nghiên cứu đặc điểm mô bệnh học cá tra (pangasianodon hypophthalmus) nhiễm bệnh do hai loài vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ và bệnh xuất huyết

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN



HỒ VĂN TO





NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC CÁ TRA
(Pangasianodon hypophthalmus) NHIỄM BỆNH DO HAI LOÀI VI
KHUẨN GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ VÀ BỆNH XUẤT HUYẾT



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN








2014
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN

HỒ VĂN TO





NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC CÁ TRA
(Pangasianodon hypophthalmus) NHIỄM BỆNH DO HAI LOÀI VI
KHUẨN GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ VÀ BỆNH XUẤT HUYẾT



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN


CÁN BỘ HƢỚNG DẪN
PGs. Ts. TỪ THANH DUNG




2014
1

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM MÔ BỆNH HỌC CÁ TRA
(Pangasianodon hypophthalmus) NHIỄM BỆNH DO HAI LOÀI VI
KHUẨN GÂY BỆNH GAN THẬN MỦ VÀ BỆNH XUẤT HUYẾT

Hồ Văn To và Từ Thanh Dung
1
1
Bộ môn Bệnh học Thủy sản, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ
ABSTRACT
The objectives of the study was to examine histopathological of bacterial disease causing by
Edwardsiella ictaluri and Aeromonas hydrophila on the striped catfish. In this study,
Pangasianodon hypophthalmus were exposed to both bacterial species by intraperitoneal
injection. The infected experiments were carried out on healthy fingerlings (15-25 gram) with 6
treatments, each treatment with 3 replicates by injection with challenge bacterial doses: A.
hydrophila 10
4
CFU/ml, E. ictaluri 10
6
CFU/ml. The results showed that mortality rate
increased strongly in all treatments when the fish were injected by 2 bacteria species and the
highest mortality rate was ạt 24 hour after the injection of A. hydrophila. Additionally,
Haematoxylin & Eosin stain and smear the tissue of muscle, gills, liver, kidney and spleen of
effected fish have done in this study. In the result, haemorrhaged and necrosis phenomenon
were recorded in those of organs when staining with Haematoxylin & Eosin. The study also
indicated that the structure of gills of injected fingerlings changed including secondary gill
filaments were swollen, haemorrhagic and sticky. Furthermore, Wright and Giemsa staining
also presented that both species were found out in the smear. However, control treatment (no
bacterial injection) did not appear both bacteria in the smeared samples.
Keywords: Pangasianodon hypophthalmus, Aeromonas hydrophila, Edwardsiella ictaluri,
histological characteristic, coinfection.
Title: Study on the histopathological characteristics of the striped catfish (Pangasianodon
hypophthalmus) exposed to both Edwardsiella ictaluri and Aeromonas hydrophila.
TÓM TẮT
Nghiên cứu được tiến hành nhằm tìm hiểu đặc điểm mô bệnh học của bệnh vi khuẩn trên cá tra

(Pangasianodon hypophthalmus). Trong nghiên cứu này, 2 loài vi khuẩn được đưa vào cơ thể cá
bằng phương pháp tiêm vào xoang bụng. Thí nghiệm tiêm vi khuẩn được tiến hành trên cá tra
giống (15-25 gram/con) với 6 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần với mật độ vi khuẩn
cảm nhiễm là E. ictaluri 10
6
CFU/ml; A. hydrophila 10
4
CFU/ml. Kết quả cho thấy, sau khi cảm
nhiễm 2 loài vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila cho thấy bệnh bộc phát mạnh khi cá bị nhiễm
cả 2 loài vi khuẩn và gây chết cao là ở thời điểm tiêm sau 24 giờ tiêm A. hydrophila. Ngoài ra,
phương pháp nhuộm với Haematoxylin & Eosin và phết kính trên da-cơ, mang, gan, thận và tỳ
tạng của cá cảm nhiễm đã được thực hiện trong nghiên cứu. Kết quả phân tích ở các nghiệm
thức tiêm vi khuẩn thì cấu trúc gan, thận, tỳ tạng đều có hiện tượng xung huyết, xuất huyết, hoại
tử mất cấu trúc khi được nhuộm với Haematoxylin & Eosin. Cấu trúc mang có những biến đổi
2

như sợi mang thứ cấp phình to, xung huyết, xuất huyết và có sự dính lại của nhiều sợi mang. Bên
cạnh đó, phương pháp nhuộm với Wright và Giemsa cho thấy có sự hiện diện của cả 2 loài vi
khuẩn trên vùng phết kính. Trong khi đó, ở nghiệm thức đối chứng (không tiêm vi khuẩn) không
thấy vi khuẩn ở các mẫu phết.
Từ khóa: Pangasianodon hypophthalmus, Aeromonas hydrophila, Edwardsiella ictaluri, mô
bệnh học, cảm nhiễm kép.
1. Đặt vấn đề
1.1 Giới thiệu
Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) là một trong những đối tượng xuất khẩu chính ở nước ta.
Việc mở rộng diện tích nuôi cũng như việc thâm canh hóa đối tượng nuôi trong những năm qua
đã dẫn đến tình hình dịch bệnh xảy ra ngày càng nhiều, đặc biệt là bệnh do vi khuẩn. Trong số
các loại bệnh do vi khuẩn trên cá tra thì bệnh xuất huyết do vi khuẩn Aeromonas hydrophila và
bệnh mủ gan do vi khuẩn Edwardsiellla ictaluri là 2 loại bệnh thường xuất hiện nhiều nhất, bệnh
xảy ra hầu như quanh năm và gây nhiều thiệt hại nghiêm trọng cho người nuôi (Từ Thanh Dung

