Bài giảng vi sinh vật thực hành

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG
BÀI GIẢNG VI SINH VẬT THỰC HÀNH
(Dùng cho ngành Nuôi trồng thủy sản)
Biên soạn: Phạm Thị Lan
Vũ Đặng Hạ Quyên
Bộ môn: Công nghệ sinh học
Một số quy định đối với sinh viên khi thực tập môn Vi sinh vật ứng dụng
tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học
1. Đi thực tập đầy đủ, đúng giờ.
2. Phải đọc kĩ tài liệu trước khi đi thực tâp.
3. Bắt buộc phải mặc áo blouse, đeo bảng tên trong suốt thời gian thực tập.
4. Phải nghiêm túc, giữ trật tự trong suốt thời gian thực tập.
5. Không được tự ý sử dụng các trang thiết bị trong phòng thí nghiệm khi chưa
được sự đồng ý của cán bộ hướng dẫn.
6. Sử dụng các trang thiết bị thí nghiệm đúng quy cách và đúng mục đích sử
dụng.
7. Phải ký vào sổ quản lý trang thiết bị sau khi sử dụng.
8. Nghiêm cấm ăn, uống, nằm, ngồi ngả nghiêng, đùa giỡn trong phòng thí
nghiệm
9. Phải vệ sinh phòng sạch sẽ trước khi ra về.
10.Hoàn thành bài báo cáo thực tập và nộp lại cho giáo viên hướng dẫn theo thời
gian quy định.
Bài 1.
CHUẨN BỊ CÁC DỤNG CỤ VÀ GIỚI THIỆU CÁC THIẾT BỊ MÁY MÓC
THƯỜNG ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT
I. Chuẩn bị dụng cụ
I.1. Các dụng cụ thường được sử dụng trong nghiên cứu vi sinh vật
- Đĩa petri (hộp petri, hộp lồng)
- Ống nghiệm, bình nón có đậy nút bông

- Pipet
- Que gạt, que cấy
- Lam kính và lamen
I.2. Yêu cầu
Các dụng cụ trên cần phải sạch sẽ về mặt hóa học (không dính các chất hữu cơ,
vô cơ, thủy tinh cần phải trung tính) và sạch về mặt vi sinh vật học (không chứa bất
kỳ tế bào vi sinh vật cũng như dạng nghỉ của chúng – các dụng cụ phải vô trùng).
I.3. Cách xử lý dụng cụ trước khi rửa
- Dụng cụ thủy tinh mới mua, chưa sử dụng, cần ngâm nước lã hoặc dung dịch H
2
SO
4
loãng 24 giờ. Rửa lại bằng xà phòng và nước nhiều lần cho tới pH trung tính.
- Các dụng cụ đã sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật, nhất là vi sinh vật gây bệnh, trước
khi rửa nhất thiết phải được khử trùng bằng hơi nước áp lực cao để giết chết các tế
bào, đảm bảo an toàn cho người rửa, không reo rắc mầm bệnh vào môi trường.
- Các ống nghiệm nuôi vi sinh vật được biết không gây bệnh cho người và động vật,
chỉ cần tháo nút bông, xếp vào nồi hoặc chậu nhôm chuyên dụng. đổ nước và xà
phòng, dìm các dụng cụ ngập kín nước, đun sôi 15-30 phút. Gom các cặn bẩn vào túi
nilon, buộc kín, cho vào thùng rác.
- Dịch nuôi vi sinh vật trước khi đổ bỏ cần thêm vài giọt formalin, lắc mạnh để giết
chết tế bào.
- Dịch sunfo-cromic thường được sử dụng để ngâm tẩy các vết bẩn trên dụng cụ thủy
tinh.
I.4. Cách rửa
- Dùng miếng nhám thấm xà phòng hoặc bông thấm cồn lau sạch các ký hiệu ghi trên
thủy tinh.
- Chọn chổi rửa thích hợp với từng loại ống hoặc bình, một đầu nên buộc miếng mút
nhỏ để phần sắt không chọc thủng đáy ống nghiệm hoặc đáy bình.
- Dùng chổi rửa đã thấm xà phòng cọ kĩ phía trong ống hoặc bình tới khi sạch hết các

