Nghiên cứu ảnh hưởng của vi khuẩn tới quá trình lên men kombucha từ trà shan tuyết hà giang (LV01192)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2






HOÀNG ÁNH SÁNG






NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA VI KHUẨN
TỚI QUÁ TRÌNH LÊN MEN KOMBUCHA
TỪ TRÀ SHAN TUYẾT HÀ GIANG


CHUYÊN NGÀNH: SINH THÁI HỌC
MÃ SỐ: 60 42 01 20




LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. ĐINH THỊ KIM NHUNG







HÀ NỘI, 2014




LỜI CẢM ƠN
______***______

Trong quá trình học tập, nghiên cứu, hoàn thiện Luận văn, ngoài sự
nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của nhiều tập thể, cá nhân.
Lời đầu tiên, tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung -
người đã tận tình hướng dẫn, cung cấp cho tôi nhiều kiến thức quý báu,
giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu, hoàn thiện đề tài.
Xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu Trường ĐHSP Hà Nội 2,
các thầy giáo, cô giáo Khoa Sinh Kỹ Thuật nông nghiệp, Phòng Sau đại học
đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu đề tài.
Xin gửi lời cảm ơn sự giúp đỡ các anh chị trong phòng Vi sinh, các em
sinh viên K37 đang làm đề tài tại phòng Vi sinh, Thư viện Trường ĐHSP
Hà Nội 2, bạn bè, người thân và đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện tốt nhất

để tôi hoàn thành đề tài này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, 16 tháng 11 năm 2014
TÁC GIẢ LUẬN VĂN




Hoàng Ánh Sáng


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những gì viết trong luận văn này đều là sự thật.
Đây là kết quả của riêng tôi. Tất cả các số liệu đều được thu thập từ
thực nghiệm, qua xử lý thống kê, không có số liệu sao chép hay bịa đặt,
không trùng với kết quả bất kỳ của tác giả nào đã công bố. Trong đề tài, tôi có
sử dụng một số dẫn liệu của một số tác giả khác, tôi xin phép tác giả
được trích dẫn để bổ sung cho luận văn của mình.
Nếu sai tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm.

TÁC GIẢ LUẬN VĂN




Hoàng Ánh Sáng

TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT


1. ADP: Adenozin diphotphat
2. ATP: Adenozin triphotphat
3. CFU: Colony Forming Unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc)
4. FAD: Flavin adenine dinucleotide
5. GlcUA: Glucuronic acid
6. MT: Môi trường
7. NADP: Nicotiamide adenine
8. PABA: Para – amino benzoic acid
9. PQQ: Pyrroloquinoline Quinone
10. PQQH
2
: Hydroquinone
11. SCOBY:

Symbiotic Colony of Bacteria and Yeast
12. STT: Số thứ tự
13. TCVN: Tiêu chuẩn Việt nam
14. VSV: Vi sinh vật


DANH MỤC HÌNH, BẢNG

* Danh mục hình
1.1. Kombucha bị nhiễm nấm mốc 6
1.2. Cấu trúc hóa học của một số hợp chất trong trà kombucha 6
1.3. “Con nấm” (SCOBY) 7
1.4. Kombucha được lên men trong các bình chứa có kích thước và hình

dạng khác nhau 8
1.5. Cơ chế phân giải đường trong tế bào nấm men 12
1.6. Quá trình oxi hóa rượu thành acid acetic 13
1.7. Trà Shan tuyết Hà Giang 17
3.1. Sản phẩm kombucha sử dụng phân lập vi khuẩn 31
3.2. Ảnh mẫu vi khuẩn X
4
nhuộm Gram 32
3.3. Chuyển hoá ethanol thành acid acetic của các mẫu vi khuẩn 32
3.4. Hoạt tính catalase của vi khuẩn Acetobacter 35
3.5. Khuẩn lạc của vi khuẩn Acetobacter X
4
trên môi trường thạch đĩa 36
3.6. Mẫu vi khuẩn Acetobacter X
4
trên môi trường thạch nghiêng 37
3.7. Hình thái của chủng vi khuẩn X
4
và 4 chủng vi khuẩn X
1
, X
2
, X
5
, và X
6

trên kính hiển vi điện tử có độ phóng đại 10.000 lần 37
3.8. Đồ thị biểu diễn động thái sinh trưởng của chủng Acetobacter X
4

42
3.9. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của (NH
4
)
2
SO
4
đến hàm lượng acid tổng
số sinh ra của chủng Acetobacter X
4
43
3.10. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của MgSO
4
.

