Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc trên một số vị thuốc đông dược đang lưu hành trên địa bàn các tỉnh Hà Tây, Bắc Ninh và Hải Dương

Bộ YTẼ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
NGUYỄN ĐÌNH HÒA
NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ NHIẺM NÂM M ố c
TRÊN MỘT SỐ VỊ THUÔC ĐÔNG Dược ĐANG
LƯU HÀNH TRÊN ĐỊA BÀN CÁC TỈNH HÀ TÂY,
BẮC NINH VÀ HẢI DƯƠNG
(KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHÓA 2001-2006)
Người hướng đẫn: Ths. TRAN TRỊNH CÔNG
Nơi thực hiện: BỘ MÔN VI SINH - SINH HỌC
Thời gian thực hiện: 10/2005 " 04/2006
\
\
HÀ NỘI - 5/ 2006
j £ ở i e ỏ M i d i t .
Çjôt rX'itt bàụ fil îôttff eảm f)'ft efiâtf ihittih ftftà't té'l: Çfh s Pettit
Çîvhth ^ỗtưẬ, tftihj ĩtã tita íìttíi qjúp. ỈĨẼ' lût Ittt'ó'ftfi titnt tồi hfíiut ihíttth
Uhóa iutttt fiftff.
Ç îè i æ in h ỉi ỊỊ ff) l ỉì n q e /t m o'ti t ó i e it e th m j eö f ji á f í lù i e it e a t th e h i
Uậ. thuiif oJhi bộ ntêtt ^)i sifth - S i ult hfie itñ flifí nt fit đĩền Uiện thiiậti
ifí’i eítiị tồi qtíít trìitít títựe hỉĩíi đề tít ỉ tại i)f) tu ĩ) ft.
Çîêi æin lừttỊ it) iỉỉíiíị Of i nt tì ft fâi lut fi h ỉ oil ạitt đ ì nit if ũ eò oũf
đềit€ị tùỀii tồi ÌrtìtựỊ. q u á frtttlt họe itỊỊi vù títiửi ítiệtt Uháư iíutn nàụ,,
'Jôft ^Ìltìĩ, ttỊỊÌiỊỊ 2 0 thfuuj 05 ft ăm 2006
rSàtíi íiỉĩỉi
Q ù ịttụ ỉtt ^ tìtttỉt '3ÔÒU
MỤC LỤC
Trang
ĐẶT VÂN ĐỂ 1
P H Ẩ N l TỔNG Q U A N 3
1.1 Hệ nấm trên các cơ chất có nguồn gốc thực vật

3
1.2 Đặc điểm hình thái một số chi nấm quan trọng
4
1.2.1 Chi Aspergillus Micheli ex Fries 4
1.2.2 Chi Pénicillium Link ex F rie s 8
1.3 Tình hình nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc trên dược liệu ở
Việt N am 11
PHẦN 2 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 13
2.1 Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm 13
2.1.1 Vật liệu
.

.
13
2.1.2 Phưcíng pháp nghiên cứu 14
2.2 Kết quả thực nghiệm và nhận xét 14
2.2.1 Mức độ nhiễm nấm mốc trên các Tĩiãu hạt sen nghiên cứu

14
2 2 2 Mức độ nhiễm nấm mốc trên ý dĩ 16
2.2.3 Mức độ nhiễm nấm mốc trên vị thuốc binh la n g 18
2.2.4 Mức độ nhiẽm nấm mốc trên vị thuốc sa n h â n
19
2.2.5 Mức độ nhiễm nấm mốc trên vị thuốc nhục đậu khấu

21
2.2.6 Mức độ nhiễm nấm mốc trên vị thuốc táo nhân

23

2.2.7 Mức độ nhiễm nấm mốc trên vị thuốc kha tử 25
2.2.8 Mức độ nhiễm nấm inốc trên vị thuốc ngũ vị tử

27
2.2.9 Đạc điểm khuẩn lạc và vi học của một số chủng thuộc loài
A.flavus phân lập từ hạt sen 29
2.3 Phưcmg pháp xác định nhanh các chủng thuộc loài A.ílavus bằng
phương pháp sinh hóa 31
PHẦN 3 k ế t l u ậ n Và đ ể X UẤ T 33
3.1 K ếtluận 33
3.2 Một số đề xuất 34
ĐẶT VẤN ĐỂ
ở nước ta nguyên liệu dùng để bào chế thuốc y học cổ truyền và các chế
phẩm đông dược hầu hết có nguồn gốc thực vật [3]. Việc trồng và thu hoạch
nguồn dược liệu này còn rất phân tán, nhỏ lẻ và chủ yếu là từ các hộ cá thể.
Phương pháp thu hoạch, chế biến, bảo quản còn đơn giản, lạc hậu, cơ bản vẫn
là các phương pháp truyền thống phơi sấy theo kinh nghiệm. Điều đó đã làm
cho các được liệu, các vị thuốc đông dược thường rất dẽ bị mốc, nhất là trong
điều kiện khí hậu nóng ẩm như ở nước ta. Khi nấm mốc xâm nhiễm và phát
triển, ngoài việc làm giảm chất lượng dược liệu như làm giảm hàm lượng
vitamin, lipid, protid, tinh bột và các loại hoạt chất khác (do đa số nấm là các
sinh vật hoại sinh), chúng còn sinh ra các độc tố (được gọi chung là
mycotoxin) gây nguy hại cho sức khỏe người tiêu dùng. Trong số hàng trăm
mỵcotoxin mà con người đã biết, đáng lưu ý nhất là các aflatoxin, một nhóm
các hợp chất có khả năng gây ung thư cho người và động vật [1,25,28].
Nhóm độc tố này chủ yếu do hai loài nấm Aspergillus ịỉaviis và A.
parasiticus sinh ra và đã được các nhà nghiên cứu nấm và độc tố phát hiện
thấy ở tỷ lệ cao trên các nông sản, đặc biệt là ngô và lạc [1,22]. Bên cạnh đó,
ở góc độ quản lý nhà nước còn thiếu một hệ thống giấm sát chặt chẽ chất
lượng của các nguồn dược liệu từ cơ sở nuôi trồng, thu hoạch, chế biến, bảo

