Phân tích coliform và e coli trong thực phẩm

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & THỰC PHẨM
Tiểu Luận Môn: VI SINH THỰC PHẨM
Đề tài: Phân Tích Coliform Và E.Coli trong Thực Phẩm
Giáo Viên Hướng Dẫn: Th.S Lưu Huyền Trang
Nhóm : 07 (CDTP8LT-CDTP10TB)
1. Đỗ Văn Toản 08845384
2. Hoàng Thị Nguyệt 08835414
3. Nguyễn Thị Hà 08844884
4. Vương Thị Thủy
MỤC LỤC
LỜI MỞ ĐẦU
Xung quanh chúng ta, ngoài các sinh vật lớn mà chúng ta có thể nhìn thấy
được, còn có vô vàn vi sinh vật nhỏ bé, muốn nhìn thấy chúng phải sử dụng kính
hiển vi, người ta gọi chúng là vi sinh vật. Môn khoa học nghiên cứu về hoạt động
sống của các vi sinh vật được gọi là Vi sinh vật học.
Vi sinh vật học phát triển rất nhanh và đã dẫn đến việc hình thành các lĩnh
vực khác nhau: vi khuẩn học (Bacteriology), nấm học (Mycology), tảo học
(Algology) virus học (Virolory), Việc phân chia các lĩnh vực còn có thể dựa vào
phương hướng ứng dụng. Do đó chúng ta thấy hiện nay còn có y sinh vi sinh vật
học, vi sinh vật học thú y, vi sinh vật công nghiệp, vi sinh vật học nông nghiệp.
Vi sinh vật phân bố rộng rãi trong tự nhiên: trong đất, nước, không khí, trên
cơ thể các sinh vật khác, trên lƣơng thực, thực phẩm và các loại hàng hóa. Chẳng
những thế, sự phân bố của chúng còn theo một hệ sinh thái vô cùng phong phú, đa
dạng, từ lạnh đến nống, từ chua đến kiềm, từ háo khí đến kị khí, Do sự phân bố
rộng rãi và do hoạt động mạnh mẽ nên vi sinh vật có tác dụng rất lớn trong việc
tham gia các vòng tuần hoàn vật chất trên trái đất cũng như tham gia vào các quá
trình sản xuất nông nghiệp.
Trong thiên nhiên, vi sinh vật giữ những mắt xích trọng yếu trong sự chu
chuyển liên tục và bất diệt của vật chất, nếu không có vi sinh vật hay vì một lý do
nào đó mà hoạt động của vi sinh vật bị ngừng trệ dù chỉ trong thời gian ngắn, có
thể nó sẽ làm ngưng mọi hoạt động sống trên trái đất.

Hiện nay vi sinh vật là một môn khoa học mũi nhọn trong cuộc cách mạng
sinh học. Nhiều vấn đề quan trọng của sinh học hiện đại như, nguồn gốc sự sống,
cơ chế thông tin, cơ chế di truyền, cơ chế điều khiển học và các tổ chức sinh vật
học, vi sinh vật học đang có những bước tiến vĩ đại, đang trở thành vũ khí sắc bén
trong tay con người để nhằm chinh phục thiên nhiên phục vụ đắc lực cho sản xuất
và đời sống.
TỔNG QUAN VỀ COLIFORM VÀ E.COLI
I. COLIFORM:
1. Định Nghĩa
Coliforms là những trực khuẩn Gram âm không sinh bào tử,
hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý, có khả năng lên men lactose sinh acid và
sinh hơi ở 370
o
C trong 24 – 48 giờ. Coliforms được xem là nhóm vi
sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước
hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện
diện của các loại vi sinh vật khác.
2. Đặc Điểm
- Hình que, Gram (-), không bào tử
- Lên men lactose sinh hơi
- Nhiệt độ phát triển; (-) 2-50
o
C
- pH: 4.4-9.0
- Nguồn nhiễm: nước hoặc thực phẩm nhiễm phân
- Loại tiêu biểu: E.Coli, Enterobacter aerogenes, Shigella
II. Escherichia coli
1. Định Nghĩa
- Thuộc họ Enterobacteriaceae, catalose (+), oxidase (-), Gram(-) , trực khuẩn ngắn,
không tạo bào tử.

