khảo sát khả năng tái sinh chồi, sự sinh trưởng và tạo biến dị của chồi cà chua sau khi chiếu xạ tia gamma

TRƯ
ỜNG ĐẠI HỌC CẦN TH
Ơ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG








TIÊU MỸ TRÂN



KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TÁI SINH CHỒI, SỰ SINH
TRƯỞNG VÀ TẠO BIẾN DỊ CỦA CHỒI CÀ CHUA
SAU KHI CHIẾU XẠ TIA GAMMA




Luận văn tốt nghiệp
Ngành: Nông học

Cần Thơ, 2014


TRƯ
ỜN
G Đ
ẠI HỌC CẦN TH
Ơ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG




Luận văn tốt nghiệp
Ngành: Nông học



Tên đề tài:
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TÁI SINH CHỒI, SỰ SINH
TRƯỞNG VÀ TẠO BIẾN DỊ CỦA CHỒI CÀ CHUA
SAU KHI CHIẾU XẠ TIA GAMMA


Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:
ThS. Lê Hồng Giang Tiêu Mỹ Trân

MSSV: C1201053
Lớp: Nông học K38




i

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN DI TRUYỂN GIỐNG NÔNG NGHIỆP



XÁC NHẬN CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
Xác nhận chấp thuận báo cáo luận văn tốt nghiệp với đề tài “Khảo sát khả
năng tái sinh chồi, sự sinh trưởng và tạo biến dị của chồi cà chua sau khi chiếu
xạ tia gamma”.
Do sinh viên: Tiêu Mỹ Trân Lớp Nông Học Liên thông khóa 38 – Bộ môn Di
Truyền Giống Nông Nghiệp – Khoa Nông Nghiệp và Sinh học ứng dụng thực hiện
từ tháng 9/2013 đến tháng 2/2014.
Nhận xét của cán bộ hướng dẫn:



Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2014
Cán bộ hướng dẫn


ThS. Lê Hồng Giang

ii

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN DI TRUYỂN GIỐNG NÔNG NGHIỆP


NHẬN XÉT CỦA HỘI ĐỒNG
Hội đồng chấm báo cáo luận văn tốt nghiệp với đề tài “Khảo sát khả năng tái
sinh chồi, sự sinh trưởng và tạo biến dị của chồi cà chua sau khi chiếu xạ tia
gamma”.
Do sinh viên: Tiêu Mỹ Trân Lớp Nông Học Liên thông khóa 38 – Bộ môn Di
Truyền Giống Nông Nghiệp – Khoa Nông Nghiệp và Sinh học ứng dụng thực hiện
từ tháng 9/2013 đến tháng 2/2014 và báo cáo trước hội đồng ngày .… tháng ….
năm 2014.
Ý kiến của hội đồng khoa học:



Luận văn tốt nghiệp được Hội đồng đánh giá ở mức

Cần Thơ, ngày….tháng… năm 2013
Thành viên hội đồng




DUYỆT KHOA
Trưởng Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng

iii

TÓM TẮT TIỂU SỬ CÁ NHÂN
1. Sơ lược lịch sử
- Họ và tên: TIÊU MỸ TRÂN
- Ngày sinh: 28/05/1990
- Nơi sinh: Huyện Phú Tân – Tỉnh An Giang
- Họ và tên cha: TIÊU VĂN ÓN
- Họ và tên mẹ: LĂNG THOẠI MAI
- Quê quán: Long Thạnh I – Phường Long Sơn – Thị xã Tân Châu – Tỉnh An Giang
2. Quá trình học tập
- Năm 1996 – 2001: học sinh trường Tiểu học “A” Tân Châu.
- Năm 2001 – 2005: học sinh trường THCS Tân Châu.
- Năm 2005 – 2008: học sinh trường THPH Tân Châu.
- Năm 2009 – 2012: sinh viên trường Cao đẳng Kinh tế - Kỹ thuật Cần Thơ.
- Năm 2012 đến nay: sinh viên trường Đại học Cần Thơ.
Tác giả luận văn

Tiêu Mỹ Trân

iv

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của bản thân và cán
bộ hướng dẫn. Các số liệu, kết quả trong bài luận văn này là trung thực và chưa
từng được công bố trước đây.
Tác giả luận văn

Tiêu Mỹ Trân

v

LỜI CẢM TẠ
Trong thời gian học tập và rèn luyện tại Trường Đại Học Cần Thơ, em đã
được qu ý thầy cô truyền đạt rất nhiều kiến thức, kinh nghiệm quý báu. Đây sẽ là
vốn sống vô cùng quan trọng giúp đỡ em trong quá trình làm việc và công tác về
sau.
Kính dâng
 Ba, Mẹ đã cho con hình hài, hết lòng yêu thương, dạy dỗ và nuôi nấng
con khôn lớn, nên người.
Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc
 Ths. Lê Hồng Giang người đã tận tình hướng dẫn em trong việc
nghiên cứu và hoàn thành Luận văn tốt nghiệp này.
 Thầy Nguyễn Phước Đằng cố vấn học tập đã hết lòng giúp đỡ em
trong suốt quá trình học tập tại trường.
Xin chân thành cảm ơn
Cô Phan Thị Hồng Nhung công tác tại Phòng Cấy Mô và các anh chị
học viên cao học, các bạn sinh viên thực hiện đề tài tại đây đã nhiệt tình chỉ dẫn tôi
trong quá trình thực hiện luận văn.
Xin cám ơn các anh chị khối ngành Nông Học & Công Nghệ Giống
và các bạn lớp Nông Học liên thông K38 đã giúp đỡ tôi hoàn thành tốt luận văn
này.
Thân gửi
Các anh, chị và các bạn trong nhóm đã luôn đồng hành cùng em
trong suốt quá trình học tập tại trường. Kính chúc quý Thầy, Cô, các anh chị và tập
thể lớp Nông Học liên thông K38 nhiều sức khỏe và thành công.

