Luận án nghiên cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

♣♦♣


HOÀNG VĂN QUỐC CHƯƠNG








NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ
SẢN XUẤT INSULIN TÁI TỔ HP





LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2010

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

♣♦♣


HOÀNG VĂN QUỐC CHƯƠNG







NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ
SẢN XUẤT INSULIN TÁI TỔ HP



Chuyên ngành: Vi sinh học
Mã số: 1.05.12

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC




NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS. TRẦN LINH THƯỚC






Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2010
-i-
Luận án Tiến só Lời cảm ơn
LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, em xin chân thành gởi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến Phó giáo
sư, Tiến só Trần Linh Thước. Thầy đã tận tụy hướng dẫn, giúp đỡ em trong quá
trình học tập, tạo điều kiện tốt nhất cho em để hoàn thành luận án. Không có sự
hỗ trợ của Thầy, em không thể hoàn thành được luận án này. Xin trân trọng cảm
ơn Thầy!
Em xin cảm ơn PGS.TS. Phạm Thành Hổ, đã thường xuyên quan tâm,
động viên và cung cấp những thông tin q báu cho em trong quá trình học tập và
thực hiện luận án.

Xin gởi lời cảm ơn đến PGS.TS. Phan Văn Chi, Phó viện trưởng Viện khoa
học Công nghệ Việt Nam, đã giúp đỡ chúng tôi phân tích trình tự mini-proinsulin.


Xin cảm ơn TS. Peer Nobert Jorgensen, công ty Norvonordisk, Đan Mạch,
đã cung cấp cho chúng tôi các kháng thể sử dụng trong quá trình nghiên cứu.


Em xin gởi lời cảm ơn đến tất cả q Thầy Cô trong Khoa sinh học, Trường
Đại học khoa học tự nhiên thành phố Hồ Chí minh, đã cung cấp cho em những
kiến thức bổ ích trong suốt quá trình học tập ở Trường.


Xin cảm ơn tất cả các bạn, các em trong phòng thí nghiệm công nghệ sinh
học phân tử (Lab A) ĐH KHTN tp HCM. Cảm ơn các bạn Hoàng, Trang, Thảo,
Trí… cảm ơn các em Nam, Nhung, Nghóa, Đạt, Đức, Trâm, Ngân… đặc biệt cảm
ơn Hoa, đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong thời gian thực hiện luận án. Không có sự
giúp đỡ của các bạn, các em, tôi không thể hoàn thành được luận án này.


Cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp đã động viên, hỗ trợ tôi trong quá trình thực
hiện luận án.


Và trên hết, xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân đã động viên, giúp
đỡ tôi trong suốt quá trình học tập.


Đặc biệt cảm ơn Vợ và các con đã mang lại cho tôi niềm hạnh phúc, sự yên
tâm trong quá trình thực hiện luận án.

Tp Hồ Chí Minh, Tháng 01 năm 2010

-ii-

Luận án Tiến só Mục lục

MỤC LỤC

Trang
LỜI CẢM ƠN i
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi
DANH MỤC HÌNH viii
DANH MỤC BẢNG xi
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 5
1.1. Insulin và vai trò đối với cơ thể 5
1.2. Bệnh tiểu đường 8
1.3. Các phương pháp sản xuất insulin 10
1.3.1. Sản xuất insulin từ tụy tạng động vật 10
1.3.2. Sản xuất insulin người bằng kỹ thuật tái tổ hợp DNA 12
1.4. Sản xuất protein tái tổ hợp trong tế bào E. coli 18
1.4.1. Đặc điểm của E. coli trong sản xuất protein tái tổ hợp 18
1.4.2. Các chủng E. coli thường dùng trong sản xuất protein tái tổ hợp 20
1.5. Các hệ thống vector biểu hiện trong E. coli 24
1.5.1. Hệ thống pGEX biểu hiện protein dung hợp với GST 24
1.5.2. Hệ thống pET biểu hiện protein dung hợp với 6xHis 25
1.5.3. Hệ thống biểu hiện dung hợp với MBP - Hệ thống pMAL 27
1.5.4. Hệ thống IMPACT biểu hiện protein dung hợp với CBP 27
1.6. Phương pháp lên men vi sinh vật 28

1.6.1. Các phương pháp lên men sản xuất protein tái tổ hợp 28
1.6.2. Đặc điểm lên men mẻ 29
1.6.3. Đặc điểm lên men liên tục 32
1.6.4. Đặc điểm lên men mẻ-bổ sung 32
1.6.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến lên men mẻ-bổ sung chủng E. coli để sản xuất
protein tái tổ hợp
34
1.7. Các bước xử lý sau lên men để thu nhận mini-proinsulin và insulin có
hoạt tính 39
1.7.1. Thu nhận và làm tan thể vùi chứa mini-proinsulin 39
1.7.2. Tái gấp cuộn mini-proinsulin tái tổ hợp 40
1.7.3. Cắt loại đoạn peptide C để thu nhận insulin có hoạt tính 43
1.7.4. Các bước xử lý để thu nhận protein mục tiêu từ protein dung hợp 44
-iii-

Luận án Tiến só Mục lục

1.7.5. Các phương pháp tinh chế trung gian và tinh chế hoàn tất trong sản xuất
insulin từ mini-proinsulin
45
1.8. Qui trình sản xuất insulin tái tổ hợp theo mô hình mini-proinsulin 47
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP 49
2.1. Dụng cụ và thiết bò 49
2.1.1. Thiết bò chính dùng trong sinh học phân tử 49
2.1.2. Thiết bò dùng trong thao tác nuôi cấy vi sinh 49
2.1.3. Thiết bò dùng cho tinh chế protein 49
2.1.4. Thiết bò dùng xác đònh hàm lượng đường huyết 50
2.2. Hóa chất và môi trường 50
2.2.1. Hóa chất 50
2.2.2. Môi trường nuôi cấy vi sinh 55