vết bẩn. Dùng khăn mềm thấm xà phòng cọ kỹ phía ngoài. Xả nước sạch xà phòng
phía trong và phía ngoài. Tráng lại bằng nước khử khoáng. Dựng ngược ống và bình
vào rổ có lót giấy sạch để róc nước. Làm khô ở nhiệt độ phòng hoặc phơi nắng hoặc
sấy khô ở 100
0
C.
- Đối với các đĩa petri: dùng khăn mềm thấm xà phòng cọ kỹ từng bộ. Rửa sạch xà
phòng, tráng lại bằng nước khử khoáng. Úp đĩa petri vào rổ theo từng bộ để róc nước.
- Các phiến kính và lá kính dùng xong nên ngâm riêng vào dung dịch tẩy rửa hoặc sát
trùng. Dùng khăn mềm cọ,rửa, tráng nước khử khoáng, thấm khô bằng khăn bông,
hong khô trước khi xếp vào hộp. Các lá kính rất dễ vỡ, rửa thận trọng dưới dòng nước
chảy nhẹ.
- Pipet dùng cho các phản ứng hóa học: không cần ngâm nước sát trùng. Đặt pipet
dưới vòi nước chảy, xả bớt hóa chất bám dính bên trong. Ngâm vào ống nước xà
phòng một ngày, rửa sạch, tráng nước khử khoáng. Loại pipet này chỉ nên hong khô ở
nhiệt độ phòng. Sấy ở nhiệt độ cao thủy tinh dãn nở dẫn đến sai lệch thể tích.
Chú ý: nếu ngâm lâu trong dung dịch tẩy rửa mạnh các vạch chia độ sơn trên
pipet dễ bị mờ.
I.5. Cách làm nút bông
- Ống nghiệm, bình nón, bình cầu dùng để nuôi cấy vi sinh vật nhất thiết phải được
đậy nút bông. Bông không thấm nước được sử dụng để làm nút. Nút bông có chức
năng như một dụng cụ lọc khí vô trùng do vậy cần có độ dày vừa phải để không khí
có thể đi qua nhưng vi sinh vật bị giữ lại. Hơn nữa nút bông cần làm đúng kiểu cách
để thuận tiện khi thao tác thí nghiệm.
I.6. Cách bao gói đĩa petri và pipet
- Quan sát cách gói đĩa petri bằng giấy
- Quan sát cách cuốn giấy bao gói pipet từng cái. Có thể chọn các pipet cùng kích cỡ
gói lại thành bó, buộc hai đầu, đánh dấu phần miệng hút. Sau khi khử trùng, chỉ được
mở phần này để lấy pipet ra dùng, tay không được chạm vào phần nhọn của pipet.
- Quan sát cách bao gói que gạt, que cấy tre hoặc thủy tinh, các ống nghiệm có nút

bông.
I.7. Khử trùng dụng cụ thủy tinh
- Khử trùng bằng sức nóng khô: xếp dụng cụ đã bao gói kín vào tủ sấy, không đặt ống
có nút bông vào dàn sắt ở ngăn dưới đề phòng bông bốc cháy. Không nên xếp chặt
quá để không khí lưu thông làm nóng đều các vật cần khử trùng. Đóng cửa tủ sấy và
các lỗ thông khí. Đặt mức điều chỉnh tự động. Bật điện. Khi nhiệt độ lên đến 160-
170
0
C thì bắt đầu tính thời gian. Duy trì nhiệt độ này trong 1 giờ. Tắt điện, để nhiệt độ
tụt xuống bằng nhiệt độ phòng mới được lấy dụng cụ ra. Nếu bộ phận điều chỉnh nhiệt
độ tự động không hoạt động tốt, cần theo dõi nhiệt độ cẩn thận. Nhiệt độ vượt quá
1700C bông, giấy dễ bị cháy và nếu vượt quá mức cho phép nhiệt kế thủy ngân sẽ bị
vỡ gây độc hại.
- Khử trùng bằng hơi nước áp lực cao: que gạt, pipet, que cấy các loại, ống nghiệm đã
bao gói kín. Khử trùng xong nên sử dụng ngay.
I.8. Bảo quản dụng cụ đã khử trùng
- Nếu không sử dụng ngay nên cho dụng cụ đã khử trùng khô vào túi polietylen buộc
chặt, bảo quản trong tủ kín sạch sẽ khô ráo. Các que gạt, que cấy chỉ nên sử dụng
trong vòng 24 giờ, hộp petri trong vòng 3 ngày, ống nghiệm, bình nón khoảng 7-10
ngày nếu bảo quản tốt. Nếu để lâu dụng cụ phải được khử trùng lại trước khi dùng.
II. Giới thiệu các máy móc và thiết bị dùng trong nghiên cứu vi sinh vật (Sinh
viên tự tìm hiểu và viết báo cáo):
- Kính hiển vi
- Cân
- Máy cất nước
- Tủ sấy
- Tủ ấm
- Máy lắc
- Bể điều nhiệt
- Tủ lạnh

