phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase từ mắm cá cơm, mắm cá linh, mắm cá sặc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC




LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC


PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN
CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME COLLAGENASE
TỪ MẮM CÁ CƠM, MẮM CÁ LINH, MẮM CÁ SẶC



CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
TS. BÙI THỊ MINH DIỆU PHẠM THÁI VY
MSSV: 3102796
LỚP: CNSH KHÓA 36





Cần Thơ, tháng 05 năm 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC




LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC


PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN
CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME COLLAGENASE
TỪ MẮM CÁ CƠM, MẮM CÁ LINH, MẮM CÁ SẶC



CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
TS. BÙI THỊ MINH DIỆU PHẠM THÁI VY
MSSV: 3102796
LỚP: CNSH KHÓA 36




Cần Thơ, tháng 05 năm 2014


PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN



TS. Bùi Thị Minh Diệu Phạm Thái Vy



DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………
Cần Thơ, ngày tháng năm 2014
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG








LỜI CẢM TẠ

Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của các bậc sinh
thành, quý thầy cô, các anh chị và các bạn sinh viên. Xin gửi lời cám ơn chân thành đến:
Cha mẹ của tôi, những người đã có công nuôi nấng dưỡng dục, dạy bảo, tạo điều kiện vật
chất để tôi yên tâm chuyên lo học hành và luôn cho tôi những lời khuyên khi gặp khó khăn trong
công việc cũng như trong cuộc sống.
Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ
đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài luận văn.
Ts. Bùi Thị Minh Diệu đã tận tình hướng dẫn, quan tâm và giúp đỡ tôi đến khi hoàn thành
đề tài luận văn.
Tập thể các thầy cô thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, đã tận tình
giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập tại Trường Đại học Cần Thơ.
Tập thể cán bộ và sinh viên trong phòng thí nghiệm Sinh học phân tử thực vật, phòng Hóa
sinh thực phẩm đã tạo điều kiện, hỗ trợ về các trang thiết bị cần thiết cho quá trình thực hiện đề
tài cũng như chia sẻ kinh nghiệm, động viên giúp tôi hoàn thành tốt đề tài luận văn này.
Cần Thơ, ngày tháng năm 2014
Sinh viên thực hiện


Phạm Thái Vy






Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học
i
TÓM LƯỢC
Collagen có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực thực phẩm, y học, dược phẩm và mỹ

phẩm. Trên thực tế, collagen là loại protein quan trọng trong cấu trúc cơ thể động vật
như da, xương. Việt nam, với lợi thế là quốc gia có nền nông - ngư nghiệp phát triển,
hàng năm thải ra môi trường hàng tấn phụ - phế phẩm (Theo Tổng cục thống kê, tính đến
tháng 4 năm 2014 là 86.340 tấn phụ - phế phẩm cá Tra/Basa ) nên việc tận dụng collagen
từ cơ thể động vật, đặc biệt là nguồn phế thải trong quá trình sản xuất thủy sản sẽ đem lại
giá trị kinh tế. Hiện nay, việc tách chiết collagen bằng phương pháp sinh học đang được
chú trọng đầu tư, nghiên cứu. Một trong những bước nghiên cứu đầu tiên là tìm kiếm
nguồn sinh vật sản xuất enzyme collagenase hiệu quả. Hệ vi sinh vật chứa một lượng
enzyme collagenase khá phong phú. Do đó, việc chọn ra những dòng vi khuẩn có khả
năng sinh tổng hợp enzyme collagenase là một bước khởi đầu cần thiết. Từ ba mẫu mắm
cá cơm, mắm cá linh và mắm cá sặc đã phân lập được 41 dòng vi khuẩn hiếu khí có khả
năng sinh tổng hợp enzyme collagenase trên hai loại môi trường gelatin (giai đoạn phân
lập) và collagen (giai đoạn sau khi tách ròng). Đa số khuẩn lạc có dạng không đều, độ
nổi mô, dạng bìa nguyên, màu trắng đục. Vi khuẩn có thời gian phát triển trung bình,
phần lớn là hình cầu. Dựa vào kết quả kích thước vòng phân giải khi cho dịch enzyme thô
vi khuẩn tương tác với cơ chất collagen, dưới tác động của thuốc thử TCA 35%, xác định
được 19 trong số 41 dòng vi khuẩn phân lập được cho hoạt tính enzyme collagenase.
Hoạt tính enzyme được xác định bằng phương pháp Ninhydrin và được đo qua bốn ngày,
dòng CV41 cho hoạt tính cao nhất (2,85 U/ml) ở ngày thứ hai, tiếp theo là dòng CV37
(hoạt tính 2,03 U/ml) ở ngày thứ hai và dòng CV32 (hoạt tính 2 U/ml) ở ngày thứ ba. Cả
ba dòng vi khuẩn CV32, CV37, CV41 đều thuộc nhóm Gram âm, di động nhưng hình
dạng khác nhau; dòng CV32 và CV37 hình cầu, dòng CV41 hình que ngắn. Ba dòng vi
khuẩn đều phản ứng dương tính với thử nghiệm amylase và catalase; phản ứng âm tính
với thử nghiệm Methyl Red và Voges Proskauer. Thử nghiệm Indol, dòng CV37 cho phản
ứng dương tính, dòng CV32 và CV41 cho phản ứng âm tính.
Từ khóa: Collagen, enzyme collagen, gelatin, mắm cá cơm, mắm cá linh, mắm cá
sặc.
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học
ii

MC LC
Trang
PHẦN KÝ DUYỆT
LỜI CẢM TẠ
TÓM LƯỢC i
MC LC ii
DANH SA
́
CH BA
̉
NG v
DANH SA
́
CH HI
̀
NH vi
TƯ
̀
VIÊ
́
T TĂ
́
T vii
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu đề tài 1
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2
2.1. Sơ lƣợc về collagen 2
2.1.1. Giới thiệu sơ lƣợc về collagen. 2
2.1.2. Cấu trúc của collagen. 2

