ứng dụng phương pháp arisa (automated ribosomal intergenic spacer analysis) trong phân tích sự biến động và đa dạng của cộng đồng vi khuẩn sống tự do ở vịnh tachibana theo thời gian

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC





LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC


ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP ARISA (AUTOMATED
RIBOSOMAL INTERGENIC SPACER ANALYSIS)
TRONG PHÂN TÍCH SỰ BIẾN ĐỘNG VÀ ĐA DẠNG
CỦA CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN SỐNG TỰ DO Ở VỊNH
TACHIBANA THEO THỜI GIAN


CÁN B NG DN SINH VIÊN THC HIN
PGS.TS. NGÔ THỊ PHƢƠNG DUNG NGUYÊ
̃
N THI
̣
ĐÔ
̃
QUYÊN
PGS. TS. WADA MINORU MSSV: 3092435
LỚP: CNSH TT K35

Cần Thơ, 09/2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC





LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP ARISA (AUTOMATED
RIBOSOMAL INTERGENIC SPACER ANALYSIS)
TRONG PHÂN TÍCH SỰ BIẾN ĐỘNG VÀ ĐA DẠNG
CỦA CỘNG ĐỒNG VI KHUẨN SỐNG TỰ DO Ở VỊNH
TACHIBANA THEO THỜI GIAN

CÁN B NG DN SINH VIÊN THC HIN
PGS.TS. NGÔ THỊ PHƢƠNG DUNG NGUYÊ
̃
N THI
̣
ĐÔ
̃
QUYÊN
PGS. TS. WADA MINORU MSSV: 3092435
LỚP: CNSH TT K35

Cần Thơ, 09/2014


PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN




PGS.TS. NGÔ TH  








DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2014 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC và PT Công nghệ Sinh học
LỜI CẢM TẠ

Lut nghii hc là ct mu s phát trin v mt kin thc
và k  hoàn thành tt, sinh viên cn phi vn dng tt c các
kin thc và hiu bic trong sut quá trình hc tp. Chính vì vy,
tôi vô cùng trân trng nhng kin thc ti Vin NC
và PT Công ngh Sinh hc-i hc Cc tp ti
ng Nagasaki, Nht Bn. Tôi xin gi nhng li cn vi:
Cha m, nhnn vng nghiên
cu khoa hc vô cùng b ích này.
Thng dy và to lp nn tng kin thc vng chc cho tôi trong
sui hc.
Cô Ngô Th    y Wada Minoru (Khoa Thy S i hc
Nagasaki, Nht Bn) là cán b ng dn thc hin lu  a tôi. Cô và thy
không ch ging dy v lý thuyt mà còn truyn vn kinh nghim thc hành vô cùng
quý báu cho tôi trong quá trình thc hin lu
Thy Hunh Xuân Phong là c vn hc tp ca l
tôi trong quá trình hc tp
Cui cùng, xin ct c các bn cùng làm vic trong phòng thí nghim
Thc Phn làm vic trong Khoa Thy Si hc Nagasaki, Nht
B  tôi trong sut quá trình thc hin lun

Cần Thơ, ngày 12 tháng 08 năm 2014
Sinh viên thc hin
Nguyê

̃
n Thi
̣
Đô
̃
Quyên
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2014 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC và PT Công nghệ Sinh học
TÓM LƢỢC
Sự tương tác phức tạp của các yếu tố không gian và thời gian gây tác động
mạnh mẽ đến cấu trúc và chức năng của quần xã vi khuẩn sống tự do trong môi
trường biển. Luận văn này đã đề cập trực tiếp đến sự biến động của cộng đồng vi
khuẩn sống tự do tại vịnh Tachibana, Nhật Bản bằng cách ứng dụng phương pháp
Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis (ARISA). Các mẫu DNA của vi
khuẩn được thu thập và lưu trữ từ mùa xuân đến đầu mùa hè (tháng tư, tháng năm, và
tháng sáu) trong khoảng thời gian từ năm 2009 đến năm 2012, đã được sử dụng cho
nghiên cứu này. Trong số các yếu tố được phân tích như tháng, năm và độ sâu, thì
năm được xem là nhân tố quan trọng nhất trong việc làm biến động quần xã vi khuẩn
sống tự do (ANOSIM, Global R = 0.422, p = 0,1%). Đặc biệt, các tháng trong năm
2011 (ANOSIM, Global R = 0,969, p = 2,9%) đã có tác động đáng kể vào sự thay đổi
của quần xã vi khuẩn. Bên cạnh đó, tùy thuộc vào từng năm, các đoạn ribosomal ITS
như 234 bp, 235 bp, 215 bp hoặc 216 bp chiếm tỷ lệ cao nhất trong toàn bộ cấu trúc
quần xã. Trong bốn năm (2009-2012), hai đoạn ribosomal ITS 234 bp (được cho là có
nguồn gốc từ Pseudomonas) và 216 bp (được cho là có nguồn gốc từ Actinobacteia)
chiếm ưu thế nhất vì tần suất xuất hiện trong toàn bộ cấu trúc quần xã rất cao. Vì thế,
cả hai chi vi khuẩn được xem có vai trò quan trọng trong môi trường biển.
Từ khóa: ARISA, Actinobacteia, Pseudomonas, ribosomal ITS