et al., 2004).
Ở Mỹ, vi khuẩn E. ictaluri là tác nhân gây nhiê
̃
m tru
̀
ng ma
́
u đư ờng ruột (Enteric Septicemia of
Catfish, ESC) trên cá nheo Mỹ (Ictalurus furcatus), được phân lập đầu tiên vào năm 1979 bởi
Hawke (Hawke, 1979). Tuy nhiên, đến năm 1981 mới được định danh là vi khuẩn E. ictaluri
(Hawke et al., 1981). Ở Việt Nam, bệnh gan thận mủ do vi khuẩn E. ictaluri được ghi nhận xuất
hiện trên cá tra nuôi ở ĐBSCL vào cuối năm 1998 với tên gọi Bacillary Necrosis of Pangasius
(BNP) (Ferguson et al., 2001). Sau đó, Crumlish et al. (2002) đã xác định chính xác nguyên
nhân gây bệnh mủ gan trên cá tra nuôi ở ĐBSCL là do vi khuẩn E. ictaluri.
Bệnh xuất huyết do vi khuẩn A. hydrophila gây ra đã được báo cáo trên nhiều loài cá và kể cả
trên các động vật (Colwell, MacDonell và DeLey, 1986), đặc biệt là vi khuẩn có thể gây bệnh
trên nhiều loài cá nước ngọt (Newman, 1993). Ở Việt Nam, các tổn thất do sự bùng phát của vi
khuẩn A. hydrophila trên cá tra đã được nhiều tác giả báo cáo (Subagja, Slembrouck, Hung và
Legendre, 1999). Vi khuẩn A. hydrophila được xem là tác nhân gây bệnh cơ hội, thường gây
bệnh khi vật chủ bị stress hoặc khi hệ thống miễn dịch bị suy yếu (Roberts, 1993).
Đặc biệt, trong vài năm trở lại đây hiện tượng nhiễm kép 2 loài vi khuẩn E. ictaluri và A.
hydrophila thường xuất hiện và gây bệnh trên cá tra (Crumlish và Dung, 2002). Chính vì vậy,
chúng gây thiệt hại nhiều hơn và đã làm cho quá trình điều trị bệnh trở nên khó khăn hơn. Kết
quả nghiên cứu của Nusbaum và Morrison (2002) cho thấy khi bị nhiễm A. hydrophila cá da trơn
chưa biểu hiện bệnh nhưng sẽ bộc phát bệnh mạnh khi cá bị nhiễm thêm vi khuẩn E. ictaluri.
Hiện tại, đã có nhiều nghiên cứu về độc lực cũng như mô bệnh học 2 vi khuẩn E. ictaluri hoặc A.
hydrophila gây bệnh trên cá tra (Đặng Thị Hoàng Oanh , 2009; Đặng Thụy Mai Thy, 2010; ).
Tuy nhiên, việc nghiên cứu về mô bệnh học 2 loài vi khuẩn cùng gây bệnh trên cá tra vẫn chưa
được nghiên cứu ở nước ta. Xuất phát từ thực tế trên, đề tài “Nghiên cứu đặc điểm mô bệnh
học cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nhiễm bệnh do hai loài vi khuẩn gây bệnh gan

3

thận mủ và bệnh xuất huyết” được thực hiện để xác định một số đặc điểm mô bệnh học cá tra
khi cảm nhiễm 2 loài vi khuẩn này nhằm làm cơ sở cho việc chẩn đoán và điều trị bệnh đạt hiệu
quả cao.
2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu nghiên cứu
Cá tra chọn làm thí nghiệm có trọng lượng khoảng 15-25 gram/con, được mua tư
̀
Trại cá giống
Hồng Mỹ. Cá tra giống sau khi mua về được nuôi dưỡng trong bể composite khoảng 7-10 ngày.
Trong thời gian nuôi dưỡng cá được cho ăn bằng thức ăn công nghiệp, 2 lần/ngày và cho ăn theo
nhu cầu của cá. Chọn cá bố trí thí nghiệm có kích thước tương đối đồng đều, khỏe mạnh, linh
hoạt và da sáng bóng. Trước khi bố trí thí nghiệm cá được kiểm tra kí sinh trùng, vi khuẩn nhằm
lựa chọn cá khỏe, không nhiễm bệnh.
2.2 Vi khuẩn thí nghiệm
Hai dòng vi khuẩn E. ictaluri (dòng E3) và A. hydrophila (dòng A7) được phân lập từ cá tra
nhiễm bệnh gan thận mủ và bệnh xuất huyết. Hai dòng vi khuẩn này được xác định giá trị LD50
lần lượt là E. ictaluri (10
6
CFU/ml) và A. hydrophila (10
4
CFU/ml). Vi khuẩn trữ trong glycerol
được phục hồi trên môi trường TSA (tryptone soya agar, Oxoid), ủ ở 28
0
C. Sau đó được nuôi
tăng sinh trong môi trường brain heart infusion (BHI, Merck) và ủ qua đêm ở nhiệt độ phòng
trên máy lắc 110 vòng/phút. Tiến hành ly tâm 4.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4
0
C để thu sinh