quản cho tới tận tay người tiêu dùng, nhất là xét về phưcmg diện nấm mốc
và độc tố nấm mốc như đã nói ở ưên.
Với những lý do trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài '"Nghiên cứu
mức độ nhiễm nấm mốc trên m ột số vị thuốc đông dược đang lưu hành
trên địa bàn các tỉnh Hà Tây, Bắc Ninh và H ải D ương” với hai mục tiêu
sau:
1. Phân lập và xác định tỷ lệ nhiễm nấm mốc thuộc 2 chi Aspergillus và
Pénicillium trên các vị thuốc đông dược: binh lang, ngũ vị tử, sa nhân, nhục
đậu khấu, hạt sen, táo nhân, ý dĩ và kha tử.
2. Xác định nhanh các chủng thuộc hai loài A. flavus và A. parasiticus
bằng phương pháp sinh hóa.
PHẦN 1: TỔNG QUAN
1.1. Hệ nấm mốc trên các cơ chất có nguồn gốc thực vật.
Trên thế giới việc nghiên cứu nấm mốc và các bệnh do chúng gây ra đã
có từ lâu, song thời kỳ phát triển mạnh nhất là sau dấu mốc quan trọng của vụ
dịch làm 100 ngàn con gà tây bị chết ở một trang trại của nước Anh do ăn phải
khô dầu lạc bị nhiễm loài nấm Aspergillus flavus.
Dựa vào các đặc điểm sinh thái của nấm và đặc biệt là hàm lượng ẩm mà
chúng yêu cầu, Christensen và Kaufmann 1974 đã chia các ỉoài nấm nhiẽm
trên các cơ chất thực vật thành 2 loại: các loài nấm nhiễm trên cây trồng đang
sống được gọi chung là hệ nấm ngoài đồng (field fungi) và nấm nhiễm trên
các bộ phân của cây như quả hạch, thân, lá, củ và rễ đã thu hoạch được gọi
chung là hệ nấm bảo quản (storage fungi).
Hệ nấm ngoài đồng bao gồm các loài nấm nhiễm trên hạt, quả, củ, lá,
thân, cành của cây trước khi thu hoạch hoặc vào giai đoạn thu hoạch. Chúng
yêu cầu một hàm ẩm cân bằng với độ ẩm tương đối (RH) từ 90-100% và đại
đa số chúng không sinh độc lố và có vai trò nhỏ trong việc gây hư hỏng thực
phẩm. Các chi nấm ngoài đồng thường gặp đó là Alternaría, Cỉadosporium,
Heỉminthosporìum và Fusarium.
Hệ nấm bảo quản bao gồm các loài nấm nhiễm trên hạt, quả, củ, lá,

thân trong quả trình bảo quản sau thu hoạch và chúng yêu cầu một ham ẩm
cân bằng với độ ẩm tưcmg đối 65-90%. Hầu hết chúng có thể phát triển khi
không có nước tự do và trên các môi trường có áp suất thẩm thấu cao. Hệ nấm
bảo quản đóng vai trồ chủ đạo trong việc làm giảm chất lượng các sản phẩm
sau thu hoạch như gạo, ngô, lạc, dược thảo và sinh các độc tố (mycotoxin)
trên các sản phẩm này. ở các nước có khí hậu nhiệt đới như Việt Nam các loài
thuộc chi Aspergillus là các loài nấm bảo quản chủ đạo và các loài của chi
Peniciỉỉium giữ vai trò thứ yếu. Theo Christensen [11] thì hệ nấm bảo quản có
khoảng 12 loài của chi Aspergillus và một số loài thuộc chi Peniciỉỉium và
nấm men. Chúng có mặt ở tất cả các nơi trên thế giới, nhiễm và phát triển trôn
tất cả các loại hạt lưcmg thực, hạt giống có hàm ẩm cao hơn 18% và nhiệt độ
30-32^C. Đây là những điều kiện rất thuận lợi cho sự phát triển và sinh độc tố
cùa các loài nấm bảo quản. Trong đó loài A.ỷỉavus và sự hình thành aflatoxin
là vấn đề đáng quan tâm nhất ở vùng khí hậu nhiệt đới.
Sự phân biệt hệ nấm ngoài đồng và hệ nấm bảo quản cũng chỉ mang tính
chất tưcmg đối, bởi một số loài nấm bảo quản trong đó có loài Ạ. flavus đã
được phát hiện nhiều trên lạc, ngô trước khi thu hoạch (Pitt & Hocking,
1991).
1.2. Đặc điểm hình thái của một sò chi nấm quan trọng.
1.2.1. Chi Aspergillus Micheli ex Fries.
Chì Aspergiỉỉus do Micheli mô tả năm 1729, sau đó năm 1832, Fries chấp
nhận chi nấm này của Micheli và theo luật quốc tế về danh pháp thực vật, chi
Aspergillus chính thức mang tên Aspergillus Micheli ex Fries.
Các loài của chi Aspergiỉỉus nhiễm khá phổ biên trên các cơ chất khác
nhau, đặc biệt ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, các ỉoài của chi này có
tần suất xuất hiện cao hoti so với các loài của PenicilỉÌLim. Một số loài đã gây
được sự chú ý đặc biệt do khả năng gây bệnh cho người và động vật hoặc khả
năng sinh độc tố của chúng. Đáng quan tâm nhất là các loài A. flavus, A.
parasiticus tạo độc tố gây ung thư gan aflatoxin [18,25,28],
Một số khác, đặc biệt ỉà loài A. oryzae đã được dùng rộng rãi trong công