2.3. Nguyên vật liệu 55
2.3.1. Chủng vi sinh vật 55
2.3.2. Plasmid 56
2.3.3. Mồi dùng cho tổng hợp gen, tạo dòng và giải trình tự 56
2.3.4. Thang phân tử lượng dùng trong điện di 57
2.3.5. Các kháng thể sử dụng cho Western Blot và ELISA 57
2.4. Phương pháp 58
2.4.1. Thiết kế, tổng hợp gen mpi mã hóa 6xHis-MPI trong E. coli bằng phương
pháp PCR tái tổ hợp
58
2.4.2. Tạo dòng gen mpi trong plasmid pBlue (pBIns) 61
2.4.3. Tái tạo dòng gen mpi vào vector biểu hiện pET-43.1a 62
2.4.4. Cảm ứng biểu hiện và xác nhận sự biểu hiện của 6xHis-MPI 63
2.4.5. Hoạt hóa chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins 66
2.4.6. Khảo sát các điều kiện cảm ứng tối ưu sự biểu hiện 6xHis-MPI của chủng
E. coli BL21(DE3)/pET43Ins
66
2.4.7. Khảo sát thay thế trypton bằng pepton trong môi trường LB nuôi cấy E. coli
BL21(DE3)/pET43Ins
68
2.4.8. Khảo sát sự biểu hiện 6xHis-MPI của chủng E. coli BL21(DE3)/ pET43Ins
được nuôi cấy trong môi trường LBp và LB
68
2.4.9. Khảo sát điều kiện nuôi cấy E. coli BL21(DE3)/ pET43Ins mật độ cao bằng
phương pháp mẻ-bổ sung ở qui mô phòng thí nghiệm
69
2.4.10. Khảo sát điều kiện lên men E. coli BL21(DE3)/ pET43Ins bằng nuôi cấy
mẻ-bổ sung ở qui mô pilot 30L
70
2.4.11. Phương pháp thu sinh khối và đồng nhất tế bào 71

2.4.12. Thu nhận và làm tan thể vùi chứa 6xHis-MPI 72
2.4.13. Thu nhận và tinh chế sơ bộ 6xHis-MPI bằng sắc ký cột Ni-NTA 72
2.4.14. Phương pháp cắt loại bỏ 6xHis bằng CNBr để thu nhận MPI 72
-iv-

Luận án Tiến só Mục lục

2.4.15. Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng lên sự tái gấp cuộn của MPI 73
2.4.16. Tủa mini-proinsulin và insulin bằng ion kẽm kim loại 75
2.4.17. Phương pháp xử lý MPI bằng trypsin/carboxypeptidase B để thu nhận
insulin có hoạt tính
75
2.4.18. Kiểm tra cấu hình của MPI và insulin bằng phương pháp ELISA 76
2.4.19. Phân tích MPI và insulin bằng sắc ký RP-HPLC 77
2.4.20. Giải trình tự amino acid của MPI bằng khối phổ 77
2.4.21. Phương pháp đònh lượng protein 77
2.4.22. Phương pháp xác đònh tính hoạt tính của insulin tái tổ hợp 79
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 80
3.1. Tạo dòng tế bào E. coli có khả năng biểu hiện mini-proinsulin dung
hợp với 6xHis (6xHis-MPI) 80
3.1.1. Tổng hợp gen mpi mã hóa mini-proinsulin biểu hiện trong E. coli 80
3.1.2. Tạo dòng gen mpi vào plasmid pBlue 81
3.1.3. Tạo dòng tế bào E. coli BL21(DE3)/pET43Ins biểu hiện MPI ở dạng dung
hợp 6xHis-MPI
83
3.1.4. Kiểm tra trình tự amino acid của 6xHis-MPI 87
3.2. Lên men E. coli BL21(DE3)/pET43Ins tổng hợp 6xHis-MPI tái tổ hợp
ở qui mô phòng thí nghiệm và qui mô pilot 89
3.2.1. Hoạt hóa, nhân giống và kiểm tra khả năng biểu hiện 6xHis-MPI của
chủng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins

89
3.2.2. Khảo sát các điều kiện biểu hiện tối ưu 6xHis-MPI của E. coli
BL21(DE3)/pET43Ins
91
3.2.3. Xác đònh điều kiện nuôi cấy mật độ cao chủng E. coli BL21(DE3)/
pET43Ins ở qui mô phòng thí nghiệm
95
3.2.4. Nuôi cấy E. coli BL21(DE3)/pET43Ins theo phương thức mẻ- bổ sung ở qui
mô 30 L để tổng hợp 6xHis-MPI
101
3.3. Thu nhận MPI có cấu hình tự nhiên 104
3.3.1. Thu nhận thể vùi chứa 6xHis-MPI 104
3.3.2. Thu nhận 6xHis-MPI từ thể vùi 105
3.3.3. Thu nhận MPI từ 6xHis-MPI 107
3.4. Thu nhận insulin từ MPI 111
3.4.1. Tái gấp cuộn MPI 111
3.4.2. Cắt loại peptide C bằng trypsin 116
3.5. Kiểm tra hoạt tính của insulin tái tổ hợp trên chuột 118
3.6. Sơ đồ qui trình công nghệ sản xuất insulin ở qui mô pilot 119
KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ 122
-v-

Luận án Tiến só Mục lục

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN
ÁN 124
TÀI LIỆU THAM KHẢO 125
PHỤ LỤC 132

-1-
Luận án Tiến só Đặt vấn đề


ĐẶT VẤN ĐỀ
“Thế kỷ 21 là thế kỷ của các bệnh Nội tiết và các Rối loạn chuyển hóa
mà điển hình là bệnh đái tháo đường (Bệnh tiểu đường)”. Nhận xét này của
nhóm chuyên gia về dự báo tình hình bệnh tật của Tổ chức Y tế thế giới đã đang
trở thành hiện thực với những con số cụ thể. Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO,
2008) [
77], hiện nay trên toàn thế giới có khoảng 180 triệu người mắc bệnh tiểu
đường và ước tính con số này sẽ tăng gấp đôi vào năm 2030, chiếm khoảng 5%