2.1.2.1. Cấu trúc phân tử của collagen 2
2.1.2.2. Thành phần acid amin 3
2.1.3. Phân loại collagen. 5
2.1.4. Ứng dụng của collagen 5
2.1.4.1. Trong công nghiệp thực phẩm 6
2.1.4.2. Trong y học và dƣợc phẩm 7
2.1.4.3. Trong mỹ phẩm 7
2.1.5. Sơ lƣợc về gelatin 8
2.2. Sơ lƣợc về enzyme collagenase 9
2.2.1. Định nghĩa enzyme collagenase 9
2.2.2. Nguồn enzyme collagenase và một số tính chất cơ bản 10
2.2.2.1. Enzyme collagenase của mô 10
2.2.2.2. Enzyme collagenase của vi sinh vật 11
2.2.3. Một số tính chất của enzyme collagenase 14
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học
iii
2.2.3.1. Kích thƣớc và cấu trúc phân tử 14
2.2.3.2. Độ bền enzyme 14
2.2.3.3. Tính đặc hiệu của enzyme 15
2.2.4. Một số ứng dụng của enzyme collagenase 16
2.2.4.1. Trong nghiên cứu tách chiết collagen 16
2.2.4.2. Trong công nghiệp thực phẩm 17
2.2.4.3. Trong y học, dƣợc phẩm và mỹ phẩm 19
2.2.5. Tình hình nghiên cứu enzyme collagenase trên thế giới và Việt Nam 21
2.2.5.1. Nghiên cứu enzyme collagenase trên thế giới 21
2.2.5.2. Nghiên cứu enzyme collagenase ở Việt Nam 22
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23
3.1. Thời gian, địa điểm 23
3.2. Phƣơng tiện nghiên cứu 23

3.2.1. Vật liệu thí nghiệm 23
3.2.2. Thiết bị và hóa chất 23
3.2.2.1. Thiết bị 23
3.2.2.2. Hóa chất 24
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 25
3.3.1. Phân lập vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase
trên môi trƣờng Czapek cải tiến 25
3.3.2. Đánh giá khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase của các dòng
vi khuẩn phân lập đƣợc 27
3.3.3. Xác định hoạt tính enzyme collagenase của các dòng vi khuẩn mạnh
đƣợc tuyển chọn 28
3.3.4. Xác định một số đặc tính hình thái và sinh hóa của các dòng vi khuẩn
mạnh đƣợc tuyển chọn 30
3.3.4.1. Xác định một số đặc tính hình thái 30
3.3.4.2. Xác định một số đặc tính sinh hóa 31
CHƯƠNG 4. KÊ
́
T QUA
̉
VÀ THẢO LUẬN 32
4.1. Phân lập vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học
iv
từ mắm cá cơm, mắm cá linh và mắm cá sặc 32
4.1.1. Số lƣợng dòng vi khuẩn phân lập đƣợc 32
4.1.2. Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc 32
4.2. Đánh giá và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp
enzyme collagenase từ các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc 34
4.3. Hoạt tính enzyme collagenase của các dòng vi khuẩn mạnh đƣợc tuyển chọn 37

4.4. Một số đặc tính hình thái, sinh hóa của các dòng vi khuẩn có khả năng sinh
tổng hợp enzyme collagenase mạnh đƣợc tuyển chọn 39
4.4.1. Đặc tính hình thái 39
4.4.2. Đặc tính sinh hóa 40
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42
5.1. Kết luận 42
5.2. Đề nghị 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO 43
PH LC
PHỤ LỤC 1. HÌNH ẢNH
1. Một số thiết bị, dụng cụ sử dụng trong quá trình thực hiện thí nghiệm
2. Một số hình ảnh trong quá trình thực hiện thí nghiệm
PHỤ LỤC 2: PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH VI KHUẨN
PHỤ LỤC 3. ĐỒNG NHẤT MẬT SỐ VI KHUẨN
PHỤ LỤC 4. SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM
PHỤ LỤC 5. KẾT QUẢ THỐNG KÊ
1. Kết quả thống kê xác định đƣờng kính vòng phân giải
2. Kết quả thống kê xác định hoạt tính enzyme collagenase






Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học
v
DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 1. Thành phần phần trăm mỗi bộ ba acid amin trong phân tử collagen 3

Bảng 2. Kết cấu chuỗi và sự phân bố của các loại collagen trong cơ thể ngƣời 5
Bảng 3. Thành phần phần trăm các acid amin thu đƣợc khi thủy phân 100g gelatin 9
Bảng 4. Một số enzyme collagenase có nguồn gốc từ mô 11
Bảng 5. Một số enzyme collagenase có nguồn gốc từ vi sinh vật 13
Bảng 6. Thành phần hóa chất môi trƣờng Czapek cải tiến 24
Bảng 7. Thành phần môi trƣờng tăng sinh 24
Bảng 8. Nồng độ pha loãng 26
Bảng 9. Nồng độ pha dung dịch leucine 29
Bảng 10. Thành phần hóa chất dựng đƣờng chuẩn leucine 29
Bảng 11. Số lƣợng dòng vi khuẩn theo nguồn gốc phân lập 32
Bảng 12. Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc 32
Bảng 13. Hoạt tính enzyme collagenase theo thời gian của các dòng vi khuẩn
mạnh đƣợc tuyển chọn 38
Bảng 14. Kết quả nhuộm Gram của ba dòng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn 39
Bảng 15. Kết quả thử nghiệm một số đặc tính sinh hóa của ba dòng vi khuẩn đƣợc
tuyển chọn 40











Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học
vi

DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 1. Cấu trúc phân tử collagen 2
Hình 2. Sự hình thành chuỗi xoắn ốc nội phân tử và giữa các chuỗi polypeptide 3
Hình 3. Trật tự sắp xếp của các acid amin trong phân tử collagen 4
Hình 4. Cấu trúc sợi collagen 4
Hình 5. Hanamai Collagen 6
Hình 6. Một số mỹ phẩm chứa collagen 8
Hình 7. Cấu trúc Gly - X - Y của phân tử gelatin 9
Hình 8. Pseudomonas sp., C. Histolyticum và Aspergillus oryzae 13
Hình 9. Bệnh co cứng Dupuytren 19
Hình 10. Các bƣớc trong giai đoạn nhuộm Gram. 31
Hình 11. Hình thái khuẩn lạc của một số dòng vi khuẩn 34
Hình 12. Vòng phân giải của các dòng vi khuẩn có hoạt tính enzyme collagenase 35
Hình 13. Biểu đồ thể hiện khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase
của các dòng vi khuẩn 36
Hình 14. Kết quả nhuộm Gram của ba dòng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn 40
Hình 15. Kết quả một số đặc tính sinh hóa của ba dòng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn 41

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học
vii
TỪ VIẾT TẮT

CFU Colony - Forming Unit
ĐC Đối chứng
ĐK Đƣờng kính
kDa Kilo Dalton
KL Khuẩn lạc
MR Methyl Red
OD Optical Density
PTN Phòng thí nghiệm
PCR Polymerase Chain Reaction
SDS - PAGE Sodium Dedocyl Sulfate - Gel Polyacrylamide
STT Số thứ tự
TCA Trichloroacetic Acid
UV Ultraviolet
VK Vi khuẩn
VP Voges Proskauer



Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học
1
CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Collagen là protein quan trọng và chiếm lượng khá cao trong cấu trúc của cơ thể
động vật (khoảng 30% tổng lượng protein trong cơ thể động vật có xương sống là

collagen). Đặc biệt, collagen có ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, y học,
dược phẩm hay mỹ phẩm. Vì vậy, việc khai thác nguồn collagen tự nhiên từ động vật
sẽ mang lại tiềm năng kinh tế rất lớn. Tuy nhiên, collagen thường được sử dụng dưới
dạng collagen thủy phân, trong khi collagen từ cơ thể động vật là loại protein khó phân
giải. Enzyme collagenase chính là lựa chọn thích hợp nhất để phân giải collagen,
enzyme collagenase là enzyme duy nhất có khả năng phân giải collagen khi cơ chất ở
trạng thái tự nhiên.
Hiện nay, collagen trên thị trường đa phần được tách chiết theo phương pháp hóa
học (sử dụng acid acetic), việc tách chiết collagen bằng enzyme collagenase (phương
pháp sinh học) đang trở thành đề tài rất được quan tâm, nghiên cứu. Bởi vì, so với
phương pháp hóa học, tách chiết collagen bằng phương pháp sinh học không những
tạo ra sản phẩm an toàn, chất lượng mà còn giảm bớt ô nhiễm môi trường khi hạn chế
được lượng lớn hóa chất dùng trong sản xuất. Vấn đề đặt ra là tìm được nguồn enzyme
collagenase hiệu quả để ứng dụng vào việc tách chiết collagen; và hệ vi sinh vật có thể
xem như một nguồn thích hợp để sản xuất enzyme collagenase. Dựa vào sự đa dạng
vốn có của hệ vi sinh vật nên khả năng tạo ra nguồn enzyme collagenase hiệu quả sẽ
rất lớn.
Nhiều vi sinh vật đã được phát hiện có khả năng sinh tổng hợp enzyme
collagenase như Clostridium, Bacillus subtilis, Vibrio hay Pseudomonas, phần lớn đều
được phân lập từ đất (Kawahara, 1993). Với mắm cá, loại thực phẩm dùng phổ biến
trong bữa ăn của người Việt Nam, được chế biến theo phương pháp truyền thống với
thành phần chính là cá và muối sẽ là nguồn lý tưởng để phân lập vi sinh vật có khả
năng sinh tổng hợp enzyme collagenase hiệu quả. Vì vậy, đề tài “Phân lập và tuyển
chọn vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase từ mắm cá cơm, mắm
cá linh, mắm cá sặc” được thực hiện.
1.2. Mục tiêu đề tài
Đề tài được thực hiện với mục tiêu phân lập để tuyển chọn được một số dòng vi
khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase.
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học

2
CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Sơ lƣợc về collagen
2.1.1. Định nghĩa collagen
Collagen được xếp vào nhóm các protein cứng dạng sợi: sợi collagen.
Collagen là loại protein cấu trúc chính yếu, chiếm khoảng 30% tổng lượng
protein có trong cơ thể ở các động vật có xương sống (Harper, 1980). Collagen có
nhiều trong gân, da, xương, hệ thống mạch máu của động vật và có mặt trong các
màng liên kết bao quanh cơ. Khoảng 10% protein trong cơ ở động vật có vú là
collagen, các protein ngoại bào (khoảng 90% trong gân, xương và khoảng 20% trong
da) có chứa collagen. Collagen có tác dụng giống như một chất keo liên kết các tế bào
lại để hình thành các mô và cơ quan nền tảng trong cơ thể.
2.1.2. Cấu trúc của collagen
2.1.2.1. Cấu trúc phân tử của collagen
Phân tử collagen (hay còn gọi là tropocollagen) là một protein hình trụ, dài
khoảng 300nm, đường kính khoảng 1,5nm.