- Màng lọc vô trùng
- Đèn tử ngoại (UV)
- Nồi hấp
- Tủ cấy vô trùng
- Bình ủ kỵ khí
III. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật
Các tế bào vi sinh vật sinh trưởng được thì cần các các chất dinh dưỡng thích hợp.
Khi nuôi cấy nhân tạo người ta làm các loại “thức ăn” cung cấp cho từng nhóm vi
sinh vật khác nhau. Dạng “thức ăn” này được gọi là môi trường nuôi cấy.
III.1. Các yêu cầu về môi trường nuôi cấy
- Đầy đủ các chất dinh dưỡng phù hợp với từng kiểu trao đổi chất của từng nhóm vi
sinh vật, không chứa các yếu tố độc hại, đảm bảo cho sự sinh trưởng bình thường
của vi sinh vật.
- Vô trùng tuyệt đối để khi nuôi cấy chỉ phát triển một loại vi sinh vật mong muốn.
III.2. Phân loại môi trường
- Phân loại theo thành phần hóa học:
Môi trường có thành phần xác định;
Môi trường có thành phần không xác định
- Phân loại môi trường theo chế độ dinh dưỡng
Môi trường tối thiểu
Môi trường đủ hoặc giàu
- Phân loại môi trường theo công dụng
Môi trường chọn lọc
Môi trường phân biệt
Môi trường chọn lọc – phân biệt
III.3. Cách làm môi trường
Cần đọc kỹ công thức môi trường, chuẩn bị các hóa chất, dụng cụ liên quan
- Pha chế
- Đun môi trường
- Điều chỉnh pH

- Phân phối môi trường vào các dụng cụ vô trùng
- Khử trùng môi trường bằng nồi hấp áp lực
- Khử trùng các thành phần kém bền nhiệt
Phần báo cáo: sinh viên mô tả các dụng cụ thí nghiệm, cách chuẩn bị các môi trường
và dụng cụ cho bài thực tập số 2
Bài 2.
PHÂN LẬP CHỦNG VI SINH VẬT THUẦN KHIẾT
Phân lập vi khuẩn là một quá trình tách rời một loại vi khuẩn từ quần thể vi sinh vật,
sau đó gieo chúng lên bề mặt môi trường thạch dinh dưỡng chọn lọc. Sau khi ủ ở các
điều kiện thích hợp các vi khuẩn sẽ phân chia nhiều lần tạo thành những quần thể mọc
riêng biệt gọi là khuẩn lạc. Một ít tế bào trong khuẩn lạc được cấy truyền vào ống môi
trường giữ giống và ủ ở các điều kiện thích hợp để chúng phát triển thành quần thể
mới. Quần thể vi khuẩn trong ống nghiệm này được gọi là một chủng vi khuẩn hoặc là
ống giống [1].
Chủng vi khuẩn thuần khiết (hay còn gọi là chủng sạch) được hiểu là thế hệ con, cháu,
dòng có nguồn gốc từ một tế bào riêng lẻ. Các chủng vi khuẩn được thu nhận từ
khuẩn lạc phân lập lần đầu chưa chắc đã thuần khiết vì một khuẩn lạc có thể được
hình thành bởi một hoặc nhiều tế bào, vì thế phải làm sạch nhiều lần mới thu được
chủng vi khuẩn thuần khiết.
1. Chuẩn bị
a. Dụng cụ, thiết bị
• Buồng cấy vô trùng;
• cân kỹ thuật - 1cái;
• giá ống nghiệm - 4 cái,
• mỗi giá có 10 ống nghiệm;
• đũa thủy tinh - 2 cái;
• que trang - 2 cái;
• que cấy - 5 cái,
• đèn cồn 2 cái,
• bếp điện - 2 cái,

