Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời lycopen và beta caroten trong dầu gấc oleum momordicae

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
— is.EQjgs’
PHẠM THỊ QUỲNH HOA
XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ĐổNG THÒI
LYCOPEN VÀ BETA- CAROTEN TRONG DẦU GẤC
Oleum momordỉcae
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHOÁ 2002- 2007)
Người hướng dẫn : Th.s Nguyễn Tường Vy
CN Vũ Tùng Lâm
Nơi thực hiện : Bộ môn Hoá phân tích
Trường Đại học Dược Hà Nội
Thời gian thực hiện: 03/2007- 05/2007
Hà Nội, tháng 5 năm 2007
LỜI CẢM ƠN
Khoá luận này được thực hiện và hoàn thành tại bộ môn
Hoá phân tích trường đại học Dược Hà Nội.
Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới Th.s Nguyễn
Tường Vy và thầy Vũ Tùng Lâm đã tận tình hướng dẫn và giúp
đỡ tôi hoàn thành khoá luận này.
Đồng thời tôi cũng chân thành cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt
tình của các thầy cô và cấc kỹ thuật viên tại bộ môn đã tạo
điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành khoá luận.
Sinh viên
Phạm Thị Quỳnh Hoa
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐÈ 1
PHẦN 1: TỎNG QUAN
2
1.1. DẦU GẤC 2
1.1.1. Nguồn gốc và đặc điểm 2

1.1.2. Thành phần hoá học 2
1.1.3. Tác dụng và công dụng 2
1.2. BETA- CAROTEN 3
1.2.1. Công thức cấu tạo 3
1.2.2. Tính chất 4
1.2.3. Tác dụng 4
1.2.4. một số phương pháp định lượng 4
1.3. LYCOPEN 5
1.3.1. Công thức cấu tạo 5
1.3.2. Tính chất 5
1.3.3. Tác dụng 5
1.3.4. Phương pháp định lượng
.
5
1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT LYCOPEN VÀ Ị3-CAROTEN
TRONG DẦU GẤC 6
1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP HPLC ĐỊNH LƯỢNG ĐồNG THỜI LYCOPEN
VÀ Ị3-CAROTEN 7
1.6. PHƯƠNG PHÁP HPLC 8
1.6.1. Khái niệm 8
1.6.2. Nguyên tắc của quá trình sắc ký trên cột 8
1.6.3. Pha tĩnh, pha động trong HPLC 9
1.6.4. Các đại lượng đặc trưng 10
1.6.5. Các cách tính kết quả 12
PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

14
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM

14

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
14
2.1.2. Thiết bị và hoá chất 14
2.1.3. Nội dung và phương pháp thực nghiệm 15
2.2. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 16
2.2.1. Xây dựng phương pháp chiết xuất lycopen và ị3-caroten trong dầu
gấc 16
2.2.2. Khảo sát và xây dựng điều kiện sắc ký 17
2.2.3. Đánh giá phương pháp định lượng 21
2.2.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 28
2.2.5. ứng dụng chương trình đã xây dựng để định lượng một số mẫu dầu
gấc 30
2.3. BÀN LUẬN 33
KẾT LUẬN 34
CHÚ GIẢI CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
EtOAC : Ethyl acetat
HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao.
MTBE : Methyl-tert-butyl ether.
MeOH : Methanol
STT : Số thứ tự
THF : Tetrahydrofuran
ĐẬT VẤN ĐÈ
Gấc (Momordica cochinchinensỉs (Lour.) Spreng, họ Bí (Curcubitaceae))
là loại cây rất quý của nước ta. Từ lâu nhân dân ta đã biết dùng quả gấc như
một nguồn thực phẩm bổ dưỡng, dùng dầu ép từ màng đỏ quả gấc để làm
thuốc. Các nhà khoa học đã nghiên cứu, phát hiện trong màng đỏ bao quanh
hạt gấc có rất nhiều chất dinh dưỡng: beta-caroten, lycopen, vitamin E, dầu
thảo mộc Khi vào trong cơ thể, beta-caroten sẽ biến thành vitamin A. Vì thế
người ta dùng dầu gấc để chữa bệnh trẻ em chậm lớn, thiếu vitamin A, khô
mắt, quáng gà, chữa bệnh người lớn kém ăn mệt mỏi. Beta-caroten và lycopen