Hình 1. Cấu trúc phân tử sợi collagen
(*Nguồn: ngày 02/09/2013)
Nó bao gồm 3 chuỗi polypeptide cuộn lại với nhau. Mỗi chuỗi cuộn thành đường
xoắn ốc theo hướng từ phải sang trái với 3 gốc trên một vòng xoắn. Ba chuỗi này xoắn
lại với nhau theo hướng từ trái sang phải tạo thành đường bộ ba xoắn ốc. Mỗi chuỗi
polypeptide có trọng lượng phân tử khoảng 100kDa (Seifter và Harper, 1971), tạo nên
tổng trọng lượng phân tử collagen khoảng 300kDa (Harper, 1980). Chuỗi


được cấu
tạo bởi khoảng 1000 amino acid, các chuỗi


khác nhau ở thành phần amino acid (
1

,
2

và
3

). Sự phân bố của các chuỗi
1

,
2

và
3

khác nhau trong các phân tử collagen
tùy thuộc vào sự khác biệt về gen.
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học
3

Hình 2. Sự hình thành chuỗi xoắn ốc nội phân tử và
giữa các chuỗi polypeptide
(*Nguồn: ngày
29/05/2014)
2.1.2.2. Thành phần acid amin
Trong collagen chứa rất ít hoặc không chứa cysteine và tryptophan, giàu thành

phần glycine, proline và hydroxyproline, collagen là một trong số ít protein có chứa
hydroxylysine. Hydroxyproline là một acid amin đặc trưng của collagen mà các
protein khác không có (Harper, 1980). Trong phân tử collagen chứa khoảng 33%
glycine, 12% proline và 11% hydroxyproline. Các acid amin sắp xếp trong chuỗi xoắn
ốc theo các dãy với sự phân bố như sau:
Bảng 1. Thành phần phần trăm mỗi bộ ba acid amin trong
phân tử collagen
Bộ ba amino acid
Tỷ lệ (%)
Gly - X – X
44
Gly - I – X
27
Gly - X – I
20
Gly - I – I
9
(*Nguồn: Lodish et al., 2000)
Trong đó, I là acid amin proline hoặc hydroxyproline, X là các acid amin khác.
Glycine chiếm 1/3 trong tổng số các acid amin và nó được phân bố một cách đều đặn
tại vị trí mỗi 1/3 trong xuyên suốt phân tử collagen. Do glycine có các nhánh phụ nhỏ
nhất nên sự lặp lại của nó cho phép các chuỗi polypeptide kết hợp chặt chẽ với nhau
hình thành nên một đường xoắn ốc với khoảng trống nhỏ ở phần lõi.
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học
4

Hình 3. Trật tự sắp xếp các acid amin trong phân tử
collagen
(*Nguồn: ngày

29/05/2014)
Ngoài ra, trong phân tử collagen còn có những vùng gồm khoảng 9 - 26 acid
amin tại các điểm đầu mút amin hay carboxyl của chuỗi. Các vùng này không sáp lại
với cấu trúc xoắn ốc và được gọi là telopeptide.
Glycine đóng một vai trò hết sức quan trọng trong cấu trúc sợi siêu xoắn của
collagen. Tropocollagen liên kết với nhau theo kiểu đầu nối đuôi hình thành các
collagen fibril (collagen sợi nhỏ). Các collagen fibril này bó lại với nhau hình thành
sợi collagen siêu cáp - collagen fiber. Vì thế collagen rất chắc, dai và bền.

Hình 4. Cấu trúc sợi collagen
a) Cấu trúc khái quát 3 sợi xoắn của collagen
b) Phân tử collagen.
c) Collagen fibril đường kính từ 10 - 300nm.
d) Collagen fibril bó lại với nhau hình thành sợi collagen siêu cáp -
collagen fiber, đường kính từ 0,5 - 3μm.
(*Nguồn:
ngày 29/05/2014)
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học
5
2.1.3. Phân loại collagen
Tính tới thời điểm hiện tại, có 42 loại chuỗi polypeptide được nhận dạng. Chúng
được mã hóa bởi 41 loại gen khác nhau, tạo thành 27 loại collagen.
Hơn 90% collagen trong cơ thể là các collagen loại I, II, III và IV. Collagen loại I
là phổ biến nhất và thường ở trong các mô liên kết như da, xương, gân. Collagen loại
II hầu như tồn tại ở các mô sụn. Collagen loại III lại phụ thuộc rất lớn vào độ tuổi của
động vật (da heo còn trẻ chứa 50%), theo thời gian tỷ lệ này giảm từ 5 - 10%. Collagen
loại IV là thành phần chính cấu tạo nên màng tế bào. Các loại collagen khác chỉ hiện
diện với lượng rất ít và chỉ ở một vài cơ quan đặc biệt. Những bệnh tật liên quan đến
collagen là do sự khuyết tật về gen ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp, sự sắp xếp cũng

như các quá trình khác trong sự sản sinh collagen một cách không bình thường.
Hiện tại, có ít nhất khoảng 13 loại collagen đã được tách chiết. Chúng khác nhau
về chiều dài của chuỗi xoắn ốc cũng như kích cỡ và bản chất của những phần không
xoắn ốc.
Bảng 2. Kết cấu chuỗi và sự phân bố của một số loại collagen trong cơ thể
ngƣời
Loại collagen
Nhóm
Kết cấu chuỗi
Phân bố
I
Sợi

1[I]

2[I]

Da, xương, dây chằng
II
Sợi

1[II]3
Sụn
III
Sợi

1[III]3
Da, mạch máu, ruột
IV
Mạng lưới


1[IV]2

2[IV]
Màng tế bào

3[IV]

4[IV]

5[IV]

5[IV]2

6[IV]
V
Sợi

1[V]3
Xương, giác mạc, nhau thai, gân

1[V]2

2[V]

1[V]

2[V]

3[V]

VI
Mạng lưới

1[VI]

2[VI]

3[VI]
Xương, gân, sụn

1[VI]

2[VI]