• soong 2 lít - 2 cái;
• besher loại 500 ml – 2 cái; loại 250 ml – 2 cái;
• pipét loại 1ml - 2 cái,
• loại 5 ml - 2 cái;
• ống nghiệm - 50 ống;
• chai tam giác loại 250 ml - 6 chai;
• kéo cắt giấy - 1cái;
• dao thái -1cái;
• hộp Petri-25 hộp/ nhóm;
• khăn lau - 2 cái;
• bật lửa - 1 cái;
• ống nhỏ giọt - 2 cái.


b. Nguyên liệu và mẫu vật
• Bông không thấm nước 100g;
• nước cất 10 lít;
• cồn đốt 1000 ml;
• bông thấm nước; giấy thấm 1 hộp;
• giấy báo cũ để gói đĩa Petri;
• dây buộc bằng nilon;
• Môi trường thạch đĩa 30 hộp,
• thạch nghiêng 50 ống để nuôi cấy vi khuẩn
• Chai tam giác loại 250 ml chứa môi trường đã pha chế trước
• Đất vườn, đất đồi, mỗi loại 100-150g.
• Các ống giống vi khuẩn chuẩn.
• Chất ức khuẩn: streptomycin, penicillin, gentian violet v.v
• Môi trường thạch TSA
• Môi trường TCBS.
2. Nguyên tắc phân lập

- Gieo cấy vi khuẩn đã pha loãng trên môi trường dinh dưỡng đặc trưng (2% thạch
hay còn gọi là agar).
- Nuôi dưỡng trong điều kiện thích hợp cho mọc các khuẩn lạc tách biệt nhau.
- Cấy tách từ khuẩn lạc mọc tách biệt sang ống môi trường dinh dưỡng thạch nghiêng
để thu nhận chủng vi khuẩn thuần khiết (do Robert Koch đề ra).
3. Các bước tiến hành
a. Pha chế môi trường thạch đĩa, thạch nghiêng
- Cân, đong chính xác từng thành phần môi trường
- Hòa tan các chất vào nước, đun và khuấy cho tan
- Làm trong môi trường, kiểm tra thể tích và pH
- Rót môi trường vào dụng cụ (ống nghiệm 1/4h, hộp Petri 1/3h, chai tam giác 1/2h).
Làm nút bông, bao giấy họa báo
- Khử trùng ở nồi hấp áp lực hơi nước (0,8 – 1,0 atm/30 phút) tùy loại môi trường
- Chế môi trường thạch nghiêng và thạch đĩa [2], [3].
b. Thu mẫu, nuôi tích lũy và pha loãng
- Thu mẫu đất hoặc các cơ chất có vi khuẩn từ 100-150g, trường hợp số vi khuẩn có
mặt ít trong mẫu thì phải nuôi tích lũy bằng cách ủ mẫu, bổ sung chất dinh dưỡng và
các điều kiện lý, hóa cần thiết hoặc bổ sung các chất ức chế sinh trưởng của các vi
sinh vật đi kèm.
- Cân lấy 1g mẫu có vi khuẩn cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước cất vô trùng,
khuấy bằng đũa thuỷ tinh cho tan hết mẫu. Ta có dung dịch mẫu pha loãng 10
-1
lần.
- Lấy 1ml dịch huyền phù ở độ pha loãng10
-1
đưa vào ống nghiệm chứa 9 ml nước vô
trùng. Trộn đều ta có dịch pha loãng 10
-2
lần.
Tiếp tục làm như trên, ta có một loạt độ pha loãng dịch mẫu khác nhau như ý.

