PHÂN lập VI KHUẨN KHỬ đạm pseudomonas stutzeri TRONG nước THẢI TRẠI CHĂN NUÔI và NUÔI TRỒNG THỦY sản của TỈNH sóc TRĂNG

PHÂN LẬP VI KHUẨN KHỬ ĐẠM Pseudomonas stutzeri TRONG NƯỚC THẢI TRẠI
CHĂN NUÔI VÀ NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CỦA TỈNH SÓC TRĂNG
Trịnh Hoài Vũ
1
, Lê Công Quyền
2
1. GIỚI THIỆU
Hiện nay vấn đề xử lý các hợp chất chứa đạm từ nước thải đã được nghiên cứu nhiều,
trong số đó biện pháp xử lý bằng vi sinh vật được chú ý đặc biệt do hiệu quả xử lý cao và ít tốn
chi phí. Trong xử lý nước thải, sự loại thải hợp chất đạm có thể được thực hiện bởi sự kết hợp
của quá trình nitrate hóa (oxi hóa ammonia thành nitrate) và quá trình khử nitrate (khử nitrate
thành N
2
O hoặc N
2
). Điều này đòi hỏi hoạt động phối hợp hoặc nối tiếp của các nhóm vi sinh vật
khác nhau, đặc biệt là vi khuẩn nitrate hóa và vi khuẩn khử nitrate (Lee et al., 2002). Một số
dòng vi khuẩn tham gia trong chu trình nitơ như Pseudomonas stutzeri có khả năng khử đạm
(denitrifying bacteria) dưới dạng thức ăn thừa hoặc phân giúp giảm lượng nitrate, ammonium
gây ô nhiễm nguồn nước, cải thiện chất lượng nước ao nuôi, góp phần thực hiện nuôi thủy sản
bền vững. Do đó, đề tài “Phân lập vi khuẩn khử đạm Pseudomonas stutzeri trong nước thải trại
chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản ở tỉnh Sóc Trăng” được thực hiện nhằm mục đích phân lập
được loài Pseudomonas stutzeri có khả năng khử đạm tốt góp một phần vào việc phục vụ cho
việc xử lý nước thải từ các trại chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản tại tỉnh Sóc Trăng.
Sơ lược về vi khuẩn Pseudomonas stutzeri
Loài vi khuẩn Pseudomonas stutzeri được phân lập và xác định lần đầu tiên bởi Burri và
Stutzer vào 1895 với tên gọi là Bacillus denitrificans II, sau đó được van Niel và Allen xác định
tên chính thức của nó là Pseudomonas stutzeri (van Niel và Allen, 1952). Đây là loài vi khuẩn
Gram âm, hình que, kích thước khoảng 1,4-2,8 x 0,7-0,8 µm, di chuyển bằng 1 chiên mao ở đầu.
Các dòng khuẩn lạc được phân lập đến nay đều là dính chặt, có màu nâu tối và có đặc điểm bên
ngoài nhăn nheo, đặc điểm này thường bị mất đi sau vài lần được cấy truyền trong môi trường thí

nghiệm (Garrity, 2005). Các khuẩn lạc cuối cùng có thể trở nên trơn láng, đặc và mất màu. Phản
ứng dương tính với gelatinase. Trong số các đặc điểm để nhận diện Pseudomonas stutzeri là khả
năng khử nitrat mạnh, sự xuất hiện các khuẩn lạc và việc sử dụng tinh bột làm nguồn carbon và
năng lượng duy nhất. Có thể sinh trưởng ở nhiệt độ từ 4-45
o
C (Lalucat et al., 2006). Nhiệt độ tối
thích khoảng 35
o
C (van Niel và Allen, 1952). pH tối thích khoảng 7 nhưng có thể sinh trưởng ở
pH 9 (van Niel và Allen, 1952). Hàm lượng G-C của DNA từ 60,6-66,3 (Garrity, 2005). Dòng
mẫu của loài là: AB 201, ATCC 17588, CCUG 11256, DSM 5190 được đăng ký trên GenBank.
Pseudomonas stutzeri là một loài vi khuẩn được phân bố rộng rãi nhất trong môi trường
tự nhiên, có thể được phân lập sau khi tăng sinh trên môi trường có nitrat dưới các điều kiện
hiếm khí ở 30
o
C sử dụng các nguồn carbon khác nhau. L (+) - tartrate cho thấy kết quả tuyệt vời
1 Ths. GV Bộ môn CNSH, khoa Nông nghiệp - TNTN, Đại học An Giang; Email:
2 Ths. GV Bộ môn Thủy sản, khoa Nông nghiệp - TNTN, Đại học An Giang; Email:
khi tăng sinh (van Niel và Allen, 1952) dù một nghịch lý là các dòng nhận được bằng cách này
không thể sinh trưởng với tartrat khi nuôi cấy thuần (Garrity, 2005).
Pseudomonas stutzeri được quan tâm nhiều vì đặc điểm tính chất đa dạng của các quá
trình chuyển hóa của chúng đối với nhiều loại hợp chất khó phân hủy trong tự nhiên (Bennasar
et al., 1998a), chẳng hạn như phân hủy các hợp chất o-xylene (Baggi et al., 1987),
carbazol/dioxin (Shintani et al., 2003), oxy hóa hiếm khí hợp chất 2-chloroethanol (Dijk et al.,
2003),… Tuy nhiên, khả năng khử nitrat là một đặc tính bền vững của Pseudomonas stutzeri, loài
vi khuẩn này là một trong những loài vi khuẩn dị dưỡng khử nitrat hiệu quả nhất và được xem
như là một hệ thống chuẩn của quá trình khử nitrat bằng vi khuẩn (Zumft, 1997).
Pseudomonas stutzeri đã được biết là một loài vi khuẩn khử nitrat rất mạnh, có khả năng
sinh trưởng trên môi trường chứa nitrat, nitrit và nitrous oxide. Beijerinck và Minkman cho rằng
dòng vi khuẩn β mà Gayon và Dupetit (những nguời đầu tiên nghiên cứu về quá trình khử nitrat)