dân số thế giới. Đáng lo ngại hơn là các biến chứng của bệnh, cứ 10 giây có một
người tử vong do nguyên nhân đái tháo đường, cứ 30 giây lại có một người đái
tháo đường bò cắt cụt chi và cứ mỗi ngày có 5000 người mất khả năng nhìn do
biến chứng mắt của bệnh. Mỗi năm có hơn 3,2 triệu người chết vì các bệnh liên
quan tới đái tháo đường tương đương với số người tử vong vì bệnh HIV/AIDS [
1].
Bệnh tiểu đường (BTĐ) đang trở thành gánh nặng cho mỗi nền kinh tế xã
hội, mặc dù mỗi năm hàng nghìn tỷ đôla Mỹ được chi phí cho điều trò bệnh,
nhưng chưa bao giờ và sẽ không bao giờ những chi phí khổng lồ về kinh tế có
thể lấp đầy được những tổn thất, nhất là những mất mát về tinh thần do bệnh tật
gây ra. Thực tế đáng lo ngại hơn là tình trạng bệnh xuất hiện ngày càng nhiều từ
lớp trẻ [
1].
Ở Việt Nam, tỷ lệ người mắc BTĐ ngày càng cao và ở các thành phố lớn
tỷ lệ này đã tăng gấp đôi từ 2% lên 4% trong 10 năm giai đoạn 1990-2000. Số
người mắc BTĐ hiện nay khoảng 4,5 triệu người, chiếm 5,7% dân số, trở thành
nước có tốc độ phát triển BTĐ nhanh nhất thế giới [
1].
Nguyên nhân của BTĐ là do thiếu insulin hoặc do cơ thể người bệnh
kháng insulin. Insulin là một polypeptide hormone được sinh ra nhờ các tế bào β
của tuyến tụy động vật, có vai trò điều hoà lượng đường trong máu. Phương
-2-
Luận án Tiến só Đặt vấn đề


pháp điều trò BTĐ phổ biến hiện nay là tiêm insulin đònh kỳ cho người bệnh. Do
số lượng người mắc BTĐ ngày càng cao nên nhu cầu sử dụng insulin càng lớn. Ở
châu Âu, lượng insulin đã tăng lên 3 lần trong vòng 12 năm từ 1995-2007. Theo
ước tính, nhu cầu insulin trên thế giới tăng từ khoảng 5.000kg trong năm 2007
lên khoảng 16.000kg vào năm 2010, với thò trường dự tính khoảng 11,8 tỷ Mỹ

kim [
41].
Năm 1978, lần đầu tiên các nhà khoa học của công ty công nghệ sinh học
Genetech đã dòng hóa thành công gen mã hóa cho insulin người vào vector biểu
hiện trong E. coli và đã cho phép công ty Eli Lilly sử dụng kỹ thuật này để sản
xuất insulin người tái tổ hợp với tên thương mại là Humulin. Năm 1982, Humulin
đã được FDA (Food & Drug Administration – Cơ quan Quản lý thuốc và thực
phẩm Hoa Kỳ) cho phép lưu hành. Hiện nay có nhiều công ty dược phẩm trên
thế giới sản xuất insulin tái tổ hợp như: Eli Lilly, Novo disk, Sanofi Aventis … với
nhiều loại sản phẩm insulin khác nhau. Công nghệ sản xuất insulin hiện nay
thường được tiếp cận theo hai phương pháp: phương pháp một chuỗi polypeptide
và phương pháp hai chuỗi polypeptide. Công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp
bằng phương pháp một chuỗi polypeptide bao gồm ba bước cơ bản. Đầu tiên là
bước tạo dòng chủng chủ (thường là E. coli) có khả năng mang gen ngoại tổng
hợp các chất tiền thân của insulin (proinsulin). Đây là khâu then chốt quyết đònh
sự thành công của công nghệ do cần phải biến đổi các codon thích hợp để tăng
cường hiệu quả biểu hiện. Tiếp theo là bước lên men, cảm ứng biểu hiện, thu
nhận proinsulin và xử lý để thu nhận insulin. Protein được biểu hiện dưới dạng
thể vùi nằm trong tế bào chất, do vậy cần phải biến tính để làm tan, sau đó tiến
hành tái gấp cuộn để có proinsulin có cấu hình tự nhiên. Proinsulin tái gấp cuộn
được xử lý bằng protease cắt loại đoạn nối nội phân tử (đoạn peptide C) để thu
insulin có hoạt tính. Đối với phương pháp sản xuất theo 2 mạch polypeptide,
-3-
Luận án Tiến só Đặt vấn đề


trước hết phải tạo dòng các chủng chủ riêng rẽ mang các gen mã hóa cho 2
chuỗi polypeptide khác nhau (chuỗi A, chuỗi B). Sau đó tinh chế thu nhận các
chuỗi polypeptide A và B và thực hiện phản ứng tạo cầu nối disulfide để thu
nhận insulin có hoạt tính.

Ở Việt Nam, nhu cầu sử dụng insulin rất cao, tuy nhiên toàn bộ nguồn
insulin sử dụng cho bệnh nhân mắc BTĐ đều phải nhập ngoại nên vừa gây tốn
kém ngoại tệ vừa không chủ động được nguồn thuốc để đáp ứng chữa trò kòp thời
cho bệnh nhân. Để đảm bảo cho điều trò toàn bộ bệnh nhân mắc BTĐ hàng ngày
với liều dùng 0,5-1,0 U/kg trọng lượng cơ thể trong một ngày [
78], thì Việt Nam
cần phải nhập ngoại khoảng từ 120-240 triệu U/ năm, tương đương 420-840 kg
insulin/ năm (100U =3,5 mg). Năm 2001, giấy phép độc quyền sản xuất insulin
tái tổ hợp chính thức hết hiệu lực, mở ra cơ hội lớn cho các nước đang phát triển
trong đó có Việt Nam, có thể tiếp cận được công nghệ hiện đại để phát triển qui
trình sản xuất insulin người tái tổ hợp trong nước, mang lại triển vọng góp phần
giải quyết khó khăn trên.
Mặc dù bản quyền sản xuất insulin bằng công nghệ DNA tái tổ hợp đã
hết hạn tuy nhiên các công ty dược phẩm vẫn tiếp tục giữ những bí quyết công
nghệ có tính thế mạnh của công ty nên rất khó tiếp cận để có được qui trình
công nghệ đầy đủ nhằm sản xuất insulin. Do vậy, cần phải nghiên cứu xây dựng
qui trình công nghệ riêng dựa trên những thông tin đã công bố và trình độ công
nghệ sẵn có để tiến đến việc sản xuất insulin trong nước đáp ứng được yêu cầu
đặt ra.
Năm 2007, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học quốc gia Thành
phố Hồ Chí Minh được giao nhiệm vụ thực hiện đề tài cấp nhà nước “Nghiên
cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp điều trò bệnh đái tháo đường”, mã số
-4-
Luận án Tiến só Đặt vấn đề