nghệ lên men truyền thống để chế biến thực phẩm ở nhiều nước châu Á như
Việt Nam (làm lương), Trung Quốc, Nhật Bản [21]. Hiện nay, công nghê
sinh học sử dụng một số loài thuộc chi Aspergillus chủ yếu là các loài A.
niger, A, oryzae trong công nghệ sản xuất enzyme, công nghệ chế biến thực
phẩm, sản xuất một số acid hữu cơ như acid citric, acid gluconic [22,23],
v ề mặt phân loại học chi Aspergillus có một số đặc điểm sau:
Hê sợi nấm gồm các sợi ngăn vách, phân nhánh, không màu, màu nhạt
hoặc trong một số trường hợp trở thành nâu hay màu sẫm khác ở các vùng
nhất định của khuẩn lạc. Bộ máy mang bào tử trần phát triển từ một tế bào
đường kính lớn hcfn, màng dày hcm các đoạn lân cận của sợi nấm (tế bào chân
- food cell). Giá bào tử trần phát triển từ tế bào chân, như là một nhánh của
scd nấm, gần như thẳng góc với trục của tế bào chân và thường ở trên mặt cơ
chất. Giá bào tử trần không có nhánh, không có hoặc ít có vách ngang, có
phần đỉnh to ra thành bọng hình chuỳ, hình elip, hình gần cầu hay hình cầu.
Bọng hữu thụ này mang các thể bình. Các thể bình này hoặc song song và họp
thành cụm ở phần đỉnh bọng, hoặc xếp thành hmh tia sát nhau trên toàn bộ bề
mặt bọng. Thể bình hoặc chỉ có một lẩng hoặc có hai tầng. Trong trường hợp
sau, mỗi thể bình cấp một (cũng gọi là cuống thể bình-metula) mang một cụm
gồm 2-3 (hoặc nhiều hơn) thể bình cấp hai ở phần đỉnh. Các bào tử trần được
tạo thành nối tiếp nhau trong miệng thé bình, thành chuỗi hướng gốc (bào tử ở
gần miệng bao giờ cũng non nhất, càng xa càng già), không phân nhánh. Bào
tử trần không ngăn vách, thay đổi về hình dạng, kích thước, màu sắc, dấu vết ở
mặt ngoài tuỳ tùng loài. Tất cả các chuỗi bào lử trần lạo thành từ các thể bình
của bọng đỉnh giá họp thành khối bào tử trần đỉnh bọng (conidial head). Khối
bào tử trần đỉnh bỏng có thể có hình cột, hình cầu hoặc hình tia tỏa tròn. Một
số loài có bào tử túi (ascosporum) trong các ihể quả kín (clcitothecium),
Dưới đây xin nêu một số đặc điểm sinh học quan trọng của một số loài
của chi:
- Đặc điểm sinh học của 2 loài A.ỷìavỉis link ex fr. và A. parasiticus
speare: hai loài A .flavus và A. parasiticus có mối quan hệ gần gũi (cùng thuộc

nhóm loài A.flavus, chi Aspergillus), sống hoại sinh trên các cơ chất có nguồn
gốc thực vật, đặc biệt là các cơ chất chết nguồn gốc từ các cây lương thực,
thực phẩm và trong đất. Hai loài này phân bố ở khắp mọi nơi trên thế giới,
nhưng phổ biến nhất là ở các nước có khí hậu nhiệt đới như ở nước ta, nơi có
lượng mưa, nhiệt độ và độ ẩm cao. Các loài thuộc chi Aspergillus có đặc trưng
là các coniđiophore không có vách ngăn. Đặc điểm này của conidiophore là
khác biệt với các sợi nấm và chúng được phình lên ờ đình để tạo ihành bọng
(vesicle). Từ bọng hình thành các tế bào sinh conidi (spore-producing cell)
đặc biệt gọi là thể bình (phialide). Thể bình này hoặc được sinh ra trực tiếp từ
bọng gọi là thể bình một lớp (uniseriate) hoặc được sinh ra trên các cuống
ngắn (metulae) xuất phát từ bọng gọi là là thể bình 2 lớp (biseriate). Trong
một số trường hợp việc xác định các lớp thể bình là rất khó khăn do lớp đầu
tiên (lớp metulae hay cuống thể bình) rất bé và dễ bị che khuất bởi các bào tử
(conidi) và lớp thứ cấp (lớp thổ bình hay lớp phialide)( ảnh 1). Khuẩn lạc của
loài A.flavus lúc đầu thường có màu vàng-xanh sau chuyển sang xanh-vàng
hoặc xanh trên môi trường Czapek. Loai này thể bình 2 lớp là phổ biến,
thường xuất hiện hạch nấm (scleroíia) màu nâu-đỏ. Conidi thường khá ráp
hay có mấu nhỏ (finely roughened or echinulale), thường thay đổi về kích
thước và có hình dạng từ ovan cho tới hình cầu. Khuẩn lạc của loài
A. parasiticus có màu xanh tối trên môi trường Czapek và thường vẫn giữ
nguyên màu xanh cho tới lúc già. Thể bình thường một lớp (uniseriate), hạch
nấm thường không có- Conidi ihường có mấu thô, đồng nhất về hình dạng và
gai (ảnh 2) [28,30\
Ảnh 1: Phần đỉnh của conidiophore hình thành bọng có các thể bình sắp xếp
kiểu phóng xạ (các mũi tên chỉ) X 1000.
Ảnh 2: Thể bình và các chuỗi conidi phát triển hướng gốc
(các mũi tên chỉ) của loài A. parasiticus.
Các conidi non nhất ở gốc chuỗi gần thể bình nhất X 3000 [28]
Loài Aspergillus flavas Link ex Fres khi nuôi cấy Irên môi trường Czapek
ở TỈ^C, 10 ngày tuổi, khuẩn lạc có đường kính 6,0 - 8,0 cm, bề mặt dạng len,