c. Phân lập vi khuẩn hiếu khí và kị khí tùy tiện
- Cấy dịch huyền phù lên môi trường đặc trong hộp Petri
+ Dùng pipet vô trùng nhỏ 1ml dịch huyền phù đã pha loãng ở nồng độ nhất định lên
bề mặt của môi trường trong hộp Petri.
+ Dùng que trang dàn đều giọt dịch huyền phù trên toàn bộ bề mặt môi trường hộp
thạch.
+ Đậy hộp Petri, gói lại và đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ 28 - 30
0
C trong 48 - 72h.
- Trộn dịch mẫu pha loãng trong các môi trường thạch nóng chảy
Dùng pipet vô trùng nhỏ 1ml dịch huyền phù đã pha loãng ở nồng độ nhất định vào
môi trường thạch đã nóng chảy và để nguội đến 45 - 50
0
C trong bình nón, lắc đều. Bổ
sung thêm một trong các chất ức khuẩn trên khoảng 0,3-0,5‰, tiếp tục lắc đều một
lần nữa rồi đổ ra các hộp Petri mỗi hộp cở 15ml. Gói các hộp Petri lại, và đặt vào tủ
ấm ở nhiệt độ 28 - 30
0
C trong 48 - 72h.
- Phân lập vi khuẩn bằng que cấy vòng
+ Nung đỏ đầu que cấy vòng (hình 2.1), làm nguội trong không khí khoảng 15s. Cho
vòng que cấy chấm vào dịch huyền phù đã pha loãng có chứa vi khuẩn cần phân lập.
+ Tay trái hé mở nắp hộp thạch. Đặt đầu que cấy vào 1 góc hộp thạch, chấm nhẹ để
loại bớt tế bào một lần nữa. Từ điểm này đẩy nhẹ đầu que cấy lướt nhanh trên bề mặt
thạch theo đường zích zắc (hình 2.2). Xoay đĩa và tiếp tục vạch các đường zích zắc
sao cho không trùng lên nhau trên khoảng trống còn lại, nhằm tạo điều kiện cho các
khuẩn lạc mọc rời nhau ra. Đậy nắp hộp. Khử trùng que cấy trước khi cắm vào giá.
+ Các thao tác phải nhanh tay và làm trên ngọn lửa đèn cồn đặt trong tủ cấy, đảm bảo
vô trùng.

Hình 2: Phương pháp phân lập vi khuẩn bằng que cấy vòng
1. Khử trùng đầu que cấy; 2. Đường cấy zích zắc trên bề mặt thạch dinh dưỡng; 3. Kết
quả khuẩn lạc vi khuẩn mọc trên bề mặt thạch (hình có tính chất minh họa)
- Nuôi dưỡng vi khuẩn
+ Nguyên tắc: Nuôi dưỡng là quá trình đảm bảo và duy trì những điều kiện thuận lợi
nhất cho sự hoạt động và sinh sản của vi khuẩn.
+ Tiến hành : Úp ngược các hộp Petri rồi đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ 28 - 30
0
C trong 24
- 48h. Sau thời gian trên ở bề mặt thạch đĩa sẽ mọc các khuẩn lạc riêng biệt mắt
thường quan sát được.
- Thu nhận chủng vi khuẩn thuần khiết
+ Cấy vi khuẩn từ khuẩn lạc mọc tách rời vào ống môi trường thạch nghiêng.
+ Nuôi vi khuẩn ở nhiệt độ và thời gian thích hợp.
+ Loại bỏ các ống bị nhiễm, chọn ra các ống có các chủng thuần khiết.
- Phương pháp kiểm tra độ thuần khiết của một chủng vi khuẩn mới phân lập
Có nhiều cách kiểm tra:
* Kiểm tra vết cấy trên môi trường thạch đĩa: nếu vết cấy có bề mặt và màu sắc đồng
đều, thuần nhất chứng tỏ chủng mới phân lập thuần khiết thì giữ lại. Nếu vết cấy
không thuần nhất thì loại bỏ.
* Kiểm tra độ thuần khiết của các khuẩn lạc:
+ Khuẩn lạc có màu sắc, bề mặt, hình dạng đặc trưng giống như khuẩn lạc chủng
mẫu.
+ Không có các màu sắc và sắc tố lạ.
+ Làm tiêu bản soi tươi dưới kính hiển vi thấy có hình dạng đặc trưng như chủng
mẫu.
+ Tiến hành phân lập lại trong điều kiện vô trùng vẫn cho hình dạng khuẩn lạc tương
tự.
+ Làm một số phản ứng sinh hóa định tính đặc trưng.
- Các phương pháp giữ giống vi khuẩn sau phân lập