có tác dụng phòng một số loại ung thư. Beta- caroten phòng và chữa bệnh ung
thư đường tiêu hóa và dạ dày, ung thư phổi. Lycopen có tác dụng phòng
chống ung thư đường tiêu hóa, ung thư tuyến tiền liệt. Do có nhiều tác dụng
tốt như vậy, nên việc chiết xuất dầu gấc ngày càng phát triển để đáp ứng đủ
nhu cầu nguyên liệu cho công nghệ thực phẩm trong nước và xuất khẩu.
Dược điển Việt Nam I, tập 1 đã đưa ra phương pháp định lượng dầu gấc
bằng đo phổ hấp thụ u v - VIS. Tuy nhiên phương pháp này chỉ định lượng
được (3-caroten trong khi lycopen cũng là một thành phần quan trọng có hoạt
tính sinh học cao hiện nay đang được quan tâm rất nhiều. Vì vậy chúng tôi
tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời
p-caroten và lycopen trong dầu gấc ” với mục tiêu cụ thể sau:
- Xây dựng một quy trình kỹ thuật thích hợp để định lượng đồng thời [3-
'■
-

-
—
_
___________________
_
_______
_
_______________
J
caroten và lycopen trong dầu gấc.
- ứng dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng |3-caroten và
lycopen trong nguyên liệu dầu gấc.
1
PHẦN 1: TỎNG QUAN
1.1. DẦU GẤC

1.1.1. Nguồn gốc và đặc điểm
Dầu gấc (Oleum Momordicae) là dầu ép từ màng đỏ phơi hay sấy khô
của hạt cây gấc (Momordica cochinchinensis. Spreng), họ bí (Cucurbitaceae).
Tính chất:
Chất lỏng sánh, trong, màu đỏ máu, mùi thơm ngọt đặc biệt, vị béo,
không khé cổ. Nếu để lâu hoặc ở nhiệt độ 0- 5°c có cặn thì cặn đó thuộc loại
tinh thể carotenoid.
Độ hoà tan: dễ tan trong ether dầu hoả, cloroform và ether.
Tỷ trọng: ở 15°c là 0,9151- 0,9156.
Chỉ số khúc xạ: ở 20°c là 1,4681- 1,4685 [3].
1.1.2. Thành phần hoá học
Trong dầu gấc có trên 0,1% P-caroten , lycopen, các acid béo không no
(acid oleic 44,4%, acid linoleic 14,7%, acid stearic 7,69%; acid palmitic
33,8%) [13].
Ngoài ra còn có một số chất vi lượng cần thiết cho cơ thể như đồng, sắt,
coban, kẽm và selen, một chất mới được biết rất cần thiết để phòng chống ung
thư [6 ].
1.1.3. Tác dụng và công dụng
*1* Tính vị công năng: dầu gấc có vị ngọt, tính bình, có tác dụng bổ tỳ
vị, làm sáng mắt [13].
♦> Công dụng'.
- Dầu gấc được dùng trong nhiều trường hợp cơ thể thiếu
vitamin A như: biến chứng về mắt (khô mắt, quáng gà), trẻ con chậm
lớn, phụ nữ có mang, cho con bú.
2
- Dùng ngoài bôi vào vết thương, vết bỏng làm mau lên da non, chóng
lành. Dầu gấc dùng kèm một số kháng khuẩn đặc biệt chữa được bệnh trứng
cá kén có nhân.
- Dầu gấc nhuận tràng, dùng thích hợp cho người táo bón, người đi lỏng
không nên uống dầu gấc [6], [13].

