so sánh phương pháp điều chế và ảnh hưởng của keratin thủy phân lên các dạng tóc hư tổn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC





LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC TIÊN TIẾN





SO SÁNH PHƢƠNG PHÁP ĐIỀU CHẾ VÀ ẢNH HƢỞNG
CỦA KERATIN THỦY PHÂN LÊN CÁC DẠNG TÓC HƢ TỔN





CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
TS. BÙI THỊ MINH DIỆU TRẦN MINH TRANG
MSSV: 2102406
LỚP: CNSHTT K36

Cần Thơ, Tháng 11/2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC





LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC TIÊN TIẾN





SO SÁNH PHƢƠNG PHÁP ĐIỀU CHẾ VÀ ẢNH HƢỞNG
CỦA KERATIN THỦY PHÂN LÊN CÁC DẠNG TÓC HƢ TỔN





CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

TS. BÙI THỊ MINH DIỆU TRẦN MINH TRANG
MSSV: 2102406
LỚP: CNSHTT K36






Cần Thơ, Tháng 11/2014

PHẦN KÝ DUYỆT


CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN




Bùi Thị Minh Diệu Trần Minh Trang


DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG










LỜI CẢM TẠ
Trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp, ngoài sự cố gắng, nỗ lực của
bản thân, tôi còn nhận được sự giúp đỡ và động viên từ nhiều phía. Tôi xin gửi những
lời cám ơn chân thành nhất của mình đến:
Ban Lãnh đạo, quý Thầy, Cô – Viện Nghiên cứu & Phát triển Công nghệ Sinh
học đã tận tình giảng dạy truyền đạt kiến thức, hỗ trợ về cơ sở vật chất, trang thiết bị
và tạo điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn.
Cô Huỳnh Hương Liên, Thầy Trần Sỹ Nam, đặc biệt là TS. Bùi Thị Minh Diệu
- giáo viên hướng dẫn và cô Trần Thị Xuân Mai - cố vấn học tập khóa 36 đã tận tình
chỉ dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn.
Các bạn cùng khóa, các anh chị và các bạn làm việc trong phòng thí nghiệm
Sinh học Phân tử Thực vật, phòng thí nghiệm Protein & enzyme đã tạo điều kiện về
các trang thiết bị và chia sẻ kinh nghiệm cho tôi.
Cô Thảo – chủ tiệm tóc, các bạn: Nguyệt, Như, Thuyền đã hỗ trợ tôi trong việc
tìm và xử lý mẫu tóc.
Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn sự giúp đỡ, động viên của gia đình về tinh thần
và vật chất để tôi hoàn thành khóa học, cũng như đề tài luận văn tốt nghiệp.
Kính chúc quý Thầy Cô, các Anh Chị và các bạn được dồi dào sức khỏe và
thành công trong cuộc sống.

Xin trân trọng cảm ơn!.
Cần Thơ, ngày tháng năm 2014
Sinh viên thực hiện


Trần Minh Trang

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến i Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học
TÓM LƢỢC
Một lượng lớn chất thải lông từ ngành công nghiệp chế biến thịt gia súc, gia cầm
đã gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường. Vì vậy, việc xử lý và tái sử dụng chất
thải từ lông một cách hiệu quả đang là vấn đề cấp bách cần được giải quyết. Đã có
nhiều nghiên cứu về việc thủy phân lông tạo thành keratin thủy phân, một trong những
protein hòa tan quan trọng để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi. Bên cạnh đó, ứng dụng
keratin thủy phân vào các sản phẩm chăm sóc da, tóc cũng đang được quan tâm
nghiên cứu. Đề tài ” So sánh phương pháp điều chế và ảnh hưởng của keratin thủy
phân lên các dạng tóc hư tổn” được nghiên cứu để so sánh khả năng phân hủy bột
lông tạo ra keratin thủy phân giữa vi khuẩn (2 dòng vi khuẩn Bacillus megaterium
VL2, Bacillus cereus K13) và enzyme bromelain; đồng thời so sánh ảnh hưởng của
keratin thủy phân lên sự hồi phục của các dạng tóc hư tổn (tóc duỗi, tóc nhuộm, tóc
uốn, tóc cháy).
Kết quả của đề tài cho thấy khả năng phân hủy và hàm lượng keratin thủy phân
tạo ra từ sự phân hủy của dòng vi khuẩn Bacillus megaterium VL2 trong 7 ngày đạt
cao nhất (71,85%; 112,404 mg) và khác biệt so với enzyme bromelain (46,76%;
71,485 mg).
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của keratin thủy phân lên các dạng tóc hư tổn cho
thấy tóc duỗi, tóc nhuộm và tóc cháy có sự phục hồi rõ rệt khi ngâm trong keratin thủy
phân bởi vi khuẩn so với đối chứng (-); và không khác biệt nhiều so với đối chứng (+).

Khi ngâm các mẫu tóc trên với keratin thủy phân bởi enzyme bromelain thì tóc hầu
như không có sự phục hồi. Tuy nhiên, với mẫu tóc bình thường và mẫu tóc uốn thì
không có sự khác biệt nhiều so với đối chứng (-). Như vậy, keratin thủy phân được tạo
ra từ chất thải lông bị phân hủy bởi vi khuẩn có tiềm năng ứng dụng trong các sản
phẩm chăm sóc tóc hư tổn.
Từ khóa: enzyme, keratin thủy phân, tóc hư tổn, vi khuẩn





Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến ii Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học
MỤC LỤC
PHẦN KÝ DUYỆT
LỜI CẢM TẠ
TÓM LƢỢC i
MỤC LỤC ii
DANH SÁCH BẢNG iv
DANH SÁCH HÌNH v
TỪ VIẾT TẮT vi
CHƢƠNG I. GIỚI THIỆU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu đề tài 1
CHƢƠNG II. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2
2.1. Sơ lược về chất thải chứa keratin 2
2.2. Tổng quan về keratin 3
2.3. Vi sinh vật phân hủy keratin 5
2.4. Cấu trúc của tóc 8