7H
2
O đến hàm lượng acid
tổng số sinh ra của chủng Acetobacter X
4
45
3.11. Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của KH
2
PO
4
đến hàm lượng acid tổng số
sinh ra của chủng Acetobacter X
4
46
3.12. Ảnh Kombucha lên men từ chủng Acetobacter X

4
bổ sung hàm lượng
KH
2
PO
4
1,0 và 1,5 (g/l) 46


3.13. Ảnh Kombucha lên men từ chủng Acetobacter X
4
với thời gian lên
men 5, 7 và 9 ngày 49
3.14. Ảnh Kombucha lên men từ chủng Acetobacter X
4
ở nhiệt độ 20
0
C
và 30
0
C 52
3.15. Quy trình lên men Kombucha quy mô phòng thí nghiệm 54
* Danh mục bảng
1.1. Thành phần hóa học trà kombucha 15
2.1. Các chỉ tiêu đánh giá mức độ cảm quan của kombucha 28
2.2. Hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu 29
2.3. Bảng quy định đánh giá mức chất lượng sản phẩm 29
3.1. Đặc điểm sinh hóa của 5 chủng vi khuẩn Acetobacter 38
3.2. Hàm lượng acid tổng số sinh ra trong quá trình lên men kombucha từ 5
chủng vi khuẩn Acetocbacter 39

3.3. Khả năng tạo độ trong, hương thơm và mùi vị đặc trưng của kombucha
từ 5 chủng vi khuẩn Acetobacter 40
3.4. Quá trình sinh trưởng của chủng Acetobacter X
4
42
3.5. Mẫu thử thay đổi tỉ lệ đường, trà trong 1000 ml nước 47
3.6. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men đến hàm lượng acid tổng số
sinh ra của chủng Acetobacter X
4
49
3.7. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng giống đến hàm lượng acid tổng số
sinh ra của chủng Acetobacter X
4
50
3.8. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hàm lượng acid tổng số sinh ra của
chủng Acetobacter X
4
51
3.9. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng acid tổng số sinh ra
của chủng Acetobacter X
4
52
3.10. Đánh giá chất lượng sản phẩm kombucha bằng phương pháp
cảm quan 57


MỤC LỤC


LỜI CẢM ƠN 1

LỜI CAM ĐOAN 3
TỪ VÀ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT 4
DANH MỤC HÌNH, BẢNG 5
MỞ ĐẦU 1
1. Lý do chọn đề tài 1
2. Mục đích nghiên cứu 1
3. Nhiệm vụ nghiên cứu 2
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2
5. Những đóng góp mới của đề tài 2
6. Phương pháp nghiên cứu 2
CHƯƠNG 1 4
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Tổng quan về Kombucha 4
1.1.1. Sơ lược về kombucha 4
1.1.2. Đặc điểm cấu tạo kombucha. 7
1.1.3. Hệ vi sinh vật trong kombucha 8
1.1.4. Cơ sở khoa học của quá trình lên men kombucha 11
1.1.5. Thành phần hóa học và công dụng của kombucha 14
1.2. Một số đặc điểm của trà Shan tuyết Hà Giang 16
1.2.1. Phương pháp sản xuất trà 17
1.2.2. Đặc điểm của trà Shan tuyết Hà Giang 17
1.3. Tình hình nghiên cứu về kombucha ở Việt Nam và trên thế giới 18
1.3.1. Trên thế giới 18
1.3.2. Ở Việt Nam 19
CHƯƠNG 2 21
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21
2.1. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 21
2.1.1. Đối tượng 21
2.1.2. Hóa chất và thiết bị 21
2.1.3. Môi trường 22

2.2. Phương pháp nghiên cứu 22
2.2.1. Phương pháp vi sinh 22
2.2.2. Phương pháp hóa sinh 25
2.2.3. Phương pháp cảm quan 27
2.2.4. Phương pháp toán học 29
CHƯƠNG 3 31
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 31
3.1. Phân lập các chủng vi khuẩn lên men kombucha từ trà Shan tuyết
Hà Giang 31
3.1.1. Tạo sản phẩm kombucha 31
3.1.2. Phân lập vi khuẩn lên men kombucha 31
3.1.3. Nghiên cứu một số đặc tính của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 34
3.1.4. Phân loại các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn 37
3.2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha 39
3.2.1. Xác định hàm lượng acid tổng số được tạo ra của mỗi chủng vi
khuẩn Acetobacter đã tuyển chọn 39
3.2.2. Đánh giá cảm quan sản phẩm kombucha 40
3.2.3. Nghiên cứu động thái sinh trưởng của chủng Acetobacter X
4
41
3.3. Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá trình lên men
kombucha 43
3.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến quá trình lên
men kombucha 43
3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện môi trường tới quá trình lên
men kombucha 48
3.4. Thực hiện lên men kombucha 53
3.4.1. Sơ đồ lên men kombucha 53

3.4.2. Thuyết minh quy trình 55
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58
1. Kết luận 58
2. Kiến nghị 58
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

