên ct hay trên b mặt cht rn. Các cht tan là thành phn ca mu sẽ di
chuyn qua pha tĩnh vi tốc đ khác nhau phụ thuc tương tc gia pha tĩnh, pha đng và
cht tan. Nh tốc đ di chuyn khác nhau các thành phn ca mu sẽ đưc tách riêng bit
thành di trên sc đồ, làm cơ sở cho phân tích định tính hay định lưng.
Cơ ch ca s phân tách là cơ ch hp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lc phân t
hay s phối hp đồng thi ca nhiu cơ ch tùy thuc vào tính cht ca cht làm pha tĩnh
và dung môi làm pha đng.
Cc phương php sc k thưng dùng trong nghiên cu sinh tổng hp KS:

13

Sắc ký lớp mỏng: Pha tĩnh là cht hp phụ, đưc cố định trên bn mỏng.
Pha đng là mt h dung môi đơn hoặc đa thành phn đưc pha theo tỷ l. Pha
đng di chuyn qua bn mỏng nh lc mao dn hoặc tc đng ca trng lc.
Sắc ký rửa giải trên cột: Pha tĩnh đưc gi trên ct, pha đng đi qua pha
tĩnh nh áp sut hoặc trng lc. Quá trình ra gii đưc thc hin bằng cách thêm
liên tục lưng mi ca pha đng.
1.6. Bưc đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh [17], [19], [20]
1.6.1. Phổ hồng ngoại
Phổ hồng ngoại là phương php đo s hp thụ bc xạ hồng ngoại (IR) khi n đi
qua mt lp cht cn th ở các số sóng khác nhau.
Trong phân t khi có nhóm nguyên t nào đ hp thụ năng lưng và thay đổi
trạng thi dao đng thì tạo nên mt di hp thụ trên phổ IR. Có mối tương quan gia
nhóm nguyên t và di hp thụ nên có th da vào s có mặt ca di hp thụ đ nhn bit
mt nhóm chc nào đ. Nhiu nhóm chc có các di phổ hp thụ đặc trưng, đây là cơ sở
ca vic phân tích cu trúc bằng IR.
1.6.2. Phổ tử ngoại
Đưng cong biu diễn s phụ thuc đ hp thụ bc xạ UV vào bưc sóng hay số
song là phổ t ngoại.
Quá trình hp thụ các bc xạ t ngoại gây ra bin đổi năng lưng đin t ca phân
t. Cc đin t ở trạng thi cơ bn E
0
chuyn sang trạng thái kích thích E
1
, E
2
. Các
electron tham gia vào hiu ng này có th là các electron trong liên kt đơn, liên kt bi,

h thống thơm…, hay cặp electron t do không tham gia liên kt ca O, N, các halogen.
1.6.3. Phổ khối
Phổ khối là tp hp cc tín hiu tương ng vi cc ion- đưc th hin dưi dạng
cc pic c cưng đ khc nhau. Cc tín hiu này thu đưc khi cc ion đưc tạo thành
trong buồng ion ha, đưc gia tốc và tch riêng nh b phân tích khối ca my khối phổ.
Phổ khối cho phép xc định chính xc khối lưng cc ion, phân t, xc định công thc
cu tạo ca cht nghiên cu hoặc dng trong phân tích định lưng.