2.5. Sơ lược về keratin thủy phân dưỡng tóc 9
2.6. Một số nghiên cứu về keratin thủy phân 9
CHƢƠNG III. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13
3.1. Phương tiện 13
3.1.1. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm…………………………………………….13
3.1.2. Vật liệu thí nghiệm……………………………………………………… 13
3.1.3. Hóa chất……………………………………………………………………14
3.1.4. Địa điểm thí nghiệm……………………………………………………….15
3.1.5. Thời gian thực hiện……………………………………………………… 15
3.2. Phương pháp nghiên cứu 15
3.2.1. Thu mẫu và chuẩn bị mẫu vi khuẩn giống…………………………………15
3.2.2. Chuẩn bị cơ chất……………………………………………………… ….16
3.2.3. Điều chế keratin thủy phân từ vi khuẩn phân giải keratin…………………16
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến iii Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học
3.2.4. Điều chế keratin thủy phân bằng phương pháp sinh hóa………………… 18
3.2.5. Khảo sát khả năng hồi phục của tóc hư tổn khi bổ sung keratin thủy phân.18
3.2.6. Chỉ tiêu theo dõi………………………………………………………….20
2.2.7. Phương pháp xử lý số liệu…………………………………………………23
CHƢƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24
4.1. Điều chế keratin thủy phân từ vi khuẩn phân giải keratin 24
4.1.1. Khảo sát khả năng phân hủy cơ chất của vi khuẩn và hàm lượng protein hòa
tan sinh ra…………………………………………………………………………24
4.1.2. Định tính các acid amin chứa lưu huỳnh trong keratin thủy phân thô từ vi
khuẩn phân giải keratin………………………………………………………… 28
4.2. Điều chế keratin thủy phân bằng phương pháp sinh hóa 29
4.2.1. Khả năng phân hủy cơ chất của enzyme và hàm lượng protein hòa tan sinh
ra………………………………………………………………………………….29
4.2.2. Định tính các acid amin chứa lưu huỳnh trong keratin thủy phân thô từ

enzyme……………………………………………………………………………30
4.3. Khảo sát khả năng hồi phục của tóc hư tổn khi bổ sung keratin thủy phân 30
4.3.1. Đánh giá cảm quan……………………………………………………… 31
4.3.2. Độ ẩm của tóc…………………………………………………………… 35
4.3.3. Cấu trúc của tóc……………………………………………………………38
CHƢƠNG V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40
5.1. Kết luận 40
5.2. Đề nghị 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO 41
PHỤ LỤC





Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến iv Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1. Nguồn gốc của một số chủng vi khuẩn phân hủy lông 6
Bảng 2. Thành phần hóa chất trong môi trường đặc 14
Bảng 3. Thành phần hóa chất trong môi trường lỏng 14
Bảng 4. Thành phần hóa chất trong môi trường tăng sinh khối 15
Bảng 5. Xây dựng đường chuẩn bradford. 21
Bảng 6. Khả năng phân hủy các loại cơ chất của 2 dòng vi khuẩn và hàm lượng protein
hòa tan sinh ra sau 7 ngày nuôi cấy. 24
Bảng 7. Khả năng phân hủy và hàm lượng protein hòa tan sinh ra khi cho bromelain
phân hủy bột lông gà. 29
Bảng 8. Đánh giá cảm quan độ bóng của tóc. 31
Bảng 9. Đánh giá cảm quan màu sắc của tóc. 32

Bảng 10. Đánh giá cảm quan độ suông và mềm mượt của tóc. 34
Bảng 11. Độ ẩm của tóc khi ngâm các mẫu tóc vào keratin thủy phân. 36















Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến v Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học
DANH SÁCH HÌNH
Hình 1. Cấu trúc của keratin. 3
Hình 2. Mô hình của α-keratin, β-keratin và cầu nối disulfide. 4
Hình 3. Cấu trúc của tóc 8
Hình 4. Biểu đồ ảnh hưởng của sự tương tác giữa chủng vi khuẩn và cơ chất đến tỉ lệ
phân hủy. 26
Hình 5. Biểu đồ ảnh hưởng của sự tương tác giữa chủng vi khuẩn và cơ chất đến hàm
lượng protein hòa tan sinh ra. 27
Hình 6. Dung dịch keratin thủy phân từ vi khuẩn trước và sau phản ứng folia 28
Hình 7. Dung dịch keratin thủy phân từ enzyme trước và sau phản ứng folia 30

Hình 8. Biểu đồ ảnh hưởng của sự tương tác giữa mẫu tóc và keratin thủy phân đến độ
ẩm của tóc. 37
Hình 9. Cấu trúc của tóc chụp sem 39
















Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến vi Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học
TỪ VIẾT TẮT
- SEM: Scanning Electron Microscope
- CV: Coefficient of Variation

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT


Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 1 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học
CHƢƠNG I. GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Cùng với quá trình đô thị hóa là sự gia tăng nhanh chóng các ngành công nghiệp,
trong đó, ngành công nghiệp chế biến thịt gia súc, gia cầm đã tạo ra một lượng lớn
chất thải như lông, phân da,… gây ô nhiễm môi trường. Bên cạnh sự quan tâm đến bảo
vệ và cải thiện môi trường, nhu cầu tăng lên đối với việc bảo tồn và tái chế năng lượng
đã thúc đẩy mạnh mẽ việc tìm kiếm các lựa chọn cho sự kiểm soát các chất thải chứa
keratin. Vì vậy, việc xử lý nguồn chất thải này bằng các phương pháp vật lý, hóa học,
vi sinh vật,… đang là mối quan tâm hàng đầu của các nhà khoa học. Bên cạnh đó, việc
này đã thúc đẩy việc nghiên cứu những phương pháp để chuyển đổi chất thải keratin
thành các sản phẩm có giá trị như thức ăn chăn nuôi, mỹ phẩm, thuốc,…

Mỹ phẩm chăm sóc da, tóc là một trong những ứng dụng quan trọng của chất thải
keratin sau khi đã chuyển đổi thành keratin thủy phân. Keratin được thủy phân thành
những protein ngắn hoặc các amino acid thiết yếu để bổ sung, chăm sóc và phục hồi
tóc hư tổn. Hầu hết các keratin dùng trong mỹ phẩm được thông qua quá trình thủy
phân hóa học và phương pháp thủy nhiệt. Vi sinh vật cũng có thể phân hủy keratin để
tạo nguồn protein có giá trị, đồng thời giảm ô nhiễm môi trường và mang lại hiệu quả
kinh tế. Vì vậy, đề tài “So sánh phương pháp điều chế và ảnh hưởng của keratin thủy
phân lên các dạng tóc hư tổn” được thực hiện góp phần làm phong phú và tạo triển
vọng cho việc ứng dụng sản phẩm này vào thực tiễn.
1.2. Mục tiêu đề tài
Đề tài được thực hiện với mục tiêu so sánh phương pháp điều chế và ảnh hưởng
của keratin thủy phân lên các dạng tóc hư tổn.






Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT


Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 2 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học
CHƢƠNG II. LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Sơ lƣợc về chất thải chứa keratin
Theo Worldwatch Institute, năm 2007, sản lượng gia cầm trên thế giới đã được
dự kiến đạt 93 triệu tấn, tăng 4% so với năm 2006. Sản lượng thịt lợn năm 2007 dự
kiến tăng gần 2%, đạt 101 triệu tấn. Theo đó, lông gia cầm, gia súc tích tụ lại thành
chất thải gây ô nhiễm môi trường, nhất là trong điều kiện ngành chăn nuôi toàn cầu
đang phát triển mạnh mẽ. Lông là chất thải giàu keratin phần lớn được thải ra bởi các
ngành công nghiệp chế biến thịt gia súc, gia cầm. Hằng năm, các nhà máy chế biến

trên toàn thế giới thải ra hàng triệu tấn lông, trong đó keratin chiếm gần 90% trọng
lượng lông (Brandelli, 2008). Lông gia súc, gia cầm thải ra ngày càng nhiều, đặt ra yêu
cầu phải xử lý tốt loại chất thải này. Lông được thủy phân bằng cách xử lý cơ học hoặc
hóa học. Hầu hết chất thải lông được chôn dưới đất hoặc bị đốt cháy rất tốn chi phí và
có thể gây ra ô nhiễm không khí, đất và nước. Cách truyền thống để phân hủy lông
như thủy phân bằng kiềm và áp suất hơi nước không chỉ phá hủy các amino acid
(methionin, lysine, histidine) mà còn tiêu thụ một lượng lớn năng lượng (Cai et al.,
2008; Cortezi et al., 2008). Một số vi khuẩn đã được phân lập từ đất và chất thải gia
cầm, gia súc cho thấy tiềm năng sử dụng trong các quá trình thủy phân keratin.
Phương pháp sử dụng vi sinh vật phân hủy keratin trong lông, tóc không tiêu tốn quá
nhiều năng lượng và thân thiện với môi trường. Đồng thời, phương pháp này còn tiết
kiệm được nguồn protein có giá trị dinh dưỡng cao để tạo thành các sản phẩm có ích
cho con người.
Keratin được phân hủy bởi vi khuẩn có ứng dụng quan trọng trong quá trình công
nghệ sinh học liên quan đến xử lý chất thải chứa keratin từ ngành công nghiệp chế
biến thịt gia súc, gia cầm. Vi sinh vật được chủng vào có thể chuyển đổi chất thải lông
thành thức ăn dễ tiêu hóa cho gia cầm, gia súc và cá; hoặc khí metan và nhiên liệu để
sưởi ấm (Ichida et al., 2001). Sau khi thủy phân bằng enzyme keratinase thì keratin
không hòa tan được chuyển thành thức ăn chăn nuôi, phân bón, keo,… hoặc được sử
dụng để sản xuất các amino acid hiếm như serine, cystein và proline (Papadopoulos et
al., 1986; Onifade et al., 1998; Gupta và Ramnani, 2006). Ngoài ra, nó còn có thể được
áp dụng cho xử lý chất thải, dệt may, dược phẩm, mỹ phẩm, da,… Như vậy, chất thải
giàu keratin khó phân huỷ như lông, tóc, móng, sừng là sản phẩm phụ được đánh giá
cao của chế biến nông – công nghiệp. Điều này làm cho tái chế lông một chủ đề quan
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT


Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 3 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học
tâm trong dinh dưỡng động vật, vì tiềm năng của nó như là một loại thức ăn giá rẻ giàu
protein dành cho gia súc và gia cầm.

2.2. Tổng quan về keratin
Keratin là một loại protein dạng sợi và được biết đến với sự ổn định cao trong
môi trường (Bradbury, 1973). Đây là vật liệu cấu trúc quan trọng, thành phần chính
tạo nên lớp biểu bì bên ngoài như da, tóc, lông, móng,… Các monome keratin lắp ráp
thành bó để tạo thành sợi trung gian. Các sợi này bền, dai, không hòa tan và tạo thành
các mô không bị khoáng hóa. Thành phần và cấu hình phân tử của các amino acid
trong keratin đảm bảo cấu trúc cứng cáp của nó. Ít nhất 30 polypeptide keratin khác
nhau được biết đến, thuộc 2 họ tiến hóa được chỉ định loại I và loại II (Brandelli,
2008). Chuỗi keratin được đóng gói chặt chẽ trong các xoắn α (α-keratin) hoặc tấm β
(β-keratin) thành một chuỗi polypeptide siêu xoắn (Parry và North, 1998; Kreplak et
al., 2004), dẫn đến sự ổn định cơ học cao và sức đề kháng chống lại các enzyme phân
giải protein phổ biến như pepsin, trypsin và papain (Hoq et al., 2005; Gradišar et al.,
2005). Đây là một trong những đặc điểm chính của keratin phụ thuộc vào liên kết
disulfide và liên kết hydro giữa các polypeptide và sự tương tác kỵ nước (Brandelli,
2008) và ổn định của các siêu cuộn, liên kết muối và các liên kết khác (Bockle và
Muller, 1997; Lin et al., 1999; Gessesse et al., 2003). Ngoài ra, keratin được phân loại
thành keratin "cứng" hay "mềm" dựa theo hàm lượng lưu huỳnh cao hay thấp. Keratin
cứng như tóc, sừng, móng tay,… ít mềm dẻo hơn so với keratin mềm như da người và
mô sẹo, bởi vì liên kết disulfide chống biến dạng (Gupta và Ramnani, 2006).