+ Cấy truyền định kỳ trên môi trường thạch nghiêng mới (1 tháng/1lần).
+ Giữ vi khuẩn ở nhiệt độ 4-5
0
C trong tủ lạnh hoặc phòng lạnh.
+ Trộn vi khuẩn với glycerol vô trùng với tỉ lệ 1 : 20 và giữ ở nhiệt độ 3-5
0
C.
+ Bảo quản vi khuẩn trong cát sạch đối với những chủng có bào tử.
+ Phương pháp đông khô v.v
4. Thu nhận nhanh một số chủng vi khuẩn trong thực tế
Bên cạnh phương pháp phân lập như trên, tùy điều kiện từng trường chúng ta có thể
tự thu nhận nhanh các chủng vi khuẩn để làm đối tượng thực hành sinh học.
a. Phân lập trực khuẩn Bacillus subtilis(Gram dương sinh bào tử)
- Cỏ khô cắt nhỏ 5g, cho vào bình tam giác dung tích 250ml, 200ml nước
- Bổ sung thêm 1g đất vườn, 1/4 viên phấn viết bảng
- Đun sôi 15 phút để diệt các tế bào sinh dưỡng và tế bào không có nội bào tử
- Đậy nút bông, ủ ấm ở nhiệt độ 30
0
C trong 72h
Kết quả: Xuất hiện lớp váng xám có nhiều trực khuẩn Bacillus subtilis
Trên kính hiển vi các tế bào Bacillus subtilis có dạng hình que, kích thước khoảng 3-5
´ 0,6 mm, mỗi tế bào chỉ có một bào tử hình ô van và không làm biến dạng tế bào.
b. Thu nhận liên cầu khuẩn Streptococcus lactis (Gram dương không sinh bào tử)
- Lấy 2 ml sữa chua Vinamilk hòa loãng với 3ml nước cất, ta được 5ml dung dịch
chứa liên cầu khuẩn Streptococcus lactis.
c. Thu nhận Vibrio (phân lập bằng môi trường TCBS)
- - Tiến hành thu mẫu nghiên cứu và xử lý mẫu như sau:
* Với mẫu bùn và nước: lấy 1ml hoặc 1g mẫu trộn đều với 9ml dung dịch nước muối
sinh lý vô trùng được nồng độ 10
-1