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2014 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC và PT Công nghệ Sinh học
MỤC LỤC

Trang
KÝ TÊN HỘI ĐỒNG
LỜI CẢM TẠ i
TÓM LƢỢC ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC BẢNG v
DANH MỤC HÌNH vi
CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU 1
t v 1
1.2. M tài 2
CHƢƠNG 2. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
2.1. Bin Ariake và vnh Tachibana 3
2.2. Qun xã vi khun sng t ng bin (Zhang et al., 2007) 4
2.3. Vùng 16S  23S rDNA (ribosomal intergenic spacer regions (rITS)) 5
 7
     ntergenic spacer analysis (ARISA)
(Brown et al., 2005) 7
CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 9
3.1 Nguyên vật liệu 9
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 11
3.2.1. Quy trình chung 11
3.2.2. ARISA-PCR 11
3.2.3. ARISA sc nhit 12
3.2.4. Phân tích DNA ca mu 12
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 13
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2014 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC và PT Công nghệ Sinh học

4.1. ng ca s  n s bing qun xã vi khun 
bin 13
4.2. ng c-n s bing qun xã vi khun 
bin 13
4.3. ng c n s bing qun xã vi khun  bin 14
4.4. ng ca 2 nhân t  sâu) ca mn s bing
qun xã vi khun  bin 15
4.5. a dng chin rITS và s bing v s ng trong mi mu 20
4.6. Nhi ca nhn rITS quan trng trong tn 25
4.7. Nhi ca nhn rITS quan trng nh 27
CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 30
5.1. Kết luận 30
5.2. Đề nghị 30
TÀI LIỆU THAM KHẢO 31
PHỤ LỤC PL-1
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2014 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC và PT Công nghệ Sinh học
DANH MỤC BẢNG
Trang
Bng 1. Mc bin  m nghiên cu A6 10
Bng 2. Các thành phn và s ng cho mt phn ng PCR 11
Bng 3. Các thành phn và s ng cho mt phn ng ARISA sc nhit 12
Bng 4. Tp hp nhn rITS quan trng nht ca mi mu 24






Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2014 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC và PT Công nghệ Sinh học
DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1. Bin Ariake 3
Hình 2. Vnh Tachibana 4
Hình 3. Nhóm vi khun sng sng t do (trái) và nhóm sng c nh (phi) 5
Hình 4. S sp xp các vùng chi rITS 6
 8
Hình 6. Quy trình chung 11
Hình 7. Cluster và MDS diagrams phng nhau ca 24 mu.
(ANOSIM, Global R=0.085, p=11.4%, Stress = 0.07) 13
Hình 8. Cluster và MDS diagrams phng nhau ca 24 mu.
(ANOSIM, Global R=0.422, p=0.1%, Stress = 0.07) 14
Hình 9. Cluster và MDS diagrams phng nhau ca 24 mu.
(ANOSIM, Global R= -0.151, p=99.4%, Stress = 0.07) 15
Hình 10. Cluster và MDS diagrams phng nhau ca 5 mu.
(ANOSIM, Global R= 0.188, p= 33.3%, stress = 0) 15
Hình 11. Cluster và MDS diagrams phng nhau ca 5 mu.
(ANOSIM, Global R= 0, p= 60%, stress = 0) 16
Hình 12. Cluster và MDS diagrams phng nhau ca 4 mu.
(ANOSIM, Global R= 1, p= 33.3%, stress = 0) 17
Hình 13. Cluster và MDS diagrams phng nhau ca 4 mu.
(ANOSIM, Global R= -0.5, p= 100%, stress = 0) 17
Hình 14. Cluster và MDS diagrams phng nhau ca 8 mu.
(ANOSIM, Global R= 0.969, p= 2.9%, stress = 0) 18
Hình 15. Cluster và MDS diagrams phng nhau ca 8 mu.
(ANOSIM, Global R= -0.479, p= 90.5%, stress = 0) 18
Hình 16. Cluster và MDS diagrams phng nhau ca 7 mu.
(ANOSIM, Global R= -0.009, p= 45.7%, stress = 0) 19
Hình 17. Cluster và MDS diagrams phng nhau ca 7 mu.