KC.04.09/06-10. Nội dung nghiên cứu của luận án là thực hiện một phần trong
nội dung của đề tài cấp nhà nước này.
Về mặt khoa học, mục tiêu của luận án nhằm bước đầu nghiên cứu qui
trình tổng hợp insulin người tái tổ hợp theo phương pháp một chuỗi polypeptide

trong E. coli bao gồm tạo dòng E. coli tái tổ hợp biểu hiện mini-proinsulin, lên
men, tái gấp cuộn mini-proinsulin và xử lý để tạo insulin có hoạt tính. Ý nghóa
thực tiễn của đề tài là ứng dụng công nghệ gen, công nghệ lên men và công
nghệ protein để tạo ra chế phẩm insulin có hoạt tính dùng làm thuốc trò bệnh
tiểu đường.
Luận án tập trung nghiên cứu cụ thể các vấn đề sau:
- Tạo chủng E. coli tái tổ hợp có mang vector biểu hiện mini-proinsulin tái
tổ hợp của người.
- Xây dựng qui trình lên men nuôi cấy chủng E. coli tái tổ hợp biểu hiện
mini-proinsulin.
- Thiết lập qui trình thu nhận và tinh sạch mini-proinsulin từ tế bào chủng
E. coli.
- Xây dựng qui trình tái gấp cuộn mini-proinsulin và xử lý thu nhận insulin
có hoạt tính.
- Thử nghiệm hoạt tính insulin tái tổ hợp trên chuột.







-5-
Luận án Tiến só Tổng quan


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Insulin và vai trò đối với cơ thể
Bệnh tiểu đường được mô tả lần đầu tiên và được ghi lại trên bia mộ của

Thebes (Ai cập) từ khoảng năm 3000-1500 trước công nguyên. Năm 1893
Hédon đã chứng minh vai trò quan trọng của tuyến tụy trong BTĐ. Năm 1901,
Opie chứng minh được mối liên hệ trực tiếp giữa BTĐ và sự hư hỏng tiểu phần
Langerhans trên tụy tạng, củng cố giả thuyết cho rằng có sự tiết nội tiết bởi tiểu
phần Langerhans của tụy tạng có chức năng ngăn ngừa BTĐ. Từ đó nhiều nhà
khoa học đã cố gắng phân lập những hợp chất từ tụy tạng có khả năng trò được
BTĐ. Năm 1922, Macleod chính thức công bố sự khám phá ra insulin. Năm
1955, Fredick Sanger xác đònh trình tự amino acid của insulin. Năm 1979, insulin
được sản xuất bằng phương pháp tái tổ hợp và được thương mại hóa vào năm
1982, trở thành protein tái tổ hợp đầu tiên được sản xuất bằng phương pháp này
và được sử dụng cho mục đích trò liệu [
35],[54].


Hình 1.1. Cấu trúc của insulin
-6-
Luận án Tiến só Tổng quan


Insulin là một hormone dạng polypeptide gồm hai chuỗi polypeptide nối
cộng hóa trò với nhau bằng 3 cầu nối disulfide: chuỗi A có 21 amino acid và
chuỗi B có 30 amino acid. Ba cầu nối disulfide (S-S) nối hai chuỗi A và B là A7-
B7, A20-B19 và A6-A11 (
Hình 1.1). Insulin có công thức phân tử chung là
C
257
H
383
N
65

O
77
S
6
, phân tử lượng 5,8 kDa. Điểm đẳng điện pI là 5,5 [14],[22],
[
74].
Ở động vật, ban đầu insulin được tạo ra từ tế bào β của tụy tạng ở dạng
preproinsulin chứa tổng cộng 109 amino acid, trong đó đoạn peptide tín hiệu
gồm 23 amino acid còn lại là proinsulin gồm 86 amino acid được cấu tạo theo
thứ tự từ đầu N như sau: chuỗi B 30 amino acid, chuỗi C 35 amino acid và chuỗi
A 21 amino acid (
Hình 1.2). Đoạn peptide tín hiệu gồm 23 amino acid có vai trò
trong sự vận chuyển proinsulin qua màng lưới nội chất đi vào khoang bên trong.
Đoạn peptide này sau đó bò cắt rời bởi một peptidase đặc trưng và tạo nên
proinsulin. Proinsulin tồn tại trong lưới nội chất và sau đó liên kết với các thể
Golgi tạo thành các thể tiết. Quá trình hình thành insulin diễn ra trong các thể
này nhờ sự thủy phân bởi protease để loại bỏ đoạn peptide C tạo phân tử insulin
có hoạt tính. Insulin được tích lũy trong tế bào β của tụy tạng dưới dạng
hexamer, gồm sáu phân tử insulin được ổn đònh nhờ gắn với 2 nguyên tử kẽm.
Thể tiết sẽ tiết insulin vào máu khi nồng độ glucose trong máu cao [
27].
Hầu hết insulin ở các loài có trình tự amino acid tương tự nhau nhưng
không hoàn toàn giống nhau. Insulin của chuột và của thỏ khác nhau một số
amino acid. Insulin của heo khác insulin của người chỉ một amino acid ở đầu C
của chuỗi B. Insulin của bò khác của người ba amino acid trong khi đó của cừu
thì khác bốn amino acid. Sự khác biệt trong cấu trúc của insulin người và insulin
của bò là ở các vò trí A8, A10, và B30 (insulin người ở các vò trí này là Thr, Ile
và Thr) [
21].

-7-
Luận án Tiến só Tổng quan



Hình 1.2. Các bước tạo insulin in vivo ở người.

Insulin có vai trò trung tâm trong cơ chế điều hòa sự biến dưỡng
carbohydrate, protein và lipid. Mức độ tiết của insulin từ các tế bào β được quyết
đònh bởi nồng độ glucose trong máu. Nồng độ glucose trong máu cao sẽ cảm ứng
sự tiết insulin nhằm thúc đẩy sự hấp thụ glucose trong máu bởi các mô cơ quan
khác nhau, đặc biệt là gan và cơ. Điều này giúp làm giảm lượng glucose trong
máu đến mức bình thường, sau đó sự tiết insulin bò giảm (
Hình 1.3).
-8-
Luận án Tiến só Tổng quan



Hình 1.3. Cơ chế điều hòa hàm lượng đường trong máu.