mặt trước có màu lục vàng, mặt sau không màu hoặc nâu hồng, có giọt tiết
hoặc không, không có sắc tố hoà tan xung quanh. Gía bào tử trần có bề mặt
ráp hoặc nhẩn, chiều dài 100 ” 150 p.m có khi lên đến 500 - 800 lum, đường
kính 1 5 -2 0 p.m. Khối bào tử trần có hình tia toả tròn hoặc hình cột, đưòíng
kính 300 “ 500 p.m, bọng đỉnh giá có hình cầu hoặc hình chuỳ, đường kính 25
- 40 Ịim, có hoặc không có cuống thể bình, đường kính 5,0 - 10,0 |im. Thể
bình có kích thước 6,5 - 12,0 X 3,0 - 6,0 |im. Bào tử trần có dạng hình cầu
hoặc hình trứng bề mặt có gai, đường kính 3,0 ” 6,0 [22],
Loài Aspegiỉỉiis parasiticus Link ex Fres khi nuôi cấy trên môi trường
Czapek ở 27°c, 10 ngày tuổi, khẩn lạc có đường kính 3,0 ~ 5,5 cm, bề mặt
dạng len, xốp nhẹ, mặt trước có màu lục vàng, xanh lục, mặt sau có màu kem
hay nâu nhạt, không có sắc tố hoà tan quanh khẩn lạc, không có giọt tiết. Giá
bào tử trẩn có bề mặt ráp hoặc nhẩn, chiều dài 300 - 700 ỊLim. Khối bào tử trần
có dạng hình cầu hoặc hình tia toả tròn, đường kính khoảng 300 - 450 ^im.
Bọng đỉnh giá có dạng gần cầu, đường kính 2 0 - 35 fj,m, không có cuống thể
bình. Thể bình có kích thước 7,0 - 9,0 X 3,0 - 4,5 |j.m. Bào tử trần có dạng
hình cầu, bề mặt ráp hoặc có gai, đường kính 3,5 - 5,5 |um [22J.
- Đặc điểm của loài Aspergillus niger: khi nuôi cấy trôn môi trường
Czapek ở 27^ c , 10 ngày tuổi, khuẩn lạc có đường kính 4,5 - 7,5 cm, màu đen.
Khối bào tử trần đỉnh bọng hình cầu, sau hình tia toả tròn hoặc tách thành các
cột có đường kính 700 - 800 ^m, đôi khi có các khối bào tử trần nhỏ màu nâu
đen. Giá bào tử trần nhẵn, dài 1,5 " 3,0 cm. Bỏng đỉnh giá hình cầu, đường
kính 45 - 75 |um. Cuống thể bình phần lớn 5,0 - 6,0 X 20,0 - 30,0 |um, đôi khi
6,0 - 10,0 X 60,0 - 70,0 p.m. Thể bình 3,0 - 3,5 X 8,0 - 10,0 |um. Bào tử trần
hình cầu, phần lớn có đường kính 4,0 - 5,0 Ịim, ráp hoặc có gai không đều
thành chuỗi góc non [22].
- Đặc điểm loài Aspergillus versicolor: nuôi cấy trên môi trường Czapek
ở 27° c , 10 ngày tuổi, khuẩn lạc có đường kính 2,0 - 3,0 cm, màu trắng, sau
vàng, vàng da cam, lục vàng, lục tuỳ từng chủng. Khối bào tử trần thường chỉ
có một loại hình cầu, hình tia toả tròn, đường kính 100 - 125 |im. Giá bão tử

trần nhẩn, không màu hoặc có màu nhạt. Bọng đỉnh giá có dạng từ gần cầu tới
elip, đường kính 1 2 -1 6 ^m, mang cuống thể bình và thể bình. Thể bình phần
lớn 5,5-8,0 X 2,5-3,0 ^m. Cuống the bình 2,0-2,5 X 5,0-7,5 Ịiin. Bào tử trần
hình cầu, đường kính 2,0 - 3,5 |im, có gai. Đôi khi có tế bào Hulle [221.
1,2.2. Chi Peniciỉlỉum Link ex Fries.
Chi Penicilỉium thuộc họ Moniliaceae, bộ Moniliaỉes, lớp Nấm bất toàn
trong hệ thống phân loại hình thái Saccardo ỉ 886.
Chi Peniciỉlium đặc trưng bỏi các đặc điểm sau:
Khuẩn lạc màu lục, vàng lục, xanh lục, lục xám, xám, đôi khi có màu
vàng, đỏ, tím hoặc trắng. Mặt trái khuẩn lạc không màu hoặc có màu sắc khác
nhau, môi trường thạch nuôi cấy không màu hoặc có màu sắc do có mặt các
sắc tố hoà tan tương ứng. Khuẩn Ịạc có hoặc không có vết khía xuyên tâm hay
đồng tâm, có hoặc không có giọl tiết.
Sợi nấm ngăn vách, phân nhánh, không màu hoặc màu nhạt, đồi khi có
màu sẫm.
Bộ máy mang bào tử trẩn (còn gọi là “chổi”, penicillus) (Ảnh 3) hoặc chỉ
gồm giá bào tử trần với một vòng thể bình ở đỉnh giá (cấu tạo ỉ vòng,
monoverticillate) hoặc gồm giá bào tử trần với 2 đến nhiều cuống Ihể bình
(metulae) ở phần ngọn giá, trên đỉnh của mỗi cuống thể bình có các thể bình
(cấu tạo 2 vòng, biverticillate). Trường hợp các giá bào tử trần mang một hoặc
nhiều nhánh ở phần ngọn giá, sau đó các nhánh mang các cuống Ihể bình và
các cuống thể bình lại mang các thổ bình cũng được coi là cấu tạo hai vòng.
Khi các cuống thể bình xếp đều đặn và sát nhau trên ngọn giá, cấu tạo 2 vòng
đó được coi là cấu tạo 2 vòng đối xứng. Trường hợp các cuống thể bình xếp
không đều đặn trên phần ngọn giá hoặc có nhánh, cấu tạo này được coi là cấu
tạo 2 vòng không đối xứng. Trường hợp giá bào lử trần mang nhiều nhánh và
các nhánh này cùng với các cuống thể bình, các thể bình xếp đều đặn và sát
nhau, đây là bộ máy mang bào tử trần có cấu lạo nhiều vòng (polyverticiỉlate).
Giá bào tử trần có thể phát triển từ các sợi nấm nằm sát cơ chất, sát mặt
môi trường thạch nuôi cấy (các sợi nền), khi đó thường có chiều dài đều nhau