Tiêu Mỹ Trân

vi

MỤC LỤC
XÉT DUYỆT LUẬN VĂN i
TÓM TẮT TIỂU SỬ CÁ NHÂN iii
LỜI CAM ĐOAN iv
LỜI CẢM TẠ v
MỤC LỤC vi
DANH SÁCH BẢNG ix
DANH SÁCH HÌNH x
DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT xi
TÓM LƯỢC xii
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2
1.1 SƠ LƯỢC VỀ CÂY CÀ CHUA 2
1.1.1 Nguồn gốc 2
1.1.2 Đặc tính thực vật 2
1.1.3 Giá trị kinh tế và giá trị sử dụng 3
1.2 KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ 4
1.2.1 Lịch sử nuôi cấy mô 4
1.2.2 Các giai đoạn nhân giống in vitro 4
1.2.3 Môi trường nuôi cấy 6
1.3 MÔ SẸO VÀ TÁI SINH CHỒI 9
1.4 ĐỘT BIẾN TRONG CHỌN GIỐNG CÂY TRỒNG 9
1.4.1 Định nghĩa 9
1.4.2 Phương pháp gây đột biến bằng tác nhân vật lý 10
1.5 TẠO GIỐNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỘT BIẾN KẾT HỢP VỚI KỸ
THUẬT NUÔI CẤY MÔ 11
1.6 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ KHẢ NĂNG TẠO BIẾN DỊ VÀ TÁI SINH

CHỒI BẰNG PHƯƠNG PHÁP GÂY ĐỘT BIẾN KẾT HỢP VỚI KỸ THUẬT
NUÔI CẤY MÔ 12

vii

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 13
2.1 THỜI GIAN THỰC HIỆN 13
2.2 ĐỊA ĐIỂM 13
2.3 PHƯƠNG TIỆN 13
2.3.1 Vật liệu và trang thiết bị 13
2.3.2 Điều kiện thí nghiệm 13
2.4 PHƯƠNG PHÁP 14
2.4.1 Môi trường nuôi cấy 14
2.4.2 Chuẩn bị mô sẹo để xử lý chiếu xạ 14
2.4.3 Các thí nghiệm 14
2.5 XỬ LÝ SỐ LIỆU 16
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17
3.1 ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC LIỀU CHIẾU XẠ TIA GAMMA CO
60
ĐẾN
KHẢ NĂNG TÁI SINH CHỒI, SỰ SINH TRƯỞNG VÀ TẠO BIẾN DỊ CỦA
CHỒI 17
3.1.1 Tỷ lệ mô sẹo chết 17
3.1.2 Tỷ lệ mô sẹo tái sinh chồi 18
3.1.3 Số chồi 20
3.1.4 Chiều cao chồi 20
3.1.5 Tỷ lệ cây có biến dị hình thái lá 21
3.2 ẢNH HƯỞNG CỦA LIỀU CHIẾU XẠ TIA GAMMA CO
60
VÀ HÀM

LƯỢNG NƯỚC DỪA ĐẾN KHẢ NĂNG TÁI SINH CHỒI, SỰ SINH
TRƯỞNG VÀ TẠO BIẾN DỊ CỦA CHỒI 24
3.2.1 Tỷ lệ mô sẹo tái sinh chồi 24
3.2.2 Số chồi 26
3.2.3 Chiều cao chồi 28
3.2.4 Tỷ lệ cây có biến dị hình thái lá 30
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 31
4.1 KẾT LUẬN 31

viii

4.2 ĐỀ NGHỊ 31
TÀI LIỆU THAM KHẢO 32

ix

DANH SÁCH BẢNG
Bảng Tên Trang
Bảng 2.1
Các nghiệm thức (NT) liều chiếu xạ và hàm lượng nước dừa được
bố trí trong thí nghiệm
16
Bảng 3.1
Ảnh hưởng của liều chiếu xạ lên tỷ lệ chết của mô sẹo (%) ở 2, 4,
6 tuần sau khi chiếu xạ
17
Bảng 3.2
Ảnh hưởng của liều chiếu xạ lên tỷ lệ mô sẹo tái sinh chồi (%) ở 3,
4, 5, 6 tuần sau khi chiếu xạ
18

