Nghiên cứu sự ảnh hưởng của chế biến đến thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của ngưu tất

BỘYTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
TRẦN THỊ LỊCH
NGHIÊN CỨU Sự ẢNH HƯỞNG CỦA CHẾ BIÊN ĐẾN
THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ MỘT s ố TÁC DỤNG
SINH HỌC CỦA NGƯU TẤT
m
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 1999-2004)
NGƯỜI HƯỚNG DẪN:
NƠI THỰC HIỆN:
THỜI GIAN THƯC HIÊN:
TS. VŨ VĂN ĐIẾNs
TS. NGUYỄN THÁI AN
BỘ MÔN DƯỢC HỌC c ổ TRUYỀN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
3/2004-5/2004
HÀ NỘI, 05 - 2004
m
J l d i C jO L W L Ổ V L
rĩrotKỊ ha tháíiụ flute hiên Ulioá Luân tất ntịliiệịì tồi đã nhận
(tíìỢe sự giúp. ĩtõ' tản tình của oáo fit ắt/ eỗ cùng, cúc htut tvứnạ. hê
mồn. QlliAễL (lìp ft (tí/ tôi dtin (tiioe hỉiíị tẻ ỉòiUỊ l-únit tvotitị oil hièt
f)’tt ÍÁIL
J
a e tối của thà ụ cô:
rĩíS. a)ã (Vàn ^Đíềtt
CĩcS . QlạuụẪn Qhál cẦn
Qỉhữuạ tiạưồi (Tã tt'lie tìêp liiiíhiạ dẫn túi tVú ti tị iiiồt quá
tvìnli tliựe kiện đề tài.
xjêì eũnạ. xin gửi Lài t‘ảm ớn tâi cắc ihầỊỊ, eáe eô ỏ' hò Ittfhi
rOiì(íe 'ăùoe @ê- CĩruụềtL, mô ti ^ ũ iùỉe hị, (Dièti (Dưđn MiêiL,

rị)iêit líỉỀm íU ịlĩiêm , ạ ia (tĩnh OÌL í) tin hè đă. fit tì điều. U iĩn giúp,
ittí, ĩtônạ tìỉỀn tài rât tiltìềii tvotMỊ thài ạian qua.
'iỊỗà Qlậi, HÍỊÌII/ 29 thắng, 5 nãtn 2004
(Sình ỉùêỉt
Cji'iu i t h ị lịe h
MỤC LỤC
Trang
Đặt vấn đ ề 1
PHẦN 1: TỔNG QUAN
2
1.1. Đặc điểm thực vật cây ngưu tất 2
1.2. Thành phần hoá học 2
1.3. Tác dụng dược lý 3
1.4. Công năng, chủ trị 4
1.5. Chế biến, bào chế cổ truyền 5
PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 7
2.1. Nguyên liệu và phương pháp thực nghiệm 7
2.1.1. Nguyên liệu, phương tiện, hoá chất 7
2.1.2. Phương pháp thực nghiệm
.
8
2.2. Kết quả thực nghiệm 12
2.2.1. Bào chế ngưu tất 12
2.2.2. Định tính một số nhóm chất trong ngưu tất 12
2.2.3. Định tính saponin bằng sắc ký lớp mỏng 20
2.2.4. Định lượng saponin và đường tự do 26
2.2.5. Thử một số tác dụng sinh học


.

30
2.2.6. Kiểm tra độ nhiễm khuẩn của sản phẩm chế


37
PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 41
3.1. Kết luận 41
3.2. Đề xuất 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO
CHÚ GIẢI CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN
M,:
Mẫu sống
M2: Mẫu trích rượu.
M3:
Mẫu trích muối.
PT: Chỉ số của hệ đông máu ngoại sinh.
APTT:
Chỉ số của hệ đông máu nội sinh.
TT:
Chỉ số ức chế quá trình chuyển fibrinogen thành fibrin.
DD: Dung dịch
tb: Trung bình
SKLM: Sắc ký lớp mỏng
STT:
Số thứ tự
CSB:
Chỉ số bọt
CSPH: Chỉ số phá huyết
tt:
Thuốc thử