sử dụng cho việc nghiên cứu của họ là dòng Bacillus stutzeri (hiện nay là Pseudomonas stutzeri)
(Zumft, 1997).
Khả năng khử nitrat của Pseudomonas stutzeri cơ bản dựa trên toàn bộ các gen mã hóa
cho các enzyme dị hóa nitrat (dissimilatory reductase) chứa bên trong. Chúng bao gồm: gen nar
(nitrate reductase), gen nir (nitrite reductase), gen nor (nitric oxide reductase) và gen nos (nitrous
oxide reductase) (Lalucat, 2006). Tổ chức của toàn bộ các gen này trong vi khuẩn Pseudomonas
stutzeri được trình bày trong Hình 1.
Hình 1. Tổ chức của các gen tham gia vào quá trình khử nitrate của vi khuẩn Pseudomonas
stutzeri (Lalucat, 2006)
Trong đó, các gen nar không liên kết với các gen khác như nir, nor hay nos trong quá
trình khử nitrat mà nằm tách biệt ra thành một nhóm trên một locus riêng. Các gen nos liên kết
với gen nor và nir hình thành một nhóm lớn khoảng 30 kb (Braun et al., 1992) chứa trong đó 33
gen khác nhau (Zumft, 1997).
Carlson et al. (1983) đã nghiên cứu khả năng khử nitrat của Pseudomonas stutzeri,
Pseudomonas aeruginosa và Paracoccus denitrificans. Kết quả cho thấy rằng Pseudomonas
stutzeri chỉ tạo ra sản phẩm là khí N
2
trong khi Pseudomonas aeruginosa tạo ra nhiều khí nitrous
oxide (N
2
O) hơn là N
2
. Thêm vào đó một bất lợi là Pseudomonas aeruginosa làm giảm lượng
nitrat, nitrit và nitrous oxide chậm và không có khả năng sinh trưởng hiếm khí, điều này hoàn
toàn có thể được thực hiện bởi Pseudomonas stutzeri. Thí nghiệm này chứng tỏ Pseudomonas
stutzeri là loài vi khuẩn có thể được tiếp tục nghiên cứu sâu hơn trong quá trình khử nitrat.
Su et al. (2001) đã phân lập được dòng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri NS-2 có khả năng
khử nitrat ở điều kiện oxy trong không khí bão hòa trong điều kiện xử lý chất thải chăn nuôi heo
bằng hệ thống bùn hoạt tính của hệ thống xử lý. Đây cũng là một đặc điểm ưu việt của loài vi
khuẩn Pseudomonas stutzeri khi nó có thể hoạt động cả trong điều kiện hiếm khí lẫn hiếu khí,

điều kiện mà các enzyme tham gia vào quá trình khử đạm của các loài vi khuẩn khác có thể bị
bất hoạt bởi nồng độ oxy không khí cao quá mức.
2. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Phương tiện nghiên cứu
2.1.1. Nguyên vật liệu
Mẫu bùn đáy và mẫu nước thu từ ao nuôi cá tra (tại hai huyện Kế Sách, Long Phú và thành
phố Sóc Trăng) và trại chăn nuôi heo (tại huyện Kế Sách và thành phố Sóc Trăng) ở tỉnh Sóc
Trăng.
2.1.2. Hóa chất
(a) Các hóa chất pha môi trường phân lập và nuôi cấy vi khuẩn
Môi trường Minimal (Sikorski et al., 2002) gồm: sodium succinate (8,1 g/l); KH
2
PO
4
(340 mg/l); K
2
HPO
4
(435 mg/l); vi lượng (1 ml/l); stock gồm 10 mM NaNO
3
, 10 mM NH
4
Cl,
100 mM artificial seawater (SW) (gồm NaHCO
3
[0,11 g/l], MgSO
4
. 7H
2
O [10,5 g/l], NaCl [24