1


MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài
Kombucha là thức uống lên men có lợi cho sức khỏe, đã được nhiều
người biết đến với các tên gọi khác nhau “trà nấm”, “thủy sâm”, “thủy hoài
sâm”… nó có vị ngọt và hương thơm của rượu táo lên men.
Trên thế giới, kombucha đã được sản xuất và tiêu thụ dưới nhiều tên
gọi khác nhau như: Machurian, Mo-Gu, Kocha kinoko,… Ở Việt Nam,
kombucha mới chỉ được lên men tại hộ gia đình từ các nguồn nguyên liệu
như trà xanh, trà lipton…. Cách tạo sản phẩm kombucha được nhiều người
quen gọi là “cách nuôi nấm thủy sâm”, nhưng bản chất là quá trình
các vi sinh vật truyển hóa đường (trong dung dịch trà đường) thành acid với
một lượng nhỏ hàng trăm các sản phẩm phụ khác nhau. Chất lượng thành
phẩm kombucha phụ thuộc vào nhiều yếu tố: nhiệt độ môi trường, thời gian
lên men, độ pH của dung dịch, loại trà, thành phần các vi sinh vật,…
Trong đó, vi khuẩn đóng vai trò rất quan trọng để tạo ra sản phẩm kombucha
thơm, ngon, đặc trưng.
Trong những năm gần đây, đã có một số công trình nghiên cứu
về nấm men, vi khuẩn, tác dụng của kombucha…Tuy nhiên, chưa có
nghiên cứu nào đánh giá đầy đủ về sự về sự ảnh hưởng của vi khuẩn,

môi trường lên men, loại vi khuẩn lên men kombucha. Chính vì vậy tôi
quyết định lựa chọn đề tài "Nghiên cứu ảnh hưởng của vi khuẩn tới quá trình
lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang".
2. Mục đích nghiên cứu
Phân lập, tuyển chọn, đánh giá ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn
tới quá trình lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang.
2


3. Nhiệm vụ nghiên cứu
3.1. Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha.
3.2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lên mem kombucha từ trà Shan tuyết
Hà Giang.
3.3. Khảo sát ảnh hưởng của của một số yếu tố tới động thái phát triển
của các chủng vi khuẩn tuyển chọn.
3.4. Thực hiện quy trình lên men kombucha quy mô phòng thí nghiệm.
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Chủng vi khuẩn có khả năng lên men Kombucha từ trà Shan tuyết
Hà Giang.
5. Những đóng góp mới của đề tài
Là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu về đối tượng vi khuẩn
lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang. Đặc biệt, đã phân lập,
được 5 chủng vi khuẩn có khả năng tạo sản phẩm kombucha; xác định được
động thái sinh trưởng, điều kiện môi trường phù hợp cho quá trình lên men
kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang.
6. Phương pháp nghiên cứu
6.1. Phương pháp vi sinh
Phương pháp phân lập vi khuẩn và quan sát hình thái tế bào trên tiêu
bản nhuộm Gram; phương pháp đếm số lượng tế bào vi sinh vật; phương pháp
bảo quản chủng giống.

6.2. Phương pháp hóa sinh
Phát hiện hoạt tính catalase; khả năng oxy hoá acid acetic; chuyển hóa
glycerol thành dihydroxyacetone; sinh trưởng trên môi trường Hoyer; phương
pháp xác định khả năng tổng hợp acid bằng chuẩn độ với NaOH 0,1N
có phenolphtalein 0,1% làm chỉ thị; phát hiện khả năng tổng hợp cellulose.

3


6.3. Phương pháp cảm quan.
Đánh giá sản phẩm theo TCVN 3217 – 79.
6.4. Phương pháp toán học


4


NỘI DUNG
1. CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về Kombucha
1.1.1. Sơ lược về kombucha
Trong sách thuốc cổ Trung Quốc, vào thời Tần Thủy Hoàng, năm 221
trước Công nguyên, người ta đã ghi chép về một loại “Thiên Trà”, trà này
được xem là một phương thuốc trường sinh. “Trà” được đưa vào Nhật do
một y sĩ người Triều Tiên tên là Kombu (và được gọi tên là “Trà Kombu”).
Sau đó được lan truyền sang Ấn Độ, Nga và các nước Đông Âu. [54].
Tuy nhiên, theo GW Frank trong tập sách “Kombu” (1991) thì kombu là
tiếng Nhật để gọi một loại rong biển và “cha” là trà và kombucha phát xuất từ

một loại nuớc uống chế tạo từ rong biển. kombucha đã có một thời kỳ
nổi tiếng tại Châu Âu, nhiều bài báo đã được viết về kombucha, đăng tải
trên các tạp chí quốc tế như "Taking the Fungal-Tea Plunge, Newsweek,
January 9,1995’’…
Ngày nay, trà lên men kombucha là loại đồ uống thông dụng, phổ biến
ở các nước Đông Âu và các nước khác, nó được biết đến như một loại thực
phẩm có lợi cho sức khỏe, được sản xuất và tiêu thụ dưới nhiều tên gọi khác
nhau như: Machurian, Mo-Gu, Champignon de longue vie, Kargasok Tea,
Kwassan, Kocha kinoko, Fungojapon…. Ở nước ta, loại trà lên men này
đã được sản xuất nhỏ lẻ trong một số hộ gia đình, nhưng chưa có nghiên cứu
nào sản xuất trên quy mô công nghiệp. Sản phẩm trà lên men kombucha được
sử dụng ngay sau khi lên men, hoặc bảo quản lạnh trước khi dùng.
Đến thời điểm hiện tại, hiểu biết hóa sinh về các thành phần chất,
chuyển hóa kombucha vẫn còn nhiều bí ẩn, chưa được làm sáng tỏ [39].
5