ĐẶT VẤN ĐỂ
Ngưu tất là vị thuốc được dùng khá phổ biến trong y học cổ truyền để chữa
các bệnh do ứ huyết gây ra hoặc một số bệnh như cao huyết áp, phong thấp,
bổ gan thận Khi dùng làm thuốc người ta thường bào chế theo phương pháp
cổ truyền khác nhau tuỳ theo mục đích điều trị. Vấn đề đặt ra là ngưu tất sau
khi xông sinh để dùng sống và đem bào chế theo những phương pháp khác
nhau thì có khác nhau không, và có cần phải bào chế theo phương pháp cổ
truyền hay không?
Vì vậy chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu sự ảnh hưởng của chế biến đến
thành phần hoá học và một số tác dụng sinh học của ngưu tất với mục đích so
sánh một số thành phần hoá học và một số tác dụng sinh học giữa mẫu sống
và mẫu chế.
Trong khuôn khổ luận văn này chúng tôi thực hiện một số nội dung sau:
- Bào chế ngưu tất theo hai phương pháp trích rượu và trích muối.
- Định tính, định lượng thành phần hoá học và thử một số tác dụng sinh
học của các mẫu chế và mẫu sống.
1
PHẦN 1: TỔNG QUAN
1.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CÂY NGƯU TẤT
Cây ngưu tất có tên khoa học Achyranthes bidentata Blume. Họ rau giền
Amaranthaceae [4], [6], [21].
Ngoài ra còn có tên khác như: Hoài ngưu tất, ngưu tịch [1], người Trung
Quốc gọi là Niu-xi [33]. Rễ ngưu tất có tên tiếng Anh là: Two-toothed chaff-
flower [32]. Rễ ngưu tất khô được gọi là Mao ngưu tất [1].
Cây thuộc thảo cao từ 60-80cm hoặc hơn [21]. Thân mọc thẳng đứng, hình
vuông, có nhiều đốt, màu lục hoặc màu nâu tía, có nhiều cành mọc đối [1],
[7], [21]. Lá đơn mọc đối, hình bầu dục, gốc thuôn hẹp, mép lá uốn lượn. Hoa
lưỡng tính. Cụm hoa là bông ở đầu cành hay ở kẽ lá [4], [7], [11]. Hoa mọc
hướng lên nhưng khi biến thành quả sẽ mọc quặp xuống. Quả nang, lá bắc còn
lại và nhọn thành gai cho nên vướng vào có thể mắc vào quần áo [4]. Rễ phình

thành củ hình trụ, dài 15- 30cm, đường kính 0,3-lcm. Đầu trên mang vết tích
của gốc thân, đầu dưới thuôn nhỏ. Mặt ngoài màu vàng nâu, có nhiều nếp
nhăn dọc nhỏ và vết tích của rễ con [6].
Trồng bằng hạt vào tháng 10-11 (ở đồng bằng) hoặc tháng 2- 3(ở vùng núi)
[21].
1.2. THÀNH PHẦN HOÁ HỌC
*Rễ có các saponin, khi thuỷ phân cho các sapogenin là acid oleanolic
C30H48 0 3 [4] và galactose, rhamnose, glucose [7], [21], [32]. Hàm lượng acid
oleanolic được xác định là 0,91 %-1,14% ở ngưu tất trồng [32].
Ngoài ra còn có các steron ecdysteron, inokosteron [4], [14], [21], [32],
chất
dính, muối kali [24], physcion và emodin [32].
2
Dịch chiết cồn của ngưu tất đã được chứng minh có terpenes, amino acid
[34].
Rễ cây cũng chứa các polisaccharide với lượng khoảng 42g/2.000g theo
khối lượng khô [32].
Betain chiếm khoảng 0,930-1,029% ở trong rễ và là một chất bền vững
trong quá trình chế biến thuốc [25], [32].
* Phần trên mặt đất của cây Achyranthes bidentata Blume trồng tại Việt
Nam có chứa 3 flavonoid, 6 saponin triterpenoid, 2 acid phenolic. Từ hỗn hợp
các polyphenol và saponin bằng phương pháp sắc ký cột và sắc ký chế hoá đã
phân lập và xác định cấu trúc 3 chất tinh khiết là: quercetin 3-0-rutinoid
(rutin), acid cafeic và beta-D-xylopyranosyl-beta-D-glucopyranosid của acid
oleanolic [18], [32].
1.3. TÁC DỤNG DƯỢC LÝ
Rễ ngưu tất có tác dụng hạ cholesterol máu và hạ huyết áp [4], [7], [15],
chống viêm, làm giảm áp lực mạch máu [32], chống đông máu [10], [20].
Saponin có tác dụng tăng co bóp tử cung [4], phá huyết và làm đông vón
albumin [14].

Polysaccharid có tác dụng chống ung thư [37], ức chế sự phát triển khối u
31-40% tại liều 25-100mg/kg và tăng cường khả năng miễn dịch trên chuột
mang thai [38].
Polysaccharid sulfate có tác dụng ức chế virus viêm gan HbsAg và HbeAg
và virus herpes đơn giản typ 1 [34].
Ecdysteron dùng đường uống 10-20mg/kg/ngày có tác dụng chống viêm
mạnh hơn amidopyrin và tương đương với cortison acetat. Cơ chế tác dụng do
3
bảo vệ nội môi mao mạch và kích thích sự giải phóng corticosteroid từ tuyến
thượng thận [13].
Ecdysteron và inokosteron có tác dụng kìm hãm sự phát triển của một số
loài sâu bọ [14].
Bidentin (dạng viên bào chế từ saponin toàn phần của ngưu tất) có tác dụng
hạ cholesterol máu và tác dụng khá ổn định [4], [12].
Cao rễ ngưu tất có tác dụng làm giảm hàm lượng serotonin ở não chuột
cống trắng và có thể theo cơ chế phân tử của tác dụng giảm đau, hạ sốt và
chống dịch rỉ [8], dịu sức căng của tử cung chuột và thỏ (có thai hoặc không
có thai). Tác dụng này có thể là do kích thích trực tiếp vào dây thần kinh dưới
bụng [14].
Viên ngưu tất (0,25g cao khô) hoặc thuốc ống uống (4g ngưu tất khô/ống)
chữa bệnh cholesterol máu cao, huyết áp cao, vữa xơ động mạch [14].
1.4. CÔNG NĂNG, CHỦ TRỊ
Tính vị: Ngưu tất có vị đắng, chua, tính bình, không độc, vào hai kinh can
và thận [2], [5], [6], [21], [24], [32], [33],
Công năng, chủ trị:
- Hoạt huyết thông kinh hoạt lạc: Đùng trong các trường hợp kinh nguyệt
không đều, kinh bế [2], [5].
- Bổ can thận, thư cân, mạnh gân cốt: Dùng cho các bệnh đau khớp, đau
lưng, đau xương sống, liệt chân, co gân không duỗi được, đặc biệt đối với các
khớp của chân, nếu thấp mà thiên về thể hư hàn thì phối hợp với quế chi, cẩu