g/l] ); KOH 4M ( 50 ml/l); pH 6,8 được điều chỉnh bằng KOH 0,1M; agar (2 %).
Môi trường Luria Bertani (LB) (Bennasar et al., 1998b): Bacto yeast extract (YE) (5 g/l);
Bacto tryptone (10 g/l); NaCl (10 g/l).
Môi trường BM/
−
3
NO
(Su et al., 2001): NH
4
Cl (0,3 g/l); KH
2
PO
4
(1,5 g/l);
NaHPO
4
.7H
2
O (7,9 g/l); Na
2
C
4
H
4
O
4
.6H
2
O (27 g/l); KNO
3

(2 g/l); bổ sung dung dịch PS-1:
MgSO
4
(20 g/l) sử dụng với lượng 5 ml/l; vitamine V
8
(100X) (g/100 ml) gồm: (biotin, [0,02];
folic acid, [0,02]; pyridoxine hydrochloride, [0,1]; riboflavin, [0,05]; thiamine hydrochloride,
[0,05]; nicotinic acid, [0,05]; pantothenic acid, [0,05]; cyanocobalamine, [0,01]; p-aminobenzoic
acid, [0,05]; thioctic acid, [0,05]) sử dụng với nồng độ 1% (v/v); dung dịch muối VS: (EDTA,
[50 g/l]; ZnSO
4
.7H
2
O, [22 g/l]; CaCl
2
, [5,54 g/l]; MnCl
2
.4H
2
O, [5,06 g/l]; FeSO
4
.7H
2
O, [4,99
g/l]; (NH
4
)
6
Mo
7

O
24
.7H
2
O, [1,1 g/l]; CuSO
4
.5H
2
O, [1,57 g/l]; CoCl
2
.5H
2
O, [1,61 g/l]) sử dụng với
lượng 5 ml/l.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phân lập vi khuẩn
(a) Phân lập (isolation) vi khuẩn khử đạm
- Cân 1g mẫu bùn đáy cho vào 99 ml nước cất vô trùng trong bình Erlenmeyer 250 ml,
đậy bình bằng nút gòn và giấy dầu. Hút 1 ml mẫu nước cho vào 99 ml nước cất vô trùng trong
bình Erlenmeyer 250 ml, đậy bình bằng nút gòn và giấy dầu. Đem các bình Erlenmeyer đã pha
loãng trên lắc trong 10 phút. Mẫu nước và mẫu bùn được pha loãng đến 10
-3
trong ống nghiệm.
Dùng micropipet hút lần lượt 100 μl mẫu nước và mẫu bùn từ ống nghiệm pha loãng rồi nhỏ lên
đĩa petri có môi trường phân lập (minimal medium). Dùng que gạt thủy tinh phân phối dịch mẫu
trải đều khắp mặt thạch. Đĩa môi trường đã trải mẫu được ủ ở 30
o
C trong tủ ủ vi sinh vật từ 2- 3
ngày để vi khuẩn phát triển.
(b) Làm thuần (purification)

- Chọn 3 khuẩn lạc nghi ngờ hoặc nhiều hơn từ đĩa môi trường trên cấy chuyển nhiều lần
sang môi trường như trên đến khi các khuẩn lạc rời ra. Tiến hành kiểm tra độ ròng của các dòng
vi khuẩn phân lập dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần.
- Chuyển một khuẩn lạc rời đã được kiểm tra độ ròng (xem như một chủng phân lập -
isolate) vào ống nghiệm chứa môi trường trên để trữ mẫu ròng.
(c) Nuôi cấy vi khuẩn
- Cấy chuyển khuẩn lạc đã kiểm tra độ ròng vào ống nghiệm có chứa môi trường nuôi LB
hoặc minimal (dạng lỏng) và đặt trên máy lắc để qua đêm nhằm thu sinh khối chuẩn bị mẫu tiến
hành trích DNA.
- Các chủng vi khuẩn đã phân lập, nuôi cấy được cất trữ trong glycerol 10 % (Sikorski et
al., 2002) cho đến khi lấy ra sử dụng trích DNA.
2.2.2. Nhận diện (identification) vi khuẩn
(d) Thực hiện phản ứng PCR nhận diện vi khuẩn
Sau khi đo nồng độ DNA trích ly từ các dòng vi khuẩn khử đạm đã phân lập, tiến hành
thực hiện phản ứng PCR bằng máy PCR Perkin Elmer PE 9700 (Hoa Kỳ) để nhận diện một số
dòng vi khuẩn khử đạm với các cặp mồi chuyên biệt.
Bảng . Trình tự primer dùng nhận diện vi khuẩn khử đạm Pseudomonas stutzeri (dựa trên
vùng 16S rRNA)
Primer Trình tự primer (5’ – 3’) Kích thước
16F27
16R1488
fps 158
rps 743
AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG
CGG TTA CCT TGT TAG GAC TTC ACC
(cặp mồi chung [universal primers] xác định vùng 16S
rRNA) (Bennasar et al., 1996)
GTG GGG GAC AAC GTT TC
CAC CTC AGT GTC AGT ATT AGC
(cặp mồi đặc trưng [specific primers] xác định chính xác vi