Các nghiên cứu về vi sinh vật cộng sinh trong kombucha cho thấy: kombucha
thực sự là một tập hợp cộng sinh của nấm men và vi khuẩn acid acetic [27],
[33], [44]. Các vi khuẩn acetic chính được tìm thấy trong các loại nấm trà:
Acetobacter xylinum [15], Acetobacter aceti, Acetobacter pasteurianus [38],
Gluconobacter oxydans [24], [35]. Nhiều hợp chất quan trọng đối với việc
bảo vệ sức khỏe con người, được sản xuất trong quá trình lên men của
kombucha cộng sinh: một loạt các axit hữu cơ như glucuronic, gluconic,
lactic, acetic, axit succinic, butyric, axit malic và usnic; vitamin, đặc biệt là
nhóm B và vitamin C, axit amin tự do và các enzyme hoạt động khác nhau.
GlcUA được coi là một trong những hợp chất quan trọng được tìm thấy trong
kombucha giải khát do tác động giải độc của nó và ảnh hưởng tới sức khỏe
[29], [37], nó ngăn ngừa bệnh tim mạch, các bệnh thoái hóa thần kinh mãn
tính thoái hóa và ung thư [22], [44].

Quá trình lên men được bắt đầu bằng con nấm giống hay chính là sự
lên men cộng sinh của vi khuẩn và nấm men, “con nấm” này được các nhà
khoa học phân loại như là biofilm (màng sinh học – là một tổ hợp vi sinh vật
trong đó các tế bào kết dính lại với nhau thành một cấu trúc trên bề mặt và
sinh ra các ngoại cao phân tử EPS – Extracellular Polymeric substance).
Con nấm có hình dạng giống bình chứa nó, bề dày thì phụ thuộc vào thời gian
nuôi cấy và độ pH của môi trường.
Nồng độ acid và rượu trong kombucha giúp chống nhiễm các nấm mốc
trong không khí và các bào tử vi khuẩn. Kết quả là kombucha có thể tương
đối dễ dàng lên men trong điều kiện thường. Các vi khuẩn và nấm men trong
kombucha cũng sản xuất ra các kháng sinh [26].
Trong quá trình làm cẩn thận để tránh cho trà không bị nhiễm các loại
nấm mốc gây độc cho cơ thể. Các yếu tố để đảm bảo an toàn cho việc lên
men: môi trường sạch sẽ, nhiệt độ thích hợp, pH thấp.
6


Nếu quá trình lên men bị nhiễm nấm mốc, có thể nhận thấy bằng
mắt thường như trên bề mặt “con nấm” có xuất hiện màu xanh lá cây,
xanh dương hoặc màu đen, mốc trắng hình cầu thì đó có thể là các loài nấm
mốc Aspergillus parasiticus, Aspergillus flavus, Penicillium citricum…
Các loại nấm mốc trên sẽ sản sinh ra mycotocin, citrinin, aflatoxin… đều là
các độc tố và gây mùi khó chịu.

Hình 1.1. Kombucha bị nhiễm nấm mốc
Trà kombucha là một loại thức uống bổ dưỡng. Quá trình lên men sản
sinh ra nhiều chất có lợi cho sức khỏe như vitamin, khoáng chất, acid
glucuronic, acid lactic, acid acetic và vitamin B (B1, B2, B3, B5, B6, B15…),
các hợp chất hữu cơ khác như PABA, acetamidophenol, cafein… [24], [28].

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của một số hợp chất trong trà kombucha
7


1.1.2. Đặc điểm cấu tạo kombucha
Hệ vi sinh vật trong kombucha rất phong phú, chủ yếu là các chủng
Acetobacter như: Acetobacter xylinum, Acetobacter ketogenum… và nấm men:
Saccharomycodes ludwigii, Saccharomycodes apiculatus, Saccharomyces
cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe… Ngoài ra còn có thể có các chủng :
Lactobacillus, Brettanomyces, Pediococcus, Bacterium gluconicum…[33].
Chính sự có mặt của các chủng Acetobacter (đặc biệt là Acetobacter
xylinum) đã hình thành nên cấu trúc của kombucha. Acetobacter xylinum có
khả năng tạo màng hemicellulose khá dày và chắc (tạo màu xanh với iot và
H
2
SO
4
) nên kombucha trông giống một cái bánh dẹp, thường được gọi là
“con nấm” hay SCOBY.