khối tế bào. Sau khi ly tâm, dùng nước muối sinh lý (0.85%) để rửa vi khuẩn (lặp lại 2-3 lần).
Tiến hành xác định mật độ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 610 nm (OD = 1
± 0.1 tương ứng với mật độ vi khuẩn E. ictaluri là 10
9
CFU/mL còn vi khuẩn A. hydrophila là
10
8
CFU/mL). Sau đó, dung dịch vi khuẩn được pha loãng đến các nồng độ thí nghiệm cần thiết.
2.3 Bố trí thí nghiệm
Bể thí nghiệm có thể tích là 60 L, cấp khoảng 40 L nước. Nguồn nước sử dụng là nước máy đã
được sục khí ít nhất 24 giờ trước khi thả cá thí nghiệm. Bể được đặt ở phòng thí nghiệm ướt
(wet-lab). Dựa trên kết quả xác định nồng độ vi khuẩn gây chết 50% cá thí nghiệm (LD
50
). Thí
nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 6 nghiệm và được bố trí như sau:
Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm cảm nhiễm 2 loài vi khuẩn A. hydrophila và E. ictaluri trên cá tra
Nghiệm thức (NT)
Mô tả thí nghiệm
Mật độ vi khuẩn
NT 1
Tiêm cùng lúc A. hydrophila và E. ictaluri
E. ictaluri 10
6
CFU/ml
A. hydrophila 10
4

CFU/ml
NT 2
Tiêm A. hydrophila sau 24 giờ tiêm E. ictaluri

NT 3
Tiêm A. hydrophila sau 48 giờ tiêm E. ictaluri
NT 4
Tiêm A. hydrophila sau 72 giờ tiêm E. ictaluri
NT 5
Đối chứng tiêm nước muối sinh lý
0.85%
NT 6
Đối chứng không tiêm

Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần với mật độ 10 con/bể, được sục khí liên tục và không cho cá ăn
trong suốt quá trình thí nghiệm. Cá thí nghiệm được tiêm 0.1 ml vi khuẩn/cá ở xoang bụng.
Nhiệt độ nước được theo dõi hằng ngày, dao động khoảng 28 ± 2
o
C và thí nghiệm được theo dõi
liên tục trong 14 ngày.
4

2.4 Phƣơng pháp phết kính mẫu tƣơi
Dùng dao cắt một phần nhỏ da-cơ, mang, gan, thận và tỳ tạng cá tra phết nhẹ lên lame sạch. Để
khô tự nhiên, sau đó cố định lame bằng dung dịch Methanol trong 1 phút và nhuộm theo phương
pháp nhuộm mẫu của Chinabut (1991). Quan sát kết quả dưới kính hiển vi ở vật kính 100x.
2.5 Phƣơng pháp mô học
Các mẫu da-cơ, mang, gan, thận, tỳ tạng của cá lờ đờ từ các nghiệm thức gây cảm nhiễm kết hợp
2 loài vi khuẩn và cá từ nghiệm thức đối chứng được thu và cố định trong dung dịch formol
trung tính 10% trong 24-48 giờ. Tiến hành rửa và trữ mẫu trong cồn 70% cho đến khi phân tích
mô học. Mẫu được xử lý qua 3 giai đoạn: loại nước, làm trong mẫu và tẩm paraffin. Sau đó mẫu
được đúc khối, cắt lát với độ dày từ 4-6 μm và nhuộm Haematoxylin và Eosin. Tiêu bản được
quan sát dưới kính hiển vi lần lượt ở độ phóng đại 10x, 40x và 100x và chụp hình tiêu bản đặc
trưng. Đọc kết quả theo Ferguson (2006).

2.6 Phƣơng pháp phân tích số liệu
Các số liệu, đồ thị trong thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm Excel 2007.
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Kết quả cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila
3.1.1 Tỉ lê
̣
ca
́
chê
́
t sau cảm nhiễm 2 loài vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila
Sau khi gây ca
̉
m nhiê
̃
m kết hợp 2 loài vi khuâ
̉
n E. ictaluri và A. hydrophila, kết quả theo dõi thí
nghiệm cho thấy ở các nghiệm thức khác nhau thì thời gian cá chết và tỉ lệ cá chết đều khác
nhau, ngoại trừ nghiệm thức đối chứng (tiêm và không tiêm nước muối sinh lý) thì không có cá
chết trong suốt thời gian thí nghiệm (Hình 3.1).