khuẩn Pseudomonas stutzeri) (Bennasar et al., 1998b)
1.500 bp
625 bp
- Thực hiện các bước tiếp theo của chu kỳ phản ứng PCR như sau:
Bảng . Chu kỳ phản ứng PCR khuếch đại bằng cặp mồi 16f27 và 16r1488 trên vùng 16S
rRNA của Pseudomonas sp.
Bước phản ứng Tên bước Số lượng chu kỳ Nhiệt độ (
o
C) Thời gian
1 Biến tính 94 5 phút
2 Biến tính
Lai
Kéo dài
30
30
30
94
55
72
1 phút
1 phút
2 phút
3 Kéo dài 72 10 phút
(Nguồn: Chu kỳ phản ứng PCR dựa trên 16S DNA theo Bennasar et al., 1998b)
Bảng . Chu kỳ phản ứng PCR khuếch đại bằng cặp mồi fps158 và rps743 trên vùng 16S
rRNA của Pseudomonas stutzeri
Bước phản ứng Tên bước Số lượng chu kỳ Nhiệt độ (
o
C) Thời gian
1 Biến tính 95 5 phút

2 Biến tính
Lai
Kéo dài
30
30
30
95
52
72
1 phút
1 phút
1 phút
3 Kéo dài 72 10 phút
(Nguồn: Chu kỳ phản ứng PCR dựa trên 16S DNA theo Bennasar et al., 1998b)
(e) Điện di gel chứa sản phẩm phản ứng PCR
Các sản phẩm sau khi đã khuyếch đại bằng phản ứng PCR sẽ tiếp tục được phân tích
bằng điện di trên trên gel agarose 1 % (wt/vol) có bổ sung EtBr (0,5 mg/l).
(f) Chụp hình gel điện di chứa sản phẩm phản ứng PCR
Sau khi chạy gel sản phẩm PCR, quan sát kết quả các band DNA trên gel bằng hệ thống
chụp hình gel Bio-Rad UV 2000 (Hoa Kỳ) để nhận diện các dòng vi khuẩn khử đạm. Chụp hình
gel chứa sản phẩm PCR của đoạn DNA đặc trưng của vi khuẩn khử đạm (nếu có).
(g) Giải trình tự các dòng vi khuẩn phân lập được trong thí nghiệm
Các dòng vi khuẩn hiện diện trong cặp mồi đặc trưng được tiến hành giải trình tự, sau đó
tìm kiếm trình tự tương đồng trên cơ sở dữ liệu GenBank (GeneBank Database) của NCBI với
phần mềm BLASTN để biết chính xác đó có phải là dòng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri hay
không.
2.2.3. Đánh giá khả năng khử đạm của các dòng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri
Đánh giá khả năng khử đạm của các dòng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri vừa phân lập
dựa trên sự phát triển của các dòng vi khuẩn này trên các đĩa chứa môi trường Minimal đặc có bổ
sung

+
4
NH
,
−
2
NO
,
−
3
NO
ở các nồng độ 10 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM, 500 mM.
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả phân lập vi khuẩn khử đạm trong nước thải ao nuôi cá tra và trại chăn nuôi
heo ở Sóc Trăng
Tổng cộng có 13 mẫu (bùn và nước) thu được ở ao nuôi cá tra và 4 mẫu (bùn và nước) ở
trại chăn nuôi heo ở hai huyện Kế Sách, Long Phú và thành phố Sóc Trăng. Sử dụng môi trường
Minimal (pH = 6,8) chuyên dùng để phân lập và nuôi cấy vi khuẩn khử đạm. Dựa trên đặc điểm
hình dạng, màu sắc và kích thước khuẩn lạc phát triển trên môi trường Minimal sau 1-2 ngày
cấy, đã phân lập được tổng cộng 54 dòng vi khuẩn có khả năng là loài Pseudomonas stutzeri để
tiến hành các bước nhận diện tiếp theo. Kết quả phân lập cho thấy:
- Về hình dạng khuẩn lạc: đa số các dòng vi khuẩn phân lập đều có hình tròn (92,59%) và
một số dòng có hình dạng không đều.
- Về màu sắc khuẩn lạc: có 59,26% khuẩn lạc màu trắng đục, một số khuẩn lạc có màu
trắng sữa (5,56%), vàng nhạt (25,93%). Về đặc điểm màu sắc khuẩn lạc, trong quá trình phân lập
có có sự biến đổi màu sắc của khuẩn lạc trong quá trình phân lập: thời kỳ đầu phân lập một số
khuẩn lạc có màu tối nhưng sau một vài lần cấy truyền, khuẩn lạc bị mất màu và có màu nhạt
hơn hay chuyển sang màu trắng đục. Điều này cũng phù hợp với mô tả của van Niel và Allen
(1952), Garrity et al. (2005) rằng khuẩn lạc có thể bị mất màu chỉ sau một vài lần cấy truyền
(Hình 2).