- Sống trong ruột già của người và động vật, theo phân đi ra ngoài
- Có khả năng lên men nhiều loại đường, sinh hơi, khử nitrat thành nitrit
- Khả năng gây bệnh đa dạng: gây nhiễm khuẩn đường tiểu; với cơ thể yếu gây
nhiễm khuẩn máu; gây viêm màng não ở trẻ sơ sinh; gây tiêu chảy.
2. Đặc Điểm.
- Hình que, không tạo bào tử
- Nhiệt độ phát triển: 7-50
o
C, nhiệt độ thích hợp: 37
o
C
- pH thích hợp: 7.0-7.5
- Gây bệnh đường ruột, tiêu chảy, nhiễm khuẩn máu, viêm màng não….
PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH COLIFORM VÀ
E.COLI TRONG THỰC PHẨM
PHƯƠNG PHÁP MOST PROBABLE NUMBER (MPN) THEO
TCVN 6505-2:1999
Đây là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí
nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau. Thông thường, việc định
lượng này được thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng
3 x 3 = 9 ống nghiệm.
Quy trình định lượng:
Cho các ống nghiệm chứa môi trường dạng lỏng thích hợp với vi sinh vật cần
xác định với 3 mức nồng độ:b 1/10, 1/100, 1/1000 mỗi mức 3 ống nghiệm. Ủ ở
nhiệt độ với thời gian thích hợp. Dựa vào kết quả nhìn thấy chứng minh sự tang
trưởng của vi sinh vật cần kiểm định (thường là những hiện tượng như: sinh hơi,
đổi màu, đục…) ghi nhân số lượng các ống nghiệm dương tính ở từng độ pha
loãng. Sử dụng các số liệu này và dựa vào bảng Mac Crady suy ra mật độ vi sinh
vật được trình bày dưới dạng MPN/100ml hay số MPN/gam.
Độ chính xác của trị số MPN phụ thuộc vào số lượng ống nghiệm lặp lại

trong mỗi độ pha loãng.
Sử dụng môi trường BGBL ở 37oC có thể định lượng nhóm Coliform, cùng
môi trường này ở 45oC cho phép định lượng Coliform trong phân.
Ghi nhận số lượng ống nghiệm dương nh
ở từng độ pha loãng. Tra bảng Mac Crady
Ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp
Kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng
trưởng của vi sinh vật cần kiểm định
Pha loãng mẫu phân ch ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên @ếp.
Mật độ vi sinh vật MPN/100 ml hay MPN/1g mẫu
1. QUY TRÌNH THỰC HIỆN:
Đa số các bảng MPN cung cấp số liệu ở dạng số MPN trong 100ml dung
dịch được sử dụng để phân tích ở các liều lượng là 10ml, 1ml, 0.1 ml. Trên thực tế
phân tích, người ta thường dùng 1ml cho mẫu đã pha loãng 10-1, 10-2, 10-3.
Lượng mẫu với các độ pha loãng này tương đương với 1/100 lượng mẫu sử dụng
theo bảng MPN/100ml tính theo lượng mẫu là 10ml, 1ml, 0.1 ml nêu trên. Vậy
số liệu của bảng MPN/100ml tính theo lượng mẫu là 10ml, 1ml, 0.1 ml tương
đương với MPN/ml mẫu chưa pha loãng khi 1ml của các dung dịch có độ pha
loãng 10-1, 10-2, 10-3được dùng để phân tích.
- Trường hợp mật độ vi sinh vật quá cao, cần phải sử dụng loạt nồng độ pha loãng
tiếp theo cần phải nhân trị số tra bảng MPN nêu trên với hệ số pha loãng. Ví dụ: sử
dụng 1ml cho mỗi độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4 tức là chỉ sử dụng 1/10 lượng
mẫu ở mỗi nồng độ so với trường hợp dùng 1ml mẫu ở các độ pha loãng 10-1, 10-
2, 10-3. Do vậy, trị số tra bảng MPN cần nhân thêm hệ số pha loãng là 10.
2. QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS VÀ E. COLI BẰNG
PHƯƠNG PHÁP MPN.
Coliforms
E.Coli
3. TIẾN HÀNH PHÂN TÍCH
Mẫu phân tích: Nước mía nguyên chất

3.1. Pha môi trường và dụng cụ
Tên môi trường Thành phần Tổng thể tích
SPW (Saline
Pepton
Water)
NaCl : 42.5g
Pepton: 5g
500 ml nước
cất
LSB
(LaurylSulphateBr
oth)
Tryptose: 20g
Lactose: 5g
Sodiumchloride: 5g
KH
2
PO
4
: 2.75g
K
2
HPO
4
: 2.75g
Lauryl sulphate: 0.1g
1000 ml nước
cất pH 6.8 ±
0.2
BGBL(Brilliant

Green Bile
Lactose Broth)
Peptone: 10g
Lactose: 10g
Mật bò: 20g
Brilliant green: 0.0133g
1000 ml
nướccất pH
7.4
EC
(E.coli medium)
Trypticase or tryptose: 20g
Muối mật No.3: 1.5g
Lactose: 5g
KH
2
PO
4
: 1.5g
K
2
HPO4: 4g
NaCl: 5g
1000 ml nước
cất pH 6.9
EMB
(Eosin Methylene
Blue Agar)
Pancreatic digest of gelatin:
10g