4[VI]
(*Nguồn: Lodish et al., 2000)
2.1.4. Ứng dụng của collagen
Collagen có rất nhiều ứng dụng trong công nghiêp thực phẩm, mỹ phẩm, y học
và dược phẩm. Collagen thường được sử dụng dưới dạng collagen thủy phân. Collagen
thủy phân được gọi là collagen hydrolysate. Tùy theo mức độ thủy phân mà collagen
sẽ có những ứng dụng khác nhau.
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học
6
2.1.4.1. Trong công nghiệp thực phẩm
Collagen được dùng làm vỏ bao xúc xích, màng bọc kẹo, làm nguyên liệu để sản
xuất một số loại thực phẩm dinh dưỡng, thực phẩm chức năng. Trong các sản phẩm
pho-mát, người ta thêm vào một hàm lượng collagen hydrolysate thích hợp nhằm ngăn
chặn sự mất nước. Ngoài ra, trong sản phẩm bơ sữa, collagen đóng vai trò quan trọng
trong việc tạo độ mịn, độ sánh cho sản phẩm, cũng như thay thế hàm lượng chất béo

trong các loại thực phẩm này.
Trong sản phẩm kẹo dẻo, sự có mặt của collagen hydrolysate cung cấp cho sản
phẩm độ dẻo, dai và mềm do chúng ngăn chặn sự kết tinh của đường. Các sản phẩm
như vỏ kẹo có chứa từ 0,5 - 1% hàm lượng collagen hyrolysate với vai trò làm giảm sự
tan chảy.
Trong công nghiệp sản xuất kẹo mứt, collagen hydrolysate được sử dụng làm
chất tạo gel, chất kết dính, chất tạo độ xốp, làm chậm quá trình tan kẹo trong miệng.
Trong các sản phẩm như thịt hộp, thịt nguội collagen hydrolysate chiếm từ 1 -
5%, giữ hương vị tự nhiên cho thực phẩm, đồng thời cũng là chất kết dính giúp cho
việc tạo thành sản phẩm dễ dàng hơn.
Trong công nghiệp sản xuất rượu bia và nước hoa quả, collagen hydrolysate
(chứa từ 0,002 - 0,15%) sử dụng như chất làm trong. Nhờ vậy, sản phẩm khi làm ra có
màu sắc trong suốt và óng ánh.
Collagen có khả năng hấp thụ nước gấp 5 - 10 lần thể tích của nó nên được sử
dụng trong công nghiệp sản xuất đồ hộp để tránh hiện tượng rỉ nước.

Hình 5. Hanamai Collagen
(*Nguồn: www.hangngoainhap.com.vn/33-hanamai-collagen-cua-nhat-collagen-dang-bot-
chiet-xuat-tu-ca.html ngày 02/09/2013)


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học
7
2.1.4.2. Trong y học và dƣợc phẩm
Collagen là một vật liệu có khả năng phân hủy sinh học, có tính tương thích sinh
học cũng như khả năng cầm máu nên có thể được chế tạo thành các dạng khác nhau, là
một loại vật liệu sinh học lý tưởng cho sản xuất các sản phẩm y học. Màng collagen
được sử dụng cho hàng loạt những ứng dụng như chất bịt kín sinh học và cải thiện tính
đáp ứng sinh học đối với những mô cấy. Collagen được sử dụng như một hệ thống

phân hủy sinh học cho ra các loại thuốc bao gồm thuốc tránh thai, thuốc kháng sinh,
insullin, hormone tăng trưởng. Collagen được sử dụng rộng rãi trong phẫu thuật thẩm
mỹ, chữa lành vết thương cho các bệnh nhân bị bỏng, tái tạo xương và nhiều mục đích
khác thuộc lĩnh vực y khoa, phẫu thuật, chỉnh hình. Collagen còn được dùng trong việc
xây dựng cấu trúc da nhân tạo để chữa trị cho các vết bỏng nghiêm trọng.
Collagen còn được sử dùng để sản xuất bao con nhộng cứng và mềm, chúng
được dùng để bảo vệ thuốc khỏi những nhân tố có hại như ánh sáng hay oxy. Thành
phần chính của vỏ bao thuốc là collagen và các tá dược khác như glycerol hay sorbitol,
những chất hoạt động bề mặt, chất màu cho phép, hương liệu. Viên thuốc với vỏ bao
collagen đảm bảo cho người bệnh có thể nuốt viên thuốc một cách dễ dàng.
2.1.4.3. Trong mỹ phẩm
Collagen tạo ra một hệ thống nâng đỡ, hỗ trợ các đặc tính cơ học của da như sức
căng, độ đàn hồi, duy trì độ ẩm, làm cho da mịn màng, tươi tắn và trẻ trung. Collagen
giúp duy trì độ ẩm tối ưu cho tế bào. Ngoài ra, collagen còn đảm bảo sắc tố da, làm
sáng màu da, đàn hồi và thúc đẩy quá trình lão hóa của cơ thể. Collagen có vai trò
quan trọng giúp cải thiện cấu trúc da, kích thích quá trình tái tạo của làn da, phục hồi
tế bào da bị thương tổn.
Chính vì vậy collagen được sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất các sản phẩm
như kem dưỡng da cao cấp, dầu gội, các sản phẩm dưỡng tóc cũng như các loại sữa
tắm.
Collagen hydrolysate là thành phần trong các sản phẩm mặt nạ dưỡng da, chúng
kết hợp với các tinh chất trong mật ong, dầu ôliu, tinh dầu hoa hồng có tác dụng dưỡng
ẩm cho da, tái tạo làn da mệt mỏi, bảo vệ da khỏi các tác nhân tia tử ngoại, khói bụi,
hóa chất. Vì thế da được trẻ hóa, tươi tắn.
Dưới tác dụng của các tác nhân tia tử ngoại, thuốc nhuộm tóc, thuốc duỗi tóc, tóc
dễ bị tổn thương, chẻ ngọn, mất đi vẻ bóng mượt. Trong các sản phẩm chăm sóc tóc
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học
8
thường có bổ sung một lượng collagen hydrolysate có tác dụng bảo vệ cho tóc, phục

hồi hư tổn tóc.
Collagen còn được dùng trong điều trị phục hồi, thường được sử dụng trong
trường hợp da bị tổn thương hay giai đoạn tái tạo sau khi điều trị nám, mụn trứng cá,
sẹo, rạn da và tiêu da thừa sau khi giảm béo.