. Tiếp tục pha loãng mẫu lần lượt đến các nồng độ
10
-2
, 10
-3
. Dùng Pipetman với các đầu côn vô trùng hút lần lượt các mẫu ở mỗi nồng
độ gạt lên các đĩa Petri có chứa môi trường TCBS.
* Với mẫu ruột cá: làm tương tự như mẫu bùn, nước. Nhưng mẫu phải được nghiền
nát, sau đó pha loãng với dung dịch nước muối sinh lý.
* Sinh viên trả lời các câu hỏi sau:
1) Trình bày các nguyên tắc và phương pháp phân lập vi khuẩn thuần khiết.
2) Nguyên tắc của việc nuôi tích lũy?
3) Thế nào là chủng vi khuẩn thuần khiết (chủng sạch)?
Khi phân lập cần lưu ý: các hộp thạch môi trường phải vô trùng có bề mặt khô nước
và có độ rắn chắc, không gồ ghề, giúp các khuẩn lạc vi khuẩn mọc rời nhau ra. Để
phòng sự nhiễm tạp do không khí bẩn, các thao tác phải tuyệt đối vô trùng.
Các chủng sau khi làm sạch cần được kiểm tra lại bằng cách quan sát hình dạng tế bào
dưới kính hiển vi cũng như xác định lại các hoạt tính đã biết.
Việc tạo ra một chủng vi khuẩn thuần khiết cũng như bảo quản khỏi bị tạp nhiễm là
việc làm có ý nghĩa rất lớn trong học tập, nghiên cứu cũng như sản xuất.
Bài 3.
NHUỘM GRAM, NỘI BÀO TỬ CÁC CHỦNG ĐÃ TUYỂN CHỌN
I. Mục đích
Vi khuẩn Bacillus là vi khuẩn gram dương, hình thành nội bào tử điển hình (một
dạng nghỉ của vi khuẩn và rất kháng với nhiệt, hóa chất…). Nội bào tử và phản ứng
Gram là những tiêu chuẩn quan trọng dùng trong phân loại Bacillus.
- Nhuộm Gram các chủng đã tuyển chọn ở Bài 2.
- Nhuộm nội bào tử chủng đã tuyển chọn ở Bài 2.
II. Nguyên liệu
- Mẫu nghiên cứu: Các chủng đã được tuyển chọn ở bài 2.

- Hóa chất dùng để nhuộm: tím kết tinh, lugol, safranin, lục malachit.
- Dụng cụ thí nghiệm: đèn cồn, lăng kính, lammen, kính hiển vi quang học…
III. Phương pháp
- Quy trình nhuộm đơn các tế bào vi sinh vật:
- Quy trình nhuộm Gram:
Vật liệu, hoá chất:
 Dung dịch Tím kết tinh (Crystal violet):
- 2g tím kết tinh hoà tan trong 20 ml etanol 95%
- 0,8 g ammon oxalat hoà tan trong 80 ml nước cất
- Trộn hai dịch nói trên lại với nhau, giữ 48 giờ rồi lọc. Bảo quản trong lọ tối, sử
dụng vài tháng.
 Dung dịch Iod:
- Hoà tan 1 g Iod (Iodine) trong 3-5ml nước cất, thêm 2g KI (Kali iodide), khuấy
cho tan hết, thêm nước cất cho đủ 300ml. Bảo quản trong lọ tối.
 Dung dịch tẩy màu:
- Etanol 95% hoặc trộn hỗn hợp 70ml etanol 95% với 30ml aceton.
 Dung dịch nhuộm bổ sung:
- Chuẩn bị sẵn dung dịch Fushin 2,5%, trước khi dùng pha với nước cất theo tỷ lệ
1:5 (vol/vol) để có dung dịch 0,5%.
Các bước tiến hành:
- Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi
cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không
khí.
- Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần.
- Nhuộm bằng dung dịch Tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.
- Nhuộm lại bằng dung dịch Iod trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.
- Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa
nước, thấm khô.
- Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Fushin trong 2-3 phút, rửa nước, để khô trong
không khí.