Hình 3.1 Tỉ lệ cá chết tích lũy theo dõi qua các ngày cảm nhiễm kết hợp 2 loài vi khuẩn E. ictaluri
và A. hydrophila
5

Kết quả Hình 3.1 cho thấy, cá cảm nhiễm ở NT 3 và NT 4 có tỉ lệ chết cao nhất là 80% sau 7
ngày tiêm vi khuẩn, thấp nhất 67% ở NT 2 sau 4 ngày tiêm vi khuẩn. Còn ở NT 1 có tỉ lệ chết là
73%. Ở NT 1 cá chết chậm và ít hơn NT 3,4 là do sự cạnh tranh giữa E. ictaluri và A.
hydrophila nên chúng làm giảm độc lực của nhau. Trái lại, ở NT 3,4 khi cá bị nhiễm một loại

bệnh thì độc lực của bệnh đó sẽ tác động lên cá. Nhưng sau đó, cá này lại nhiễm tiếp tục một
bệnh khác thì lúc này độc lực do vi khuẩn nhiễm trước và nhiễm sau sẽ đồng thời tác động lên cá
làm cho cá chết cao.
Thời gian cá bắt đầu chết sau khi tiêm vi khuẩn ở tất cả các nghiệm thức là ngày thứ 2. Trong đó,
cá chết tập trung và nhiều nhất là từ ngày thứ 2 ngày đến ngày thứ 5 sau đó giảm dần và từ ngày
thứ 7 trở đi không thấy xuất hiện cá chết cho đến khi kết thúc thí nghiệm. Cá ở bể đối chứng
tiêm nước muối sinh lý và đối chứng không tiêm đều bình thường trong suốt thời gian thí
nghiệm. Kết quả thí nghiệm cũng cho thấy bệnh bộc phát mạnh khi cá bị nhiễm cả 2 loài vi
khuẩn và gây chết cao là ở thời điểm tiêm sau 24 giờ được tính kể từ khi kết thúc tiêm A.
hydrophila. Kết quả tương tự của Nusbaum và Morrison (2002) cho thấy khi bị nhiễm A.
hydrophila cá da trơn chưa biểu hiện bệnh nhưng sẽ bộc phát bệnh mạnh khi cá bị nhiễm thêm vi
khuẩn E. ictaluri.
3.1.2 Dấu hiệu bệnh lý của cá cảm nhiễm
Trong quá trình thí nghiệm, cá bị nhiễm vi khuẩn A. hydrophila và E. ictaluri có những dấu hiệu
bất thường như lờ đờ trên mặt nước, màu sắc da nhợt nhạt, xuất huyết trên khắp cơ thể, ở các
vây, hậu môn, xung quanh miệng, hầu và mắt cũng xuất huyết, đôi khi xuất hiện những điểm
xuất huyết trên cơ thể (Hình 3.2 A, B). Cá sắp chết thường nhào lộn và xoay tròn, ngửa bụng, thả
trôi theo dòng nước rồi chìm xuống đáy. Giải phẩu bên trong xoang nội quan có chứa dịch lỏng
màu hồng hay màu vàng (Hình 3.2 C). Gan, thận, tỳ tạng sưng to, xuất hiện những đốm trắng có
đường kính 1-2 mm, đặc biệt có hiện tượng nhũn ở thận (Hình 3.2 D). Ở giai đoạn đầu mới
nhiễm bệnh những đốm trắng chỉ xuất hiện trên thận hoặc tỳ tạng của cá. Kết quả nghiên cứu này
tương tự với các kết quả thí nghiệm cảm nhiễm đơn vi khuẩn E. ictaluri của một số tác giả như
Ferguson et al. (2001); Từ Thanh Dung và ctv (2004), Đặng Thụy Mai Thy (2010),
Kết quả tái phân lập vi khuẩn từ gan, thận, tỳ tạng cá tra cảm nhiễm 2 loài vi khuẩn trên môi
trường TSA cho thấy có sự xuất hiện của cả 2 dạng khuẩn lạc của vi khuẩn A. hydrophila và E.
ictaluri. Trong khi đó, ở nghiệm thức đối chứng không tiêm vi khuẩn thì không phân lập được vi
khuẩn trong quá trình thí nghiệm. Đối với dòng vi khuẩn E. ictaluri sử dụng trong thí nghiệm
gây cảm nhiễm được xác định là vi khuẩn Gram âm, hình que, oxidase âm tính, catalase dương
tính. Trong khi đó, vi khuẩn A. hydrophila cũng được xác định là vi khuẩn Gram âm, hình que
ngắn, phản ứng oxidase và catalase dương tính. Từ các kết quả trên cùng với việc tái định danh

bằng kỹ thuật PCR có thể kết luận 2 dòng vi khuẩn tái phân lập trên cá cảm nhiễm là 2 loài vi
khuẩn A. hydrophila và E. ictaluri.