Hình 1.3. “Con nấm” (SCOBY)
Kombucha sinh trưởng tốt trong môi trường nước trà đường. Trong quá
trình lên men, kombucha sẽ tạo ra một lớp màng mỏng trên bề mặt dịch trà
và dần dần tăng bề dày, hình thành nên một lớp màng thứ hai (thường gọi là
“nấm con”), tách biệt với lớp màng ban đầu (“nấm mẹ”).
Hình dạng và kích thước của “con nấm” phụ thuộc vào hình dạng tiết
diện của bình chứa.
8

Hình 1.4. Kombucha được lên men trong các bình chứa có kích thước và
hình dạng khác nhau
Người ta có thể dùng trà xanh, trà đen, chè xanh, trà lipton để làm
môi trường lên men kombucha. Các loại trà khác nhau sẽ tạo ra sản phẩm
kombucha có ra mùi vị khác nhau.
1.1.3. Hệ vi sinh vật trong kombucha
1.1.3.1. Vi khuẩn acetic
Vi khuẩn acetic thuộc họ Acetobacteriaceae (hiếu khí bắt buộc).
Chúng phát triển tốt trên bề mặt môi trường, phân bố rộng rãi, đa dạng, phong
phú trong tự nhiên: trong không khí, đất, gỗ, cây ăn trái, đặc biệt là các loại
thực phẩm, hoa trái, nước trái cây và các sản phẩm lên men tự nhiên chứa
ethanol như rượu, bia, giấm tự nhiên… Bên cạnh những mặt có lợi trong lên
men như giấm, vi khuẩn acetic được xem là một trong những nguyên nhân
quan trọng gây hư hỏng thực phẩm tươi và thực phẩm lên men giàu cồn.
Họ vi khuẩn Acetobacteraceae (Gillis và de ley, 1980) bao gồm:
Chi Acetobacter (Beijerinck, 1898);
Chi Gluconobacter (Asai, 1935);
Chi Acidomonas (Urakami et al., 1989);
Chi Gluconacetobacter (Yamada et al., 1998);
Chi Asaia (Yamada et ai., 2000);
Chi Kozakia (Lisdiyanti et al., 2002);
Chi Swacharibacter (Jojima et al., 2004);
9


Chi Neoasaia (Yukphan et al.,2006);
Chi Granulibacter ( Greenberg et al., 2006).
* Các phương pháp truyền thống trong phân loại và định danh
họ Acetobacteriaceae:

Việc phân loại và định danh vi khuẩn theo phương pháp truyền thống
chủ yếu dựa vào các đặc điểm kiểu hình bao gồm các đặc điểm hình thái,
sinh lý, dinh dưỡng và đặc điểm sinh thái.
a. Đặc điểm hình thái
Các đặc điểm hình thái thường được khảo sát gồm màu sắc, hình dạng
khuẩn lạc, trạng thái nhuộm Gram, cách sắp xếp, hình dạng và kích thước
tế bào. Ngoài ra, số lượng và cách sắp xếp roi trên tế bào cũng có vai trò trong
định danh vi khuẩn acetic.
b. Đặc điểm sinh thái
Đặc điểm phân bố của vi khuẩn acetic thường gắn liền với các nguồn
dinh dưỡng chứa đường hay alcohol như các loại hoa, quả, bia, rượu và các
nơi sản xuất giấm. Tuy nhiên, trong một số trường hợp, đặc điểm sinh thái
được đánh giá là đặc điểm điển hình của giống hay loài. Cụ thể như
Acidomonas chỉ có thể phân lập được trong bùn hoạt tính có methanol;
Granulibacter được tìm thấy trong cơ thể người bị u hạch; một số loài có khả
năng cố định đạm thuộc hai giống Acetobacter và Gluconacetobacter
sống cộng sinh trong rễ cây họ đậu.
c. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Các đơn vị phân loại thuộc nhóm vi khuẩn sinh acetic acid được
phân biệt bởi các đặc điểm sinh lý, sinh hóa sau: Oxy hóa acetate tạo CO
2

và H
2
O; phát triển ở các khoảng nhiệt độ, áp suất thẩm thấu và pH khác nhau;
phát triển sinh khối trong các môi trường chứa D- glucose 30%; acetic acid
10