14

1.7. Một số nghiên cứu liên quan
1.7.1. Điều hòa phân tử sinh tổng hợp kháng sinh trong Streptomyces [24]
Streptomyces là nguồn phổ bin nht ca thuốc khng sinh. Thông thưng mi
loài sn xut mt số thuốc kháng sinh vi đặc đim đặc trưng cho tng loài.
Streptomyces coelicolor là mt đin hình, tạo ra ít nht năm loại thuốc kháng sinh khác
nhau. Chng tôi xem xét cc cơ ch điu hòa v sinh tổng hp kháng sinh trong S.
coelicolor và các Streptomyces không mô hình trong hưng các nghiên cu gn đây.
Sinh tổng hp ca mi khng sinh đưc xc định bởi mt nhóm gen ln, thưng bao gồm
c gen điu tit [CSR
s
]. Đây là nhng đim chính đ kt nối vi rt nhiu h thống qun
lý bo tồn ni chung như theo dõi chc năng sinh l ca sinh vt, tổ chc sinh vt, mt
đ sinh vt và môi trưng đ khởi phát và mc sn xut ca mi thuốc kháng sinh. Mt
số CSR cũng có th nhạy cm vi các mc đ ở các loài khác nhau ca các phối t, bao
gồm c các sn phẩm ca quá trình riêng ca mnh, cũng như là cc sn phẩm ca con
đưng khng sinh khc trong cơ th, và đặc bit là các phân t nhỏ như gamma-
butyrolactones . Nhng tương tc này c th dn đn s tăng cưng các cht chuyn tip
và các mạch liên h phc tạp gia cc con đưng. Các tín hiu sinh l và cơ ch điu tit
có tm quan trng cho s hoạt hóa ca nhiu nhóm chuyn hóa th cp trong s phát

hin ca nhiu trình t gen Streptomyces gn đây.
1.7.2. Một chủng đầy hứa hẹn của streptomyces sp. vi những đặc điểm thúc đẩy
tăng trưởng và quản lý dịch bnh trong nông nghip [25]
Mt chng vi khuẩn Streptomyces sp. CIMAP-A1 đưc phân lp t rễ Phong l và
xc định bởi hình thái, tính cht sinh lý, sinh hóa và phân t (16S trình t gen rDNA). Nó
đ đưc tìm thy có liên quan chặt chẽ nht vi S. vinacendrappus, chng NRRL-2363
vi 99% trình t giống nhau. Chng đ c hoạt đng tim năng đối kháng (in vitro)
chống lại nhiu loại nm gây bnh cho cây trồng như Stemphylium sp., Botrytis cinerea,
Sclerotinia sclerotiorum, Colletotrichum spp., Curvularia spp., Corynespora cassicola
và Thielavia basicola. Các cht chuyn hóa trung gian ngoại bào đưc tạo ra bởi chng
trong dịch lc nuôi cy c ch mạnh s ny mm bào t, phát trin ca ống mm ca các
bào t ny mm và phát trin xuyên tâm ca Alternaria alternata, Colletotrichum

15

acutatum, Curvularia andropogonis và Fusarium moniliforme. Vic khai thác nuôi cy
trong dịch lc bằng các dung môi và lc bằng VLC và PTLC phương php luôn luôn
mang lại 10 hp cht chống nm có th chống lại nhiu loại nm gây bnh cho thc vt.
Các chng có th sn xut siderophores và axit indole-3-acetic. Chng đ đưc tìm thy
đ tăng cưng s tăng trưởng và sn xut ca Phong l. Nó tăng 11,3% sinh khối chồi
ca Phong l và sn lưng du cn thit 21,7%.
1.7.3. Nghiên cứu mi trong sản xuất kháng sinh từ S. hygroscopius D1.5 [23]
S. hygroscopius D1.5 đ đưc phân lp và nghiên cu thy nó có kh năng khng
c nm c vi khuẩn. Chng này có th s dụng nguồn nitơ là arginine và nguồn cacbon là
glycerin vi nồng đ tối ưu ln lưt là 0,75 g/l; 11,5 g/l. S.hygroscopius D1.5 là mt
VSV mesophylic, sn xut kháng sinh nhóm ester nonaromatic. Trong nghiên cu này,
VSV đưc s dụng là B.subtilis và E.coli; s tăng trưởng đưc đo bằng trng lưng khô
ca sinh khối (mg/50ml); hoạt tính khng sinh đưc xc định bằng vòng vô khuẩn. Ngoài
2 điu kin dinh dưng trên, các thông số vt l khc cũng đưc nghiễn cu. Kt qu thu
đưc là: pH, nhit đ lên men và số ngày lên men tối ưu ln lưt là 7,0; 30

0
C; 7 ngày.
Như vy, nghiên cu này đưa ra mt cch đ sn xut kháng sinh t S. hygroscopius
D1.5 trong môi trưng ít dinh dưng, nhit đ và pH kim sot đưc, t đ gp phn
gim giá thành sn phẩm.