Hình 6. Một số mỹ phẩm chứa collagen
(*Nguồn: ngày 29/05/2014)
2.1.5. Sơ lƣợc về gelatin
Khi collagen được thủy phân đủ sẽ thu được một loại protein dễ tan trong nước,
được gọi là gelatin. Điều này xảy ra do sự biến tính collagen dưới tác động nhẹ của
nhiệt tạo ra gelatin mà không bị bẻ gãy các liên kết peptide (Seifter và Harper, 1971).
Quá trình này bao gồm việc dãn xoắn cuộn collagen và sắp xếp lại dạng cấu trúc Poly -
L - proline của các chuỗi peptide.
Gelatin có cấu trúc gần giống với collagen, hay phân tử gelatin là một phần trong
phân tử collagen. Cấu trúc phân tử gelatin chứa 18 acid amin liên kết với nhau theo
một trật tự xác định, tuần hoàn, tạo nên chuỗi polypeptide với khoảng 1000 đơn vị,
hình thành nên cấu trúc bậc I. Cấu trúc thường gặp của gelatin là Gly - X - Y (với X
chủ yếu là nhóm proline, còn Y là nhóm hydroxyproline). Cứ 3 chuỗi polypeptide
xoắn lại theo hình xoắn ốc tạo nên cấu trúc bậc II. Ở cấu trúc bậc III, chuỗi xoắn đó tự
xoắn quanh nó, tạo nên cấu trúc phân tử dạng dây thừng, gọi là “proto fibril”.
Trong phân tử gelatin có một số nhóm mang điện tích: carboxyl, imiazole,
amino, guanidine. Tỷ lệ các nhóm này ảnh hưởng đến pH và pI của gelatin. Ngoài ra,
số lượng nhóm không mang điện tích như các nhóm hydroxyl (serine, threonine,
hydroxyproline, hydroxylysine, tyrosine) và các nhóm peptide (- CO - NH -) quy định
khả năng tạo liên kết hydro, quy định cấu trúc phân tử.

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học
9
Bảng 3. Thành phần phần trăm các acid amin thu đƣợc khi thủy phân 100g

gelatin
Thành phần
Tỷ lệ (%)
Thành phần
Tỷ lệ (%)
Alanine
8 – 11
Lysine*
4 – 5
Arginine*
8 – 9
Methionine*
0,7 – 1
Aspartic acid
6 – 7
Phenylalanine*
2 – 3
Glutamic acid
11 – 12
Proline
15 – 18
Glycine
26 – 31
Serine
2,9 – 4,2
Histidine*
0,7 – 1
Systeine
0
Hydroxyproline

13 – 15
Threonine*
2,2 – 4,4
Hydroxylysine
0,8 – 1,2
Trytophan*
0
Isoleucine*
1,4 – 2
Tyrosine
0,2 – 1
Leucine*
3 – 3,5
Valine*
2,6 - 3,4
(*Ghi chú: *: Acid amin không thay thế)
(*Nguồn: Lodish et al., 2000))

Hình 7. Cấu trúc Gly - X - Y của phân tử gelatin
(*Nguồn: ngày 07/01/2014)
2.2. Sơ lƣợc về enzyme collagenase
2.2.1. Định nghĩa enzyme collagenase
Enzyme collagenases là enzym phá vỡ các liên kết peptide trong cấu trúc phân tử
collagen dạng Poly - L - proline đặc trưng trong vùng xoắn của collagen ở trạng thái tự
nhiên (Seifter và Harper, 1971), xúc tác quá trình thủy phân collagen.

Collagen tự nhiên + H
2
O peptides và/hoặc những đoạn dài hơn
Định nghĩa này bao gồm các enzyme có thể tác động đến vùng xoắn và chỉ cắt

chuỗi xoắn ở một liên kết peptide duy nhất cũng như các enzyme có khả năng cắt các
liên kết peptide ở các vị trí khác nhau trong vùng xoắn. Theo định nghĩa này, vị trí cắt
của các enzyme không được quy định là phải ở trong vùng không có cực hay vùng có
Enzyme collagenase
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học
10
cực của chuỗi xoắn. Như vậy, các enzyme có khả năng tác dụng trong vùng cực nằm
trong vùng xoắn của collagen cũng được xem là enzyme collagenase.
Trong hệ thống phân loại enzyme, enzyme collagenase được coi là một phân
nhóm của nhóm metalendopeptidase E.C.3.4.24.3.
2.2.2. Nguồn enzyme collagenase và một số tính chất cơ bản
Enzyme collagenase có thể được thu nhận từ các sinh nhật nhân chuẩn, cũng như
từ các sinh vật nhân sơ. Khi xem xét toàn bộ các loại enzyme collagenase được phát
hiện, có thể chia thành hai nhóm chính: nhóm thứ nhất bao gồm các enzyme thu được
từ sinh vật nhân chuẩn có chứa collagen trong cơ thể như là một cấu tử chính của mô
(các loài động vật), nhóm enzyme này được gọi là enzyme collagenase của mô và
nhóm thứ hai là các enzyme collagenase được tổng hợp từ vi sinh vật khi trong cơ thể
của chúng không chứa collagen, được gọi là enzyme collagenase của vi sinh vật
(Seifter và Harper, 1971).
2.2.2.1. Enzyme collagenase của mô
Enzyme collagenase giữ vai trò sinh lý rất quan trọng trong sự phát triển của
động vật, được tìm thấy ở da, dưới lớp biểu bì da, trong xương, sụn, trong các khối nối
bị viêm và trong các mô bị bệnh (ví dụ trong khối u ký sinh). Enzyme collagenase tồn
tại trong cơ thể dưới dạng tiền enzyme (Seifter và Harper, 1971).
Enzyme collagenase trong cơ thể động vật thường thể hiện hoạt tính theo quá
trình đổi mới các mô, tại các thời điểm xác định trong tiến trình phát triển cơ thể. Một
số loại enzyme collagenase của mô có liên quan tới cơ chế sửa chữa mô, tách các
collagen bị tổn thương và thúc đẩy sự tái sinh và làm lành vết thương.
Hầu hết các enzyme collagenase của người từ các mô khác nhau đều có đặc tính