Insulin có ảnh hưởng lớn đối với hoạt động của nhiều cơ quan trong cơ
thể như tăng cường sự hấp thụ glucose trong máu và chuyển thành glucogen bởi
tế bào gan, làm giảm hàm lượng glucose trong máu. Tăng cường hấp thu amino
acid từ máu và chuyển thành protein. Chuyển glucose thành glucogen ở cơ vân.
Tăng cường sự tổng hợp mỡ bởi tế bào mỡ. Các ảnh hưởng này có thể giúp cơ
thể tích lũy được các chất dinh dưỡng hòa tan được hấp thụ từ ruột non thành
dạng dự trữ giàu năng lượng như glycogen, protein, mỡ đồng thời làm giảm hàm
lượng glucose trong máu [
3].

1.2. Bệnh tiểu đường
Bệnh tiểu đường là tình trạng lâm sàng diễn ra khi tuyến tụy không sản
xuất đủ insulin hoặc cơ thể sử dụng không hiệu quả insulin đã được tiết ra. Hậu
quả là hàm lượng đường huyết cao và gây nên các rối loạn liên quan trong trao
đổi chất, dẫn đến sự hư hỏng nghiêm trọng của nhiều cơ quan trong cơ thể đặc
-9-
Luận án Tiến só Tổng quan


biệt là thần kinh và tim mạch [76]. Bệnh tiểu đường được Tổ chức Y tế Thế giới
(WHO) [
2] phân loại như sau:
- Bệnh tiểu đường type I (BTĐ phụ thuộc insulin): Do cơ thể không thể
sản xuất đủ insulin, phần lớn xảy ra ở trẻ em và người trẻ tuổi và thường có yếu
tố tự miễn, chiếm từ 5-10% tổng số bệnh nhân mắc BTĐ. Ở Việt nam, tỷ lệ này
chiếm khoảng 7%.
- Bệnh tiểu đường type II (BTĐ không phụ thuộc insulin): Do cơ thể
kháng insulin đi kèm với sự thiếu hụt insulin tương đối, thường gặp ở lứa tuổi
trên 40, gần đây xuất hiện ở lứa tuổi 30, thậm chí cả ở lứa tuổi thanh thiếu niên,
chiếm xấp xỉ 90%-95% trong các trường hợp BTĐ. Ở Việt nam, tỷ lệ này chiếm
khoảng 91,2%.
- Bệnh tiểu đường thai nghén: là trường hợp rối loạn dung nạp glucose
được chẩn đoán lần đầu tiên khi có thai. Mặc dù trong đa số các trường hợp khả
năng dung nạp glucose có cải thiện sau thời gian mang thai, nhưng vẫn có sự gia
tăng đáng kể nguy cơ phát triển thành BTĐ type II về sau này.
- Các thể BTĐ khác: nhóm này bao gồm tất cả các nguyên nhân khác
hiếm gặp hơn, có thể gây BTĐ bao gồm tiểu đường là triệu chứng do bệnh lý
của hệ thống nội tiết, các bệnh về tụy, các hình thái di truyền của BTĐ hoặc tiểu
đường do thuốc và hóa chất.
Hiện nay trên thế giới có khoảng 180 triệu người mắc BTĐ, số người mắc

BTĐ ngày càng tăng cao và theo dự đoán thì năm 2030 có ít nhất là 366 triệu
người bò mắc BTĐ [
70]. Ở một số nước, tiểu đường được xem như là một căn
bệnh xã hội. Tỷ lệ mắc BTĐ loại II: ở Israel: 6,7%, ở Mỹ: 6,6%, ở Saudi Arabia:
6,6%, ở Nam Italia: 6,5% [
71],[77].
-10-
Luận án Tiến só Tổng quan


Ở Việt Nam, bệnh tiểu đường phát triển rất nhanh. Năm 1990 tỷ lệ mắc
bệnh tiểu đường chỉ ở mức từ 0,96%( Huế) cho đến 2,52%( thành phố Hồ Chí
Minh), nhưng chỉ sau 10 năm, năm 2001 tỷ lệ này ở các thành phố lớn đã là
4,1%, năm 2002 tăng lên 4,4%, với mức tính ở cả cộng đồng là 2,7% dân số; nếu
tính ở nhóm người có yếu tố nguy cơ mắc bệnh cao thì tỷ lệ bệnh đã tăng trên
10%. Theo thống kê năm 2008, tỷ lệ mắc bệnh tiểu đường trong cả nước là trên
5% (khoảng 4,5 triệu người), tại các thành phố lớn và khu công nghiệp có tỷ lệ
từ 7,0 đến 10% [
1].
1.3. Các phương pháp sản xuất insulin
1.3.1. Sản xuất insulin từ tụy tạng động vật
Trước đây người ta thường sử dụng insulin chiết tách từ tụy tạng động vật
như heo, cừu, bò để điều trò BTĐ. Tuy nhiên insulin heo thường được ưa dùng
hơn của bò do có trình tự amino acid gần với insulin của người, chỉ khác một
amino acid là alanine ở đầu C của chuỗi B trong khi insulin người là threonine
và ít gây các phản ứng miễn dòch (
Hình 1.4).

Hình 1.4. Cấu trúc không gian của insulin heo (bên trái), của người (bên phải).

Chế phẩm insulin tinh sạch đầu tiên dùng cho trò liệu vào những năm
1920 được chiết từ tụy tạng của heo hoặc bò bằng kỹ thuật tủa protein nhờ acid-
-11-
Luận án Tiến só Tổng quan


alcohol, do vậy độ tinh sạch của chế phẩm không cao. Năm 1926, các nhà khoa
học đã kết tinh thành công tinh thể insulin từ các dòch chiết insulin thô. Năm
1934, người ta phát hiện rằng kẽm kim loại có khả năng tăng cường sự kết tinh
của insulin từ các dòch chiết thô này. Từ đó có thể sản xuất insulin thương mại
dạng tinh thể và được coi là insulin truyền thống dù độ tinh sạch chưa cao [
35].
Qua nhiều thập niên, các nhà khoa học đã phát triển nhiều phương pháp
khác nhau để sản xuất insulin với số lượng lớn đáp ứng nhu cầu sử dụng ngày
càng cao của con người. Một trong những phương pháp được sử dụng trong một
thời gian dài là phương pháp biến đổi enzyme của insulin heo bằng cách thủy
phân bởi trypsin ở vò trí amino acid 22- 23 và ở vò trí 29-30 của chuỗi B, loại bỏ
một đoạn peptide có 8 đơn phân ra khỏi chuỗi này (
Hình 1.5). Sau đó tổng hợp
đoạn peptide gồm 8 amino acid tương đồng với đoạn cuối của insulin người, thực
hiện kết gắn đoạn này vào vò trí đã xử lý bằng trypsin trước đó (
Hình 1.5) [27].
GLy
Ile
Val