và khuẩn lạc có dạng mặt nhung (velutinale). Giá bào tử trần có thể là nhánh
của các sợi nấm khí sinh, khuẩn lạc trong trường hợp này có dạng len hoặc
xốp bông (lanate, floccose). Trường hợp các giá bào tử trần là các nhánh của
bó sợi hoặc bản thân chúng tụ lại với nhau thành các bó giá, khuẩn lạc đặc
trưng bởi các bó sợi (funiculose) hoặc của các bó giá (fasciculate).
Tế bào sinh bào tử trần của các loài ihuộc chi Penicỉỉỉium là các thể bình.
Thể bình của nhiều loài của chi nấm này có phần đỉnh ngắn và thon nhỏ đần,
phần đỉnh này thường có đường kính khoảng 1/3 đường kính phần ihân. Một
số loài thuộc nhóm loài Biverticillata-Symmetrica có thể bình hình mũi dáo
(thể bình có phần đỉnh tương đối dài và thon nhỏ dần).
Bào tử trần của các loài thuộc chi PeniciỊìium thuộc tip phialoconidi (tip
cơ bản euconidi), không có vách ngăn, hình cầu, gần cầu, hình trứng, elip đôi
khi hình trụ. Bào tử trần thường không màu hoặc màu nhạt khi đứng đcfn độc,
khi tụ họp thành đám thường có màu lục, vàng lục, lục xanh, lục xám, xám.
Các bào tử trần tạo thành chuỗi dài trên miệng thể bình.
Mặt ngoài của bào tử trần, giá bào tử trần, các nhánh, cuống thể bình, thể
bình có thể ráp, nhẩn, có gai hoặc sần sùi hay gồ ghề.
Ảnh 3: Bộ máy mang bào tử trần của chi PenÌciUium.
1.3. Tinh hình nghiên cứu mức độ nhỉễm nấm mốc trên dược liệu ở Việt
Nam.
Do sự phát triển của nồn ỵ học cổ truyền ngày càng lớn mạnh đã
làm cho khối lượng và chủng loại dược liệu, đặc biệt là các dược liệu có
nguồn gốc dược thảo ngày càng tăng cả về lượng tiêu dùng cũng như
lượng bảo quản, lưu thông buôn bán. Qua thực tế của công tác thu
hoạch, bảo quản và tiêu dùng cho thấy các dược thảo này rất dễ bị mốc.
Tuy nhiên các cồng trình nghiên cứu về mức độ nhiễm nấm mốc và
m ycotoxin trên dược liệu còn rất ít. Mặc dầu vậy cũng đã có một số
công trình đáng chú ý. Đó là công trình nghiên cứu về hệ nấm mốc đặc
trưng trên dược liệu ở kho của tác giả Nguyễn Thị Sinh năm 1984 [4].
Một số dẫn liệu quan trọng, giúp định hướng cho các công trình nghiên

cứu tiếp theo về nấm mốc và mycotoxin trên dược liệu mà tác giả đã
công bố là: hệ vi nấm đặc trưng trên dược liệu bảo quản trong đó nổi
bật là các loài của 2 chi Aspergillus vờ peniciỉlium , đặc biệt là sự xuất
hiện của loài A .flavus trên 80% dược liệu nghiên cứu. Ngoài ra tác giả
cũng cho biết độ ẩm tương đối (Relative H umidity) tối thiểu cần thiết
cho sự phát triển của hệ vỉ nấm dược ỉiệu ở kho ỉà 75%.
Một công trình nghiên cứu khác mang ý nghĩa thăm dò của tác giả
Nguyễn Hữu Tuấn [6] về sự có mặt của loài A.flavus và khả năng tạo
aflatoxin trên dược liệu đã cho thấy tỷ lệ nhiễm A.fiavus là khá cao
(90%). Tuy nhiên do thiếu chất chuẩn aflaloxin tác giả chỉ phát hiện
được aflatoxin G2 trên các mẫu dược liệu nần nghẹ và ngưu tất đã
nghiên cứu.
Công trình nghiên cứu gần đây nhất (1/2003) của tác giả Trần Trịnh
Công [2] , nghiên cứu về mức độ nhiễm nấm mốc và aílatoxin BI trên
một SỐ vị thuốc đông dược đang lưu hành trên địa bàn Hà Nội. Kết quả
của công trình đã cung cấp cho chúng ta những bằng chứng cụ thể về
mối đe dọa tiềm tàng của nấm mốc và độc tố aflatoxin, nhất là các vị
thuốc có nguồn gốc quả và hạt. Trong số 6/15 vị thuốc có nguồn gốc
quả, hạt mà tác giả nghiên cứu đã phát hiộn thấy 4 vị thuốc là nguồn cơ
chất rất phù hợp cho cho các loài nấm sinh độc tố phát triển. Vị thuốc
đầu tiên mà chúng ta không thể không nói đến là hạt sen, một loại hạt
không chỉ được dùng phổ biến làm thuốc từ lâu đời mà còn được dùng
phổ biến trong dân gian làm thực phẩm đã bị nhiễm loài A.flavus trung
bình tới 40 % trong các mẫu tác giả nghiên cứu. Đặc biệt hơn tác giả đã
phát hiện thấy 4/20 mẫu hạt sen lấy ở các hiệu thuốc đông dược và các
chợ thực phẩm bị nhiễm aflatoxin BI với hàm ỉượng dao động 17,5-434
ppb. Trong khi đó giới hạn tối đa của độc tố này trên lương thực, thực
phẩm mà ngành ỵ tế cho phép chỉ là 10 ppb. Hai vị thuốc khác trong số
6 vị thuốc có nguồn gốc quả, hạt là ngũ vị tử và phá cố chỉ đã bị nhiễm
loài A.niger lần lượt là 91 và 30,6 %. Đây là m ột loài tuy không phải là