Hình 2. Một số hình dạng khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập
- Về đặc điểm hình dạng của tế bào vi khuẩn phân lập được: các vi khuẩn có que ngắn
chiếm đa số với 96,3% số dòng phân lập được, trong đó có 53/54 dòng có khả năng chuyển
động. Điều này có thể là do đa số các dòng vi khuẩn phân lập được đều có chiên mao. Kết quả
này phù hợp với mô tả của van Niel và Allen (1952), Garrity et al. (2005) và Lalucat et al.
(2006) rằng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri chuyển động được nhờ vào chiên mao gắn ở đầu.
Sau khi phân lập, một số dòng được chọn để chụp hình dưới kính hiển vi điện tử quét ở các độ
phóng đại thích hợp. Các hình ảnh thu nhận được cho thấy các dòng đều có hình que ngắn và có
chiên mao ở đầu chứng tỏ giả thiết ban đầu rằng các dòng này chuyển động bằng chiên mao là
phù hợp.
3.2. Nhận diện các dòng vi khuẩn phân lập được bằng kỹ thuật PCR
3.2.1. Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi 16f27 và 16r1488
Kết quả PCR và chạy diện di trên gel agarose 1% (w/v) cho thấy có 34/54 dòng xuất hiện
band ở vị trí 1500 bp chứng tỏ 34 dòng này là vi khuẩn Pseudomonas sp Các dòng đó là: CB2-
1; CB2-3; CB6-6; CB7-2; CB7-5; CB7-7; CN1-3; CN4-1; CN4-6; CN5-1; CN5-2; CN5-3; CN5-
4; CN7-6; CN6-2; CN7-1; CN7-3; CN7-7; CN7-8; CN8-1; CN8-2; CN10-4; CN10-5; CN12-1;
CN13-2; CN13-3; CB9-4; CN4-3; HN1-3b; HB1-4; HB1-5; HB1-7a; HB1-7b; HB1-10b (Hình
3 và 4).
1500 bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
(1) Thang chuẩn 100bp plus; (2) CB2-1; (3) CB2-2; (4) CB2-3; (5) CB4-1; (6) CB4-3; (7) CB4-
4; (8) CB5-1; (9) CB5-2; (10) CB5-4; (11) CB6-2; (12) CB6-4; (13) CB6-6; (14) CB7-2; (15)
CB7-5; (16) CB7-7; (17) CN1-3;
1500 bp
(18) Thang chuẩn 100bp plus; (19) CN4-1; (20) CN4-2; (21) CN4-6; (22) CN5-1; (23) CN5-2;
(24) CN5-3; (25) CN5-4; (26) CN7-6; (27) CN6-2; (28) CN7-1; (29)CN7-3; (30)CN7-7; (31)
CN7-8; (32) CN8-1; (33) CN8-2; và (34) đối chứng âm (nước).
Hình 3. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi tổng 16f27 và 16r1488 của 31 dòng vi
khuẩn phân lập