6


Hình 3.2 Dấu hiệu bệnh lý cá cảm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila và E. ictaluri . A. Vùng đầu, mắt,
các vây và hậu môn xuất huyết; B. Nhiều điểm xuất huyết khắp trên da cá; C. Nhiều đốm trắng
xuất hiện trên gan, thận và tỳ tạng cùng với dịch màu hồng; D. Gan, tỳ tạng sƣng và thận bị nhũn
3.2 Biến đổi cấu trúc mô quan sát bằng phết kính tiêu bản tƣơi
Quan sát mẫu cá thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila bằng phương pháp
phết kính mẫu tươi da-cơ, mang, gan, thận, tỳ tạng cá tra cho thấy có sự xuất hiện của 2 loại vi
khuẩn hình que (dạng que ngắn: A. hydrophila, que dài: E. ictaluri) nằm rải rác hay tập trung
thành từng cụm trên các vùng mô phết kính. Ở nghiệm thức đối chứng không có vi khuẩn hiện
diện trên vùng phết kính vào ngày thu mẫu cuối cùng (Hình 3.3 A). Kết quả phết kính cho thấy,
sau 2 ngày cá chết thì vi khuẩn hiện diện rất ít trên mẫu mô và chỉ có sự xuất hiện của vi khuẩn
E. ictaluri, riêng nghiệm thức tiêm cùng lúc 2 loài vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila thì có cả
2 loài vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila, chúng bao quanh tế bào hồng cầu nhưng chưa tấn
công vào nhân tế bào chất (Hình 3.3 B).
Từ ngày thứ 4 trở đi, trên vùng mô phết kính có sự xuất hiện của cả 2 loài vi khuẩn E. ictaluri và
A. hydrophila ở tất cả các nghiệm thức. Quan sát cho thấy, chúng tấn công phá vỡ màng tế bào
hồng cầu, tạo nhiều không bào trong tế bào chất hoặc không còn tế bào làm cho các tế bào bị
biến đổi hình dạng (Hình 3.3 C). Kết quả này tương tự với kết quả thí nghiệm gây cảm nhiễm vi
khuẩn E.ictaluri trên cá tra của Đặng Thụy Mai Thy (2010). Bên cạnh đó, trên tiêu bản mẫu thận
7

và tỳ tạng cũng cho thấy các loại tế bào bạch cầu tham gia vào hệ thống miễn dịch của cơ thể,
chống lại các tác nhân gây bệnh (Hình 3.3 D). Nhưng khi có sự gia tăng số lượng vi khuẩn thì hệ
miễn dịch không thể tiêu diệt được vi khuẩn làm suy giảm khả năng chống chịu với tác nhân gây
bệnh dẫn đến cá chết.

Hình 3.3 Mẫu phết kính cá nhiễm E. ictaluri và A. hydrophila (Giemsa, 100x). A. Mẫu thận cá khỏe.
a: hồng cầu; b: bạch cầu đơn nhân; c: tế bào lympho; B. Vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila bao
quanh hồng cầu ở thận cá tra. a: vi khuẩn A. hydrophila, b: vi khuẩn E. ictaluri; C. Màng tế bào
hồng cầu bị vi khuẩn phá vỡ và vi khuẩn xâm nhập vào tế bào chất trong tỳ tạng (mũi tên); D. Đại
thực bào vi khuẩn ở thận (mũi tên)
3.3 Biến đổi mô học của cá tra cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila
3.3.1 Da và cơ
Khảo sát mô da-cơ cá khi gây cảm nhiễm 2 loài vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila cho thấy
ở các nghiệm thức tiêm vi khuẩn cấu trúc mô ít biến đổi so với mô cá khỏe (Hình 3.4). Sau 14
ngày theo dõi, ở các nghiệm thức tiêm vi khuẩn cá chết đều phân lập được vi khuẩn từ gan, thận,
tỳ tạng trên môi trường TSA. Đồng thời, kết quả phết kính ở trên, sau khi thu mẫu cá cảm nhiễm
2 loài vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila nhuộm Giemsa cho thấy có vi khuẩn hình que hiện
diện trên vùng da-cơ. Thí nghiệm của Takashi Hybyia (1982) cho thấy mẫu da-cơ bị biến đổi với
các hiện tượng viêm, khối cơ phù, thoái hóa hạt, thoái hóa lỏng, khối u phù khi bị các tác nhân là
8

vi khuẩn, kí sinh trùng, nấm xâm nhập và gây bệnh. Như vậy, cá chết do bị nhiễm vi khuẩn
nhưng kết quả quan sát mô da-cơ của các nghiệm thức tiêm vi khuẩn không có sự biến đổi so với
cá khỏe (nghiệm thức đối chứng). Cơ quan này ít bị ảnh hưởng trực tiếp bởi vi khuẩn cũng được
Hybiya (1982) giải thích là do cấu trúc cơ quan này khá rắn chắc và không giữ vai trò quan trọng
trong quá trình tạo máu và không trực tiếp tham gia vào hệ miễn dịch của cơ thể. Do đó, ít có
khả năng tiếp xúc và ít bị tấn công bởi vi khuẩn.