*1*
Cách dùng
:
- Dùng trong với liều 5 giọt một lần, ngày 2 lần trước 2 bữa ăn chính, có
thể dùng tới 20 giọt. Đối với trẻ em, dùng 5 đến 10 giọt một ngày.
- Dùng ngoài dưới hình thức thuốc mỡ có 5 đến 10% dầu gấc, có thể dùng
dưới hình thức dầu nguyên chất để bôi bỏng [6].
1.1.4. Các phương pháp sản xuất dầu gấc
Muốn chế dầu gấc, trước hết cần sấy khô màng hạt gấc, sau đó tán nhỏ rồi
áp dụng một trong các phương pháp sau [6]:
> Chiết bằng dung môi (ether dầu hoả): Lấy kiệt bằng ether dầu hoả. Sau
đó thu hồi ether bằng cách đun cách thuỷ trong bầu khí trơ. Cặn còn lại là dầu
gấc.
> Ép: Màng đỏ đã sấy khô tán nhỏ, đem đồ lên rồi ép.
> Phương pháp thủ công nghiệp: Màng hạt gấc đã sấy khô tán nhỏ cho
vào dầu lạc hay mỡ lợn đã đun nóng ở nhiệt độ 60-70°. Dầu lạc hay mỡ lợn sẽ
hoà tan chất dầu chứa trong màng dầu gấc.
Dầu gấc được bảo quản trong chai màu, nút kín.
1.2 BETA- CAROTEN.
1.2.1. Công thức cấu tạo
3
Tên khác: Ị3,ị3- caroten, carotaben, provaten, solaten.
Tên khoa học: (all E)- 3, 7, 12, 16- tetramethyl- 1, 18- bis(2, 6, 6- trimethyl
cyclohex- 1-enyl) octadeca-1, 3, 5,7,9,11,13,15,17- nonaene.
1.2.2. Tính chất
- Bột kết tinh màu đỏ nâu.
- Nhiệt độ nóng chảy: 183°c.
- Độ tan: tan trong cyclohexan, cloroform, benzen, ether dầu hoả. Hầu
như không tan trong ethanol, nước.
- Cho phổ hấp thụ UV-VIS, cực đại hấp thụ (trong chloroform) là 497 và

466nm
- Dễ bị biến đổi khi tiếp xúc với không khí, ánh sáng và nhiệt độ [ 14],[21],
1.2.3. Tác dụng
- Về mặt sinh học P-caroten là tiền chất quan trọng nhất của vitamin A.
Trong công nghiệp dược được dùng như vitamin A nhưng không gây tích luỹ
độc như vitamin A. Cơ thể người tích luỹ (3-caroten ở gan và khi cần thì
enzym gan sẽ phần ly P-caroten thành 2 phân tử vitamin A.
- Ị3-caroten còn có tác dụng chống oxy hoá, ngăn ngừa ung thư.
- Trong công nghiệp thực phẩm P-caroten được dùng làm phẩm màu.
1.2.4. Một số phương pháp định lượng
- Sử dụng quang kế với kính lọc màu 347nm, mẫu trắng là ether dầu hoả.
Đọc mật độ quang và đối chiếu với đường cong chuẩn của p-caroten kết tinh
để tính kết quả [3].
- Đo độ hấp thụ của dung dịch (3-caroten trong cyclohexan ở Ảmax=455nm,
E1%!=2500 [14].
- Phương pháp HPLC [24]:
• Cột: Vydac 218TP54
• Pha động: Acetonitril: methanol: tetrahydrofuran (40:56:4)
4
• Detector: 470nm
1.3. LYCOPEN.
1.3.1. Công thức cấu tạo
v ^5ỵ \ /
Tên khác: Ỹ^-caroten
Tên khoa học: (6E, 8E, 10E, 12E, 14E, 16E, 18E, 20E, 22E, 24E, 26E)- 2,
6, 10, 14, 19, 23, 27, 31- Octamethyldotriaconta- 2, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18,
20, 22, 24, 26, 30- tridecaene.
1.3.2. Tính chất
- Tinh thể hình kim màu đỏ tía, không mùi.
- Nhiệt độ nóng chảy: 172 - 173°c.

- Độ tan: tan trong cacbon disulfid, ether dầu hoả, cloroform, benzen. Hầu
như không tan trong methanol, ethanol.
- Phổ hấp thụ cực đại (trong ether dầu hoả) là 472nm [21].
1.3.3. Tác dụng
- Lycopen là một chất có hoạt tính chống oxy hoá mạnh.
- Có tác dụng làm giảm nguy cơ mắc các bệnh tim mạch và ung thư, đặc
biệt là ung thư tuyến tiền liệt.
- Lycopen còn được sử dụng như một chất màu thực phẩm.
1.3.4. Phương pháp định lượng
- Phương pháp HPLC [16]:
• Cột: YMC ODS -AM, 250mm
X
3mm, 5|im, PN AM12S052503WT
(hoặc cột tương đương: Phenomenex, LUNA, C18 (2), 150nm X 4,6mm, 5|im
PN 00F-4252-E0).
• Pha động: MeOH:THF (90:10) Isocratic.
5
• Tốc độ dòng: l,2mL/phút.
• Detector: 472nm.
• Thể tích tiêm: 10(0.1
• Nhiệt độ cột: 30°c
• Thời gian chạy: 12 phút
1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT LYCOPEN VÀ p-CAROTEN
TRONG DẦU GẤC.
❖ Phương pháp 1
Cân chính xác khoảng 0,5g dầu gấc vào bình nón nút mài dung tích
lOOmL, thêm 30mL dung dịch KOH 2N trong ethanol (TT), đung sôi hồi lưu
trong cách thuỷ 30 phút. Sau đó làm lạnh nhanh rồi dùng 20mL nước cất để
chuyển hết hỗn hợp sang bình gạn, acid hoá dung dịch bằng acid HC1 đặc đến
pH khoảng 4-5, chiết 3 lần, mỗi lần với 30mL ether dầu hoả (40-60°C). Rửa