Lactose: 10g
K
2
HPO
4
: 2g
Eosin Y: 0.4g
Methylene blue: 65mg
Agar: 15g
1000 ml nước
cất. pH 7.1 ±
0.2
Tryptone water Tryptone hoặc
trypticase:10g
1000ml nước
cất pH 7.2 ±
0.2
MR-VP
Both
(Glucose
Phosphate)
Môi trường 1:
Buffered peptone-water
powder: 7g
Glucose: 5g
K
2
HPO
4
: 5g

1000ml nước
cất. pH 6.9 ±
0.2
Môi trường 2:
Casein Pancreatic
Digest: 3.5g
Peptic digest of animal
tissue:3.5g
Dextrose: 5g
Potassium phosphate: 5g
pH 6.9 ± 0.2
Môi trường 3:
Peptone: 5g
Glucose: 5g
Phosphate buffer: 5g
pH 7.5 ± 0.2
SCA
(Simmons Citrate
Agar)
Sodium citrate: 2g
NaCl: 5g
K
2
HPO
4
: 1g
NH
4
H
2

PO
4
: 1g
MgSO
4
: 0.2g
Bromothymol blue: 0.08g
Agar: 15g
1000ml nước
cất. Đun nóng
nhẹ và thỉnh
thoảng lắc.
Đun sôi 1-2
phút cho đến
khi hòa tan
hết. pH 6.8 ±
0.2
3.2. Khử trùng dụng cụ và môi trường đã pha
Bao gói dụng cụ và phân phối môi trường vào dụngcụ, gắn nút và
bao gói. Hấp tiệt trùng ở 121
0
C trong 15 phút.
3.3. Tiến hành phân tích.
a. Pha loãng mẫu:
b. Cấy mẫu vào canh LSB
Chuyển 1ml dung dịch 10
-1
, 10
-2
, 10

-3
vào ống 10ml canh LSB, mỗi nồng độ
có 3 ống lặp lại, ủ ở 37
0
C, 48 giờ.
Sơ đồ cấy mẫu từ các độ pha loãng
Ống Mẫu
c. Định lượng Coliform và E.Coli
Định lượng Coliform Định lượng E. coli
Ghi nhận số ống có sinh hơi (+) Ghi nhận số ống có sinh hơi (+)
Dùng que cấy vòng cấy chuyển dịch
mẫu từ các ống LSB (+) sang các ống
có chứa canh BGBL và ủ ở 37
0
C ± 1
0
C,
48 giờ
Dùng que cấy vòng cấy chuyển dịch
mẫu từ các ống LSB (+) sang môi
trường canh EC, ủ ở 44.5
0
C ± 0.2
0
C, 24
giờ
Ghi nhận số ống có sinh hơi (+) ứng
với mỗi độ pha loãng
Ghi nhận số ống có sinh hơi (+) ứng
với mỗi độ pha loãng

Tính kết quả (3.4 cách tính kết quả) Dùng que cấy vòng ria dịch mẫu từ các
ống (+) trên canh EC sang môi trường
thạch đĩa EMB. Ủ ở 37
0
C, 24 giờ.
Chọn khuẩn lạc đường kính lớn hơn
1mm (tròn, dẹt hình đĩa và có ánh
kim xanh)
(xem hình 4 ), cấy vào Trypton, MR-
VP, SC Citrate, ủ ở 44.5
0
C ± 0.2
0
C, 24
giờ
d. Thử nghiệm IMViC
Kết quả IMViC của Escherichia coli sau 24giờ ủ ở 37°C. (Anne Hanson,
University of Maine, Orono)
Ống A: dương tính thử nghiệm indole trên môi trường tryptone. Xuất hiện
lớp màu đỏ trên bề mặt môi trường sau khi nhỏ thuốc thử Kovács.
Ống B: dương tính thử nghiệm methyl red xuất hiện màu đỏ của methyl red.
Ống C: âm tính thử nghiệm Voges-Proskauer biểu hiện qua sự không thay
đổi màu sau khi cho thuốc thử Barritt’s A và Barritt’s B.
Ống D: âm tính thử nghiệm citrate biểu hiện qua sự thay đổi màu sắc và
không có khuẩn lạc trong ống nghiệm.
 Thử nghiệm Indol (I):
Nguyên tắc: Tryptophan là một acid amin có thể bị oxi hóa bởi một số vi
sinh vật có hệ enzyme tryptophanase tạo nên các sản phẩm chứa gốc indol. Việc
phát hiện indol được thực hiện bằng phản ứng của phân tử này với các thuốc
thử chứa p-Dimethylaminbenzaldehyde (p-DMABA) tạo nên một phức chất