loài nguy hiểm như A.ỷĩavus hay A.parasiticus nhưng cũng có khả năng
sinh aflatoxin. Vị thuốc cuối cùng trong sổ 6 vị có nguồn gốc quả, hạt
mà tác giả đã nghiên cứu là bá tử nhân cũng cho ihấy đây là cơ chất đặc
trưng của một loài nào đó thuộc chi PeniciUium, chi nấm mà theo các
nhà nghiên cứu độc tố nấm trôn thế giới là có khả năng sinh nhiều
m ycotoxin có hại cho người và động vật [13].
PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THựC NGHIỆM.
2.1.1. Vật liệu.
2.1.1.1. Đối tượng nghiên cứu.
Các vị thuốc đông dược nghiên cứu được thu thập ở các hiệu thuốc trên
địa bàn thuộc 3 tỉnh Hà Tây, Bắc Ninh và Hải Dương:
- Binh lang: 3 mẫu ở Hải Dương, 2 mâu ở Bắc Ninh và 2 mẫu ở Hà Tây.
- Ý dĩ: 3 mẫu ở Hải Dương, 2 mẫu ở Bắc Ninh và 1 mẫu ở Hà Tây.
- Hạt sen: 3 mẫu ở Hải Dương, 2 mẫu ở Bắc Ninh và 3 mẫu ở Hà Tây.
- Táo nhân: 3 mẫu ở Hải Dương, 1 mẫu ở Bắc Ninh và 3 mẫu ờ Hà Tây.
- Ngũ vị tử: 3 mẫu ở Hải Dương, 2 mẫu ở Bắc Ninh và 1 mẫu ở Hà Tây.
- Sa nhân: 3 mẫu ở Hải Dương và 1 mẫu ở Bắc Ninh.
- Nhục đậu khấu: 3 mẫu ở Hải Dưoìig, 1 mẫu ở Hà Tây.
- Kha tử: 3 mẫu ở Hải Dương và 1 mẫu ở Bắc Ninh.
2.1.1.2. M ôi trường phân lập và xác định nấm mốc,
- Môi trường PDA (g/1): Glucosc: 20g; thạch: 15g; dịch chiết khoai tây: 1
lit.
- Môi trường Czapek ~ Dox (g/1): Sacarose: 30g; NaNOg 3,0g; KCl 0,5g;
K2 HPO4 l,Og; MgS0 4 .7 H2 0 : 0,5g; FeSO^-VH^O: 0,01g; Thạch: 17,5g; nước
cất vừa đủ lOOOml; pH = 5 - 6, Khử trùng ở 121‘^c trong 15 phút.
- Môi trường AFPA (xác định nhanh các chủng thuộc 2 loài A.flavm vả
A.parasiticus): Peptone: lOg; Cao nấm men: 20g: sắt amoni citrat: 0,5g;
Chloramphenicol: 0,lg; Thạch: 15g; nước vừa đủ 1 lít. Khử trùng ỏ 121^c
trong vòng 15 phút.

2.ỉ . 1.3. Thiết bị thí nghiệm.
- Kính hiện vi Axiostar plus (Carl Zeiss-Đức, gắn máy chụp ảnh kỹ thuật
số SO N Y -N hật Bản).
- Tủ cấy vô trùng BIOAIR, Cộng hoà liên bang Đức.
2.1.2. Phương pháp nghĩên cứu.
2.1.2.1. Phương pháp lấy mẫu.
Phưcrng pháp lấy mẫu hạt dựa trên cơ sở phưcnig pháp của FAO [16]. Các
mẫu hạt được bảo quản ở dạng đóng bao lấy bằng 10% số bao trong toàn lô
hàng. Mẫu đại diện có trọng lượng khoảng lOkg. Mãu đại diện được Irộn đều,
chia theo phucfng pháp đường chéo, lấy ỉkg làm mẫu đại diện phụ.^M ^^đại
diện phụ lại được trộn đều, lấy một phần tư theo phương pháp chia theo đường
chéo để nghiên cứu nấm mốc
2.1.2,2, Phương pháp xác định mức độ nhiễm nấm mốc.
Phương pháp này được tiến hành theo phương pháp của Samson và cộng
sự [24]. Mức độ nhiễm này được tính bằng phần trăm hạt bị nhiễm các chi hay
loài từ bên trong các vị thuốc. Các mẫu dược ỉiêu được khử trùng hệ nấm bên
ngoài bằng cách ngâm trong dung dịch H2 O2 4% trong 6 - 7 phút. Sau đó rửa
sạch bằng nước cất khử Irùng 5 lần. Để ráo nước và đặt nhanh các mẩu dược
liệu vào đĩa petri đã có môi trường PDA bằng kẹp vô trùng. Mỗi mẫu dùng 5
dĩa mỗi đĩa đặt từ 5-15 mẩu tuỳ từng vị. Sau đó ủ ở nhiệt độ 25*^c - 35®c sau
3-7 ngày tuỳ theo nhiệt độ cao hay thấp, phân lập các chủng nấm mọc chuyển
sang môi trường Czapek - Dox, ủ ở nhiệt độ 25° c sau 3,5,7 ngày tiến hành
các bước phân loại và kết luận. Trên cơ sư đó tính % mức độ nhiễm nấm mốc
nói chung, mức độ nhiễm các chi và loài nấm nói riêng của từng vị thuốc.
2,13.3. Phương pháp phán loại nấm mốc.
- Phân loại các chi nấm theo khoá phàn loại của Barnett và Hunter [10].
- Phân loại các loài thuộc chi Aspergillus theo khoá phân loại của Raper
và Fennell [23],
- Xác định các chủng của 2 loài Aspergỉỉhis flaviis và A. parasừicus bằng
phucfng pháp sinh hóa của Pitt & Hocking [22].