Bảng 3.3
Ảnh hưởng của liều chiếu xạ tia gamma lên số chồi ở 3, 4, 5, 6 tuần
sau khi chiếu xạ
20
Bảng 3.4
Ảnh hưởng của liều chiếu xạ lên chiều cao chồi ở 3, 4, 5, 6 tuần
sau khi chiếu xạ
21
Bảng 3.5
Ảnh hưởng của liều chiếu xạ lên tỷ lệ cây có biến dị hình thái lá
(%) ở 12 tuần sau khi chiếu xạ
22
Bảng 3.6
Ảnh hưởng của liều chiếu xạ và hàm lượng nước dừa lên tỷ lệ mô
sẹo tái sinh chồi (%) ở 3, 4, 5, 6 tuần sau khi cấy
25
Bảng 3.7
Ảnh hưởng của liều chiếu xạ và hàm lượng nước dừa lên số chồi ở
3, 4, 5, 6 tuần sau khi cấy
27
Bảng 3.8
Ảnh hưởng của liều chiếu xạ và hàm lượng nước dừa lên chiều cao
chồi (cm) ở 3, 4, 5, 6 tuần sau khi cấy
29
Bảng 3.9
Ảnh hưởng của liều chiếu xạ lên tỷ lệ cây có biến dị hình thái lá
(%) ở 6 tuần sau khi cấy
30

x

DANH SÁCH HÌNH

Hình Tên Trang
Hình 2.1 Mẫu mô sẹo được cấy trên đĩa petri chuẩn bị chiếu xạ tia gamma. 14
Hình 3.1
Ảnh hưởng của các liều chiếu xạ tia gamma lên sự tái sinh chồi
từ mô sẹo ở 6 tuần sau khi chiếu xạ
19
Hình 3.2 Các dạng biến dị hình thái lá ở 12 tuần sau khi chiếu xạ 23



xi

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
ctv. Cộng tác viên
MS Môi trường Murashige và Skoog
NT Nghiệm thức
TSKC Tuần sau khi cấy
TSKCX Tuần sau khi chiếu xạ

xii

TIÊU MỸ TRÂN, 2014. “Khảo sát khả năng tái sinh chồi, sự sinh trưởng và tạo
biến dị của chồi cà chua sau khi chiếu xạ tia gamma”. Luận văn tốt nghiệp Kỹ sư
ngành Nông Học, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ.
Cán bộ hướng dẫn: Th.S Lê Hồng Giang.

TÓM LƯỢC

Đề tài: “Khảo sát khả năng tái sinh chồi, sự sinh trưởng và tạo biến dị của
chồi cà chua sau khi chiếu xạ tia gamma” được thực hiện nhằm mục tiêu xác định
liều chiếu xạ thích hợp để tạo biến dị chồi trên cây cà chua. Đề tài được thực hiện
qua hai thí nghiệm: (1) Ảnh hưởng của các liều chiếu xạ tia gamma Co
60
đến khả
năng tái sinh chồi, sự sinh trưởng và tạo biến dị của chồi; (2) Ảnh hưởng của liều
chiếu xạ tia gamma Co
60
và hàm lượng nước dừa đến khả năng tái sinh chồi, sự
sinh trưởng và tạo biến dị của chồi. Kết quả cho thấy khi chiếu xạ tia gamma ở liều
chiếu từ 10-50 Gy sẽ làm tăng tỷ lệ mô sẹo chết. Tỷ lệ mô sẹo tái sinh chồi và chiều
cao chồi bị giảm khi tăng liều chiếu xạ. Các liều chiếu xạ từ 10-40 Gy tạo được
nhiều dạng biến dị hình thái lá. Trong các liều chiếu xạ thì liều 30 Gy có tỷ lệ biến
dị cao nhất và dạng lá dài, lá bị cuốn lại (hình thái 4) là dạng biến dị phổ biến nhất.
Môi trường có bổ sung hàm lượng nước dừa 150 ml/l có hiệu quả lên quá trình tái
sinh chồi, sự sinh trưởng của chồi ở các liều chiếu xạ.
Từ khóa: cà chua, tái sinh chồi, tia gamma, nước dừa, biến dị hình thái lá.





1

MỞ ĐẦU

Cà chua là loại rau ăn quả có giá trị dinh dưỡng cao, chứa nhiều đường, chủ

yếu là đường glucose, carotene, vitamin như B1, B2, C; axit amin và các chất
khoáng quan trọng như Ca, P, Fe… Cà chua dùng để ăn quả tươi hoặc chế biến thực
phẩm và được dùng làm nước giải khát. Vì vậy, cà chua trở thành món ăn thông
dụng và là mặt hàng xuất khẩu quan trọng của nhiều nước. Tuy nhiên, năng suất và
chất lượng cà chua phụ thuộc vào nhiều yếu tố như giống, đất, phân bón, thời tiết…
Chính vì những lợi ích mà cà chua mang lại nên việc nhân rộng giống cà chua đang
được quan tâm. Hiện nay, phương pháp nhân giống vô tính bằng nuôi cấy in vitro
đang dần trở nên phổ biến vì nó tạo ra nguồn giống có chất lượng, đáp ứng yêu cầu
nhân nhanh số lượng, cây giống hoàn toàn sạch bệnh, đồng nhất về mặt di truyền,
không phụ thuộc vào mùa vụ. Bên cạnh đó, gây đột biến in vitro là phương pháp kết
hợp giữa kỹ thuật nuôi cấy mô với phương pháp gây đột biến, sự kết hợp này mang
lại khả năng tạo biến dị rất cao. Gây đột biến có thể tạo ra một hoăc một số tính
trạng mong muốn mà không ảnh hưởng đến các tính trạng khác và có thể rút ngắn
thời gian trong công tác chọn giống. Đến nay, kỹ thuật gây đột biến in vitro đã được
áp dụng thành công trên nhiều giống cây trồng như lúa, mía, bắp, các loại hoa
kiểng… Tuy nhiên, kỹ thuật này trên cây cà chua chưa được nghiên cứu nhiều.
Vì vậy, trước nhu cầu của thực tiễn, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
“Khảo sát khả năng tái sinh chồi, sự sinh trưởng và tạo biến dị của chồi cà
chua sau khi chiếu xạ tia gamma” nhằm mục tiêu xác định liều chiếu xạ thích hợp
để tạo biến dị chồi trên cây cà chua.