Glu
Gln Cys Cys Thr Ser Ile Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr CysCys AsnSer Leu
His
Gln
Asn
Val
Phe
Leu Cys Gly Ser Glu Ala Leu Tyr Leu Val CysHis GlyLeu Val Glu
Arg
Gly
Phe
PheTyrThrProLysAla
Gly
Phe
PheTyrThrProLysThr
(a)
(
b
)
Trypsin

Hình 1.5. Biến đổi insulin heo thành insulin người.
(a) Xử lý insulin heo bằng trypsin sẽ cắt bỏ đoạn gồm 8 amino acid đầu
C. (b) Tổng hợp đoạn peptide 8 amino acid cuối cùng của insulin người
và gắn vào (a).
-12-
Luận án Tiến só Tổng quan


Kỹ thuật này giúp tạo ra được chế phẩm insulin người và được sử dụng

rộng rãi trong nhiều năm. Tuy nhiên phương pháp này cũng chưa đáp ứng được
nhu cầu insulin do số người mắc BTĐ ngày một tăng cao. Do vậy, người ta đã
phát triển phương pháp sản xuất insulin người bằng kỹ thuật tái tổ hợp DNA và
đã được chấp nhận sử dụng từ năm 1982.
1.3.2.
Sản xuất insulin người bằng kỹ thuật tái tổ hợp DNA
Insulin người tái tổ hợp được sản xuất theo hai phương án: (1) Biểu hiện
hai chuỗi A, B độc lập sau đó thực hiện phản ứng tạo cầu nối disulfide hình
thành phân tử insulin (phương án hai chuỗi); (2) Sản xuất proinsulin tái tổ hợp
sau đó dùng enzyme đặc hiệu (trypsin/carboxypeptidase) cắt bỏ đoạn peptide C
tạo insulin có hoạt tính (phương án một chuỗi). Gần đây, thay cho proinsulin
trong phương án một chuỗi, người ta biểu hiện mini-proinsulin (có đoạn C ngắn
hơn so với trường hợp proinsulin) để sản xuất insulin.
1.3.2.1. Sản xuất insulin tái tổ hợp bằng phương án hai chuỗi
Chế phẩm insulin tái tổ hợp của người đầu tiên được thu nhận bằng cách
gắn hai đoạn cDNA mã hóa cho chuỗi A và chuỗi B vào plasmid, dòng hóa vào
các tế bào E. coli khác nhau (chủng K12) và biểu hiện hai chuỗi A, B tái tổ hợp
riêng rẽ. Hai chuỗi peptide A, B sau đó được tinh sạch tạo các cầu nối disulfide
để hình thành insulin có hoạt tính. Năm 1999, Michael Schmidt và cộng sự công
bố một nghiên cứu về “Sản xuất insulin người bằng E.coli tái tổ hợp với cảm
ứng nhiệt” theo phương án hai chuỗi. Hai chuỗi A, B được tổng hợp riêng rẽ trên
hai hệ thống biểu hiện sử dụng promotor của phage lamda (λ-P
L
), cảm ứng biểu
hiện bằng nhiệt độ. Tiến hành tinh chế hai chuỗi này khỏi các thể vùi, sau đó
cho thực hiện đúng cầu nối disulfide nhờ các dẫn xuất của S-sulfonate để hình
thành insulin có hoạt tính với hiệu suất biểu hiện của chuỗi A, B đạt tương ứng
-13-
Luận án Tiến só Tổng quan

là 600 mg/L và 800 mg/L môi trường nuôi cấy. Ưu điểm của phương án hai chuỗi
so với phương án một chuỗi là không cần phải dùng các enzyme để cắt bỏ đoạn
peptide trung gian. Tuy nhiên phương án này có một số nhược điểm là cần có hai
hệ thống biểu hiện và tinh chế độc lập cho hai chuỗi A, B; hiệu suất và độ chính
xác của quá trình tạo cầu nối disulfide không cao [
27],[57].
1.3.2.2. Sản xuất insulin dạng proinsulin tái tổ hợp (phương án một chuỗi)
Proinsulin được thiết kế theo nguyên tắc là dung hợp với một
protein/peptide nhằm mục đích tăng cường biểu hiện và giữ được cấu trúc của
proinsulin ổn đònh sau dòch mã. Trong trình tự này thường có một đoạn peptide
hỗ trợ việc tinh chế (ví dụ 6xHis) chèn thêm một amino acid vào đầu N của
proinsulin là Arg hoặc Lys để tạo vò trí cần cho việc cắt bỏ đoạn protein dung
hợp (fusion protein) ra khỏi insulin sau này. Do vậy, cấu trúc phức hợp này
thường là Met-peptide/protein dung hợp-Arg/Lys- Proinsulin. Sau đây là một số
hướng tiếp cận trong sản xuất insulin người tái tổ hợp theo phương án một chuỗi.
- Biểu hiện proinsulin tái tổ hợp trong tế bào chất
Preproinsulin được biểu hiện ở dạng thể vùi không tan trong tế bào chất
trong E. coli bởi hệ thống vector pGEX-6T ở dạng dung hợp 6xHis-GST-
preproinsulin, dưới sự kiểm soát của promotor Ptac với chất cảm ứng là IPTG.
Trong điều kiện nuôi cấy thích hợp sau 24 giờ, sự biểu hiện của preproinsulin có
thể đạt đến 20% của tổng protein của tế bào. Protein dung hợp này sau đó được
thu hồi và tinh chế bằng sắc ký ái lực dựa trên thẻ 6xHis. Sử dụng enterokinase
để cắt bỏ đoạn protein dung hợp ra khỏi preproinsulin với trình tự nhận biết được
thiết kế là VDDDDKG chèn vào giữa GST và preproinsulin [
13].
Met-Lys-Proinsulin được biểu hiện trong E. coli với promotor được kiểm
soát bằng nhiệt độ với hiệu suất có thể đạt 20-30%. Sau quá trình tinh chế đơn
-14-
Luận án Tiến só Tổng quan