2.2. Kết quả thực nghiệm và nhận xét.
2.2.1. Mức độ nhiễm nấm mốc trên các mẫu hạt sen nghiên cứu.
Hạt sen ( Semen Nclumbinis ) còn gọi là liên nhục, là hạt còn màng mỏng
của quả già đã phơi hay sấy khô của cây sen (Nelumbo nucífera Gaertn).
Thành phần hoá học có nhiều linh bột, đường, proũt, chất béo. Ngoài ra còn
có một tỷ lệ nhỏ canxi, phốt pho, sắt. Trong tâm sen có asparagin và ancaloit.
Từ những mẫu hạt sen đã thu thập để nghiên cứu chúng tôi thu được kết quả
về mức độ nhiễm nấm mốc được trình bày ở bảng 1.
Bảng 1: Mức độ nhiễm nấm mốc trên các mẫu hạt sen nghiên cứu.
STT
Địa
điểm
lấy
mẫu
Tỷ lê
% hat
bị
nhiễm
nấm
mốc
Mức đô nhiêm các chi và loài nấm chủ
/ếu (%)
Aspergiỉhis
PeniciUium Rhizopus
Fusariiim
A.flaviís A.ìiỉger
1
Bắc
Ninh
10

4 3 2
i
0
1
2
Bắc
Ninh
9 3
1
3
1 1
3
Hải
Dương
75 35 15 15 5
5
4
Hải
Dương
20
5 8 5 2
0
5
Hải
Dưofng
40 10 12
10 4 4
6
Hà
Tây

40 15 ■
: 5
9
6 5
7
Hà
Tây
4
ỉ 1
2 0 0
8
Hà
Tây
3
1 1
1
0
0
Tỷ lệ nhiễm
dao động
3-75
%
1-35 %
1-15% 1-15%
1-6% 1-5%
Kết quả khảo sát mức độ nhiễm nấm mốc của 8 mẫu hạt sen thu thập ở
các địa phương khác nhau cho thấy tất cả các mẫu hạt sen nghiên cứu đều bị
nhiễm nấm mốc với tỷ lệ dao động từ 3 - 75 % (ảnh 4), trong đó tỷ lệ nhiẻm
loài A, flavas là 1-35 % (trung bình 9 %), một tỷ lệ đáng quan tâm về khả
năng nhiễm aflatoxin của các mẫu hạt sen nghiên cứu. Bên cạnh đấy tỷ lệ

nhiẻm chi Penicilinm dao động từ 1-15 % cũng là điểm cần lưu ý về khả năng
nhiễm độc tố cùa chi này. Qua kết quả khảo sát cũng cho thấy không có mặt
của loài A.parasiticus ưên các mẫu hạt nghiên cứu. Ngoài ra trên các mẫu hạt
sen còn có mặt một tỷ lệ nhỏ của 2 chi là Fusarium (1-6 %) và Rhizopus (1-5
%) trong 6 mẫu nghiên cứu.
Ảnh 4: Nấm mốc nhiêm trên hạt sen thu thập ở Hải Dương
2.2.2. M ức độ nhiễm nấm mốc trên ý dĩ.
Ý dĩ (semen coicis) là hạt đã phd hay sấy khô của cây ý dĩ. Thành phần
hóa học gồm có nhiều tinh bột, chất béo, protid và các acid amin. Kết quả
nghiên cứu về mức độ nhiễm nấm mốc được trinh bày ở bảng 2.
S l'l
Dia diem
lay mau
Ty le % hat
nhi6m nam
m6c
Mure do nhi6m cac chi va loai chu yeu (%)
Aspergillus
Penicillium Mucor
A.flavus A.niger
1
i
Bac Ninh 25 10
8 2 5
2
Bac Ninh 5 4 1
0 0
3
Hai Dufcmg
7 2

0 3 0
4
Hai Dircmg 0 0
0 0
0
5
Hai Ducfng 30
6 6 12
6
6
HaTay 4
0 3 1
0
Ty le dao dong
0-30 % 0-10 %
0-8% 0-12 % 0-6%
Ket qua b bang 2 cho thiy trong 6 m^u y di khao sat, c6 5 m^u bi nhi6m
na'm m6c vcd ty le dao dong tir 4-30 % (anh 5). Trong do c6 4 m lu nhi^m loai
A.flaviis vdi ty 16 dao dOng 2-10 %. Ben canh do cac loai cua chi Penicillium
cung bi nhi^m 4/6 m^u vcfi ty 16 dao dong la 1-12 %.
Anh 5: Nam moc nhiem tren hat y dl thu thap cf Hai Ducmg
17
KL lU a
\
2.23. Mức độ nhiễm nấm mốc trẽn vị thuốc binh lang.
Binh lang (Semen Arecae) là hạt phơi hay sấy khô của cây cau (Areca
catechu L.). Thành phần hoá học gồm có: tanin (15 - 20%), chất béo (14%),
đường và các ancaloid. Bảng 3 dưới đây trình bày kết quả khảo sát mức độ
nhiễm nấm mốc trên các mẫu bing lang nghiên cứu.
Bảng 3: Mức độ nhiẽm nấm mốc trên vị thuốc binh lang.