2

CHƯƠNG 1
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
1.1 SƠ LƯỢC VỀ CÂY CÀ CHUA
1.1.1 Nguồn gốc
Theo Tạ Thu Cúc (2002) cà chua có tên khoa học là Lycopersicon esculentum
Mill, thuộc họ cà Solanaceae. Cà chua có nguồn gốc ở Peru, Bolivia và Ecuador.
Năm 1554, nhà nghiên cứu về thực vật Pier Andrea Mattioli giới thiệu những giống
cà chua có màu vàng và đỏ nhạt. Mặc dù cà chua có nhiều tên gọi nhưng thời bấy
giờ cà chua chưa được chấp nhận là thực phẩm. Đến thế kỷ 19 cà chua đã trở thành
loại thực phẩm không thể thiếu trong bữa ăn hàng ngày.
1.1.2 Đặc tính thực vật
Rễ: Hệ rễ cây cà chua thuộc loại rễ chùm, có khả năng ăn sâu trong đất, rễ cái
ăn sâu 0,5-1 m. Khả năng tái sinh của hệ rễ cà chua mạnh, khi rễ chính bị đứt rễ phụ
phát triển mạnh và phân bố chủ yếu ở tầng đất 0-30 cm. Rễ cà chua tương đối chịu
hạn, nhưng hệ rễ sinh trưởng tốt ở đất có sức giữ ẩm đồng ruộng trong khoảng 70-
80% (Tạ Thu Cúc, 2002).
Thân: Thân tròn, thẳng đứng, mọng nước, phủ nhiều lông, khi cây lớn gốc thân
dần dần hóa gỗ. Thân mang lá và chùm hoa. Chồi nhánh mọc ở nách lá, chồi mọc ở
các vị trí lá khác nhau, có tốc độ sinh trưởng và phát dục khác nhau. Chồi nhánh
mọc ở lá dưới ngay chùm hoa thứ nhất có khả năng tăng trưởng mạnh và phát dục
sớm hơn so với chồi gần gốc. Theo Phạm Hồng Cúc (2007), tùy vào khả năng tăng
trưởng và phân nhánh, cà chua có 4 dạng:
+ Dạng vô hạn: Thân cao trên 2 m, có chùm hoa đầu tiên ở lá thứ 9-11, sự sinh
trưởng vẫn tiếp tục khi cây ra hoa. Dạng này có tiềm năng cho năng suất cao nhờ
thu hoạch dài ngày.
+ Dạng hữu hạn: Thân cứng, mọc đứng, có chùm hoa đầu tiên ở lá thứ 7-9, khi
xuất hiện chùm hoa ngọn thì cây ngừng sinh trưởng chiều cao. Dạng này cho trái
sớm và tập trung.
+ Dạng bán hữu hạn: Cây có nhiều chùm hoa ở tận ngọn,lúc này cây ngừng

tăng trưởng chiều cao.
+ Dạng bụi: Cây có lóng rất ngắn, đâm chồi mạnh, ít chùm hoa, cho trái tập
trung, phục vụ cho việc trồng dày và thu hoạch bằng cơ giới.

3

Lá: Lá kép lông chim lẻ, mỗi lá có 3-4 đôi lá chét, ngọn lá có riêng lá đỉnh. Ở
giữa các đôi lá chét còn có lá giữa, trên gốc lá chét có những phiến lá nhỏ gọi là lá
bên. Bộ lá có ý nghĩa quan trọng đối với năng suất. Số lá là đặc tính di truyền của
giống, nhưng quá trình hình thành chịu ảnh hưởng của nhiệt độ (Tạ Thu Cúc, 2002).
Hoa: Hoa mọc thành chùm trên thân, thông thường mỗi chùm có 6-12 hoa, đôi
khi có 30-100 hoa. Chùm hoa có thể không phân nhánh, phân hai hay nhiều nhánh
tùy giống và điều kiện trồng. Hoa lưỡng tính tự thụ phấn là chính. Sự thụ phấn chéo
khó xảy ra vì hoa cà chua tiết ra nhiều tiết tố độc nên không hấp dẫn côn trùng và
hạt phấn nặng không bay xa được. Hoa gồm đài liên kết với 5-9 cánh màu xanh, tồn
tại và phát triển cùng với trái. Số cánh hoa tương ứng với số lá đài và hợp thành
tràng hoa dính nhau ở đáy, khi nở có màu vàng tươi và rụng sau khi đậu trái.
Trái: Trái thuộc quả mọng nước, hình dạng thay đổi từ tròn đến dài, vỏ trơn
láng hay có khía, màu xanh và có lông khi còn xanh, màu đỏ, hồng, cam hay vàng
và trơn láng khi chín, trái có hai hay nhiều ngăn chứa nhiều hạt. Trọng lượng trái
thay đổi tùy theo giống (từ 20-300g). Trong trái xanh có chứa một lượng khá nhiều
chất độc là tomatine, lượng chất này giảm dần theo mức độ chín của trái và biến
mất khi trái chín đỏ.
Hạt: Hạt nhỏ, dẹp, nhiều lông, màu vàng sáng hoặc hơi tối. Trong trái hạt nằm
trong buồng chứa dịch bào kiềm hãm sự nảy mầm. Hạt khô ở ẩm độ 5,5% có thể
vẫn nảy mầm tốt sau nhiều năm tồn trữ (Phạm Hồng Cúc, 2007).
1.1.3 Giá trị kinh tế và giá trị sử dụng
Cà chua là cây rau có giá trị kinh tế cao, được trồng rộng rãi trên thế giới. Cà
chua có thể cho năng suất cao, sinh trưởng nhanh, bảo quản được tương đối dài hơn
so với các loại rau khác, quả có khả năng vận chuyển được thuận lợi và đi xa