gần tương tự nhau và tồn tại ở dạng tiềm enzyme. Năm 1981, các nhà khoa học đã tinh
chế và nghiên cứu enzyme collagenase từ da người. Năm 1986, cấu trúc bậc nhất của
enzyme này đã được xác định (Goldberg et al., 1986). Nhiều nghiên cứu về enzyme
collagenase từ da người còn được tiến hành xa với mục đích xác định các tác nhân
tổng hợp enzyme collagenase lưu trữ tại chỗ (In situ) nhằm tăng cường quá trình đổi
mới các mô bị thương (Whitham et al., 1986).
Theo Tsutsumi et al. (1998), enzyme collagenase của mô thực vật từ quả kiwi là
phát hiện gần đây nhất về enzyme collagenase. Theo tác giả, enzyme này được coi như
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học
11
một tác nhân mới để sử dụng trong quá trình làm mềm thịt cùng với các enzyme
protease khác.
Bảng 4. Một số enzyme collagenase có nguồn gốc từ mô
STT
Nguồn gốc
Cơ chất và phân tích
Đặc tính
1
Tadpole,
Rana catesbiana.
Collagen (chế biến từ da cá
dưới dạng nhầy), gelatin,
peptide tổng hợp.
pH tối ưu: pH 8,0 - 9,0; cần
có mặt ion Ca; bị ức chế bởi
EDTA, cysteine, serum.
2
Từ mô nguyên bào sợi
của chuột và của các tế

bào Hela.
Được phân tích bằng sự thủy
phân peptide; PZ-Pro-Leu-Gly-
Pro-D-Arg.OH tạo màu vàng.

3
Bạch cầu ở người, mô
nguyên thủy.
Collagen nguyên thủy (chế biến
từ da cá dưới dạng nhầy); C -
peptide giải phóng từ gel.
pH 7,6; chất ức chế EDTA,
cysteine.
4
Mô bì ở người.
Collagen nguyên thủy (chế biến
từ da cá dưới dạng nhầy); C -
peptide giải phóng từ gel; phân
tích sự ức chế của gel.
pH 7,0 - 8,0; chất ức chế
EDTA, cysteine, huyết thanh
người.
5
Từ các mô xương của
người, dê, chuột.
Collagen nguyên thủy (chế biến
từ da cá dưới dạng nhầy); C -
peptide giải phóng từ gel.
pH 7,0 - 9,0; cần Ca
2+

; chất
ức chế EDTA, cysteine.
6
Từ mô viêm màng hoạt
dịch dạng khớp của
người.
Collagen nguyên thủy (chế biến
từ da cá dưới dạng nhầy);
14
C -
peptide giải phóng từ gel.
pH 7,6; chất ức chế EDTA và
huyết thanh người.
7
Từ dạ con của chuột, mô
bì bị bệnh của người, vết
thương đang lên da non,
từ mô xương của chuột
đang lớn, chỗ viêm lợi
của người, …
Collagen nguyên thủy (chế biến
từ da cá dưới dạng nhầy); sự ức
chế gel.

8
Từ tuyến gan tụy của
Uca pugilator.
Collagen nguyên thủy (chế biến
từ da cá dưới dạng nhầy);
14

C -
peptide giải phóng từ gel.

(*Nguồn: Tô Kim Anh, 2004)
2.2.2.2. Enzyme collagenase của vi sinh vật
Trong ngân hàng dữ liệu enzyme, nhóm enzyme collagenase vi sinh vật được xếp
vào nhóm enzyme thủy phân có mã hiệu phân loại EC.3.4.24.3 mà đại diện là enzyme
collagenase của Clostridium histolyticum. Vì thế, ngoài tên gọi enzyme collagenase vi
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học
12
sinh vật chúng còn có tên gọi khác là enzyme collagenase clostridium histolyticum,
clostridiopeptidase A, enzyme collagenase A, collagenase I.
Vi sinh vật không chứa collagen nhưng trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật,
các nhà nghiên cứu đã thu được enzyme collagenase vào năm 1937 (Seifter và Harper,
1971). Dựa vào đó, có thể đưa ra nhận định sự có mặt enzyme collagenase trong môi
trường nuôi cấy do hai chức năng liên quan: chức năng liên quan tới cơ chế ký sinh
của vi sinh vật vào tế bào chủ và chức năng liên quan tới cơ chế dinh dưỡng của vi
sinh vật.
Chức năng đầu của enzyme collagenase ở các vi sinh vật thuộc giống Clotridium,
các enzyme này làm yếu và phân giải các màng chắn mô liên kết của tế bào chủ. Trong
nhiều trường hợp, tế bào chủ hỗ trợ cho chức năng này của enzyme collagenase bằng
cách sản sinh ra enzyme elastase và enzyme polysaccaridase, thậm chí cả enzyme
phospholipase, làm rối loạn các mô của màng tế bào. Hầu hết chúng đều thuộc nhóm
enzyme ngoại bào thực sự, nghĩa là chúng được tiết ra ngoài môi trường và không có
mặt trong dịch thủy phân của tế bào.
Chức năng thứ hai của enzyme collagenase thể hiện phổ biến ở đa số vi sinh vật
có khả năng sinh tổng hợp enzyme collagenase (chức năng dinh dưỡng). Enzyme
collagenase phân cắt phân tử collagen thành các đoạn peptide nhỏ hơn, tạo điều kiện
cho các enzyme peptidase phân cắt tiếp tục các đoạn peptide này thành các acid amin,