Hình 3.4 Đặc điểm mô da-cơ cá tra (H&E). A. Da-cơ cá khỏe (20x), a: lớp biểu bì, b: lớp hạ bì, c:
lớp cơ; B. Da-cơ cá bệnh (10x). a: lớp biểu bì ; b: các tế bào sắc tố, c: lớp hạ bì, d: lớp cơ
3.3.2 Mang
Qua khảo sát mô mang cá bệnh tiêm 2 loài vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila cho thấy cấu
trúc mô mang có những biến đổi như sợi mang thứ cấp phình to, xung huyết, xuất huyết và có sự
dính lại của nhiều sợi mang, động mạch ra vào mang cũng bị xung huyết (Hình 3.5). Hiện tượng

phình to của các sợi mang thứ cấp được ghi nhận từ ngày thu mẫu thứ 3 sau khi tiêm vi khuẩn.
Đến ngày thứ 5 mô mang ở các nghiệm thức này bị nhiễm bệnh nặng hơn, mô mang bị xuất
huyết, mất cấu trúc và không có khả năng hồi phục. Không tìm thấy sự biến đổi cấu trúc mang ở
nghiệm thức đối chứng vào ngày thu mẫu cuối cùng.
Hiện tượng sợi mang thứ cấp bị dính lại với nhau, sưng viêm và cấu trúc bị phá vỡ có thể là do
khi vi khuẩn tấn công sẽ tạo nên phản ứng miễn dịch làm các tế bào ở mang sưng lên và khi các
tế bào sưng càng to thì sẽ dẫn đến sự tiếp xúc giữa các sợi mang này cùng với dịch viêm sẽ tạo
nên sự dính lại của các sợi mang. Sự dính lại của các sợi mang làm giảm khả năng hô hấp của
mang do giảm diện tích tiếp xúc với nước và có thể do mất chức năng ở các vùng sợi mang bị
dính lại và hoại tử. Do đó, cá bệnh thường có biểu hiện thiếu oxy và thường lờ đờ trên mặt nước.
Tuy nhiên, sự biến đổi của mang chỉ xuất hiện trên một số mẫu ở các nghiệm thức qua các ngày
thu mẫu, có thể do mang không giữ vai trò trọng trong quá trình tạo máu nên ít bị phá hủy bởi vi
khuẩn gây bệnh.
9


Hình 3.5 Đặc điểm mô mang cá tra (H&E). A. Mang cá tra khỏe (20x). a: Sợi mang sơ cấp, b: sợi
mang thứ cấp; B. Mang cá tra bi xung huyết và có sự dính lại của các sợi mang thứ cấp (mũi tên)
(20x); C. Mang cá tra bị xung huyết ở các sợi mang thứ cấp và động mạch ra vào mang (mũi tên)
(10x); D. Mang cá tra có sự dính lại của các sợi mang và xuất huyết (mũi tên) (10x)
3.3.3 Thận
Qua khảo sát mô thận cá bệnh tiêm hai 2 loài vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila cho thấy cấu
trúc mô thận có những biến đổi như xung huyết, xuất huyết, hoại tử. Không tìm thấy sự biến đổi
cấu trúc mô ở nghiệm thức đối chứng vào ngày thu mẫu cuối cùng (Hình 3.6 A). Ở ngày thứ 2
sau khi cảm nhiễm quan sát mô thận cá nhiễm vi khuẩn cho thấy chủ yếu là hiện tượng xung
huyết, xuất huyết (Hình 3.6 B, C).
Hiện tượng xung huyết được xem là phản ứng đầu tiên của cơ thể đối với tác nhân gây bệnh do
kích thích đặc biệt làm cho mao mạch nở ra một lượng máu lớn hơn bình thường được đưa đến
gần ổ viêm. Khi những vùng xung huyết dưới ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn, các mao mạch
máu bị vỡ hoặc tính thẩm thấu của mao mạch tăng lên, làm cho các tế bào máu trong vùng xung

huyết thoát ra xen lẫn với các tế bào máu cơ quan sẽ gây ra hiện tượng xuất huyết. Hiện tượng
xung huyết và xuất huyết kéo dài sẽ làm cho mô thận sưng viêm mất cấu trúc và dẫn đến hoại tử.
10

Đến ngày thứ 3, bên cạnh hiện tượng xung huyết, xuất huyết, tế bào bị biến đổi cấu trúc, nhiều
vùng hoại tử lan rộng và các đại thực bào sắc tố cũng được tìm thấy trên mô thận (Hình 3.6 D).
Từ đó, làm thận mất đi những chức năng quan trọng của thận như điều hòa áp suất thẩm thấu, bài
tiết các sản phẩm của quá trình biến dưỡng như NH
3
, urê, các muối hóa trị 2, sản xuất hồng cầu
cũng như tiết hormone điều hòa các quá trình sinh lý của cơ thể kết hợp với những yếu tố khác
làm cho cá chết.