A
18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33

34
B
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
17
(1) Thang chuẩn 100bp plus; (2) CN9-5; (3)CN10-1; (4) CN10-2; (5) CN10-3; (6) CN10-4; (7)
CN10-5; (8) CN11-1; (9) CN11-2; (10) CN11-3; (11) CN11-4; (12) CN11-5; (13) CN11-6; (14)
CN12-1; (15) CN13-2; (16) CN13-3; (17) CB9-4;
1500 bp
(18) Thang chuẩn 100bp plus; (19) CN4-3; (20) HN1-3b; (21) HB1-4; (22) HB1-5; (23) HB1-
7a; (24) HB1-7b; (25) HB1-10b; (26) Đối chứng âm (nước)
Hình 4. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi tổng 16f27 và 16r1488 của 23 dòng
vi khuẩn phân lập
3.2.2. Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi fps158 và rps743
Sử dụng cặp mồi fps158 và rps743 để nhận diện chính xác dòng vi khuẩn Pseudomonas
stutzeri từ 34 dòng đã được nhận diện là Pseudomonas sp Kết quả cho thấy có 28 dòng xuất
hiện band ở vị trí 625 bp (Hình 5) chứng tỏ 28 dòng này là loài vi khuẩn Pseudomonas stutzeri.
Các dòng này bao gồm 22 dòng trong nước thải ao nuôi cá tra (CB2-3, CB6-6, CB7-2, CB7-5,
CB7-7, CN1-3, CN5-1, CN5-2, CN5-3, CN5-4, CN6-2, CN7-3, CN7-7, CN7-8, CN8-1, CN8-2,
CN10-5, CN12-1, CN13-2, CN13-3, CB9-4, CN4-3) và 6 dòng trong chất thải của trại chăn nuôi
heo (HN1-3b, HB1-4, HB1-5, HB1-7A, HB1-7b, HB1-10b). Kết quả này cũng phù hợp với kết
quả của Su et al. (2001) phân lập trên chất thải chăn nuôi heo tại Đài Loan. Tại ĐBSCL, việc sử
dụng cặp mồi đặc hiệu fps158 và rps743 để nhận diện loài vi khuẩn khử đạm Pseudomonas
stutzeri cũng đã đạt được một số kết quả như: Phan Trường Khanh (2007) trên đất tại ĐBSCL,
Nguyễn Thành Nhân (2008) trên chất thải trại chăn nuôi heo tại Tiền Giang, Huỳnh Thị Cẩm Tú
(2009) trên nước thải ao nuôi tôm ở Bạc Liêu, Nguyễn Thị Thủy Trinh (2009) nước thải ao nuôi
cá ở Bến Tre, Nguyễn Thị Ngọc Hà (2009) trên nước thải ao nuôi cá tra tại An Giang. Các kết
C

1500 bp
18 19 20 21 22 23 24 25

26
D
quả trên cùng với kết quả phân lập và nhận diện trong thí nghiệm này cho thấy Pseudomonas
stutzeri phân bố rất rộng rãi trong môi trường đất và nước tại vùng ĐBSCL.
625 bp
(1) Thang chuẩn 100bp; (2) Đối chứng dương P. stutzeri ZoBell14405; (3) CB2-1; (4) CB2-3;
(5) CB6-6; (6) CB7-2; (7) CB7-5; (8) CB7-7; (9) CN1-3; (10) CN4-1; (11) CN4-6; (12) CN5-1;
(13) CN5-2; (14) CN5-3; (15) CN5-4; (16) CN7-6; (17) CN6-2;
625 bp
(18) Thang chuẩn 100bp; (19) CN7-1; (20)CN7-3; (21)CN7-7; (22) CN7-8; (23) CN8-1; (24)
CN8-2; (25) Đối chứng dương P. stutzeri ZoBell 14405
625 bp
(1) Thang chuẩn 100bp; (2) CN10-4; (3) CN10-5; (4) CN12-1; (5) CN13-2; (6) CN13-3; (7)
CB9-4; (8) CN4-3; (9) HN1-3b; (10) HB1-4; (11) HB1-5; (12) HB1-7a; (13) HB1-7b; (14) HB1-
10b; (15) Đối chứng dương P. stutzeri ZoBell 14405 (16) Đối chứng âm (nước)
Hình 5. Kết quả điện di sản phẩm PCR bằng cặp mồi fps158 và rps743
E
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

17
18 19 20 21 22 23 24

25
F
G
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

16
3.3. Kết quả giải trình tự một số dòng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri phân lập
Các dòng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri phân lập HB1-4, HB1-7a (thu được tại huyện
Kế Sách) được chọn để giải trình tự đoạn gen có kích thước 625 bp (sản phẩm PCR với cặp mồi
fps158 và rps743) bằng máy giải trình tự ABI PRISM 3130 XL (Hoa Kỳ).
Kết quả nhận được từ máy giải trình tự ABI PRISM 3130 XL được so sánh bằng chương
trình BLASTN (NCBI) với các trình tự đã có trước đây về loài vi khuẩn Pseudomonas stutzeri
lưu trữ trên ngân hàng gen (GenBank) của NCBI. Kết quả so sánh cho thấy dòng HB1-4 có tổng
số nucleotide là 594 cho kết quả đồng hình 100% với vi khuẩn Pseudomonas stutzeri (Hình 6).
Hình 6. Tương đồng của dòng HB1-4 với vi khuẩn Pseudomonas stutzeri