tích, tục
đoạn; nếu thấp mà thiên về nhiệt thì phối hợp với hoàng bá [2], [5].
4
- Chỉ huyết: Thường dùng trong các trường hợp hoả bốc lên gây nôn ra máu,
chảy máu cam; có thể dùng thêm thuốc tư âm giáng hoả và thuốc chỉ huyết
khác hoặc chảy máu do huyết ứ gây thoát quản [2], [5].
- Lợi niệu, trừ sỏi: Dùng trong các trường hợp tiểu tiện đau buốt, tiểu tiện ra
sỏi [2], [5].
- Giáng áp: Dùng trong các bệnh cao huyết áp, do có khả năng làm giảm
cholesterol máu [2].
- Giải độc, chống viêm: Dùng phòng bệnh bạch hầu [2], [5]
Cấm kỵ: Người có thai, người bị mộng hoạt tinh, người đang rong kinh
hoặc đang có chảy máu nhiều không nên dùng. Nếu dùng với tính chất để khí
vị đi xuống hạ tiêu, chữa các bộ phận phía dưới thì dùng không qua chế biến.
Khi sao rượu, trích nước muối hoặc tẩm rượu rồi chưng thì có tác dụng bổ [2],
[5].
1.5. CHÊ BIẾN, BÀO CHÊ c ổ TRUYỀN.
Chếbiến (sơchếsau khi thu hoach)
- Đào về, cắt bỏ cây sát đầu củ, phơi qua 1-2 ngày cho củ tái để đỡ bị giòn
gãy. Đem xông sinh 1 ngày, sau đó đem rửa sạch và sấy ở 40-50°C cho đến
độ ẩm khoảng 15-18%; sau đó phân loại, bó thành bó nhỏ để bảo quản [22].
Bào ch£_cổ_truỵềnỊm
Khi sử dụng làm thuốc thường phải qua khâu bào chế cổ truyền, thường có
các
phương pháp chế sau đây:
- Thái phiến hoặc cắt đoạn.
Ngưu tất được, ủ mềm, thái phiến, vát dàyl-3mm (nếu rễ to); cắt đoạn 3-
5mm (nếu rễ nhỏ), phơi khô hoặc sấy qua để dùng [16], [24].
5
- Sao cám.

Sao cám nóng già, bốc khói trắng; cho ngưu tất phiến vào sao đều đến khi có
màu hơi vàng. Rây bỏ cám [16].
- Trích rượu. Ngưu tất 10kg
Rượu 2kg
Ngưu tất phiến sao nóng, phun rượu vào đảo đều, sao đến khô. Hoặc tẩm
ngưu tất vào rượu; ủ 30 phút đến 1 giờ cho ngấm rượu, sau sao tới khô [16].
- Ngưu tất thán.
Đem ngưu tất sao đến khi phía ngoài bị đen hoàn toàn, bên trong vàng nâu
đậm; có thể trích rượu rồi sao đen như trên [16].
- Ngưu tất sao đen.
Lấy ngưu tất phiến, dùng lửa nhỏ sao đến khi xuất hiện các chấm đen [16].
- Ngưu tất trích muối.
Ngưu tất phiến 10kg
Muối 0,2kg
Muối hoà thành dung dịch đem tẩm vào ngưu tất; ủ 30 phút, sao khô [16].
6
PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THựC NGHIỆM:
2.1.1. Nguyên liệu, phương tiện, hoá chất:
* Dược liệu: Ngưu tất trồng theo quy trình sản xuất dược liệu an toàn tại
Trung tâm nghiên cứu cây trồng và chế biến cây thuốc Hà Nội. Rễ ngưu tất
sau khi thu hoạch được phơi khô qua, rồi đem xông sinh theo tỷ lệ 1,5kg
sinh/100kg dược liệu sau đó sấy khô.
* Hoá chất:
- Cồn tuyệt đối, acid sulfuric đặc, dung dịch NaOH 0,1N, KOH 0,1N, acid
sulfuric 72%, glucose .đạt tiêu chuẩn phân tích do viện dược liệu cung cấp.
*Máy móc và trang thiết bị:
- Máy đo độ ẩm Precisa MA300 (Thuỵ sĩ).
- Máy ly tâm.
- Máy quang phổ UV-VIS Cary 1E của hãng Varian (Mỹ).