(Đường Hồng Dật, 2002). Vì vậy, việc trồng cà chua đã thực sự mang lại hiệu quả
kinh tế cao và là mặt hàng xuất khẩu quan trọng của nhiều nước.
Ở Việt Nam, trong những năm gần đây diện tích trồng cà chua đang ngày một
tăng. Cà chua là cây rau quan trọng của nhiều vùng chuyên canh, là cây trồng sau
lúa mùa sớm cho hiệu quả kinh tế cao.
Quả cà chua có giá trị dinh dưỡng rất cao, thành phần dinh dưỡng gồm protein,
glucid, P, Ca, carotene, Fe, các vitamin B1, B2, PP, C (Vũ Văn Vụ và ctv., 2006).
Cà chua chín cây có chất lượng tốt hơn so với cà chua chín trong thời gian bảo
quản. Đặc biệt, quả cà chua chứa hàm lượng lycopen khá cao. Lycopen hoạt động
như chất chống oxy hóa cực mạnh trong cơ thể, khôi phục các tế bào bị tổn thương,

4

tiêu diệt những phân tử thoái hóa, kiềm chế quá trình oxy hóa của DNA. Do đó, cà
chua có tác dụng tốt đối với nhiều bệnh như ung thư, tim mạch, chống lão hóa,….
1.2 KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ
1.2.1 Lịch sử nuôi cấy mô
Năm 1838, Schleiden và Schwann đã đề xướng thuyết tế bào “Các tế bào đã
phân hóa đều mang thông tin di truyền có trong tế bào đầu tiên, đó là trứng đã thụ
tinh, và là những đơn vị độc lập, từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể”.
Năm 1902, Haberlandt, nhà thực vật học người Đức, là người đầu tiên đưa lý
thuyết của Schleiden và Schwann vào thực nghiệm. Tuy nhiên ông đã thất bại vì
nuôi cấy các tế bào đã phân hóa tách từ một số cây một lá mầm, đối tượng rất khó
nuôi cấy, hơn nữa ông đã dùng các tế bào đã mất khả năng tái sinh. (Nguyễn Bảo
Toàn, 2010).
Năm 1934, White là người phát hiện tế bào của rễ cà chua có thể được nuôi
cấy vô hạn, đồng thời ông là người tìm ra môi trường nuôi cấy rễ được sử dụng phổ
biến hiện nay.
Năm 1962, Murashige và Skoog cải tiến môi trường nuôi cấy tạo ra môi
trường MS phù hợp với nhiều loại cây và được dùng cho đến nay.

1.2.2 Các giai đoạn nhân giống in vitro
Theo Nguyễn Bảo Toàn (2010)
Giai đoạn 0: Chọn cây mẹ và chuẩn bị
Giai đoạn 0 là giai đoạn cải thiện điều kiện sinh lý và vệ sinh cây mẹ. Đây là
phương pháp cải thiện tình trạng sinh lý của cây mẹ để đạt được mẫu cấy theo ý
muốn và tạo điều kiện thuận lợi nhất cho sự thành công của các giai đoạn sau.
Giai đoạn 1: Khử trùng mẫu cấy
Mẫu cấy được khử vô trùng để đạt được độ sạch cần thiết và cho tỉ lệ sống
cao trước khi thực hiện các thao tác cấy. Kết quả có thể thu được là các chồi thân
lớn lên, hoặc các chồi thân ra rễ, hoặc còn là một mô sẹo
Phương pháp vô trùng mẫu cấy thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất
hóa học có hoạt tính diệt nấm khuẩn. Hiệu lực diệt nấm khuẩn của các chất này phụ
thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẽ
ngách lồi lõm trên bề mặt mẫu cấy, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt
mô cấy.

5

Giai đoạn 2: Nhân chồi
Đây là quá trình kích thích các trung tâm mô phân sinh như đỉnh sinh trưởng
(chồi chính, chồi bên). Có nhiều kiểu để gia tăng tốc độ nhanh như cấy mắt. Trong
kỹ thuật này có hai kiểu tạo chồi, tạo chồi từ kiểu cấy nhiều mắt hoặc từ mẫu cấy
một mắt.
Việc gia tăng số chồi phụ thuộc nhiều vào việc sử dụng auxin và cytokinin.
Sử dụng hàm lượng cytokinin cao và auxin thấp kích thích sự phát sinh nhiều chồi
bên và chồi bất định. Sử dụng cytokinin thấp và auxin cao dễ phát sinh callus và
chồi bất định từ callus. Sự kết hợp hài hòa giữa cytokinin và auxin dễ hình thành
cây hoàn chỉnh. Tuy nhiên, cần lưu ý khi sử dụng cytokinin cao có thể gây ra một
số vấn đề như sự thừa nước, tạo thành cụm chồi, biến dị vô tính và các vấn đề về
cấu trúc bất thường.