Hình 1. Cấu trúc của keratin.
(Nguồn: 30/5/2014)
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 4 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học
- Các α-keratin có trong tóc, lông, sừng, móng tay, móng vuốt và móng của động
vật có vú. Tóc và các α-keratin bao gồm các sợi đơn α-helically protein liên kết
với nhau bằng liên kết hydro (Voet và Voet, 1995).
- Các β-keratin cứng hơn được tìm thấy trong móng tay và móng vuốt, vảy của
loài bò sát, loài có mai hoặc vỏ (rùa, đồi mồi), và trong lông, mỏ, móng vuốt
của chim và lông của nhím (keratin được hình thành chủ yếu trong các tấm
beta. Tuy nhiên, các tấm beta cũng được tìm thấy trong α-keratin) (Kreplak et
al., 2004). Các beta keratin là sự sắp xếp phản song song và song song của các
chuỗi liên kết thông qua liên kết hydro. Các β-keratin của loài bò sát và các loài
chim có tấm β nếp gấp xoắn lại với nhau, sau đó ổn định và làm cứng bằng cầu
disulfide.






Hình 2. Mô hình của α-keratin, β-keratin và cầu nối disulfide.
(Nguồn:
30/5/2014)
Ngoài việc liên kết hydro trong nội bộ và giữa các phân tử, keratin có số lượng
lớn amino acid cysteine chứa lưu huỳnh cần thiết cho các cầu nối disulfide. Các cầu
nối này làm tăng thêm sức mạnh và độ cứng lâu dài, ổn định của keratin. Mùi hăng khi
đốt tóc là do các hợp chất lưu huỳnh được hình thành. Các liên kết disulfide góp phần
làm cho keratin không tan, ngoại trừ trong sự phân ly hoặc có tác dụng của chất khử.
Các keratin trong tóc có tính linh hoạt và đàn hồi hơn là do có ít cầu nối disulfide hơn
so với keratin trong móng tay của động vật có vú, móng guốc và móng vuốt (tương

đồng cấu trúc). Ngoài ra, liên kết chéo của các chuỗi protein bởi cầu nối cysteine làm
cho ổn định cơ học cao và khả năng chống sự phân giải keratin (Brandelli, 2008). Các
sợi keratin có nhiều trong các tế bào sừng được tìm thấy trong cấu trúc của các dạng
biểu bì như lông, móng, tóc, mô và sừng của động vật có vú, động vật lưỡng cư, bò sát
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT


Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 5 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học
và các loài chim. Chất thuộc sinh học khác được biết đến có độ bền xấp xỉ của mô
keratinized là chitin (Vincenta et al., 2004; Tombolato et al., 2010).
2.3. Vi sinh vật phân hủy keratin
Keratin không tích lũy trong tự nhiên và có thể được thủy phân của một số vi
sinh vật. Keratinase là enzyme thủy phân keratin được sản xuất từ nấm, xạ khuẩn và vi
khuẩn được phân lập từ đất có chứa keratin (Kaul và Sumbali, 1997; Riffel và
Brandelli, 2006). Trong số các loại nấm sản xuất keratinase, dermathophytes được đặc
biệt mô tả và được phân lập từ vết thương của con người và động vật. Keratinase sản
xuất từ Microsporum, Trychophyton và Doratomyces microsporum được mô tả bởi
(Kushwaha, 1983; Grzywnowicz et al., 1989; Gradisar et al., 2000). Chủng Aspergillus
fumigatus và Aspergillus flavus sản xuất keratinase được mô tả bởi (Santos et al.,
1996). Trong số các loài vi khuẩn, hoạt động thủy phân keratin đã được ghi nhận rộng
rãi cho các chủng từ chi Bacillus và Streptomyces (Lin et al., 1999; Kim et al., 2001;
Bressolier et al., 1999). Một số Streptomyces sản xuất keratinase được phân lập từ đất
là vi sinh vật ưa nhiệt. Chúng có thể phát triển và phân hủy keratin ở nhiệt độ cao hơn
50°C (Chitte et al., 1999; Mohamedin, 1999). Tuy nhiên, chủng mesophilic cũng được
mô tả như chất thoái hóa keratin, như S. pactum DSM 40530 (Böckle et al, 1995) và S.
albidoflavus K1-02 (Bressolier et al., 1999). Ngoài ra, S. pactum có thể làm giảm các
liên kết disulfide trong khi đang tăng trưởng trên lông vũ (Böckle và Müller, 1997),
cho thấy vi sinh vật này có thể sản xuất enzyme phân hủy cầu nối disulfide để tạo điều
kiện thủy phân keratin. Keratinase cũng được sản xuất từ các vi khuẩn Bacillus spp.
Một số chủng B. licheniformis và B. subtilis được mô tả bởi (Lin et al., 1999; Suh và

Lee, 2001) và các loài khác như B. pumilus và B. cereus cũng sản xuất keratinase (Kim
et al., 2001; Werlang và Brandelli, 2005). Chủng B. licheniformis thường có khả năng
phân hủy hoàn toàn lông (Lin et al., 1992; Cheng et al., 1995). Ba loài vi khuẩn
Bacillus được phân lập từ lưu vực sông Amazon đã được mô tả gần đây trong phòng
thí nghiệm (Giongo et al., 2007). Những vi khuẩn này (B. subtilis, B.
amyloliquefaciens và B. Velesensis) có sự tương đồng cao và tạo ra một sự tổ hợp các
hoạt động phân giải keratin đáng chú ý như cạo lông trên tấm da bò. Một số chủng vi
khuẩn Bacillus ưa nhiệt và kiềm tính cũng đã được mô tả cho thấy hoạt động làm suy
giảm keratin, chẳng hạn như vi khuẩn Bacillus sp. P-001A (Atalo và Gashe., 1993), B.
halodurans AH-101 (Takami et al., 1992a, 1999), B. pseudofirmus AL-89 (Gessesse et
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT


Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 6 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học
al., 2003), và B. pseudofirmus FA30-01 (Kojima et al., 2006). Keratinase được mô tả
cho dòng Fervidobacterium pennavorans ưa nhiệt (Friedrich và Antranikian, 1996),
Thermoanaerobacter keratinophilus (Riessen và Antranikian, 2001),
Fervidobacterium islandicum (Nam et al., 2002), và các chủng kiềm tính Nesternkonia
sp. AL-20 (Gessesse et al., 2003) và Nocardiopsis sp. TOA-1 (Mitsuiki et al., 2004).
Vi khuẩn ưa nhiệt được hứa hẹn cho quá trình thủy phân protein cứng, không hòa tan
như keratin (Suzuki et al., 2006). Hai chủng inomycete là Streptomyces flavis 2BG và
Microbispora aerata IMBAS-11A, được phân lập từ đất ở Nam Cực đã sản xuất
enzyme keratinase trong khi đang phát triển trên chất thải từ lông cừu (Gushterova et
al., 2005). Một số vi khuẩn phân hủy lông đã được phân lập từ đất và chất thải gia cầm
(Bảng 1).
Bảng 1. Nguồn gốc của một số chủng vi khuẩn phân hủy lông (Brandelli,
2008)
Chủng vi khuẩn
Nguồn gốc
Tài liệu tham khảo

Gram dương


Bacillus licheniformis PWD-1
Chất thải gia cầm
Williams et al., 1990
Bacillus subtilis S14
Đất
Macedo et al., 2005
Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis
và Bacillus cereus
Chất thải gia cầm
Kim et al., 2001
Bacillus pseudofirmus
Hồ nước kiềm tính
Gessesse et al., 2003
Bacillus macroides và Bacillus cereus
Đất đồng cỏ khô
Lucas et al., 2003
Streptomyces pactum DSM 40530
Môi trường sưu tập
Böckle et al., 1995
Streptomyces albidoflavus K1-02
Đất ở chuồng gà
Bressolier et al., 1999
Streptomyces thermoviolaceus
Đất
Chitte et al., 1999
Fervidobacterium pennavorans
Suối nước nóng

Friedrich và
Antranikian, 1996
Microbacterium sp. kr10
Lông gia cầm phân hủy
Thys et al., 2004
Microbispora aerate và
Streptomyces flavus
Đất ở Nam Cực
Gushterova et al.,
2005
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT


Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 7 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học
Terrabacter terrae
Đất
Montero-Barrientos et
al., 2005
Kocuria rosea
Đất
Bernal et al., 2006a
Gram âm


Vibrio sp. kr2
Đất ở lò giết mổ gia cầm
Sangali và Brandelli,
2000
Lysobacter sp. NCIMB 9497
Môi trường sưu tập

Allpress et al., 2002
Stenotrophomonas sp.
Lông nai
Yamamura et al.,
2002
Chryseobacterium sp. kr6
Lông gia cầm phân hủy
Riffel et al., 2003a
Alcaligenes faecalis, Janthinobacterium
lividum và Stenotrophomonas
maltophilia
Đất đồng cỏ khô
Lucas et al., 2003
Mặc dù các phân lập chủ yếu giới hạn trong các chi Streptomyces và Bacillus,
một số nghiên cứu cho thấy sự đa dạng của vi khuẩn phân hủy lông lớn hơn đáng kể
(Lucas et al., 2003). Trong số các vi khuẩn Gram dương, chủng phân hủy lông đã được
phân lập và xác định như Arthrobacter sp. (Lucas et al., 2003), Microbacterium sp.
(Thys et al., 2004), và Kocuria rosea (Bernal et al., 2006a). Hầu hết các chủng vi
khuẩn phân hủy keratin của lông trong vòng 48 giờ, điển hình như Microbacterium sp.
kr10. Hoạt động của keratinase gần đây có liên quan đến vi khuẩn Gram âm (Bảng 1).
Chủng phân hủy lông của vi khuẩn Vibrio sp. (Sangali và Brandelli, 2000), Xantho-
monas maltophilia (De Toni et al., 2002), Stenotrophomonas sp. (Yamamura et al.,
2002), và Chryseobacterium sp. (Riffel và Brandelli, 2002) đã được phân lập từ lông
gà phân hủy. Cuộc điều tra về sự đa dạng của vi khuẩn sản xuất keratinase khi phân
lập từ môi trường đất dưới khí hậu nhiệt độ cho thấy chủng Proteobacteria và nhóm
Cytophaga-Flavobacterium đang chiếm ưu thế (Lucas et al., 2003). Điều này phù hợp
với một nghiên cứu khác, nơi vi khuẩn phân hủy lông chủ yếu là vi khuẩn Gram âm
(Riffel và Brandelli, 2006). Vi khuẩn S. fradiae làm suy giảm đáng kể cấu trúc hình
thái phức tạp của tóc và lông, dẫn đến giải phóng protein hòa tan trong quá trình lên
men (Hood và Healy, 1994). Shama và Berwick (1991) mô tả lông cừu đã gần như

hoàn toàn hòa tan bởi S. fradiae.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT


Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 8 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học
Bacillus cereus là trực khuẩn, Gram dương, có khả năng tạo nội bào tử. Đây là
vi khuẩn hiếu khí và kị khí không bắt buộc. Bacillus cereus K13 được phân lập từ
nguồn chất thải lông gia súc (Đinh Thị Bé Hiền, 2011) có hình dạng tế bào là dạng que
ngắn, màu trắng đục. Đặc điểm của khuẩn lạc có hình dạng không đều, bìa răng cưa,
độ lài, kích thước 2µm, Gram dương. Kết quả nghiên cứu của Dương Trọng Tín
(2013) cho thấy, dòng vi khuẩn Bacillus cereus K13 có thời gian nuôi cấy tối ưu là 3
ngày. Ở nhiệt độ 37
o
C và pH = 7,5 vi khuẩn có mật số và khả năng phân hủy bột lông
gia cầm cao nhất so với các nghiệm thức còn lại.
Bacillus megaterium là vi khuẩn Gram dương, có bào tử. Đây là vi khuẩn hiếu
khí và kị khí không bắt buộc. Bacillus megaterium VL2 được phân lập từ nguồn chất
thải lông gia cầm, có hình dạng tế bào là que dài, kích thước khuẩn lạc là dài 3,99 µm
và rộng 0,71 µm, Gram dương. Kết quả nghiên cứu của Trần Hồng Thảo (2014) cho
thấy, dòng vi khuẩn Bacillus megaterium VL2 có thời gian nuôi cấy tối ưu là 3 ngày.
Ở nhiệt độ 50
o
C và pH = 9 vi khuẩn có mật số và khả năng phân hủy bột lông gia cầm
cao nhất so với các nghiệm thức còn lại
2.4. Cấu trúc của tóc
Thành phần chủ yếu của tóc là keratin chiếm 90% và một lượng nhỏ chất béo
chiếm 1 – 9% (Villa et al., 2013). Đường kính của sợi tóc khoảng 40 – 150 µm (Villa
et al., 2013). Cấu trúc của tóc bao gồm 3 phần: biểu bì (cuticle), vỏ (cortex) và tủy
(medulla) (Hình 1).

Hình 3. Cấu trúc của tóc (Villa et al., 2013)
Lớp ngoài cùng là biểu bì, chiếm 10% tổng trọng lượng của sợi tóc (Villa et al.,
2013). Biểu bì gồm sáu đến tám lớp tế bào dẹt, mỏng, không màu, chồng chéo nhau từ
gốc đến ngọn. Mỗi lớp là loại β keratin dày khoảng 0,2 – 0,5 µm (Rodney Dawber,
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT


Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 9 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học
1996). Các lớp biểu bì có chức năng bảo vệ phần vỏ của tóc, tránh các tác hại do các
yếu tố như nhiệt, hóa chất,… gây ra. Vỏ chiếm phần lớn khối lượng của sợi tóc và
đóng vai trò quan trọng cho sức bền, sức căng và độ đàn hồi của sợi tóc. Nó có đường
kính khoảng 3 – 6 µm và dài khoảng 100 µm (Rodney Dawber, 1996). Vỏ được tạo
thành từ các tế bào kéo dài, xếp chặt chẽ với nhau và có định hướng dọc theo trục song
song với tóc. Các tế bào này được gọi là các vi sợi (microfibril). Mỗi vi sợi là một hình
trụ vững chắc có đường kính 0,1 – 0,4 µm và chiều dài thay đổi theo từng tế bào
(Rodney Dawber, 1996). Các vi sợi chứa các α helix keratin nằm trong chất nền liên vi
sợi (intermicrofibrillar matrix) và các hạt melanin. Phần lõi của tóc là tủy. Tủy bao
gồm các tế bào chuyên biệt có chứa các khoang khí. Cấu trúc của tóc rất ổn định và
khó phân hủy thậm chí đến hàng ngàn năm sau khi chết.
2.5. Sơ lƣợc về keratin thủy phân dƣỡng tóc
Keratin thủy phân là protein phục hồi hiệu quả trong quá trình chăm sóc tóc.
Những phân tử keratin nhỏ (phần đã thủy phân) là các oligopeptide có khối lượng
phân tử < 1000 Dalton có thể xâm nhập vào vỏ của tóc. Nó thẩm thấu vào trong tủy
của tóc và khôi phục cấu trúc sâu bên trong của tóc. Các keratin có kích thước lớn hơn

bám dính trên bề mặt tóc và đóng vai trò như một chất keo, chất kết dính giúp bổ sung,
hàn gắn và nối liền các đoạn tóc khô ráp, đứt gãy. Keratin thủy phân là nguồn dinh
dưỡng cần thiết để nuôi dưỡng và tạo thành một lớp màn bảo vệ tóc khỏi các tác nhân
môi trường bên ngoài như nắng gắt, bụi bẩn,… Bên cạnh đó, nó còn được sử dụng để
sửa chữa, điều trị và tái tạo cấu trúc hiệu quả cho những sợi tóc hư tổn, thiếu dinh
dưỡng, khô xơ do uốn, nhuộm, duỗi,… nhiều lần
2.6. Một số nghiên cứu về keratin thủy phân
Keratin thủy phân từ lông cừu và lông gia cầm được nghiên cứu để nâng cao giá
trị dinh dưỡng của rơm từ lúa mì làm thức ăn cho động vật nhai lại. Kết quả của
Abouheif et al. (1985) cho thấy, keratin thủy phân từ lông cừu có hàm lượng các acid
amin như glutamic acid, methionine, tyrosine, histidine và lysine cao gấp 1,5 – 4 lần
so với keratin thủy phân từ lông gia cầm. Trong phòng thí nghiệm, khi bổ sung 8,5%
keratin thủy phân, hàm lượng vật chất khô trong rơm lúa mì tăng tốt nhất và đạt thêm
21,1 – 23,7% so với rơm lúa mì chưa qua xử lý (44,72%).
Vi khuẩn Vibrio sp. kr2 được Grazziotin et al. (2007) sử dụng để sản xuất protein
thủy phân từ lông gia cầm. Sản lượng tối đa của protein hòa tan đạt được ở 30
o
C trong
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT


Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 10 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học
5 ngày với pH = 6 – 8. Báo cáo này có ý nghĩa trong việc sử dụng keratin thủy phân
như một thành phần trong thức ăn chăn nuôi, làm phân bón hữu cơ,…; do đó làm giảm
sự tác động xấu của chất thải lông từ ngành công nghiệp chế biến thịt gia súc, gia cầm
đến môi trường.
Hiệu quả mỹ phẩm khi sử dụng các peptide keratin thủy phân và chất béo có
nguồn gốc từ lông cừu được Barba et al. (2008) báo cáo có sự khác biệt đáng kể giữa
các mẫu đối chứng và các mẫu được điều trị. Sự gia tăng độ ẩm và độ đàn hồi là kết
quả của ứng dụng peptide keratin. Nó củng cố lớp bảo vệ bên ngoài và cải thiện khả

năng giữ nước của da.
Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thủy phân bằng enzyme nhằm thu được keratin
thủy phân có giá trị sinh học cao đã được thực hiện bởi Eremeev et al. (2009). Protease
kiềm từ Acremonium chrysogenium đã được chuẩn bị để tạo điều kiện thủy phân tối
ưu cho ra sản phẩm hòa tan có khối lượng dao động từ 3,55 – 3,60 kDa. Bên cạnh đó,
các sản phẩm thủy phân có khả năng chống oxy hóa cao, 100% hoạt tính sinh học và
cân bằng thành phần acid amin.
Freis et al. (2010) sử dụng kính hiển vi huỳnh quang quét laser đồng tiêu để đánh
giá sự xâm nhập của protein thủy phân vào tóc cho thấy số lượng cao protein được tìm
thấy trong các lớp biểu bì. Ngoài ra số lượng protein vẫn còn đáng kể đã được quan sát
trong phần vỏ của tóc và sự thâm nhập này tăng lên khi thời gian ủ lâu hơn.
Hoạt động keratinolytic của Bacillus subtilis AMR được Mazotto et al. (2010) sử
dụng trên tóc của con người cho thấy, B. subtilis AMR đã sản xuất keratinase và
gelatinase có khả năng thủy phân tóc người để sản xuất peptidase serine và peptide
keratin. Đây là báo cáo đầu tiên mô tả việc sản xuất và một phần đặc tính của
keratinase bởi B. subtilis phát triển trong một môi trường có chứa sợi tóc người.
Những dữ liệu này cho thấy rằng các peptide thu được bởi enzyme thủy phân tóc có
thể hữu ích cho các ứng dụng tương lai trên dược phẩm và công thức mỹ phẩm.
Nagal và Jain (2010) sử dụng vi khuẩn Elizabethkingia meningoseptica KB042
(MTCC 8360) trong quá trình lên men chìm để thủy phân lông gia cầm. Sau 6 ngày
nuôi cấy và ủ ở 37
o
C, pH = 10,02±0,1, 150 (vòng/phút), nồng độ acid amin được tìm
thấy trong sản phẩm thủy phân là tối đa gồm các acid amin thiết yếu như valine,
cysteine, leucine, tryptophan, threonine, và một lượng nhỏ methionine và arginine.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT


Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 11 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học
Lông cừu được Mokrejs et al. (2011) sử dụng để sản xuất keratin thủy phân

thông qua hai giai đoạn. Giai đoạn đầu, lông cừu được xử lý trong môi trường kiềm và
sau đó, ở giai đoạn hai, lông cừu được thủy phân thông qua các hoạt động của enzyme
thủy phân protein. Các yếu tố được nghiên cứu là ảnh hưởng của thời gian giai đoạn
thủy phân đầu tiên (6 – 24 giờ), thời gian thủy phân giai đoạn thứ hai (6 – 24 giờ) và
số lượng thêm vào enzyme phân giải protein (1 – 5%) trên số lượng của lông cừu bị
phân hủy. Hiệu suất keratin thủy phân đạt cao nhất khi thủy phân lông cừu trong 24
giờ ở cả hai giai đoạn và enzyme phân giải protein được thêm vào là 5%.
Mokrejs et al. (2011) đã nghiên cứu khả năng sản xuất keratin thủy phân từ lông
gia cầm thông qua sự thủy phân của kiềm và enzyme ở hai giai đoạn. Trong giai đoạn
đầu, lông gia cầm được pha trộn với dung dịch KOH 0,1 – 0,3% theo tỉ lệ 1:50 và
được ủ ở 70
o
C trong 24 giờ. Ở giai đoạn hai, hỗn hợp được điều chỉnh pH = 9 và bổ
sung enzyme phân giải protein từ 1 – 5% trong 4 – 8 giờ ở nhiệt độ 50 – 70
o
C. Kết quả
là khi cho bột lông gia cầm pha trộn với KOH 0,3% ở giai đoạn đầu; và thủy phân
trong 8 giờ ở 70
o
C với 5% enzyme (dựa theo khối lượng lông gia cầm) trong giai đoạn
hai – thì hiệu suất phân hủy lông gia cầm đạt xấp xỉ 91%; đạt cao nhất so với các
nghiệm thức còn lại.
Sionkowska et al. (2011) đã thực hiện một nghiên cứu về ảnh hưởng của tia UV
lên keratin thủy phân. Kết quả cho thấy rằng bức xạ tia cực tím có thể được sử dụng để
phân hủy keratin tạo keratin thủy phân cho các ứng dụng mỹ phẩm.
Nghiên cứu của Fakhfakh et al. (2013) báo cáo khả năng sản xuất và tối ưu hóa
điều kiện sản xuất protein thủy phân từ lông cừu thông qua sự thủy phân của dòng vi
khuẩn Bacillus pumilus A1. Ở điều kiện pH = 10, nhiệt độ 45
o
C, lượng protein thủy

phân đạt cao nhất trong ống nghiệm là 97% sau 2 ngày phân hủy. Bên cạnh đó, khả
năng chống oxy hóa của protein thủy phân từ lông cừu cũng được đánh giá bằng cách
sử dụng chất chống oxy hóa trong phòng thí nghiệm như 1,1-diphenyl-2-
picrylhydrazyl (DPPH), ion Fe(2+),… Kết quả cho thấy protein thủy phân từ lông cừu
sẽ là một nguồn protein và chất chống oxy hóa hữu ích trong khẩu phần ăn của động
vật.
Các hoạt động chống oxy hóa và chống tăng huyết áp của lông gia cầm thủy
phân thu được từ dòng vi khuẩn Chryseobacterium sp. Kr6 đã được Fontoura et al.
(2014) tiến hành nghiên cứu. Lượng protease tối đa thu được sau 48 giờ phân hủy với
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT


Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 12 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học
những tác động không đáng kể của nồng độ lông gia cầm và các giá trị pH. Các hoạt
động chống oxy hóa và chống tăng huyết áp tối ưu đã được quan sát trong môi trường
chứa 50g/l lông gia cầm với pH = 8 ở 30
o
C sau 48 giờ phân hủy. Ngoài ra, lông gia
cầm thủy phân còn được chứng minh có khả năng ngăn chặn 65% enzyme chuyển hóa
angiotensin I và 44% dipeptidyl peptidase IV. Lông gia cầm thủy phân có thể được
ứng dụng như chất bổ sung trong thức ăn gia súc; và là một nguồn tiềm năng của các
phân tử hoạt tính sinh học trong thức ăn chăn nuôi, thực phẩm và dược phẩm.