dịch chiết ether dầu với nước cất 3 lần, mỗi lần 70mL. Lọc dịch chiết ether
dầu qua phễu có natrisulfat khan vào bình thuỷ tinh, dùng 30mL ether dầu để
tráng phễu và bình gạn. Để dịch lọc ether dầu bay hơi tự nhiên đến cạn. Dùng
40mL dicloromethan để chuyển hết cắn thu được vào bình định mức màu nâu
50mL, lắc đều và thêm dicloromethan vừa đủ đến vạch, trộn đều. Hút chính
xác 5mL dung dịch vào bình định mức 20mL, thêm dicloromethan vừa đủ,
trộn đều. Lọc qua màng lọc 0,45p.m. Thu được dung dịch thử [5].
❖ Phương pháp 2
Cân chính xác khoảng 0,75g dầu gấc vào bình định mức 20mL, thêm 15
mL ether dầu hoả (40-60° C) lắc kỹ cho tan, định mức đến vạch bằng ether dầu
hoả. Hút chính xác 2,0mL dung dịch này chuyển vào một cột thuỷ tinh có
chứa lg bột nhôm oxyd (đã được hoạt hoá). Cho 20mL ether dầu hoả (40-
60°C) chảy qua cột với tốc độ khoảng 30-35 giọt/phút. Hứng lấy dịch chiết
6
ether dầu hoả, tiếp tục cho 30mL dicloromethan chảy qua với tốc độ như trên.
Gộp dịch chiết dicloromethan và dịch chiết ether dầu hoả, để bay hơi tự nhiên
đến cạn. Dùng dicloromethan để hoà tan và chuyển toàn bộ cắn vào bình định
mức thuỷ tinh màu nâu lOmL, thêm dicloromethan đến vạch, lắc đều, lọc qua
màng lọc cỡ 0,45|im, thu được dung dịch thử [8].
1.5. CÁC ph ư ơ n g ph á p h plc đ ịn h lượ n g đ ồ n g th ờ i l y c o pe n
VÀp-CAROTEN ~
ví —^ _
- Phương pháp 1 [7]:
• Cột: ODS -C18
• Pha động: methanol: acetonitril: cloroform (42:55:3)
• Tốc độ dòng: lmL/ph
• Detector UV- VIS: 470nm
- Phương pháp 2 [8]:
• Cột Lichrospher RP18 (250mm
X

4mm, 10|j,m)
• Pha động: A: Acetonitril
B: Methanol
C: Dicloromethan
Chương trình HPLC:
Thời gian (phút)
Dung môi A
Dung môi B
Dung môi c
o
ị
to
o
100 ->70
0 ^ 10

T
o
to
o
ị
u>
o
70 10
20
30 —> 35 70 100
10-+0
o
T
35->45

100
0 0
• Tốc độ dòng: lmL/phút
• Detector UV-VIS ở bước sóng 476nm
• Thể tích tiêm: 20|il
7
- Phương pháp 3 [25]:
• Cột C30 (YMC Inc. Wilmington, NC), 250mm
X
4,6mm, 3|j,m.
• Pha động: MTBE: MeOH: EtOAC (40:50:10)
• Tốc độ dòng: lmL/ph.
• Thể tích tiêm: 20|j,m
• Detector (DAD): 300-700nm.
1.6. PHƯƠNG PHÁP HPLC
1.6.1. Khái niệm
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC: high performance liquid
chromatography) là một phương pháp hoá lý dùng để tách các thành phần của
một hỗn hợp dựa trên cơ sở phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong
cột nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao.
1.6.2. Nguyên tắc của quá trình sắc ký trên cột:
Nạp mẫu phân tích gồm các chất A, B, c vào cột tách, đồng thời cho
dung môi pha động chảy qua cột, kết quả là các chất A, B, c .sẽ được tách ra
khỏi nhau sau khi đi qua cột. Quyết định hiệu quả của sự tách ở đây là tống
của các tương tác:
F3
Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rữa giải ra
khỏi cột trước tiên khi lực lưu giữ là nhỏ nhất và ngược lại. Đối với mỗi chất
sự lưu giư được quy định bởi 3 lực thành phần: FI, F2, F3. Trong đó FI, F2 là
quyết định, F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn.