(ANOSIM, Global R= -0.074, p= 57.1%, stress = 0) 20
Hình 18. S ng các chin rITS và s bing v s ng trong mi
mu  2009 20
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2014 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vii Viện NC và PT Công nghệ Sinh học
Hình 19. S ng các chin rITS và s bing v s ng trong mi
mu  21
Hình 20. S ng các chin rITS và s bing v s ng trong mi
m1 22
Hình 21. S ng các chin rITS và s bing v s ng trong mi
mu  2012 23
Hình 22. Nhi ca nhn rITS quan tr 25
Hình 23. Nhi ca nhn rITS quan tr 26
Hình 24. Nhi ca nhn rITS quan tr 26
Hình 25. Nhi ca nhn rITS quan trng  2012 27
Hình 26. Nhi ca nhn rITS quan trng nh 28

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2014 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 1 Viện NC và PT Công nghệ Sinh học
CHƢƠNG I. GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Theo Fisher và Tripplet (1991)     
Spacer Analysis (ARISA) là mt k thut mi trong vic phân tích DNA. Chiu dài
ca vùng Intergenic Transcibed Spacer (ITS) gia các gen 16S -23S rDNA vc
a các sinh v. a trên s không
ng nht chiu dài này bng cách s dng PCR nhm khu i toàn b vùng
Intergenic Transcibed Spacer (ITS) v a các loài vi sinh vt hin
din trong m        
c bit là trong vic ly trích DNA và phn ng PCR,
mi oligonucleotide huc s dc thc hin

vi mt h thng laser t ng nhm phát hin DNA hunh quang. Trong
quá kh, ARISA ch c s d hin th s ng ca các vi sinh vt,
, nó c ng d phân tích s ng vi sinh vt trong nhiu
c, bao gm c ng bin.
Bin Ariake nói chung và vc xem là mt trong nhng
vùng bin giàu ti ca tnh Nagasaki. Các vùng bin này ni ting vi
nhiu bãi bùn ln nht Nht Bn nh vào s ng ln các con sông mang theo mt
ng cát khng l ra bin. Vì s bi ca thy tri,
 là nhng bãi bùn vi nhiu chng loi cá, tôm hùm và ngc trai, mà còn
p cho vic trng rong bin vi s ng ln.
Do nhng giá tr v kinh t      n, bin Ariake và vnh
 chú ý ca nhiu nhà khoa hc trên khp Nht Bnc bit là
i hc Nagasaki. Có th nói rng lut phn trong nhng d án khoa
hc "Phân tích cu trúc qun xã vi khun sng t do  bin Ariake b
ARISA, Cloning và Flow Cytometry". Lup trung vào cu trúc qun xã
vi khun sng t dotra hóa  .
Bin Ariake có nhi m ly mu quan tr  , A11, A15, và C9. Tt c
c nghiên cu v qun xã vi khun t n nay. , A6
( 32,6
o
 130.033
o
), nm  vnh Tachibana, c xem là mt trong nhng
m nghiên cng nht vì ít chng ca microplankton c
sinh vt bin khác (Ohta, 2013).
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2014 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 2 Viện NC và PT Công nghệ Sinh học
1.2. Mục tiêu đề tài
Bng k thut ARISA, phân tích s bing ca cng vi khun
sng t do  vnh Tachibana trong 3 tháng liên ti

sáu) trong khong thi gian b-2012).