Trong khi đó dòng HB1-7a có tổng số nucleotide là 601 cho kết quả đồng hình với vi
khuẩn Pseudomonas stutzeri là 99% (Hình 7).
Hình 7. Tương đồng của dòng HB1-7a với vi khuẩn Pseudomonas stutzeri
Các kết quả trên cho thấy các dòng vi khuẩn phân lập được trong thí nghiệm này là vi
khuẩn Pseudomonas stutzeri. Các dòng vi khuẩn này tiếp tục được đánh giá khả năng khử đạm
dạng nitrate, nitrite và oxid hóa ammonium trong thí nghiệm tiếp theo.
3.4. Khả năng khử nitrate, nitrite và oxid hóa ammonium của các dòng Pseudomonas stutzeri
Các dòng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri đã được nhận diện chính xác bằng cặp mồi đặc
hiệu fps158 và rps743 tiếp tục được xác định khả năng khử đạm bằng phương pháp kiểm tra trên
đĩa petri chứa môi trường Minimal đặc bổ sung
+
4
NH
,
−
2
NO
,
−

3
NO
ở các nồng độ 10 mM, 100
mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM, 500 mM.
Trên môi trường Minimal đặc có bổ sung
+
4
NH
,
−
2
NO
,
−
3
NO
(bổ sung
+
4
NH
,
−
2
NO
,
−
3
NO

ở các nồng độ 10 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM, 500 mM) cho thấy các dòng

Pseudomonas stutzeri phân lập được đều có khả năng phát triển. Trong đó các dòng CB2-3,
CCN7-3, CN12-1, CN13-2, HB1-4, HB1-7a, HB1-10b có khả năng phát triển tốt ở nồng độ
+
4
NH
,
−
3
NO
thử nghiệm là 500 mM, ở nồng độ
−
2
NO
thử nghiệm là 100 mM. Kết quả này cho
thấy các dòng Pseudomonas stutzeri phân lập được đều có khả năng khử nitrate, nitrite và oxid
hóa ammonium. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả của Cartson et al. (1983), Su et al.
(2001), Phan Trường Khanh (2007), Nguyễn Thành Nhân (2008), Huỳnh Thị Cẩm Tú (2009),
Nguyễn Thị Thủy Trinh (2009) và Nguyễn Thị Ngọc Hà (2009).

Hình 8. Dòng CB3-2 phát triển trên môi trường Minimal chứa
+
4
NH
,
−
3
NO
,
−
2

NO
A:
+
4
NH
500 mM B:
−
3
NO
500 mM C:
−
2
NO
100 mM
4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1. Kết luận
- Từ 13 mẫu thu được từ các ao nuôi cá tra và trại chăn nuôi heo tại tỉnh Sóc Trăng đã
phân lập được 54 dòng vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trường Minimal chuyên dùng
cho vi khuẩn khử đạm.
- Có 28/54 dòng được nhận diện chính xác là vi khuẩn Pseudomonas stutzeri bằng
phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu fps158 và rps743. Kết quả giải trình tự cho thấy dòng
HB1-4 và dòng HB1-7a (thu được tại huyện Kế Sách) có mức độ đồng với vi khuẩn
Pseudomonas stutzeri chuẩn lần lượt là 100% và 99%.
- Đa số các dòng Pseudomonas stutzeri phân lập được đều có khả năng phát triển trên
môi trường Minimal có bổ sung
+
4
NH
,
−

3
NO
và
−
2
NO
. Trong đó, các dòng CB2-3, CN7-3,
CN12-1, CN13-2, HB1-4, HB1-7a và HB1-10b có khả năng phát triển tốt ở nồng độ
+
4
NH

và
−
3
NO
là 500 mM và trên môi trường có bổ sung
−
2
NO
là 100 mM.
C
B
A
4.2. Đề nghị
Khảo sát khả năng khử đạm của các dòng vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi
trường có bổ sung
+
4
NH

,
−
3
NO
và
−
2
NO
cao trên nước thải chăn nuôi heo, ao nuôi cá tra và các
loại nước thải ô nhiễm đạm khác.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Nguyễn Đức Lượng và Nguyễn Thị Thủy Tiên. 2003. Công nghệ sinh học môi trường, Tập 1:
Công nghệ xử lý nước thải. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh. TP. Hồ Chí
Minh.
Nguyễn Thị Ngọc Hà. 2009. Phân lập vi khuẩn Pseudomonas stutzeri trong nước thải ao nuôi cá
tra tại tỉnh An Giang. Luận văn thạc sĩ khoa học ngành Sinh thái học, trường Đại học Cần
Thơ.
Nguyễn Thị Thủy Trinh. 2009. Phân lập vi khuẩn Pseudomonas stutzeri trong nước thải ao nuôi
tại tỉnh Bến Tre. Luận văn thạc sĩ khoa học ngành Công nghệ sinh học, trường Đại học Cần
Thơ.
Phan Trường Khanh. (2007), Phân lập vi khuẩn Pseudomonas stutzeri trong đất đồng bằng
sông Cửu Long và ứng dụng xử lý ammonia trong nước ở điều kiện phòng thí nghiệm. Luận
văn thạc sĩ Khoa học môi trường, trường Đại học Cần Thơ.
Bennasar, A., R. Rossello´-Mora, J. Lalucat, and E. R. B. Moore. 1996. 16S rRNA gene
sequence analysis relative to genomovars of Pseudomonas stutzeri and proposal of
Pseudomonas balearica sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 46, pp. 200–205.
Bennasar, A., C. Guasp, M. Tesar, and J. Lalucat. 1998a. Genetic relationships among
Pseudomonas stutzeri strains based on molecular typing methods, J. App. Microbiol. 85, pp.
643- 656.
Bennasar, A., C. Guasp and J. Lalucat. 1998b. Molecular methods for the detection and