Giai đoạn 3: Được chia thành 2 giai đoạn là giai đoạn kéo dài (3a), kích thích
tạo rễ và tiền thuần dưỡng
Giai đoạn 3a: Kéo dài chồi
Môi trường dùng để kéo dài chồi thường không sử dụng cytokinin hoặc sử
dụng với một lượng yếu hơn so với giai đoạn 2. Nồng độ của chất điều hòa sinh
trưởng, đặc biệt là cytokinin, cần thiết để kích thích tạo mầm chồi bất định, ức chế
sự kéo dài của chồi. Do đó, khi đặt mẫu cấy vào trong môi trường kích thích tạo
chồi thì đôi khi cần thiết phải chuyển chúng sang môi trường không có chất điều
hòa sinh trưởng hoặc môi trường có nồng độ cytokinin giảm để các mầm chồi sinh
trưởng.Tùy thuộc vào kiểu cây, sự kéo dài có thể xảy ra trên các chồi đơn hoặc cụm
chồi.
Giai đoạn 3b: Kích thích tạo rễ và tiền thuần dưỡng
Mục đích của giai đoạn này là tạo cây con phát triển đầy đủ rễ, thân, lá có
khả năng thực hiện quang hợp và sống sót mà không cần cung cấp nguồn
carbohydrate nhân tạo.
Auxin và than hoạt tính thường được sử dụng trong giai đoạn này để kích
thích tạo rễ. Tạo rễ tốt nhất thường đạt được trên môi trường với hàm lượng khoáng
thấp. Than hoạt tính thường được bổ sung vào giai đoạn này để tạo môi trường tối,
hấp thu các phân tử có cấu trúc vòng hoặc các hợp chất phenol. Than hoạt tính
thường được sử dụng với nồng độ 0,5-3%. Bên cạnh đó có thể làm tăng khả năng tự
dưỡng cho cây con với việc cung cấp carbohydrate hoặc làm thấp ẩm độ tương đối
trong bình chứa, sử dụng nấm rễ, sử dụng chất trơ….

6

Giai đoạn 4: Sự thuần dưỡng
Đây là giai đoạn giúp cây con thích nghi dần với điều kiện môi trường tự nhiên
và giảm thiểu sự chết cây con. Trong giai đoạn này cây con thường có tỷ lệ chết rất
cao do cấu trúc giải phẫu của cây nuôi cấy mô không thích ứng kịp với điều kiện tự
nhiên, và do sự thay đổi đột ngột của điều kiện môi trường. Vì vậy cần quan tâm

đến tình trạng cây con khi chuyển ra vườn ươm và các yếu tố về môi trường như
nhiệt độ, ẩm độ, ánh sáng của nơi thuần dưỡng hoặc tình trạng cây con trong bình
nuôi cấy.
1.2.3 Môi trường nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy là một trong những yếu tố quan trọng quyết định sự sinh
trưởng và phát triển của mô và tế bào thực vật trong quá trình nuôi cấy (Nguyễn
Bảo Toàn, 2010). Theo Nguyễn Đức Thành (2000), các thành phần cơ bản của môi
trường nuôi cấy gồm: khoáng đa lượng - vi lượng, nguồn carbon, vitamin, các chất
điều hòa sinh trưởng thực vật, thạch,… Ngoài ra người ta còn bổ sung một số chất
hữu cơ có thành phần xác định (amino acid, EDTA…) và một số chất có thành phần
không xác định như nước dừa, dịch chiết nấm men… (Nguyễn Đức Lượng và Lê
Thị Thuỷ Tiên, 2002).
Khoáng đa-vi lượng
Có nhiều môi trường khoáng cơ bản đã được thiết lập cho nuôi cấy mô tùy
theo mục đích và đối tượng nghiên cứu (Vũ Văn Vụ và ctv., 2006). Nhưng phổ biến
nhất vẫn là môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) (George, 1996).
Theo Lê Văn Hòa và Nguyễn Bảo Toàn (2005), khoáng đa lượng rất cần cho
cây, có ảnh hưởng rất tốt cho sự hấp thu của mô cấy và không gây độc. Các nguyên
tố đa lượng cần phải cung cấp là Nitrogen (N), Phospho (P), Potassium (K),
Magnesium (Mg), calcium (Ca), Lưu huỳnh (S). Khoáng vi lượng là những nguyên
tố mà cây trồng cần rất ít nhưng không thể thiếu cho sự sinh trưởng và phát triển
của cây. Các vi lượng thường thêm vào môi trường là Iode (I), Bo (B), Mangan
(Mn), Kẽm (Zn), Đồng (Cu), Molipden (Mo), Cobalt (Co), Sắt (Fe).
Trong môi trường nuôi cấy, sắt thường được bổ sung dưới dạng chelate-EDTA
(Ethylene diamin tetraacetic acid), ở dạng này sắt không bị kết tủa và từ từ giải
phóng vào môi trường (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
Nguồn carbon
Mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức dị
dưỡng nên việc đưa đường vào môi trường nuôi cấy làm nguồn carbon cung cấp