Hình 3.6 Đặc điểm mô thận cá tra (H&E). A. Thận cá khỏe (20x). a: tiểu cầu thận; b: ống thận; c:
trung tâm đại thực bào sắc tố; B. Thận cá xung huyết và xuất huyết (20x). a: vùng xung huyết; b:
vùng xuất huyết; C. a : tiểu cầu thận xung huyết; b: xuất huyết ; c: trung tâm đại thực bào sắc tố
(10x); D. Nhiều vùng mô xuất huyết và hoại tử (10x) a: xuất huyết, b: hoại tử
3.3.4 Tỳ tạng
Tỳ tạng được bao bọc bởi lớp tế bào biểu mô lát đơn và mô liên kết. Cấu tạo của tỳ tạng gồm hai
phần chính là tủy đỏ và tủy trắng. Tủy trắng nằm bên trong bắt màu sậm hơn phần tủy đỏ, tủy đỏ
tạo thành mạng lưới bao quanh tủy trắng. Ngoài tủy đỏ và tủy trắng, tỳ tạng còn có sự hiện diện
của trung tâm đại thực bào sắc tố, có màu vàng nâu hoặc nâu đen, đóng vai trò kho lưu trữ những
tế bào phá hủy, mảnh vụn kháng nguyên (Ferguson, 2006).
Qua khảo sát mô tỳ tạng cá bệnh cho thấy cấu trúc mô tỳ tạng có những vùng bị hoại tử mất cấu
trúc (Hình 3.7). Không tìm thấy sự biến đổi cấu trúc tỳ tạng ở nghiệm thức đối chứng vào ngày
thu mẫu cuối cùng. Đặc biệt, nhiều trung tâm đại thực bào sắc tố màu vàng nâu xuất hiện trên mô
tỳ tạng. Vi khuẩn gây bệnh tấn công làm cho cấu trúc tỳ tạng bị biến đổi. Những biến đổi cấu
11

trúc ở tỳ tạng giống với nghiên cứu trước đây của Trần Thị Ngọc Hân (2006) trên cá tra bị bệnh

mủ gan.
Tỳ tạng là cơ quan tạo máu chính của cá, khi hồng cầu trong máu giảm dẫn đến sự lưu thông của
các tế bào hồng cầu tham gia vào các đáp ứng miễn dịch và thực hiện quá trình trao đổi chất diễn
ra yếu. Khi đó tác nhân gây bệnh xâm nhập vào xảy ra hiện tượng xung huyết, xuất huyết mạch
máu sau đó là sự mất cấu trúc của tế bào. Cá bị xung huyết, xuất huyết và tế bào sưng viêm kéo
dài dẫn đến những vùng hoại tử xuất hiện trên diện rộng cùng với sự phá hủy của trung tâm đại
thực bào sắc tố sẽ làm cho tỳ tạng mất chức năng sản sinh hồng cầu, bạch cầu, khả năng tạo
kháng thể và thực bào không còn, cùng với tác động khác làm cho cá chết.

Hình 3.7 Đặc điểm mô tỳ tạng cá tra (H&E). A. Tỳ tạng cá khỏe (10x). Trung tâm đại thực bào sắc
tố (mũi tên); B. Tỳ tạng bị biến đổi cấu trúc (mũi tên) (10x)
3.3.5 Gan
Kết quả quan sát tiêu bản mô gan cá bệnh tiêm 2 loài vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila ở các
nghiệm thức cho thấy trên các tiêu bản mô bệnh xuất hiện một số biến đổi như liên kết cấu trúc
tế bào bị phá hủy, nhiều vùng tế bào gan bị xung huyết, xuất huyết và hoại tử mất cấu trúc.
Không tìm thấy sự biến đổi cấu trúc gan ở nghiệm thức đối chứng vào ngày thu mẫu cuối cùng
(Hình 3.8 A). Hiện tượng xung huyết xảy ra sau 2 ngày cảm nhiễm (Hình 3.8 B). Khi hiện tượng
xung huyết kéo dài sẽ làm vỡ mạch máu, giải thoát nhiều enzyme tiêu hóa (tiêu hóa protein,
lipid, ) từ các bạch cầu làm cho tổ chức viêm bị hủy hoại dẫn đến tế bào bị hoại tử mất cấu trúc.
Hiện tượng mất cấu trúc được ghi nhận trên mô gan ở ngày thứ 5 sau khi cảm nhiễm (Hình 3.8
C). Tế bào mất cấu trúc và dẫn đến hoại tử, đầu tiên là hoại tử dạng hạt và sau đó là hoại tử gần
hóa lỏng đến hóa lỏng.
Tuy nhiên, hiện tượng hoại tử dạng hạt và hoại tử hóa lỏng không xảy ra ở gan cá cảm nhiễm.
Điều này không giống với các thí nghiệm cảm nhiễm đơn trước đây. Trần Thị Ngọc Hân (2006)
đã ghi nhận có hiện tượng hoại tử dạng hạt và hóa lỏng ở nghiệm thức 1x10
5
CFU/ml và 1x10
6

CFU/ml khi gây cảm nhiễm E. ictaluri trên cá tra. Đặng Thụy Mai Thy (2010) nghiên cứu đặc

tính gây bệnh của vi khuẩn E. ictaluri ở cá tra cũng ghi nhận có hiện tượng hoại tử dạng hạt đến
hóa lỏng ở các trên gan. Theo Ferguson (1989) những tổn thương diễn ra toàn bộ tổ chức gan
12

làm cho gan không còn chức năng khử độc, lọc máu, chuyển hóa protein, lipid, glucid, tiết mật.
Từ đó, các độc lực của vi khuẩn không được loại bỏ sẽ tích lũy trong cơ thể và làm giảm khả
năng đề kháng với mầm bệnh kết hợp với các điều kiện bất lợi khác làm cá chết.