-Máy phân tích máu tự động (CA 1000 của Nhật).
-Tủ sấy Memmert (Đức).
* Động vật thí nghiệm:
- Chuột nhắt trắng, khoẻ mạnh, trọng lượng 18- 20g/con do Viện vệ sinh dịch
tễ cung cấp.
- Chuột cống trắng khoẻ mạnh, trọng lượng 120- 150g/con đạt tiêu chuẩn thí
nghiệm.
7
2.1.2. Phương pháp thực nghiệm:
2.1.2.1 Bào chê ngưu tất:
Tiến hành bào chế theo phương pháp cổ truyền trích rượu, trích muối và
dùng sống theo các tài liệu [3], [16], [24].
2.1.2.2. Hoá học:
* Định tính một số nhóm chất trong ngưu tất: Định tính một số nhóm
chất trong các mẫu ngưu tất sống (Mj), ngưu tất trích rượu (M2), ngưu tất
trích muối (M3) bằng phản ứng hoá học sử dụng thuốc thử đặc trưng của
mỗi nhóm chất theo các tài liệu [4], [9], [17].
* Định tính saponin bằng sắc ký lớp mỏng: Tiến hành định tính các mẫu
ngưu tất Mị, M2, M3 với bản mỏng Silicagel GF254-Merck tráng sẩn [4],
[6], [9].
Khai triển trên nhiều hệ dung môi và chọn hệ tách tốt nhất ghi lại kết quả.
* Xác định chỉ số bot:
Chỉ số bọt là số ml nước để hoà tan saponin trong lg nguyên liệu cho một
cột bọt cao lcm sau khi lắc và đọc (tiến hành trong điều kiện qui định) [4].
Chỉ số bọt (CSB) tính theo công thức (A):
CSB = kx (A)
a X n
Trong đó: V: thể tích dịch chiết đem xác định chỉ số bọt (ml).
a: khối lượng dược liệu (g).
n: số thứ tự của ống nghiệm có cột bọt cao lcm.

k: hệ số pha loãng dịch chiết.
* Xác định chỉ số vhá huỵết.
Chỉ số phá huyết là số ml dung dịch đệm cần thiết để hoà tan saponin có
trong lg gam dược liệu chứa saponin để gây ra hiện tượng phá huyết đầu tiên
và hoàn toàn đối với một loại máu đã chọn [17].
8
Chỉ số phá huyết được tính theo công thức (B):
CSPH = - í — (B)
(B)
cxx
Trong đó: c: nồng độ của dung dịch dược liệu (%).
x: là số ml dịch chiết dược liệu cho vào ống nghiệm mà
ở đó xảy ra hiện tượng phá huyết đầu tiên và hoàn toàn.
* Định lượng saponin và đường tự do trong ngưu tất.
• Đinh lương saponin bang phương pháp đo quango
Nguyên tắc:
Dùng dịch chiết trong cồn 80°, đem đo mật độ quang ở bước sóng 538nm,
với chất chuẩn là acid oleanolic và thuốc thử tạo màu là cồn vanilin trong
H9SO4 đặc.
Hàm lượng saponin (tính theo acid oleanolic) được tính bằng công thức (C)
• Định lưong đường tư do bằng phương pháp đo quang.
Nguyên tắc:
Dịch chiết trong nước, đem đo mật độ quang ở bước sóng 630nm, với chất
chuẩn là glucose 0,025% và thuốc thử tạo màu là o. toluidin và thioure.
Hàm lượng đường tự do được tính theo công thức (D) [23]:
[23]:
(C)
Dcx Pt X (100 - ồ)
Trong đó: Dt: mật độ quang của ống thử
Dc: Mật độ quang của ống chuẩn.

Pt: Lượng bột dược liệu đã cân (g).
Pc: Lượng acid Oleanolic đã cân (g).
b: Độ ẩm của dược liệu (%).
9
'x% = Dtx Q’025 x Ỉ(M X100 (D)
Dc X p X (100 - b)
x%: Hàm lượng đường tự do tính theo Glucose.
Dt: Mật độ quang của ống thử.
Dc: Mật độ quang của ống chuẩn.
P: Lượng bột dược liệu đã đem cân (g).
b: Độ ẩm của dược liệu (%).
2.1.2.3 Thử một sô tác dụng sinh học:
> Thử tác dụng chông đông máu:
Được tiến hành trên máy phân tích máu tự động (CA 1000 của Nhật) tại
trung tâm nghiên cứu phòng chống ung thư.
- Để thăm dò tác dụng ức chế đông máu ngoại sinh chúng tôi chọn thời
gian Quick (PT).
-Để thăm dò tác dụng chống đông máu nội sinh chúng tôi chọn Active
Partial Thromboplastin Time (APTT).
-Để thăm dò thời gian chuyển từ fibrinogen thành fibrin chúng tôi chọn
thời gian Thrombin (TT) [19].
> Thử tác dụng giảm đau theo phương pháp của Koster và Turner:
Nguyên tắc: Cho chuột uống chế phẩm thử trước khi gây đau 1 giờ, gây
đau bằng cách tiêm 0,2ml dung dịch acid acetic 1% vào màng bụng, đếm số
lần quặn đau sau những khoảng thời gian nhất định. Kết quả giảm đau thể
hiện qua sự giảm số lần quặn đau của lô thử so với lô chứng.
Đau được biểu hiện bằng chuột choãi hai chân sau, bụng sát xuống sàn,
mình xoắn vặn. Mỗi lần như vậy được tính là 1 cơn quặn đau [28], [36].
> Thử tác dụng lợi tiểu theo phương pháp của Dobrescu cải tiến:
10