7

năng lượng chủ yếu trong nuôi cấy nhiều loài thực vật. Đường thường sử dụng
trong nuôi cấy là đường sucrose. Tùy theo mục đích nuôi cấy, nồng độ sử dụng từ
1-6%, đóng vai trò là chất thẩm thấu chính của môi trường. Nếu hàm lượng đường
cao, mô nuôi cấy khó hút được nước, còn hàm lượng đường thấp là một trong
những nguyên nhân gây ra hiện tượng thủy tinh thể (Vũ Văn Vụ và ctv., 2006).
Đường còn có vai trò quan trọng trong sự tạo rễ bất định (Nguyễn Đức Lượng và Lê
Thị Thủy Tiên, 2002).
Thạch (Agar)
Tùy đối tượng nuôi cấy mà hàm lượng thạch được sử dụng dao động từ 6-8
g/l (Nguyễn Xuân Linh, 1998). Agar được bào chế từ rong biển, dùng làm chất nền
cho môi trường nuôi cấy vì nó có nguồn gốc thực vật tự nhiên, agar không gây độc
cho môi trường (Nguyễn Bảo Toàn, 2010).
Các vitamin
Các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamin
(B1), acid nicotinic (PP), pyridoxin (B6) và myo-inositol. Trong đó thiamin là một
vitamin căn bản cần thiết cho sự tăng trưởng của tất cả các tế bào (Nguyễn Đức
Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
Chất điều hòa sinh trưởng
+ Auxin
Bổ sung auxin vào môi trường nuôi cấy nhằm kích thích sự vươn dài tế bào,
kích thích hình thành rễ, tăng cường quá trình trao đổi chất. Các auxin thường được
sử dụng trong nuôi cấy mô: IAA (Indole-3-acetic acid), NAA (Napthalene acetic
acid), IBA (Indole-3-butyric acid), 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxy acetic acid).
NAA có tác dụng làm tăng hô hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính
enzyme và ảnh hưởng đến trao đổi chất nitơ, tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng
đường trong môi trường nuôi cấy. Trong nuôi cấy mô thường sử dụng NAA kết hợp
với cytokinin để nhân chồi.
Có những loài thực vật về mặt cơ bản không cần cả auxin và cytokinin để tạo

chồi bất định. Tuy nhiên, khi bổ sung auxin và cytokinin vào môi trường nuôi cấy
thì những chất này cũng có tác dụng lên sự tạo chồi. Hầu hết các loài thực vật đều
cần đến cytokinin để cảm ứng tạo chồi, trong khi auxin thì có vai trò ngược lại. Tuy
nhiên, khi kết hợp nồng độ auxin thấp với nồng độ cytokinin cao sẽ kích thích sự
tạo chồi.


8

+ Cytokinin
Cytokinin là chất điều hòa sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phân chia tế
bào, các chất được sử dụng phổ biến là BA (Benzyl adenine), kinetin, zeatin và
TDZ (Thidiazuron). Hiệu quả của kích thích tố BA là rất đa dạng, vừa có khả năng
tạo chồi, nhân chồi và kéo dài chồi đồng thời với nồng độ thấp BA có thể hỗ trợ sự
thành lập rễ (Lee và ctv., 2003; Hashemloian và ctv., 2008). Khi kết hợp cytokinin
với auxin tỷ lệ 1:1 thích hợp cho sự tạo mô sẹo. Tuy nhiên, sử dụng hàm lượng
cytokinin cao có thể gây ra một số vấn đề trong các cây được nhân giống như sự
thừa nước, tạo thành bụi rậm, biến dị vô tính… (Nguyễn Bảo Toàn, 2010). Ở nồng
độ cao chúng có thể cảm ứng tạo chồi bất định nhưng ức chế sự tạo rễ; chúng kích
thích tạo chồi nách do làm chậm và giảm hoạt động tính trội của chồi đỉnh (Pierik,
1991). Để đạt được tỷ lệ nhân giống cao, số lượng tương đối lớn cytokinin đã được
sử dụng trong môi trường nuôi cấy.
pH
Tế bào và mô thực vật đòi hỏi pH tối ưu cho sinh trưởng và phát triển trong
nuôi cấy. pH ảnh hưởng đến sự di chuyển của các ion và đối với hầu hết các môi
trường nuôi cấy pH 5,5-6,0 trước khi khử trùng được xem là tối ưu. pH còn ảnh
hưởng đến sự hấp thu khoáng trong môi trường nuôi cấy. pH môi trường cao hơn sẽ
làm cho môi trường rất rắn ngược lại pH thấp hơn giảm khả năng đông đặc của agar
(Lê Văn Hoàng, 2008).
Nước dừa

Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và
chất kích thích sinh trưởng (George, 1993; George, 1996). Theo Nguyễn Bảo Toàn
(2010), diphenylurea (DPU) có hoạt tính giống như cytokinin là chất chính trong
nước dừa. Nước dừa đã được sử dụng để kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi ở
nhiều loại cây. Nước dừa thường được sử dụng ở nồng độ từ 5-20% (Lê Văn
Hoàng, 2008).
1.3 MÔ SẸO VÀ TÁI SINH CHỒI
Mô sẹo bao gồm một khối vô định hình của các tế bào nhu mô có vách mỏng
được sắp xếp lỏng lẻo (Nguyễn Bảo Toàn, 2010). Mô sẹo hình thành từ các mô
hoặc cơ quan đã phân hóa dưới điều kiện đặc biệt như vết thương, xử lý với các
chất điều hòa sinh trưởng thực vật