s n r
Địa điểm lấy
mẫu
Tỷ lê
nhiễm
nấm (%)
Các chi và loài nấm thường gặp (%)
AspergÌUus
Peniciỉìium Fusarium
A.ýỉavus A.niger
1 Hải Dưcmg 30
10 12 4 4
2 Hải Dưcfng 25
10 8 7 0
3 Hải Dưcmg 28 13
5 5 5
4
Bắc Ninh 35 15
10 8 2
5 Bắc Ninh
20 8 8
3 1
6
Hà Tây
5 2
2 1 0
7
Hà Tây 10
5 3 2
0

Tỷ lệ nhiêm
dao động
5-35 %
2-15 %
i
2-12%
1
1-8 % 1-5 %
Kết quả bảng 3 cho thấy 100% các mẫu binh lang đều bị nhiễm nấm mốc
với tỷ lệ dao động từ 5-35% (ảnh 6), tỷ lệ nhiễm trung bình là 22 %. Trong đó
các loài thuộc chi Aspergillus là A.ßaviis và A.niger có tỷ lệ nhiễm trung bình
lần lượt là 9 % và 7 %. Đây là một tỷ lệ nhiễm cần lưu ý về khả nâng nhiễm
aflatoxin trên loại dược liệu này. Ngoài ra hai chi Pénicillium và Fusarium
cũng có mặt với tỷ lệ nhiễm dao động lần lượt là 1-8 %; 1-5 %.
Ánh 6: Nấm mốc nhiễm trên vị thuốc binh lang thu thập tại Bắc Ninh
2,2 A. Mức độ nhiễm nấm mốc trên vị thuốc sa nhân.
Sa nhân (Fructus et Semen Amomi xanthioidis) là quả gần chín phcfi hay
sấy khô của cây sa nhân (Amomum xanthioides). Thành phần hoá học chủ
yếu í à tinh dầu (2 -3 % ). Kết quả khảo sát nấm mốc nhiễm trên một số mẫu sa
nhân thu thập từ Hải Dưcíng và Bắc Ninh được trình bày ỏ bảng 4.
Tỷ_lệ
nhiễm
nấm (%)
Scfn Hoà -
Hải Dương
30 15 10
Sơn Hoà -
Hải Dương
13
Bấc Kinh -

Hải Dương
17
Từ Sơn -
Bắc Ninh
0
0 0 0
0
Tỷ lệ dao động
0-30 % 0-15 %
0- 1 0 % 0-6 %
0-3%
Kết quả ở bảng 4 cho thấy có khoảng 75% các mẫu nghiên cứu bị nhiễm
nấm mốc, với tỷ lệ từ 17-30 % (ảnh 7), tỷ lệ nhiễm Irung bình là 19 %. Trong
đó loài A.ịỉavus có 3 mẫu nhiễm với tỷ lệ từ 8-15 %. Bên cạnh đó các chi
Peniciỉlium và Fusarium cũng nhiễm với các tỷ lệ trung bình lần lượt là 3% và
1,5 %. Với những tỷ lệ nhiễm này mà đặc biệt là loài A.ßavits đã tiềm ẩn nguy
cơ lây nhiễm độc tố aflatoxin của vị thuốc này.
Ảnh 6: Nấm nhiẻm trên vị thuốc sa nhân thu thập từ Hải Dương
2.2.5. M ức độ nhiễm nấm mốc trên vị thuốc nhục đậu khấu.
Nhục đậu khấu (Semen Myristicae) là nhân phơi hay sấy khô của cây
nhục đâu khấu. Thành phần hoá học gồm có tinh bột, protid, chất béo đặc còn
gọi là bơ nhục đậu khấu (40%), ngoài ra còn có tinh dầu và chất nhựa. Tác
dụng chủ yếu của vị thuốc này là kích thích tiêu hoá, nhưng nếu dùng liéu cao
có thể gây ngộ độc. Từ những mẫu đã thu thập, kết quả về mức độ nhiễm nấm
mốc được thể hiện ở bảng 5.
Tỷ lệ
nhiễm
nấm (%)
Hải Dương 81 30 35 5
Hải Dương

94 44 20 20
Hải Dương 100 55 20
8 12
Hà Tây 83 33
15 10 20
Tỷ lệ dao động 81- 100%
30-55 % 15-35 % 5-6%
4-10% 5-20 %
Kết quả thu được ở bảng 5 cho ta thấy mức độ nhiễm nấm mốc trên vi
thuốc này là rất cao. Tất cả 4 mẫu nghiên cứu đều bị nhiễm với tỷ lệ dao động
từ 81 ~ 100%. Tỷ lệ nhiễm trung bình là 89,6 %, trong đó hai loài A.flavus và
A.niger nhiễm nhiều nhất với tỷ lệ trung bình lần lượt là 40,5% và 22,5%. Các
chi khác cũng có tỷ lệ nhiẻm trung bình cao là Mucor 14,25 %, Fusarium 7%,
Penicilỉium 5,25 %. Điều này cho thấy tỷ lệ nhiễm nấm mốc ở vị thuốc này là
rất cao. Vì vậy để đảm bảo chất lượng vị thuốc này phải có phương pháp thu
hoạch, chế biễn và bảo quản tốt.