8
F1 là lực giữ chất trên cột.
F2 là lức kéo nó ra khỏi cột.
Như vậy, các chất khác nhau thì F1 và F2 sẽ khác nhau, kết quả là các
chất khác nhau sẽ di chuyển trong cột với tốc độ khác nhau và tách hẳn nhau
khi ra khỏi cột [13].
1.6.3. Pha tĩnh, pha động trong HPLC
1.6.3.1. Pha tĩnh:
Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột có nhiệm vụ tách một hỗn hợp
chất phân tích. Pha tĩnh có bản chất là chất rắn, xốp, hạt thường là hình cầu và
kích thước rất nhỏ, đường kính hạt từ 3- 10ụm, diện tích bề mặt riêng từ 50-
500m2/g.
Điều kiện đối với pha tĩnh:
- Phải trơ và bền với các điều kiện cuả môi trường sắc ký.
- Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong
những điều kiện nhất định.
- Tính chất bề mặt phải ổn định, đặc biệt là đặc trưng xốp của nó.
- Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt.
- Hạt phải đồng nhất.
1.6.3.2. Pha động :
Pha động là dung môi để rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột tách,
thực hiện quá trình sắc ký. Nó có thể chỉ là một dung môi hữu cơ hay cũng có
thể là hỗn hợp nhiều dung môi trộn lẫn vào nhau theo một tỷ lệ phù hợp. Nó
cũng có thể là dung dịch của các muối chứa các chất đệm, chất tạo phức.
Điều kiện đối với pha động:
- Phải trơ đối với pha tĩnh.
- Phải hoà tan được các chất phân tích.
- Ben với thời gian.
9
- Có độ tinh khiết cao.

- Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký.
- Phù hợp với loại detector sử dụng.
- Phải kinh tế, không quá đắt và hiếm.
1.6.4. Các đại lượng đặc trưng
signal C o m p o n e n t C o m p o n e n t
• Thời gian lưu (t,.):
Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ lúc bơm mẫu vào cột đến
khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại.
Thời gian lưu phụ thuộc các yếu tố:
+ Bản chất sắc ký của pha tĩnh.
+ Bản chất thành phần, tốc độ của pha động.
+ Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan.
+ Trong một số trường hợp cũng phụ thuộc pH của pha động.
• Hệ số dung lượng (k’):
10
Hệ số dung lượng là một thông số quan trọng mô tả tốc độ di chuyển
của chất qua cột. Cho biết khả năng phân bố của chất đó trong hai pha cộng
với sức chứa của cột.
k'= t_RZlo= tJL_l
to to
• Độ chọn lọc a:
Độ chọn lọc a cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký.
a _ A _ l RB l O
^ B l RA l O
B là chất bị lưu giữ mạnh hơn A
Để tách hai chất cần có a >1, thường dùng trong khoảng 1,05-2,0. Nếu
a quá lớn thì thời gian phân tích kéo dài.
• Số đìa lý thuyết N và chiều cao đĩa lý thuyết H:
Cột sắc ký được coi như có N lớp mỏng, ở mỗi lóp sự phân bố chất tan
vào hai pha được coi là đạt đến một trạng thái cân bằng. Những lóp mỏng này