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT


Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 13 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học
CHƢƠNG III. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Phƣơng tiện
3.1.1. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
Sử dụng các phương tiện nghiên cứu (các thiết bị, dụng cụ) có tại Viện Nghiên

cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
- Tủ cấy vi sinh vật TELSTAR – Nhật Bản.
- Tủ ủ vi sinh vật BINDER – Hoa Kỳ.
- Nồi khử trùng nhiệt ướt PBI INTERNATIONAL – Ý.
- Tủ sấy BINDER – Hoa Kỳ.
- Máy khuấy từ IKA C-MAG HS7 – Đức
- Tủ lạnh trữ mẫu -4
o
C SANYO – Nhật Bản.
- Máy lắc mẫu NEW BRUNSWICH SCIENTIFIC – Hoa Kỳ
- pH kế EUTECH – Malaysia.
- Cân điện tử SARTORIUS TEG101 – Đức.
- Lò vi sóng LG MS2029U – Hàn Quốc.
- Bộ micropipette NICHIPET EX – Nhật Bản.
- Máy đo OD U-I500 – Nhật
- Máy chụp SEM JEOL – Nhật
- Một số dụng cụ khác như đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, cốc thủy tinh,
ống đong, đèn cồn, kẹp ống nghiệm, que cấy, đầu cone (vàng, xanh, trắng), găng tay,
khẩu trang y tế,
3.1.2. Vật liệu thí nghiệm
Mẫu tóc: tóc được thu tại một số tiệm cắt tóc ở thành phố Cần Thơ.
Mẫu keratin: các mẫu lông gia cầm, lông heo được thu tại một số cơ sở giết mổ
gà, vịt, heo ở tỉnh Vĩnh Long.
Mẫu vi sinh vật: chủng vi khuẩn Bacillus megaterium VL2 và chủng vi khuẩn
Bacillus cereus K13 đã được phân lập từ nguồn chất thải lông gia súc, gia cầm được
cung cấp từ luận văn tốt nghiệp đại học của Trần Hồng Thảo (2014) và Dương Trọng
Tín (2013).
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 14 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học
3.1.3. Hóa chất
* Môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật phân hủy keratin
a. Môi trường đặc (Bo Xu et al., 2009): nuôi dưỡng và đánh giá sự phát triển của vi
sinh vật phân hủy keratin
Bảng 2. Thành phần hóa chất trong môi trƣờng đặc
Hóa chất
Nồng độ (g/L)
NaCl
0,5
K
2
HPO
4

0,3
KH
2
PO
4

0,4
MgCl
2
.6H
2
O
0,1
Bột lông gia cầm
10

NH
4
Cl
0,5
Agar
20
Chỉnh pH về mức 7,5 ở 37
o
C
b. Môi trường lỏng (Bo Xu et al., 2009): đánh giá khả năng phân hủy keratin và sự
hoạt động của enzyme keratinase
Bảng 3. Thành phần hóa chất trong môi trƣờng lỏng
Hóa chất
Nồng độ (g/L)
NaCl
0,5
K
2
HPO
4

0,3
KH
2
PO
4

0,4
MgCl
2

.6H
2
O
0,1
Bột lông gia cầm
10
NH
4
Cl
0,5
Chỉnh pH về mức 7,5 ở 37
o
C


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2014 Trường ĐHCT


Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 15 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học
c. Môi trường tăng sinh khối (Sangali và Brandelli, 2000)
Bảng 4. Thành phần hóa chất trong môi trƣờng tăng sinh khối
Hóa chất
Nồng độ (g/L)
NaCl
0,5
K
2
HPO
4

0,3
KH
2
PO
4

0,4
MgCl
2
.6H
2
O
0,24
Yeast extract
0,2
Bột lông gia cầm
10
NH
4
Cl
0,5
Chỉnh pH về mức 7,5 ở 37
o
C
* Hóa chất
- NaCl, K
2
HPO
4
, KH

2
PO
4
, MgCl
2
.6H
2
O, NH
4
Cl, Agar, Yeast extract,…
- Dung dịch đệm 0,05 M Potassium Phosphate pH 7,5 (K
2
HPO
4
.2H
2
O, KH
2
PO
4
.H
2
O)
3.1.4. Địa điểm thí nghiệm
Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh học phân tử Thực vật
thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
3.1.5. Thời gian thực hiện
Đề tài được thực hiện từ tháng 7/2014 đến hết tháng 11/2014.
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.2.1. Thu mẫu và chuẩn bị mẫu vi khuẩn giống

Mẫu tóc: thu 300 g mẫu tóc, cắt khoảng > 5cm, rửa sạch rồi để khô tự nhiên. Bảo
quản tóc ở nơi khô thoáng, tránh ánh nắng trực tiếp từ mặt trời và tránh những nơi ẩm
ướt.
Mẫu vi khuẩn: 2 chủng vi khuẩn Bacillus megaterium VL2 và Bacillus cereus
K13 được cấy chuyển sang môi trường đặc (môi trường agar) để sinh trưởng và phát
triển (thành phần: NaCl 0,5 g/L, K
2
HPO
4
0,3 g/L, KH
2
PO
4
0,4 g/L, MgCl
2
.6H
2
O 0,1
g/L, bột lông gia cầm 10 g/L, NH
4
Cl 0,5 g/L, agar 15 g/L, pH 7,5) (Bo Xu et al., 2009)