giản bằng Sephadex G50, khoảng 150mg Met-Lys-proinsulin tái tổ hợp được thu
nhận với độ tinh khiết đạt 90% từ 1 lít dòch lên men. Sử dụng cặp enzyme
trypsin/carboxypeptidase B để xử lý chuyển proinsulin thành insulin. Hiệu suất
thu nhận là 50 mg/L môi trường lên men [
17].
Met-Arg-proinsulin-GFP được biểu hiện trong tế bào chủng E.coli
BL21(DE3) khi cảm ứng bởi IPTG đến mức 20-25%, khoảng 140mg/L môi
trường lên men. Met-Arg-proinsulin được xử lý bởi trypsin và carboxypeptidase
B thành insulin người [
17],[21].
ZZ-Arg-Proinsulin với đoạn ZZ được nhận diện và gắn bởi kháng thể IgG
được biểu hiện trong E. coli ở mức khoảng 25% tổng protein tế bào và khoảng 3
g/L môi trường nuôi cấy. Phức hợp protein tinh chế thông qua sắc ký ái lực với
IgG để thu nhận proinsulin dung hợp tinh khiết và được xử lý bằng
trypsin/carboxypeptidase B để thu nhận insulin có hoạt tính [
31],[49].
- Biểu hiện proinsulin tái tổ hợp trong chu chất
Việc biểu hiện proinsulin trong tế bào chất E. coli thường tạo thành các
thể vùi chứa proinsulin không tan. Proinsulin không tan trong thể vùi cần được
làm tan bằng các muối có nồng độ cao, sau đó cần được tái gấp cuộn để có cấu
hình tự nhiên trước khi xử lý bằng protease để thu được insulin có hoạt tính. Để
tránh các bước phức tạp nêu trên, một phương án được tiếp cận nghiên cứu là
biểu hiện proinsulin tan trong chu chất (periplasm) của E. coli. Để proinsulin
được vận chuyển qua màng tế bào chất của E. coli đi vào chu chất thì cần phải
gắn thêm vào đầu N của proinsulin một trình tự mã hóa một đoạn peptide tín
hiệu (signal peptide) có vai trò hướng proinsulin ra chu chất. Sau đây là một số
công trình nghiên cứu theo hướng này đã được công bố.
Peptide tín hiệu của β-lactamase từ Staphylococcus aureus với trình tự

amino acid MKKLIFLIVALVLSACNSN-SHA::KE được gắn vào đầu N của
-15-
Luận án Tiến só Tổng quan


proinsulin. Sự biểu hiện có thể đạt 27 phân tử proinsulin ở trong chu chất trong 1
tế bào E.coli [
60].
Một cách tiếp cận khác để tạo proinsulin tái tổ hợp dạng tan có cấu hình
tái gấp cuộn tự nhiên trong chu chất của E. coli là dung hợp với DsbA, một
enzyme xúc tác sự hình thành cầu nối disulfide. Tính ổn đònh của protein tái tổ
hợp được sản xuất trong tế bào E. coli phụ thuộc chặt chẽ vào hiệu quả gấp cuộn
trong in vivo. Do vậy, khoang chu chất của tế bào vi khuẩn là nơi thích hợp cho
sự biểu hiện của proinsulin. Chu chất tạo ra môi trường có điều kiện ôxi hóa và
các protein thuộc nhóm Dsb* (DsbA, DsbC và DsbG) xúc tác cho sự thành lập
các cầu nối disulfide trong chu chất. DsbA là oxydase quan trọng nhất của nhóm
sulhydryl trong chu chất, hỗ trợ tạo cầu nối disulfide của các protein trong in
vitro rất hiệu quả. Trong cách tiếp cận này DsbA cùng với peptide tín hiệu vốn
có của protein này được dung hợp vào đầu N của proinsulin để tạo ra pre-DsbA-
proinsulin. Phức hợp này được vận chuyển qua màng tế bào chất vào chu chất
thành DsbA-proinsulin. DsbA sẽ giúp ổn đònh nội phân tử proinsulin chưa gấp
khúc thông qua các điểm liên kết polypeptide và tạo các cầu nối disulfide. Hiệu
suất tối đa của proinsulin người thu nhận được từ phần hòa tan trong chu chất sau
khi cắt loại bỏ DsbA là 9,2 mg/g protein chu chất, tương đương 1,8% tổng lượng
protein tế bào [
73].
- Biểu hiện proinsulin tái tổ hợp tiết ra môi trường
Một số chủng vi sinh vật khác được sử dụng cho việc biểu hiện proinsulin
tái tổ hợp dạng tiết ra môi trường [
64]. Sau đây là một vài công trình tiêu biểu

cho hướng nghiên cứu này.
Nấm men Pichia pastoris và Sacchromyces cerevisiae có các đặc điểm rất
giống nhau về việc tiết insulin ra môi trường. Tương tự như E. coli, sự vận
chuyển của protein qua màng và tiết ra môi trường cần có peptide được nhận
-16-
Luận án Tiến só Tổng quan


diện bởi hệ thống tiết của tế bào. Ở P. pastoris, prepro-leader peptide giúp sự
tiết ngoại bào của proinsulin. Ngoài ra, trình tự peptide này dùng làm đoạn nối
(spacer) giữa prepro-leader peptide và proinsulin cùng ảnh hưởng đến hiệu suất
tạo và tiết proinsulin trong P. pastoris [
36],[53].
Trong một nghiên cứu dùng S. cerevisiae làm chủng chủ biểu hiện và tiết
proinsulin. Proinsulin được dung hợp ở đầu N với nhân tố α, một peptide tín hiệu
làm nhiệm vụ tiết ra protein dung hợp ra ngoài. Protein dung hợp sau đó được
biểu hiện và tiết ra môi trường nuôi cấy với hiệu suất có thể đạt 41,1mg/L môi
trường [
37].
Một cách tiếp cận khác để tạo proinsulin tiết vào môi trường là sử dụng
Bacillus subtilis làm chủng chủ. Trong trường hợp này trình tự peptide tín hiệu
aprE từ B. subtilis được dung hợp với đầu N của proinsulin để giúp vận chuyển
proinsulin qua màng tế bào vào môi trường (B. subtilis là vi khuẩn gram dương
chỉ có màng tế bào chất, không có màng ngoài như trong trường hợp của E. coli).
Hiệu suất tạo proinsulin là 1 g/L môi trường nuôi cấy và 90% lượng biểu hiện
này được tiết ra môi trường nuôi cấy 1 giờ sau pha ổn đònh [
52].
1.3.2.3. Sản xuất insulin bằng phương án một chuỗi dạng mini-proinsulin tái
tổ hợp
Nhiều nghiên cứu cho thấy việc thay đoạn peptide C có chứa 35 amino