được gọi là đĩa lý thuyết.
H là chiều cao đĩa lý thuyết:
H = — (L là chiều dài côt)
N
SỐ đĩa lý thuyết được tính bằng công thức sau:
N = 16(— )2 = 5,54(— )2
w X /
W: chiều rộng đo ở đáy pic.
W0 5: chiều rộng đo ở nữa chiều cao pic.
Thực tế N nằm trong khoảng 2500 đến 5500 là vừa đủ.
• Độ phẩn giải R:
Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên
một điều kiện sắc ký đã cho.
11
RB t r a ) _ t RA ) _
_
1 k ' B
■ WA+WB ■ W0>5A+W05B 4 a k'A
R = 0,75 : hai pic tách không tốt, còn xen phủ nhau nhiều.
R = 1 : hai pic tách khá tốt, còn xen phủ nhau 4%.
R = 1,5 : hai pic tách nhau gần như hoàn toàn, chỉ xen
phủ nhau 0,3%
• Hệ số bất đổi xứng:
Hệ số bất đối xứng cho biết mức độ không đối xứng của pic trên sắc đồ
thu được.
T = a, b là đô rông đo ở 1/20 chiều cao pic.
2
a
T nằm trong khoảng 0,5-2,5 thi phép định lượng được chấp nhận.
1.6.5. Các cách tính kết quả

• Phương pháp ngoại chuẩn:
Dựa trên cơ sở so sánh mẫu chuẩn và mẫu thử trong cùng điều kiện. Kết
quả mẫu thử được tính toán so với mẫu chuẩn đã biết trước nồng độ hoặc suy
ra từ đường chuẩn [12].
ST X Cc
ừc
c r: nồng độ dung dich thử.
Cc: nồng độ dung dịch ngoại chuẩn
s r: diện tích pic thử.
sc: diện tích pic chuẩn.
• Phương pháp nội chuẩn:
Người ta chọn một chất chuẩn thứ hai đưa vào trong mẫu phân tích và
trong dung dịch chuẩn đối chiếu. Chất thêm vào này gọi là chuẩn nội. Trong
cùng điều kiện sắc ký nó có thòi gian lưu gần với thời gian lưu của chất phân
12
tích nhưng phải được tách hoàn toàn và có nồng độ tương đương, cấu trúc hoá
học tương tự [12].
sr
CT=^-CnxFx
Yếu tố hiêu chỉnh: Fỵ = S"X C('
sc X c„
Cn: nồng độ dung dich nội chuẩn.
Cc: nồng độ dung dịch ngoại chuẩn.
Sn: diện tích pic chuẩn nội.
sc: diện tích pic chuẩn ngoại.
• Phương pháp thêm chuẩn'.
Thêm vào mẫu thử một lượng xác định chất chuẩn. Tiến hành sắc ký cả
hai dung dịch mẫu thử và mẫu thử đã thêm chất chuẩn trong cùng điều kiện
[12].
Ac: là lượng chất chuẩn thêm vào.

As: là phần tăng của diện tích pic.
• Phương pháp tính theo % diên tích pic:
Hàm lượng phần trăm của các chất cần phân tích trong mẫu được tính
bằng phần trăm diện tích pic của nó so với tổng diện tích tất cả các pic thành
phần trên sắc ký đồ. Kết quả chỉ tương đối và nó đòi hỏi mọi chất trong mẫu
đều phải được rửa giải và được phát hiện như nhau [12].
13
PHẦN 2: THựC NGHIỆM VÀ KÉT QUẢ
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM
2.1.1. Đối tượng nghiên cửu
Chúng tôi sử dụng 8 mẫu dầu gấc do công ty TNHH Hải Linh cung
cấp. Các mẫu này có nguồn gốc khác nhau.
Bảng 1: Các mẫu dầu gấc được dùng để nghiên cứu.
Stt
Mã hoá mẫu
Tên mẫu
1 MI
Thái Nguyên
2 M2
Thanh Hà 1 (011206)
3 M3
Hưng Yên
4 M4
Thái Bình
5 M5
Chí Linh
6
M6 Tứ Kỳ
7
M7 Bắc Giang

8 M8
Thanh Hà 2 (021206)
2.1.2. Thiết bi và hoá chất
2.1.2.1. Thiết bị:
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent - Detetor UV- VIS.
- Cân phân tích Sartorius (10'4).
- Máy lắc siêu âm.
- Bình định mức có nút mài, pipét và các dụng cụ thuỷ tinh cần thiết
khác.
- Cột sắc ký thuỷ tinh dài 20cm, đường kính trong lcm, phía dưới có
vòi khoá.
2.ỉ.2.2. Hoá chất:
14
- Bột nhôm oxyd trung tính được hoạt hoá ở 120°c trong 3 giờ.
- Ether dầu hoả (40-60°C) PA.
- Dicloromethan PA.
- Dung dịch kali hydroxyd 2N trong ethanol.
- Dung dịch HC1 đặc.
- Methanol loại dùng cho HPLC.
- Acetonitril loại dùng cho HPLC.
- Dicloromethan loại dùng cho HPLC.
Chất chuẩn sử dụng trong phân tích gồm:
- Chuẩn làm việc lycopen (Roche).
- Chuẩn P-caroten 95% (C 9750) Sigma.
2.1.3. Nội dung và phương pháp thực nghiệm
2.13.1. Khảo sát xây dựng phương pháp chiết đồng thời lycopen và /?-
caroten trong dầu gấc
2.1.3.2. Lựa chọn điều kiện sắc ký:
Tiến hành trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao detector UV- VIS .
Trên cơ sở có sẵn cột RP18 (250mm X 4mm, lOịim ) chúng tôi tiến