identification of Pseudomonas stutzeri in pure culture and environmental samples, Microb.
Ecol. 35, pp. 22- 33.
Braun, C., and W. G. Zumft. 1992. The structural genes of the nitric oxide reductase complex
from Pseudomonas stutzeri are part of a 30-kilobase gene cluster for denitrification. J.
Bacteriol. 174, pp. 2394-2397.
Carlson, C. A. and J. L. Ingraham. 1983. Comparison of Denitrification by Pseudomonas
stutzeri, Pseudomonas aeruginosa, and Paracoccus denitrificans. Appl. Environ. Microbiol.
45 (4), pp. 1247-1253.
Garrity, G. M., J. A. Bell and T. Lilburn. 2005. Order IX. Pseudomonadales, Family I.
Pseudomonadaceae, Genus I. Pseudomonas. In Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology,
2nd Edition, Volume 2 The Proteobacteria, Part B The Gammaproteobacteria. Springer,
New York. pp. 323-378.
Lalucat, J., A. Bennasar, R. Bosch, E. García-Valdés, and N. J. Palleroni. 2006. Biology of
Pseudomonas stutzeri. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 70 (2), pp. 510-547.
Lee H. W., S. Y. Lee, J. W. Lee, J .B. Park, E. S. Choi, and Y. K. Park. 2002. Molecular
characterization of microbial community in nitrate-removing activated sludge, FEMS
Microb. Ecol. 41, pp. 85-94.
Rossello´-Mora, R. A., J. Lalucat, W. Dott and P. Ka¨mpfer. 1994. Biochemical and
chemotaxonomic characterization of Pseudomonas stutzeri genomovars. J. Appl. Bacteriol.
76, pp. 226-233.
Sikorski, J., N. Teschner, and W. Wackernagel. 2002. Highly different levels of natural
transformation are associated with genomic subgroups within a local population of
Pseudomonas stutzeri from soil, Appl. Environ. Microbiol. 68 (2), pp. 865- 873.
Sikorski, J., J. Lalucat and W. Wackernagel. 2005. Genomovars 11 to 18 of Pseudomonas
stutzeri, identified among isolates from soil and marine sediment. Int J Syst Evol Microbiol
55, pp. 1767-1770.
Su, J. J., J. Lin, B. Y. Liu, and J. B. Yang. 2001. Isolation of an aerobic denitrifying bacterial
strain NS-2 from the activated sludge of piggery wastewater treatment systems in Taiwan
possessing denitrification under 92% oxygen atmosphere. J. Appl. Microbiol. 91, pp. 853-
860.

van Niel, C. B., and M. B. Allen. 1952. A note on of Pseudomonas stutzeri. Bacteriol. 64, pp.
413- 422.
Zumft, W.G 1997. Cell biology and molecular basis of denitrification, Microbiol. Mol. Biol.
Rev. 61 (4), pp. 533- 616.
ABSTRACT
Fifty-four denitrifying bacterial isolates were isolated from the sediment and wastewater of catfish ponds and
piggery farms in Soc Trang province. Among them, 28/54 isolates were determined as Pseudomonas stutzeri by
using PCR technique with specific fps158 and rps743 primers. The result of DNA sequence showed that two isolates
(Hb1-4 and H1-7a) had the identity with standard Pseudomonas stutzeri were 100% and 99% respectively. Most of
them could grow on Minimal medium complemented with various concentration of NH
4
,
−
3
NO
và
−
2
NO
.
Especially, many isolates such as CB2-3, CCN7-3, CN12-1, CN13-2, HB1-4, HB1-7a and HB1-10b could develop
well in 500 mM
+
4
NH
,
−
3
NO
and 100 mM

−
2
NO
concentration.
Key words: Pseudomonas stutzeri, piggery waste, denitrifying bacteria, catfish pond’s wastewater, PCR
technique