Nguyên tắc: Cho chuột uống chế phẩm thử, nhốt chuột vào thiết bị có bộ
phận thu gom nước tiểu. Đo thể tích lượng nước tiểu trong khoảng thời gian
nhất định (sau 24 giờ) kể từ khi cho chuột uống chế phẩm thử. Tác dụng lợi
tiểu thể hiện qua mức độ lợi tiểu tính theo công thức (E) [26]:
x% = xioo (E)
Vcxn
Trong đó: x%: là mức dộ lợi tiểu trên một chuột.
Vt: thể tích nước tiểu ở lô thử (ml).
Vc: thể tích nước tiểu
ở lô chứng (ml),
n: số chuột của một lô.
2.I.2.4. Kiêm tra độ nhiễm khuẩn của sản phẩm chế theo phương pháp
ghi trong Dược điển Việt Nam III [6],
Mục đích: Nhằm đánh giá số lượng vi khuẩn, nấm mốc, nấm men sống lại
được và phát hiện các vi khuẩn chỉ điểm y tế có trong ngưu tất.
* Chế phẩm đạt tiêu chuẩn về vi sinh vật khi:
Số lượng vi khuẩn <10000 vi khuẩn/lg.
Số lượng vi nấm <100 vi nấm/lg.
Số trung bình các khuẩn lạc trên một đĩa (S) được tính theo công thức (G):
s = (Sị + S2)/2 (G)
Trong đó: s,: là số khuẩn lạc mọc tên đĩa 1.
S2: là số khuẩn lạc mọc tên đĩa 2.
Số vi sinh vật trong lg ngưu tất tính theo công thức (H):
X = S xn (H)
Trong đó: X: là số vi sinh vật trong lg ngưu tất.
S: số trung bình các khuẩn lạc trên 1 đĩa.
n: Hệ số pha loãng.
Các kết quả thử sinh học được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học với
sự hỗ trợ của Excel 98.
11

2.2. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM:
2.2.1. Bào chê ngưu tất:
*Ngưu tất dùng sống (M|):
Ngưu tất khô rửa sạch, làm mềm, thái phiến vát dày l-3mm, sau đó sấy ở
50-60°C và bảo quản để nghiên cứu.
*Ngưu tất trích rượu (M2):
Ngưu tất khô rửa sạch, làm mềm, thái phiến vát dày l-3mm; sấy khô qua,
lkg trích với 200ml rượu trắng 40°, ủ 1 giờ cho ngấm rượu sau đó đem sao
khô tới khi có mùi thơm nhẹ, màu vàng nhạt là được.
*Ngưu tất trích muối (M3):
Ngưu tất khô rửa sạch, làm mềm, thái phiến, vát dàyl-3mm; sấy khô qua,
lkg trích với 180ml dung dịch muối 5%, ủ 1 giờ cho thấm đều, sao khô đến
khi có mùi thơm nhẹ, màu vàng nhạt là được.
2.2.2. Định tính một sô nhóm chất trong ngưu tất:
Phản ứng định tính được tiến hành đồng thời với các mẫu Mj, M2, M3, mỗi
thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
2.2.2.1. Định tính alcaloid:
* Chuẩn bị dịch thử:
Cho lg dược liệu đã tán nhỏ vào bình nón dung tích 50ml, thêm 20ml dung
dịch acid sulfuric 2%, lắc đều. Đun trên nồi cách thuỷ sôi trong 10 phút. Để
nguội, lọc vào bình gạn. Kiềm hoá dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6N đến
pH kiềm (thử bằng chỉ thị màu vạn năng), chiết alcaloid bằng chloroform (3
lần X 5ml). Dịch chloroform được lắc vài lần với dung dịch acid sulfuric 2%,
dung dịch acid được dùng để định tính.
12
- Phản ứng với thuốc thử Dragendorff:
Cho lml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt thuốc thử Dragendorff,
lắc nhẹ, không thấy xuất hiện tủa da cam (phản ứng âm tính).
- Phản ứng với thuốc thử Bouchardat:
Cho lml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt thuốc thử Bouchardat,