hành khảo sát để lựa chọn điều kiện sắc ký thích hợp cho phép phân tích đồng
thời |3-caroten và lycopen:
- Khảo sát chọn thành phần pha động
- Chọn bước sóng phát hiện.
- Chọn tốc độ dòng.
2.1.3.3. Thẩm định chương trình sắc ký đã xây dựng
- Khảo sát độ ổn định của hệ thống sắc ký.
- Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp.
- Khảo sát độ chính xác của phương pháp.
- Khảo sát độ đúng của phương pháp.
2.1.3.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
15
2.1.3.5. ứng dụng phương pháp đã xây dựng để xác định hàm lượng một số
mẫu dầu gấc
2.1.3.6. Một số công thức tính thống kê xử lý kết quả
- Giá trị trung bình: X = - Y Xị
n t ỉ
2.2. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT
2.2.1. Xây dựng phương pháp chiết xuất Iycopen và p-caroten trong
dầu gấc
Sau khi tiến hành chiết xuất đồng thời lycopen và P-caroten trong dầu
gấc theo 2 phương pháp đã nêu ở mục 1.4 chúng tôi nhận thấy phương pháp 2
tiến hành đơn giản, nhanh chóng hơn so với phương pháp 1. Các vòng caroten
được đẩy ra hết chứng tỏ hoạt chất được chiết kiệt. Các tạp chất không ảnh
hưởng đến quá trình định lượng.
Tuy nhiên quá trình để bay hơi dung môi ở môi trường tự nhiên tương
đối lâu. Với điều kiện của phòng thí nghiệm chúng tôi cho bay hơi dung môi
bằng cách sục khí trơ (khí N2). Phương pháp này vừa rút ngắn thời gian chuẩn
bị mẫu, vừa làm giảm nguy cơ chất phân tích bị oxy hoá khi tiếp xúc với môi
trường tự nhiên. Vì vậy chúng tôi đưa ra phương pháp chiết đồng thời lycopen

và [3-caroten như sau:
Cân chính xác khoảng lg dầu gấc vào bình định mức 25mL, thêm 10
mL ether dầu hoả (40-60°C) lắc kỹ cho tan, định mức đến vạch bằng ether dầu
hoả. Hút chính xác 2,0mL dung dịch này chuyển vào một cột thuỷ tinh có
E o , -x)2
- Độ lệch chuẩn:
M
n
- 1
- Độ lệch chuẩn tương đối: RSD(%) = £ X100
X
16
chứa lg bột nhôm oxyd (đã được hoạt hoá). Cho 20mL ether dầu hoả (40-
60°C) chảy qua cột với tốc độ khoảng 30 giọt/phút. Hứng lấy dịch chiết ether
dầu hoả, tiếp tục cho 30mL dicloromethan chảy qua với tốc độ như trên. Gộp
dịch chiết dicloromethan và dịch chiết ether dầu hoả, làm bay hơi dung môi
đến cắn bằng dòng khí nitơ. Dùng dicloromethan để hoà tan và chuyển toàn
bộ cắn vào bình định mức thuỷ tinh màu nâu 20mL, định mức bằng
dicloromethan đến yạch, lắc đều, lọc qua màng lọc cỡ 0,45|j.m, thu được dung
dịch thử.
2.2.2. Khảo sát và xây dựng điều kiện sắc ký
• Lựa chọn thành phần pha động:
Căn cứ vào đặc điểm của các carotenoid là những chất không hoặc rất ít
phân cực, tan tốt trong các dung môi có độ phân cực thấp (tetrahydrofuran,
dicloromethan, cloroform, acetonitril )- Dựa trên một số tài liệu tham khảo,
và điều kiện hiện có, chúng tôi đã khảo sát sơ bộ với nhiều hệ pha động khác
nhau. Từ kết quả khảo sát sơ bộ, chúng tôi nhận thấy với hỗn hợp 3 chất:
methanol, acetonitril và dicloromethan, (3-caroten và lycopen phân tách tốt,
các pic nhọn và cân đối. Vì vậy từ 3 chất trên chúng tôi tiếp tục khảo sát để
lựa chọn chương trình gradient tối ưu cho pha động.