4. KẾT LUẬN
Kết quả sau khi cảm nhiễm 2 loài vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila cho thấy bệnh bộc phát
mạnh khi cá bị nhiễm cả 2 loài vi khuẩn và gây chết cao là ở thời điểm tiêm sau 24 giờ được tính
kể từ khi kết thúc tiêm A. hydrophila.
Kết quả phết kính mẫu tươi trên da-cơ, mang, gan, thận và tỳ tạng cá tra đều có sự xuất hiện của
2 loài vi khuẩn có dạng hình que ngắn của vi khuẩn A. hydrophila và dạng que dài của vi khuẩn
E. ictaluri. Trong khi đó, ở nghiệm thức đối chứng không thấy vi khuẩn ở các mẫu phết.
Cấu trúc mô gan, thận, tỳ tạng đều có hiện tượng xung huyết, xuất huyết, hoại tử mất cấu trúc
khi cảm nhiễm cùng lúc vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila. Kết quả thí nghiệm cũng cho thấy
cấu trúc mang có những biến đổi như sợi mang thứ cấp phình to, xung huyết, xuất huyết và có sự
dính lại của nhiều sợi mang. Trong khi mô da-cơ không có sự biến đổi cấu trúc qua các ngày thu
mẫu.

13

TÀI LIỆU THAM KHẢO
CrumLish, M. Thanh, P.C., Koesling, J., Tung, V., T. and Gravingen, K., 2010. Experimental
challenge studies in Vietnamese catfish, Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage),
exposed to Edwardsiella ictaluri and Aeromonas hydrophila.
Crumlish, M., T.T. Dung, J.F. Turnbull, N.T.N Ngoc and H.W. Ferguson, 2002. Identification of
Edwardsiella ictaluri from diseased freshwater catfish, Pangasianodon hypophthalmus
(Sauvage), cultured in the Mekong Delta, Vietnam. Journal of Fish Diseases, 25: 733-736.

Chinabut S, P Kitsawat and C Limsuwan, 1991. Histology of the walking catfish, Clarias
batrachus. International development research centre, Canada.
Colwell R.R., MacDonell M.R. & DeLey J. (1986) Proposal to reorganize the family
Aeromonadaceae fam. nov. International Journal of Systematic Bacteriology 36, 473-477.
Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương, 2009. Độc lực của vi khuẩn Edwardsiella
ictaluri phân lập từ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bị bệnh mủ gan. Tạp chí Nông
Nghiệp và Phát triển Nông thôn, số 12:64-70.
Đặng Thụy Mai Thy, 2010. Nghiên cứu đặc tính gây bệnh của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri ở
cá tra. Luận văn cao học, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ.
Ferguson, H.W., 1989. Systemic pathology of fish. 247p.
Ferguson, H.W., 2006. Systemic pathology of fish: Atext và atlas of normal tissues in teleosts và
their responses in disease. Scotian press. 367 pp.
Ferguson, 2002. Identification of Edwardsiella ictaluri from diseased freshwater catfish,
Pangasius hypophthalmus (Sauvage), cultured in the Mekong Delta, Vietnam. Journal of
Fish Diseases, 25: 733-736.
Hybiya, T. 1982. An atlas of histology (Normal and Pathological features). College of
Agriculture and Veterinary Medicine, Nihon Univ. Tokyo, Japan. 146p.
Hawke, J.P., A.C. McWhorter, A.G. Steigerwalt and D.J. Brenner, 1981. Edwardsiella ictaluri
sp. nov., the causative agent of enteric septicemia of catfish. International ournal of
Systematic bacteriology, 31: 396-400.
Hawke, J.P. 1979, A bacterium associated with disease of pond cultured channel catfish (Italurus
punctaus). Journal of fishes Research Board of Canada, 36: 1058-1512.
Inglis, V., R.J. Roberts, N.R. Bromage, 1993. Bacterial disease of fish. 196-210.
Newman S.G. (1993) Bacterial vaccines for fish. Annual Review of Fish Diseases 3, 145–185.
Nusbaun, K.E. and E.E. Morrison, 2002. Edwardsiella ictaluri bacteraemia elicits shedding of
Aeromonas hydrophila complex in latently infected channel catfish, Ictalurus punctatus
(Rafinesque). Journal of Fish Diseases, 25: 343-350.
14

Subagja J., Slembrouck J., Hung L.T. & Legendre M. (1999) Larval rearing of an Asian catfish

Pangasius hypophthalmus (Siluroidei, Pangasiidae): analysis of precocious mortality and
propositions of appropriate treatments. Aquatic Living Resources 12, 37-44.
Trần Thị Ngọc Hân, 2006. Khảo sát mô học cá tra (Pangasianodon hypophthalamus). Luận văn
Đại học, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ.
Từ Thanh Dung, M Crumlish, Nguyễn Thị Như Ngọc, Nguyễn Quốc Thịnh và Đặng Thụy Mai
Thy, 2004. Xác định vi khuẩn gây bệnh trắng gan trên cá tra (Pangasianodon
hypophthalamus). Tạp chí khoa học. Đại học Cần Thơ, 2004. 373 trang.