0,35%; KNO

3
1%; methanol; glutamate và malnitol; sinh acetic acid
từ ethanol; tạo sắc tố hòa tan trong nước; đồng hóa ammonia trong
môi trường chứa D- glucose, D-malnitol hay ethanol; tạo dyhidroxyaceton
từ glcerol; phát triển trong môi trường không có nicotinic acid; phát triển
sinh khối và tạo acid trong các môi trường có nguồn carbon duy nhất là:
D-glucose, D-mamnose, D-galactose, D-fructose, L-sorbose, D-xylose,
arabinose, L-arabinose, D-malnitol, D-sorbitol, glycerol, maltose, lactose,
melibiose, sucrose, raffinose và ethanol [31], [49].
1.1.3.2. Nấm men
Tế bào nấm men thường có dạng hình cầu, ovan, elip, hình trụ…,
thường có kích thước rất lớn gấp từ 5 – 10 lần tế bào vi khuẩn. Kích thước
trung bình: chiều dài: 9 – 10

m, chiều rộng: 2 – 7

m. Hình dạng và kích
thước tế bào thay đổi, không đồng đều ở các loài khác nhau, ở các lứa tuổi
khác nhau và điều kiện nuôi cấy khác nhau. Nấm men là sinh vật đơn bào
nhân chuẩn, tế bào nấm men cũng như nhiều loại tế bào khác được cấu tạo
chủ yếu từ các phần cơ bản như sau: thành tế bào, màng sinh chất,
chất nguyên sinh, nhân tế bào và những thành phần khác: không bào, ty thể,
riboxom,…[4].
Nấm men có một số hình thức sinh sản sau: Sinh sản bằng cách
nảy chồi, phân đôi, sinh sản bằng bào tử và sự hình thành bào tử.
Phân loại: nấm men chủ yếu có hai lớp: nấm men thật (Ascomyces)
và nấm men giả (Fungi imperfecti). Lớp nấm men thật phần lớn dùng trong
công nghiệp thuộc lớp Ascomyces, đa số thuộc giống Saccharomyces.
Lớp nấm men giả bao gồm giống Crytococus, Mycoderma, Eandida,
Geotrichum, Rhodotorula.

11


1.1.3.3. Vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lên men lactic thuộc họ Lactobacterium. Đây là những
trực khuẩn, cầu khuẩn không tạo bào tử và hầu hết không di động, hô hấp
tùy tiện. Chúng có khả năng lên men nhiều loại đường đơn và đường đôi
nhưng không có khả năng lên men các loại glucid phức tạp và tinh bột.
Sự phát triển của nó cần có sự có mặt của pepton, acid amin hay muối amon.
Chúng có yêu cầu đặc biệt về chất dinh dưỡng là giàu vitamin, acid amin
và khoáng chất. Quá trình lên men xảy ra tốt nhất trong môi trường acid.
Nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men từ 15 ÷ 50
0
C. Tuy nhiên, mỗi loài
có khoảng nhiệt độ thích hợp khác nhau, nếu nhiệt độ lớn hơn 80
0
C vi khuẩn
lactic bị tiêu diệt hoàn toàn.
1.1.4. Cơ sở khoa học của quá trình lên men kombucha
Theo kết quả nghiên cứu về thành phần cấu tạo của kombucha thì quá
trình lên men dịch trà có thể xảy ra các quá trình sau:
* Lên men ethanol
Lên men rượu là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của
nấm men, chúng sẽ chuyển hóa đường lên men thành ethanol và CO
2
.
Quá trình lên men rượu chia làm hai thời kỳ chính: thời kỳ phát triển
sinh khối và thời kỳ lên men chuyển đường thành rượu và CO
2

. Sau khi được
vận chuyển vào trong tế bào chất, đường hexose được chuyển hóa theo
chu trình đường phân để tạo thành acid pyruvic. Tiếp theo acid pyruvic
sẽ được chuyển hoá thành acetaldehyde rồi thành ethanol. Dihydroxyacetone
phosphat là một sản phẩm trung gian trong chu trình đường phân, hợp chất
này có thể chuyển hoá thành glyxerol. Trong môi trường pH acid, glycerol
chỉ được tạo ra với hàm lượng nhỏ. Ngược lại, trong môi trường pH kiềm
lượng glycerol sinh ra sẽ tăng lên rất nhiều và glycerol sẽ trở thành một trong
những sản phẩm chủ yếu của quá trình lên men.
12



Hình 1.5. Cơ chế phân giải đường trong tế bào nấm men
Phương trình tổng quát của quá trình lên men trong môi trường pH acid:
C
6
H
12
O
6
+ 2ADP +2Pi
→ 2C
2
H
5
OH + 2CO
2
+ 2ATP
Sự chuyển hóa đường hexose thành ethanol và khí CO

2
diễn ra trong
tế bào chất của nấm men. Đây là quá trình trao đổi năng lượng của nấm men
trong điều kiện kỵ khí. Ethanol và CO
2
trong tế bào chất sẽ được nấm men
thải vào môi trường lên men. Ngoài ra, tế bào nấm men còn tổng hợp và thải
vào dịch lên men hàng trăm sản phẩm phụ và sản phẩm lên men khác,
13


những hợp chất này được tìm thấy với hàm lượng rất nhỏ, chúng được
chia thành 4 nhóm: glyxerol cùng rượu bậc cao, aldehyde, acid hữu cơ và
este. Trong quá trình lên men ethanol, nhiều acid hữu cơ được tạo thành
(The Moll, 1990). Một số acid hữu cơ được sinh tổng hợp từ chu trình Krebs,
nếu như quá trình lên men không diễn ra trong điều kiện kỵ khí nghiêm ngặt,
các acid hữu cơ chiếm hàm lượng cao nhất trong dịch lên men là: acid citric,
malic, acetic, lactic
* Lên men acetic:
Lên men acid acetic là quá trình oxy hóa rượu thành acid acetic
dưới tác dụng của vi khuẩn [31].
C
2
H
5
OH + O
2
→ CH
3
CHO (Acetaldehyde) + H