lắc nhẹ không thấy tủa nâu (phản ứng âm tính).
- Phản ứng với thuốc thử Mayer:
Cho lml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt thuốc thử Mayer, không
thấy tủa đục (phản ứng âm tính).
Sơ bộ kết luận: Không có alcaloid trong cả 3 mẫu thử.
2.2.2.2. Định tính glycosid tim:
* Chuẩn bị dịch thử:
Lấy lOg dược liệu cho vào bình nón có dung tích 250ml thêm 100ml nước
cất, ngâm ở nhiệt độ phòng 24 giờ. Gạn dịch vào cốc có mỏ, thêm vào dịch
gạn dung dịch chì acetat 30% đến khi không còn tủa, khuấy đều, để lắng, lọc
qua giấy lọc. Chuyển dịch lọc vào bình gạn 100ml, lắc với chloroform 3 lần,
mỗi lần 5ml. Gạn lớp chloroform vào cốc có mỏ, dịch gạn phải trong suốt,
thêm Na2S04 khan, lọc, chia đều dịch chiết chloroform vào 4 ống nghiệm
nhỏ, cô trên nồi cách thuỷ đến khô, cắn còn lại tiến hành làm các phản ứng:
- Phản ứng Liebermann: cho vào ống nghiệm chứa cắn lml anhydrid
acetic, lắc đều cho tan hết cắn, cho thêm đồng lượng acid sulfuric đặc theo
thành ống nghiệm cho phân thành hai lớp. Thấy xuất hiện vòng đỏ tím giữa
hai lớp phân cách (phản ứng dương tính).
- Phản ứng Baljet: Cho vào ống nghiệm chưá cắn lml ethanol 90°, lắc đều
cho tan hết cắn, thêm 2ml thuốc thử Baljet vừa mới pha (một phần acid picric
13
1%- 9 phần dung dịch NaOH 10%). Không thấy xuất hiện màu vàng da cam
(phản ứng âm tính).
- Phản ứng Legal: Cho vào ống nghiệm chứa cắn lml ethanol 90°, lắc cho
tan hết cắn, thêm 3 giọt thuốc thử Natri nitroprussiat 0,5% và hai giọt dung
dịch NaOH 10%. Không thấy xuất hiện màu đỏ (phản ứng âm tính).
- Phản ứng Keller- Kiliani: Cho vào ống nghiệm chứa cắn lml ethanol 90°,
lắc cho tan hết cắn, thêm lml dung dịch FeCl3 5% trong acid acetic, nghiêng
ống nghiệm, cho từ acid sulfuric đặc theo thành ống nghiệm. Không thấy
vòng đỏ giữa hai lớp phân cách (phản ứng âm tính).

Sơ bộ kết luận: Không có glycogid tim trong cả 3 mẫu thử.
2.2.2.3. Định tính flavonoid:
* Chuẩn bị dịch thử:
Lấy lOg bột dược liệu cho vào bình nón, thêm 50ml cồn 90° đun sôi cách
thuỷ trong 10 phút, lọc nóng thu lấy dịch lọc để làm phản ứng.
- Phản ứng Cyanidin: Cho vào ống nghiệm nhỏ lml dịch chiết. Thêm vào
một ít bột Mg kim loại. Giỏ từng giọt acid HC1 đậm đặc (3-5 giọt), lắc đều rồi
đun nóng cách thuỷ một vài phút. Không thấy dung dịch chuyển màu (phản
ứng âm tính).
- Phản ứng với kiềm:
+ Giỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc. Hơ khô rồi để lên miệng lọ
amoniac đặc đã mở nút không thấy màu vàng của dịch chiết tăng lên
(phản ứng âm tính).
+ Cho vào ống nghiệm lml dịch chiết thêm vài giọt dung dịch NaOH
10% thấy xuất hiện kết tủa màu vàng (phản ứng dương tính).
Sơ bộ kết luận: Không có ílavonoid trong cả 3 mẫu thử.
14
2.2.2.4. Định tính coumarin:
Tiến hành chiết như ở mục 2.2.2.3, dịch chiết làm các phản ứng sau:
- Phản ứng mở đóng vòng lacton: Cho vào hai ống nghiệm, mỗi ống lml
dịch chiết, ống thứ nhất thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10%, ống thứ hai để
nguyên.
Đun cả hai ống nghiệm đến sôi, để nguội rồi quan sát:
Ống 1: Có kết tủa màu đỏ.
Ống 2: Trong suốt.
Thêm vào cả hai ống nghiệm, mỗi ống 2ml nước cất. Lắc đều, quan sát thấy:
Ống 1: Tủa đục màu đỏ.
Ống 2: Trong.
Phản ứng âm tính.
+ Phản ứng Diazo hoá: trong ống nghiệm nhỏ cho lml dịch chiết. Thêm