acid bằng một đoạn peptide ngắn hơn cũng tạo được dạng tiền thân của insulin,
gọi là mini-proinsulin (MPI), có cấu hình tự nhiên giống proinsulin nhưng có
hiệu suất gấp cuộn cao hơn. Lars Thim và cộng sự (1987) [
53] đã tiếp cận
nghiên cứu sản xuất insulin thông qua mô hình mini-proinsulin với đoạn mini-C
là 6 amino acid (Arg-Arg-Leu-Gln-Lys-Arg) bằng nấm men S. cerevisiae. Kang
và cộng sự (1994) [
34] đã thiết kế và biểu hiện thành công phức hợp ZZ-
miniproinsulin trong đó chiều dài đoạn peptide C thay đổi từ 1-11 amino acid.
-17-
Luận án Tiến só Tổng quan


Hiện nay, vai trò của đoạn peptide C trong cấu trúc của proinsulin của động vật
chưa được xác đònh rõ ràng, chiều dài và trình tự amino acid của đoạn peptide C
này thay đổi từ 26-38 đơn phân tùy vào từng loài động vật. Tuy nhiên cấu trúc
căn bản tại các vò trí gần khu vực liên kết của chuỗi B-C và C-A là không thay
đổi và được xem là yêu cầu tối thiểu để chuyển proinsulin thành insulin có hoạt
tính [
14],[15],[34]. Năm 2005, Dorschug và cộng sự đăng ký bản quyền (US
patent) về mô hình mini-proinsulin, biểu hiện bởi E. coli hoặc ở nấm men
Saccharomyces cerevisiae, với đoạn C chỉ có một amino acid là Arg sau đó sử
dụng trypsin và carboxypeptidase để biến đổi thành insulin [
23].
Tuy nhiên cho đến nay chỉ có các công bố sản xuất insulin người tái tổ
hợp thông qua mô hình mini-proinsulin ở qui mô phòng thí nghiệm, chưa có công
bố ở qui mô sản xuất [
15]. Sau đây là hai nghiên cứu tiêu biểu về tổng hợp
insulin theo mô hình mini-proinsulin.
Shin và cộng sự (1997) [

59] đã thiết kế mini-proinsulin (M2PI) với đoạn
peptide C chỉ có 9 amino acid Arg-Arg-Tyr-Pro-Gly-Asn-Val-Lys-Arg. M2PI
được dung hợp ở đầu N một peptide T2 gồm 18 amino acid Pro-Ser-Asp-Lys-
Pro-(His)
10
-Ser-Ser-Met có vai trò ổn đònh protein dung hợp và hỗ trợ việc tinh
chế bằng sắc ký ái lực giữa 10xHis và cột sắc ký Ni-NTA. Khi được biểu hiện
trong E. coli bởi hệ thống vector biểu hiện pET-3a, hiệu suất biểu hiện protein
dung hợp T2-M2PI có thể đạt 7 g/L và khoảng 62% của phức hợp này có thể
được chuyển thành insulin có hoạt tính sau khi qua các bước xử lý tiếp theo. Như
vậy, việc sản xuất insulin tái tổ hợp thông qua mô hình mini-proinsulin biểu hiện
trong tế bào chất của E. coli dạng thể vùi cho mức độ biểu hiện cao.
Chang và cộng sự (1998) [
16] đã thiết kế mini-proinsulin M2PI tương tự
như Shin (1997) và dung hợp với peptide T2 chứa 21 amino acid thay vì 18
amino acid trong đó bổ sung thêm một Met ở đầu N và Gly-Ser trước Met ở đầu
-18-
Luận án Tiến só Tổng quan


C (Met-Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-His10-Ser-Ser-Gly-Ser-Met-M2PI). Khi được biểu
hiện trong E. coli bằng hệ thống vector biểu hiện pET-3a, phức hợp T2-M2P
được tạo ra dưới dạng thể vùi với hàm lượng đạt đến 25% tổng protein của tế
bào. Phần dung hợp T2 sau đó được cắt bỏ bởi CNBr và M2PI mini-proinsulin
được tinh sạch bằng sắc ký trao đổi ion. Hiệu suất tái gấp cuộn của M2PI mini-
proinsulin tốt hơn từ 20-40% so với hiệu suất gấp cuộn của proinsulin.
1.3.2.4. Tình hình nghiên cứu sản xuất insulin trong nước
Ở Việt Nam, công trình nghiên cứu sản xuất insulin tiếp cận theo hướng
biểu hiện proinsulin ở tế bào E. coli của nhóm tác giả PGS.TS. Lê Văn Phủng và
cộng sự thực hiện đề tài cấp bộ (Bộ Y tế) [

6],[7]. Kết quả công bố cho thấy đã
thiết kế thành công gen biểu hiện proinsulin trên E. coli BL21(DE3) bằng vector
pET-28a(+) và khảo sát được các điều kiện tối ưu để biểu hiện proinsulin.
Hiện nay, nhóm nghiên cứu thuộc trung tâm công nghệ sinh học thành
phố Hồ Chí Minh thực hiện tạo dòng biểu hiện mini-proinsulin trên đối tượng là
nấm men Pichia pastosis [
5]. Theo kết quả công bố thì hiện đang ở giai đoạn tạo
dòng Pichia pastosis có khả năng biểu hiện mini-proinsulin, tuy nhiên mức độ
biểu hiện còn rất thấp.
1.4. Sản xuất protein tái tổ hợp trong tế bào E. coli
1.4.1. Đặc điểm của E. coli trong sản xuất protein tái tổ hợp
Escherichia coli là vi khuẩn gram âm, hiếu khí tùy ý, hình que, có kích
thước khoảng 0,3-1,0 x 1,0-6,0μm, di động, được tìm thấy khắp nơi trong tự
nhiên (
Hình 1.6). Do chúng có khả năng phát triển rất mạnh (thời gian thế hệ
khoảng 20 phút) và nhu cầu dinh dưỡng đơn giản nên được sử dụng trong công
nghiệp và các mục đích về y học. Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu của E. coli là 37
o
C,
pH 6,0-7,0. Thành phần môi trường tối thiểu để E. coli phát triển là glucose