2
O
CH
3
CHO + H
2
O → CH
3
CH(OH)
2
(Hydrat acetaldehyde)
CH
3
CH(OH)
2
+ O
2
→ CH
3
COOH + H
2
O


Hình 1.6. Quá trình oxi hóa rượu thành acid acetic
14


* Lên men lactic:
Lên men lactic là một quá trình trao đổi năng lượng. Các phân tử ATP

được hình thành trong quá trình chuyển hóa cơ chất sẽ được vi khuẩn giữ lại
trong tế bào để phục vụ cho quá trình trao đổi chất và sinh trưởng của vi sinh
vật. Ngược lại, các sản phẩm như acid lactic, ethanol, CO2 được vi khuẩn thải
vào môi trường lên men. Kết quả là hàm lượng acid lactic tích lũy trong
môi trường lên men ngày càng tăng, làm giảm pH môi trường và kéo theo
những biến đổi hóa lý khác. Bản chất là quá trình chuyển hóa đường thành
acid lactic nhờ vi sinh vật.
Phương trình phản ứng:
C
6
H
12
O
6
→ CH
3
CHOHCOOH + 94kcal
Trong quá trình lên men lactic ngoài sản phẩm acid lactic (lên men
đồng hình), acid acetic, ethanol, CO
2
(lên men dị hình). Trong dịch lên men
còn xuất hiện cả trăm hợp chất hóa học mới khác. Một số hợp chất trong
nhóm trên rất dễ bay hơi. Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc góp phần
hình thành nên mùi vị đặc trưng cho những sản phẩm lên men lactic.
Phương trình tổng quát:
C
6
H
12
O

6
 CH
3
CHOHCOOH + CH
3
COOH + C
2
H
5
OH + COOH(CH
2
)
2
COOH + CO
2
Glucose acid lactic(40%) acid acetic ethanol acid succinic
Lượng sản phẩm phụ tạo thành hoàn toàn phụ thuộc vào giống vi sinh
vật, vào môi trường dinh dưỡng và điều kiện ngoại cảnh, nói chung thì acid
lactic thường chiếm 40% lượng đường đã được phân hủy, acid succinic 20%,
ethanol chiếm 10%, acid axetic 10% và các loại khí gần 20%.
1.1.5. Thành phần hóa học và công dụng của kombucha
Kombucha có thể sử dụng một số loại trà để lên men, nhưng không
sử dụng được trà thảo mộc vì kombucha dễ bị hỏng khi lên men trà có nhiều
tinh dầu. Loại trà như Earl Grey có chứa dầu thơm Bergamot, có thể làm cho
15


kombucha bị chết hoặc bị ảnh hưởng xấu. Sử dụng các loại trà khác nhau
sẽ cho ra những loại thức uống với những hương vị khác nhau.
1.1.5.1. Thành phần hóa học của kombucha

Theo nghiên cứu của tổ chức The American FDA and CDC [46], [47],
tỷ lệ các chất hóa học có trong trà kombucha như sau:
Bảng 1.1. Thành phần hóa học trà kombucha
Thành phần Giá trị Đơn vị
Acetic Acid 2,36 g/l
Glyconic Acid 0,129 g/l
Formic Acid 0,109 g/l
Oxalic Acid 0,01 g/l
Caffeine 0,065 g/l
Vitamin B1 0,74 g/l
Vitamin B6 0,52 g/l
Vitamin B12 0,84 g/l
Vitamin C 1,51 g/l
pH 3,2
1.1.5.2. Công dụng của kombucha
Kombucha đã được Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm của Mỹ
(FDA) chứng nhận là an toàn đối với con người [47]. Theo nhiều nghiên cứu
trên thế giới thì trà kombucha có nhiều lợi ích đối với con người [22], [32],
thường được tìm mua ở các cửa hàng thực phẩm chức năng. Tác dụng của trà

kombucha dựa trên các thành phần sau: Acid Lactic: cần thiết cho hệ thống
tiêu hóa, giúp cho việc lưu thông máu, cân bằng độ acid và kiềm trong cơ thể.
Trong kombucha, acid này tồn tại ở dạng có lợi nhất (lactic – L); Acid Acetic:
là 1 chất bảo quản chống lại sự xâm nhập của vi khuẩn có hại; Acid Usnic: là
1 loại chất kháng sinh tự nhiên, giúp chống lại nhiều loại virus. Acid Oxalic là
một chất bảo quản hiệu quả và cung cấp năng lượng; Acid malic giúp giải độc
gan; Acid butyric tạo ra bởi nấm men, bảo vệ màng tế bào …
16