vào đó 2ml dung dịch NaOH 10%. Đun cách thủy đến sôi. Để nguội thêm vài
giọt thuốc thử diazo. Quan sát không thấy xuất hiện màu đỏ (phản ứng âm
tính).
Sơ bộ kết luận: Không có courmarin trong cả 3 mẫu thử.
2.2.2.5. Định tính saponin:
+ Hiện tượng tạo bọt: Cho vào ống nghiệm to lg bột dược liệu, thêm 5ml
nước, đun sôi nhẹ, lọc nóng. Dịch lọc cho vào 1 ống nghiệm to, thêm 10ml
nước, lắc ống nghiệm trong 5 phút theo chiều dọc. Để yên quan sát hiện tượng
tạo bọt. Thấy cột bọt bền sau 15 phút. Cả 3 mẫu đều có hiện tượng tạo bọt.
+ Phản ứng trong ống nghiệm:
* Chuẩn bị dịch thử:
15
Cho vào ống nghiệm lớn lg bột dược liệu, thêm 10ml cồn 90° đun cách
thuỷ 5 phút, lọc, lấy dịch lọc làm các phản ứng.
- Phản ứng Liebermann- Burchardat:
Lấy lml dịch chiết cho vào ống nghiệm, bốc hơi cách thuỷ đến khô. Hoà
tan cắn trong lml dung dịch chloroform, thêm lml dung dịch anhydrid acetic,
lắc đều. Cho từ từ lml H2S04 đặc theo thành ống nghiệm. Thấy xuất hiện vòng
màu tím đỏ giữa hai lớp phân cách (phản ứng dương tính).
- Phản ứng Salkowski:
Lấy lml dịch chiết cho vào ống nghiệm, bốc hơi cách thuỷ đến khô. Hoà
tan cắn trong lml dung dịch chloroform. Cho từ từ lml H2S04 đậm đặc theo
thành ống nghiệm. Thấy xuất hiện vòng màu nâu đỏ giữa hai lớp phân cách
(phản ứng dương tính).
Sơ bộ kết luận: Có saponin trong cả 3 mẫu thử.
.2.2.2.6. Định tính tanin:
* Chuẩn bị dịch thử:
Lấy 5g bột dược liệu cho vào cốc có mỏ 100ml, thêm vào 20ml nước
cất,
đun sôi trong 5 phút, lọc nóng. Dịch lọc chia vào các ống nghiệm làm các

phản ứng sau:
- Phản ứng với dung dịch gelatin 1%: cho lml dịch chiết vào ống nghiệm,
thêm vài giọt dung dịch gelatin 1%, không thấy xuất hiện tủa bông trắng
(phản ứng âm tính).
- Phản ứng với dung dịch FeCl3 5 %: cho vào ống nghiệm nhỏ 2ml dịch
chiết, thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%, không thấy xuất hiện màu xanh đen
(phản ứng âm tính).
16
Sơ bộ kết luận: Không có tanin trong cả 3 mẫu thử.
2.2.2.7. Định tính anthraglycosid:
- Phản ứng Borntraeger: Lấy lOg bột dược liệu, cho vào bình nón 250ml,
thêm 100ml acid sulfuric 10%. Đun cách thuỷ 15 phút, lọc, chuyển dịch lọc
vào bình gạn, lắc với 10ml ether ethylic để phân thành hai lớp. Gạn lấy dịch
chiết ether ethylic, thêm 2ml dung dịch NaOH 10%, lắc đều. Quan sát thấy
lớp nước không có màu đỏ sẫm (phản ứng âm tính).
- Vi thăng hoa: Đặt một ít bột dược liệu trong một nắp nhồm. Hơ nhẹ trên
đèn cồn cho đến khi bay hơi hết nước trong dược liệu. Đặt lên miệng lắp nhôm
một tấm kính, trên tấm kính có để một miếng bông tẩm nước lạnh. Để nắp
nhôm trực tiếp trên nguồn nhiệt. Sau 5- 10 phút lấy tấm kính, để nguội quan
sát trên kính hiển vi. Không thấy có tinh thể (phản ứng âm tính).
Sơ bộ kết luận: Không có anthraglycosid trong cả 3 mẫu thử.
2.2.2.8. Định tính đường khử tự do:
Cho vào ống nghiệm khoảng 2ml dịch chiết nước dược liệu, thêm 0,5ml
thuốc
thử Fehling A và 0,5ml thuốc thử Fehling B. Đun sôi cách thuỷ vài phút. Xuất
hiện tủa màu đỏ gạch (phản ứng dương tính).
Sơ bộ kết luận: Có đường khử tự do trong cả 3 mẫu thử.
2.2.2.9. Định tính chất béo:
Giỏ 1 giọt dịch chiết ether dầu hỏa lên tờ giấy lọc, hơ khô không để lại vết
mờ trên giấy lọc (phản ứng âm tính).