dạng quinone có màu đỏ.
Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này là
nước tryptone. Sinh khối chủng thuần được cấy vào môi trường lỏng tryptone,
ủ ở nhiệt độ 37
0
C trong 24-48 giờ. Bổ sung 1ml ether hoặc xylene vào ống
nghiệm, lắc đều để chiết tách indol lên lớp dung môi hữu cơ. Nhỏ 5 giọt thuốc
thử vào ống dịch nuôi cấy, để yên vài phút, theo dõi sự tạo màu đỏ trong lớp dung
môi hữu cơ.
Thử nghiệm Indol.
Đọc kết quả: (+) xuất hiện của lớp màu đỏ trên bề mặt môi trường. (-) lớp
màu vàng của thuốc thử. Đôi khi có sự xuất hiện của màu cam do skatol, là tiền
chất của methyl hóa của indol, tạo ra.
 Thử nghiệm Methyl Red (MR):
Nguyên tắc: chỉ thị đỏ methyl red giúp phân biệt nồng độ H+ hiện diện
trong môi trường sau khi vi sinh vật lên men glucose. Chỉ thị này thay đổi màu như
sau: pH<4.4 đỏ; pH 5.0-5.8 màu cam; pH>6.0 màu vàng.
Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này là môi
trường lỏng Glucose Phosphate (MR-VP Broth). Dùng que vòng cấy một lượng
nhỏ khuẩn lạc trên môi trường MR-VP, ủ ở 37
0
C trong khoảng 2-5 ngày. Thêm vào
vài giọt thuốc thử đỏ methyl red (0.02% trong hỗn hợp cồn nước có tỷ lệ 3:2, bảo
quản ở 4
0
C) vào trong ống nghiệm dịch nuôi cấy, đọc kết quả ngay.
Thử nghiệm MR.
Đọc kết quả: (+) môi trường có màu đỏ sau khi bổ sung thuốc thử. (-)
khi có màu vàng. Trường hợp màu cam, cần tiếp tục ủ ống môi trường có giống
trong 4 ngày và thực hiện lại thử nghiệm.

 Thử nghiệm Citrate (iC)
Nguyên tắc: sự biến dưỡng citrate bởi vi sinh vật sẽ tạo ra CO2 làm kềm hóa
môi trường. Mặt khác mọi VSV có khả năng sử dụng citrate làm nguồn carbon duy
nhất đều có khả năng dùng muối ammonium làm nguồn đạm duy nhất. Sự
phân giải của muối ammonium dùng làm nguồn đạm trong môi trường sẽ
sinh NH3 làm kiềm hóa môi trường. Sự gia tăng giá trị pH này được chỉ thị
bằng sự đổi màu của chỉ thị pH trong môi trường.
Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này là môi
trường lỏng SCA. Dùng que vòng cấy ria một lượng nhỏ khuẩn lạc lên môi
trường SCA rắn trong ống nghiệm thạch nghiêng, ủ ở 35
0
C trong khoảng 24-48
giờ.
Thử nghiệm Citrate.
Đọc kết quả: (+) khi xuất hiện khuẩn lạc và môi trường chuyển sang
màu xanh dương. (-) khi không có khuẩn lạc và môi trường giữ nguyên màu xanh
lục.
3.4. Cách Tính Kết Quả.
Từ số lượng các ống nghiệm có E. coli (+) ở mỗi độ pha loãng của mẫu,
dùng bảng MPN loạt 3 ống nghiệm ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp để tính ra
mật độ vi sinh vật trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị số MPN/ml mẫu ban đầu
chưa pha loãng.
Bảng Tra MPN dùng cho loạt 3 ống nghiệm ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp.
KẾT LUẬN
Phương pháp Most Probable Number (MPN) là phương pháp phổ
biến và đạt hiệu quả trong việc xác định Coliform và E.Coli có trong
thực phẩm. Đây là phương pháp dựa trên bảng MPN để tìm ra có sự hiện
diện của Coliform và E.Coli.
Phương pháp này đòi hỏi thời gian tương đối dài và phương pháp

thực hiện cũng tương đối phức tạp. Các bước thực hiện đảm bảo phải
đúng tránh không có sự nhầm lẫn trong các bước nếu không ta sẽ phải
thực hiện làm lại từ đầu.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Giáo trình phân tích Vi Sinh Thực Phẩm, Ths. Lê Thùy Linh , Trường Đại
Học Công Nghiệp Thực Phẩm Tp.HCM
2. TCVN 6505-2:1999 Sữa và các sản phẩm từ sữa – định lượng E.Coli giả
định bằng phương pháp MPN.
3. Google.com.vn
4. Giáo trình Vi Sinh Thực Phẩm, trường Đại Học Công Nghiệp Tp.HCM.