- Soi kính: dùng vật kính dầu 100 .
Kết quả:
- Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram ( ) bắt màu đỏ.
-
-
- Hình3. Các bước tiến hành nhuộm Gram và ví dụ minh hoạ kết quả.
Nhuộm nội bào tử theo phương pháp nhuộm Lục Malachit (phương pháp
Schaeffer-Fulton)
Vật liệu, hoá chất:
 Dung dịch Lục Malachite (Malachite green) bão hoà (khoảng 7,6%)
 Dung dịch Safranin 0,5% (xem nhuộm Gram)
Các bước tiến hành:
 Làm vết bôi và cố định tế bào như đối với nhuộm Gram.
 Nhuộm bằng dung dịch Lục Malachite trong 10 phút, rửa nước.
 Nhuộm lại bằng dung dịch Safranine trong 30 giây, rửa nước, thấm khô.
 Soi kính: dùng vật kính dầu 100
Kết quả:
Bào tử có màu lục, tế bào có màu đỏ.
Chú ý: phân biệt bào tử với các hạt dị nhiễm cũng bắt màu lục
Phần báo cáo: Sinh viên vẽ lại hình ảnh các chủng vi sinh vật mà sinh viên quan sát
được bằng bút màu, và so sánh kích thước, hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào sau
khi nhuộm đơn, nhuộm Gram và nhuộm nội bào tử.
Bài 4.
Phần thực nghiệm định lượng số tế bào vi sinh vật có trong mẫu
bằng phương pháp đếm số khuẩn lạc trên thạch đĩa.
Cách tiến hành :
- Cho một ít giống vi sinh vật vào ống nghiệm chứa 1 ít nước cất vô khuẩn nhờ que
cấy vòng để tạo huyền phù tế bào. Cán bộ hướng dẫn có thể chuẩn bị trước các dịch
huyền phù tế bào có nồng độ nằm trong khoảng xác định.
- Pha loãng dịch huyền phù tế bào ở các nồng độ thích hợp như : 10

-1
, 10
-2
, 10
-3
, 10
-4
,
10
-5
tiến hành cấy mẫu ở các độ pha loãng khác nhau vào cac đĩa Petri (lặp ba, tức
là cấy mẫu ở mỗi độ pha loãng vào 3 đĩa Petri) theo hai phương pháp trên. Lưu ý rằng
ở phương pháp cấy gạt, chỉ cấy 0,1 ml dịch mẫu lên môi trường thạch rắn đã đổ sẵn,
còn đối với phương pháp đổ đĩa thì cấy 1 ml dịch mẫu vào đĩa trước khi thêm môi
trường thạch lỏng đã nguội vào.
- Đặt các đĩa thạch vừa cấy vào tủ ấm cài ở nhiệt độ 30oC và ủ trong 48 giờ.
- Kết thúc thời gian ủ, lấy các đĩa thạch ra, tiến hành đếm khuẩn lạc và tính số lượng
tế bào trong 1ml mẫu theo công thức đã nêu trên.
Mật độ tế bào vi sinh vật trong mẫu ban đầu tính từ số liệu của độ pha loãng D1
được tính theo công thức là :
Mi (CFU/ml) = A
i
x D
i
/V
Trong đó : A
i
là số khuẩn lạc trung bình/ đĩa
D
i

là độ pha loãng
V là dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml)
Mật độ tế bào trung bình M
I
trong mẫu ban đầu là trung bình cộng của M
i
ở
các nồng độ pha loãng khác nhau.
Bài 5.
KIỂM TRA KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI TINH BỘT CỦA NHÓM VI KHUẨN
BACILLUS PHÂN LẬP ĐƯỢC.
I. Mục đích
Kiểm tra hoạt tính của nhóm vi sinh vật phân lập được ở khả năng phân giải
tinh bột của nhóm vi khuẩn Bacillus.
II. Nguyên liệu
- Mẫu nghiên cứu: Chủng vi sinh phân lập được từ bài 2
- Hóa chất: môi trường TSA bổ sung tinh bột
dung dịch lugol
dung dịch NaCl
II. Phương pháp
* Khả năng phân giải tinh bột
Quy trình gồm các bước như sau:
- Các đĩa petri chứa môi trường có cơ chất là tinh bột
- Cấy điểm trên đĩa Petri bởi các nhóm vi sinh vật cần thử hoạt tính
- Tráng bằng dung dịch Lugol trong 15 phút
- Đổ dịch thừa, tiếp tục tráng bằng NaCl 1% để giữ màu
- Đo vòng phân giải
Trả lời các câu hỏi sau:
1. Thế nào là vòng phân giả enzym?
2. Viết cơ chế phân giải tinh bột?

3. Mô tả kết quả kiểm tra hoạt tinh đối kháng của hai nhóm vi sinh vật phân lập
được.
4. Mô tả kết quả kiểm tra hoạt tính phân giải tinh bột của chủng vi sinh vật đã
tuyển chọn.