để cung cấp cho vi sinh vật.
Năm 1937, Maschmann là người đầu tiên phát hiện ra Clostridium histolyticum,
tác giả cho biết sự khác nhau giữa hoạt tính enzyme gelatinase lên collagen biến tính
và enzyme collagenase tác dụng trực tiếp lên collagen (Seifter và Harper, 1971). Tiếp
đó, nhiều tác giả liên tục công bố những công trình nghiên cứu về các chế phẩm
enzyme collagenase mà sau này được biết đến với tên gọi clostridiopeptidase A
(Seifter và Harper, 1971), clostridiopeptidase B hay enzyme collagenase A và enzyme
collagenase B, hai loại enzyme đầu tiên dưới dạng thương phẩm. Đến năm 1962, hầu
hết nghiên cứu đều tập trung vào tinh chế enzyme collagenase của C. histolyticum.
Những năm sau này, enzyme collagenase của các vi sinh vật cũng được công bố.
Điển hình là của vi sinh vật biển Vibrio B - 30 (Joseph, 1978) và Achomobacter
iophapus (Billes và Keil, 1976).
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học
13
Ngoài enzyme collagenase từ những vi sinh vật điển hình trên, còn có thể tìm
thấy enzyme collagenase từ một số vi sinh vật khác như Pseudomonas
marinoglutinosa (Hanada et al., 1973), Pseudomonas sp. (Hisano et al., 1989),
Bacillus alvei DC - 1 (Kawahara et al., 1993), Bacillus cereus (Kaulo et al., 1987),
Streptomyces sp. (Endo et al., 1987), Cytophaga sp. L43 - 1 (Sasagawa et al., 1993).
Hầu hết các vi sinh vật này được phân lập từ đất và một số từ hệ vi sinh vật biển.

Hình 8. Pseudomonas sp., C. Histolyticum và Aspergillus oryzae
(*Nguồn: ngày
29/05//2014)
Bảng 5. Một số enzyme collagenase từ một số nguồn vi sinh vật
Enzyme
Nguồn gốc
Cơ chất và phân tích
Đặc tính

Collagenase
Bacillus subtilis
Collagen không tan gelatin.
MW: 125000. Chất ức chế
EDTA, trypsine, iodoacetamide,
acid odoacetic, 2-β-
mecaptoethanol và DFP.
Collagenase
Clostridium
histolyticum
Collagen tự nhiên, 4-
phenylazobenzyloxycarbonyl
- Pro - Leu - Gly - Pro - D -
Arg. Cần có mặt của Zn, Ca.
MW: 116000.
Collagenase
Vi khuẩn biển
Vibrio B - 30
Collagen tự nhiên, peptide
tổng hợp. Cần có mặt của ion
kim loại.
MW: 105000 (từ các tiểu phần có
trọng lượng là 24 và 28 kDa).
Collagenase
A
Clostridium
histolyticum
Collagen, gelatin, peptide
tổng hợp: Z-Gly-Pro-Gly-
Gly-Pro-Ala.OH.

MW: 105000. Phụ thuộc Ca, cần
Zn. Sản phẩm phân cắt cơ chất
tạo ra các peptide đầu NH
2
-Gly.
Collagenase
B
Clostridium
histolyticum
Gelatin; không thủy phân
collagen; có thể thủy phân
peptide tổng hợp: Z-Gly-Pro-
Gly-Gly-Pro-Ala.OH.
MW: 57400. Phụ thuộc Ca, cần
Zn. Sản phẩm phân cắt cơ chất
tạo ra các peptide đầu NH
2
-Gly.
Pleudocolla
Clostridium
Gelatin; không thủy phân

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ sinh học Viện NC&PT Công nghệ sinh học
14
- genase
histolyticum
collagen; có thể thủy phân
peptide tổng hợp: Z-Gly-Pro-
Gly-Gly-Pro-Ala.OH.

Collagenase
Aspergillus
oryzae
Hemoglobin, peptide tổng
hợp, N-acetyl Tyrosine
ethyiester, gelatin, collagen
nguyên thủy (chế biến từ da
cá dưới dạng nhầy).
MW: 20000. Hoạt động không
cần ion kim loại, pH tối ưu là 9,0
-10.
(*Nguồn: Tô Kim Anh, 2004)
2.2.3. Một số tính chất của enzyme collagenase
2.2.3.1. Kích thước và cấu trúc phân tử enzyme collagenase
Enzyme collagenase là những protein có kích thước phân tử lớn và cấu trúc phân
tử không giống nhau. Ngày nay, dựa vào tiến bộ khoa học, phương pháp xác định cấu
trúc phân tử của enzyme là phương pháp điện di trên SDS - PAGE (Sodium Dodecyl
Sulfate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis) hoặc phương pháp lọc gel được tiến
hành khi enzyme ở dạng tinh khiết.
Cấu trúc phân tử enzyme collagenase có thể được hình thành bởi các đơn vị.
Enzyme collagenase A có kích thước phân tử 100kDa được phát hiện có 4 đơn vị
không có hoạt tính enzyme với tổng trọng lượng mỗi phần là 25kDa (Seifter và
Harper, 1971), Vibrio B có 30 đơn vị, bao gồm 2 đơn vị có kích thước phân tử không
giống nhau 24kDa và 28kDa (Merkel và Dreisbach, 1975). Một số enzyme collagenase
vi sinh vật cũng như enzyme collagenase của mô tồn tại dưới dạng isozyme như phức
hợp enzyme collagenase của C. histolyticum:


- enzyme collagenase (68kDa),


-
enzyme collagenase (115kDa),


- enzyme collagenase (79kDa),

- enzyme
collagenase (110kDa),

- enzyme collagenase (125kDa),

- enzyme collagenase
(100kDa) (Bond và Van Wart, 1984). Aspergillus alginoliticus chứa ba dạng isozyme
có kích thước phân tử khác nhau là 110kDa, 90kDa và 70kDa (Tsugita et al., 1986).
Trong môi trường nuôi cấy của Streptomyces sp. các nhà khoa học cũng phân tách
được hai dạng isozyme có trọng lượng phân tử gần giống nhau là 90kDa và 90kDa -
110kDa (Endo et al., 1987).
2.2.3.2. Độ bền của enzyme
Phần lớn các enzyme collagenase được phát hiện có khoảng pH hoạt động ở
khoảng trung tính hoặc hơi kiềm (pH 7,0 - 8,0). Tuy nhiên, khả năng hoạt động của