1.1.5.3. Một số lưu ý khi sử dụng
Do trà chứa nhiều acid lactic, uống quá nhiều, trong một thời gian dài
không có lợi cho sức khỏe, có thể dẫn đến đau khớp, chóng mặt, viêm xoang;
trẻ em có thể dùng nhưng liều lượng thay đổi theo tuổi, cân nặng và cần phải
được pha loãng với nhiều nước, không nên cho trẻ dưới 2 tuổi uống; phụ nữ
có thai không nên dùng vì có đến 1% lượng cồn trong nước trà, không nên
uống trong thời gian cho con bú vì gây đau bụng cho trẻ sơ sinh; người tiểu
đường không nên uống nhiều vì hàm lường sót kombucha vẫn còn khá cao
(5-8 mg/l); Trà kombucha gây loãng máu, cần giảm liều và chú ý ngưng một
tuần trước khi phẫu thuật; phụ nữ bị rong kinh cũng cần thận trọng và nên
ngưng sử dụng trước kinh kỳ tối thiểu một tuần. Men trà kombucha có thể bị
hỏng và mất hết tác dụng nếu ủ không đúng quy cách [34], [36], [50]
1.2. Một số đặc điểm của trà Shan tuyết Hà Giang
Trà Shan tuyết là từ dùng để gọi các loại trà được sản xuất từ búp cây
chè cổ thụ, mọc trên các vùng núi cao (trên 1.000m so với mặt nước biển).
Chúng thuộc giống chè cổ thụ 200-300 năm tuổi, búp chè phủ một lớp lông tơ
mịn như nhung, trắng như tuyết, bởi thế người ta gọi là chè Shan tuyết (có
người cho rằng chữ “Shan” là chữ gọi chệch của “Sơn”). Ở nước ta có nhiều
vùng chè Shan tuyết như: Thái Nguyên, Hà Giang, Tuyên Quang, trong đó,
Hà Giang là vùng sản xuất trà Shan tuyết nổi tiếng và lâu đời nhất nước ta.
Ngay từ những năm đầu thế kỷ 20, người Pháp đã tiến hành điều tra cây chè
ở Hà Giang và đặc biệt chú ý những cây chè cổ thụ vùng cao.
Về giống chè Shan Hà Giang có thể chia thành 2 dạng chính đó là chè
shan lá nhỏ, tiêu biểu chè Lũng Phìn (Đồng Văn), Phìn Hồ (Hoàng Su Phì)
với đặc điểm dạng tán hình mâm xôi hoặc dạng nến. Dạng chè shan thứ 2 với
tiêu biểu vùng chè cổ Bó Đướt, Thượng Sơ (Vị Xuyên). Loại chè này đặc biệt
nhiều về mức độ lông tuyết ở cả búp lá 1 và một phần lá 2. Cây chè càng già
17

càng quý, tuyết trắng cuả trà càng nhiều thì trà chất lượng càng cao, cây chè
mọc ở độ cao càng cao so với mặt nước biển thì càng nhiều tuyết trắng.
Loại trà chúng tôi sử dụng cho đề tài là trà Shan tuyết Phìn Hồ.
1.2.1. Phương pháp sản xuất trà
Trà Shan tuyết được chế biến từ búp chè tươi, qua các quá trình sau:
Chè búp sau khi thu hái tiến hành diệt men triệt bằng thùng quay
(khoảng 8-10 phút, nhiệt độ trong khối nguyên liệu 800 C, nhiệt độ của chảo
sao 3500 C.) đến khi chè chín đều thì đổ ra rải mỏng cho nguội. Sau đó tiến
hành vò chè, vò làm 2 công đoạn: Cho chè đã diệt men vào túi vải rồi vò bằng
tay trong thời gian 2-5 phút; sau đó cho chè vào cối vò để vò, thời gian vò
13 - 15 phút. Sau khi vò, cho chè ra nia, rũ tơi và sao lăn đến khô ta được sản
phẩm trà Shan tuyết.
1.2.2. Đặc điểm của trà Shan tuyết Hà Giang
- Ngọn chè Shan Tuyết tươi phủ một lớp phấn trắng như tuyết.
- Thành phẩm trà xoăn chặt, màu xanh đen, cánh trà có tuyết.
- Nước trà sau khi pha có màu vàng sậm có hương thơm, uống lúc đầu
chát gắt, có vị đắng, sau có vị ngọt kéo dài, pha nhiều lần vẫn đậm.

Hình 1.7. Trà Shan tuyết Hà Giang.
Do quá trình diệt men làm đình chỉ hoạt động của enzyme, nên các
thành phần trong búp chè ít bị biến đổi, hàm lượng polyphenol trích ly trong