Sơ bộ kết luận: Không có chất béo trong cả 3 mẫu thử.
2.2.2.10. Định tính acid hữu cơ:
Cho lg bột dược liệu vào ống nghiệm to, thêm 10ml nước cất. Đem đun 30
phút, để nguội, lọc vào ống nghiệm, thêm một ít tinh thể Na2C03 thấy có bọt
khí nổi lên (phản ứng dương tính).
Sơ bộ kết luận: Có acid hữu cơ trong cả 3 mẫu thử.
2.2.2.11. Định tính acid amin:
Cho vào ống nghiệm lg dược liệu, thêm 5ml nước cất, đun trong 5 phút.
Lọc nóng, thêm 2-3 giọt thuốc thử Ninhydrin 3%, đun cách thuỷ 5-10 phút.
Thấy xuất hiện màu xanh tím (phản ứng dương tính).
Sơ bộ kết luận: Có acid amin trong cả 3 mẫu thử.
Kết quả định tính các nhóm chất trong ngưu tất được tóm tắt ở bảng 1.
18
Bảng 1: Kết quả định tính các nhóm chất trong rễ ngưu tất.
STT Nhóm chất
Phản ứng định tính
Kết quả
Kết luận
1 Alcaloid
- Phản ứng với tt Dragendorff
-
Phản ứng với tt Mayer
-
Không
✓
Phản ứng với tt Bouchardat
-
có
2 Glycosid tim
- Phản ứng Liebermann

++
- Phản úng Baljet
-
Không
✓
- Phản ứng Legal
-
có
- Phản ứng Keller-Kiliani
-
3
Flavonoid - Phản ứng Cyanidin
-
- Phản ứng với NH4OH
-
Không
- Phản ứng với kiềm
+
có
4 Saponin
- Hiện tượng tạo bọt
- Phản ứng Salkowski
- Phản ứng Liebermann
+++
++
++
Có
5 Coumarin
- Với thuốc thử Diazo
-

- Phản ứng mở đóng vòng
lacton
-
Không
có
6 Tanin
- Phản ứng với FeCl3 5%
-
Không
- Phản ứng với gelatin 1 %
-
có
7
Anthranoid - Phản ứng Borntraeger
-
Không
- Vi thăng hoa
-
có
8
Đường khử
- Với tt Fehling A, B
+++ Có
9
Chất béo
- Vết mờ trên giấy lọc
-
Không
có
10 Acid hữu cơ

- Phản ứng với bột Na2C03
+
Có
11
Acid amin - Phản ứng với thuốc thử
Ninhydrin 3%
+
Có
Ghi chú: phản ứng âm tính. +: phản ứng dương tính.
++: phản ứng rõ. +++: phản ứng rất rõ.
19
Sơ bộ kết luận: Trong rễ ngưu tất có saponin, đường khử, acid hữu cơ,
acid amin.
Qua các phản ứng định tính các nhóm chất như trên chúng tôi nhận thấy
giữa mẫu sống và mẫu chế, giữa các mẫu chế khác nhau thì kết quả không có
sự khác nhau.
2.2.3. Định tính saponin bằng sắc ký lớp mỏng:
- Chuẩn bị dịch chấm sắc ký: Cân 2g bột dược liệu, thêm 20ml ethanol (tt),
đun nóng cách thuỷ hồi lưu trong vòng 40 phút, để yên.
Lấy lOml dung dịch ở phía trên, thêm lml dung dịch HC1 đậm đặc (tt), đun
hồi lưu trong vòng 1 giờ, cô đặc dịch chiết chỉ còn 5ml, rồi thêm 10ml nước,
chiết với 20ml ether dầu hoả. Bốc hơi dịch chiết ether dầu hoả đến cắn, hoà
cắn vào 2ml ethanol làm dung dịch chấm sắc ký.
- Triển khai sắc ký
+ Dùng bản mỏng Silicagel GF254- Merck đã tráng sẵn, đã được hoạt hoá ở
110°c trong vòng 1 giờ.
+ Khai triển trên một số hệ dung môi:
1. n- Buthanol bão hoà nước
2. n- Buthanol - acid acetic - nước (4:1:1)
3. Chloroform - methanol - nước (65:35:10)

4. Chloroform - methanol (19:1)
5. n- Buthanol - ethanol - amoniac 25% (7:2:5)
6. Chloroform - aceton (4:1); (9:1)
7. Chloroform - ethyl acetat (4:1); (9:1)
20
- Thuốc thử hiện màu:
Dung dịch 1% vanilin trong cồn. Thêm 2ml acid sulfuric đậm đặc.
Sau khi phun thuốc thử sấy bản mỏng ở 110°c trong 10 phút.
Trong số các hệ số dung môi trên, hệ dung môi n-butanol: ethanol: amoniac
25% (7:2:5) tách vết rõ hơn cả, chúng tôi chọn hệ này để ghi lại kết quả.
Kết quả sắc ký lớp mỏng saponin đựơc ghi ở bảng 2 và hình 1.
Bảng 2. Kết quả định tính Saponin bằng sắc kỷ lớp mỏng.
Vết
số
Rf
Màu khi phun
thuốc thử hiện màu
M,
m 2
m 3
1
0,35
0,36
0,36
Xanh
2
0,49 0,49
0,49
Nâu
3

0,61 0,62
0,61
Xanh rêu
4
0,68
0,69
0,68
Tím
Hình 1: Ảnh sắc ký đồ saponin trong ngưu tất. Ml M2 M3
21