Các chương trình gradient khảo sát:
Chương trình 1:
Thời gian
(phút)
Acetonitril
(%)
Methanol
(%)
Dicloromethan
(%)
0 - 1 8
100 20 0 10
o
T
o
18 - 30
20 - 100
1 0 - 0
o
ĩ
o
c
17
Chương trình 2:
Thời gian
(phút)
Acetonitril
(%)
Methanol
(%)

Dicloromethan
(%)
0 ^ 18
100 - 25
0 - 1 0
0-» 75
18 -+ 30 25 - 100
10-+0 75 -» 0
Chương trình 3:
Thời gian
(phút)
Acetonitril
(%)
Methanol
(%)
Dicloromethan
(%)
oo
T
o
100 -> 30 0 - 1 0 0 - 6 0
18 - 30 30 - 100
1 0 - 0
o\
o
ị
o
Sau quá trình khảo sát chúng tôi nhận thấy với chương trình 2, 3 thời gian
lưu của các chất khảo sát lớn hơn khi chạy theo chương trình 1, pic không cân
đối có hiện tượng pic bị chẻ ngọn. Vì vây chương trình gradient 1 là chương ụ

trình tối ưu cho quá trình sắc ký.
DAD1A Sig=476,4 Ref=55ũ,100 (MDRPHIN2\1504S000.D)
mAU j
175-Ị
:'í
150:
125:
100
:
75
50
25
cr> c o
1

ì I

Ị~ -
___
JL
JL
“T"
30 35
Hình 3: sắc ký độ của lycopen và p-caroten khi chạy chương
gradient 1
_ _ __
min
trình
18
DAD1 A, Sig=476,4 Ref=550,100 (F:\HPLC-D-1\LYCOPEN\0902SL30.D)

mAU
80
70
60
50
40
30
20
10
0
n
_10_
~r~
_14_
min
Hình 4: sắc ký độ của ly copen và P-caroten khi chạy chương trình
gradient 2
DAD1 A, Sig=476,4 Ref=550,100 (F:\HPLC-D~1\LYCOPEN\0902SL11.D)
mAU
140
120
T
_ r _
10 14
~ĩ'~
.
T-—I —-
„18

.

mill
Hình 5: sắc ký đồ của lycopen và ậ-caroten khi chạy chương trình
gradient 3.
• Lựa chọn bước sống thích hợp để phát hiện hai chất:
Để xác định bước sóng thích hợp phát hiện hai chất, chúng tôi tiến hành
quét phổ UV- VIS của các dung dịch chuẩn riêng rẽ của hai chất trên dải sóng
190- 900nm.
19
Nhận thấy ở Ả=476nm, phổ hấp thụ của hai chất là cực đại. vì vậy chúng
tôi chọn bước sóng này để định lượng hai chất.
• Lựa chọn tốc độ dòng:
Chúng tôi tiến hành khảo sát với các tốc độ dòng khác nhau từ 0,8mL/phút,
đến l,4mL/phút. Qua kết quả cho thấy tốc độ dòng 1 mL/ph các píc được tách
tốt, thời gian lưu ngắn (của lycopen là 9,9 phút, của (3-caroten là 11,84 phút).
Vì vậy chúng tôi quyết định chọn tốc độ dòng là 1 mL/ph.
DAD1A, Sig=476,4 Ref=550,100 (LYCOPEN1\293S3000.D)
250
“ĩ ~
JL JL
~T~
JL
J 5
___
I
JL
min
Hình 6: sắc ký đồ của Lycopen và /3-caroten trong mẫu chuẩn.
DAD1 A, Sig=476,4 Ref=550,100 (LYCOPENU0503M911 .D)
mAU
300

ị 250
200
150
100
50
0
f=
o í ° O r> CV P O C'
5
oq
o
1L
T - p - l
40
Hình 7: sắc ký đồ của Lycopen và P-caroten trong mẫu thử
20