9

Theo Vũ Văn Vụ (1999), mô sẹo khi hình thành thường có hai loại: loại xốp
có nhiều tế bào xốp với nhân nhỏ, tế bào chất lỏng và không bào to; Loại cứng là
các tế bào cứng chắc thành khối nhân to, tế bào chất đậm đặc và không bào nhỏ.
Khả năng tái sinh chồi sớm mất đi ở mô sẹo xốp nhưng vẫn duy trì ở mô sẹo
cứng. Nguyên nhân có thể do các tế bào mô sẹo mất đi khả năng tổng hợp một số
chất thiết yếu cho sự tái sinh của nó khi số lần cấy chuyền tăng lên. Do đó, khi nuôi
cấy mô sẹo nhằm mục đích tái sinh chồi thì phải chọn môi trường thích hợp cho sự
hình thành các khối mô sẹo cứng chắc.
1.4 ĐỘT BIẾN TRONG CHỌN GIỐNG CÂY TRỒNG
1.4.1 Định nghĩa
Đột biến là những biến đổi bất thường trong vật chất di truyền, nghĩa là những
biến đổi trong cấu trúc gen hoặc trong cấu trúc và số lượng nhiễm sắc thể. Đột biến
tạo nên vô số biến dị, làm tăng tính đa dạng trong sinh giới (Khuất Hữu Thanh,
2003).
Theo Chu Thị Thơm và ctv. (2006) đột biến được chia làm hai loại: đột biến
gen và đột biến nhiễm sắc thể.

+ Đột biến gen là những biến đổi trong cấu trúc phân tử của gen, tức là nó làm
thay đổi số lượng, thành phần và trật tự của các nucleotide trong DNA. Tần số đột
biến có thể thay đổi tùy vào các tác nhân gây đột biến. Các tác nhân gây đột biến là:
các chất hóa học (thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ…), các tác nhân vật lý (tia phóng xạ:
tia X, tia β…). Thường là đột biến lặn và có hại cho cơ thể, cũng có một số là đột
biến trội. Có ý nghĩa rất lớn đối với quá trình tiến hóa và chọn giống.
+ Đột biến nhiễm sắc thể là những đột biến làm đứt hoặc thay đổi cấu trúc
nhiễm sắc thể.
Đa số đột biến xảy ra là đột biến lặn, do đó ở thế hệ F1 alen đột biến bị alen
trội lấn át nên sẽ không biểu hiện ra bên ngoài (trừ trường hợp đột biến trội và trội
không hoàn toàn). Nó chỉ được phát hiện ra ở thế hệ F2, F3 và các thế hệ sau khi tự
thụ (Trần Đình Long và ctv., 1997).
1.4.2 Phương pháp gây đột biến bằng tác nhân vật lý
Tia gamma là tia không bị lệch trong điện trường, có bước sóng rất ngắn <0,05
A
o
do hạt nhân nguyên tử bị kích thích phóng ra. Tia gamma thường được sử dụng
là Co
60
. Được sử dụng nhiều trong gây đột biến nhân tạo ở thực vật.

10

Tia bức xạ ion hóa tác dụng lên cơ thể sống thông qua hai con đường: tác động
trực tiếp (tác kích vào các đại phân tử sinh học chức năng gây biến đổi chúng và tạo
nên hiệu ức sinh học), và tác dụng gián tiếp (thông qua sự xạ phân của phân tử
nước).
Sinh vật là do các vật chất hữu cơ và vô cơ tạo thành, được cấu tạo từ các
nguyên tử và phân tử. Về cấu tạo: nguyên tử có hạt nhân mang điện tích dương và
xung quanh mang điện tích âm. Số điện tích âm và dương trong nguyên tử thường

cân bằng. Khi chiếu xạ các tia X, tia β… vào cơ thể sinh vật sẽ làm mất đi một số
điện tử dẫn đến hiện tượng mất cân bằng và nguyên tử mang điện tích dương. Như
vậy, các tia có tác dụng ion hóa các nguyên tử, các nguyên tử ion hóa sẽ làm cho
các phân tử cấu tạo nên cơ thể sinh vật như DNA, protein có những biến đổi về hóa
học. Nếu biến đổi hóa học xảy ra trên đơn vị gen thì gen có thể phát sinh đột biến
(Nguyễn Văn Hiển, 2000).
Trần Đình Long và ctv. (1997) cho rằng, sự tác dụng của các tia phóng xạ lên
vật chất sống là bước đầu tiên của quá trình lý hóa, quá trình này xảy ra trong một
thời gian cho đến khi có sự cấu tạo lại phân tử, làm thay đổi các quá trình sinh hóa
và cuối cùng gây nên đột biến gen hay gãy đoạn nhiễm sắc thể. Độ nhạy cảm phóng
xạ của mỗi tế bào đều khác nhau, tế bào đa bội của một loài có độ nhạy cảm phóng
xạ hơn những tế bào lưỡng bội và đơn bội.
Tính mẫn cảm của cây là khác nhau, phụ thuộc vào liều chiếu xạ, bộ phận
chiếu xạ, bản chất di truyền, đặc điểm sinh lý cũng như thời kỳ sinh trưởng của cây.
Liều lượng bức xạ cao có thể gây ra thay đổi lớn, nhiều khi làm giảm khả năng sống
hoặc độ hữu thụ. Do đó, trong chọn giống để thu được các đột biến nhỏ có lợi,
người ta thường dùng liều chiếu xạ thấp hơn liều tới hạn từ 1,5-2 lần, tốt nhất là chỉ
sử dụng những liều làm giảm tỉ lệ nảy mầm và ít kìm hãm sinh trưởng (Trần
Thượng Tuấn, 1992).
Bộ phận chiếu xạ có thể là hạt phấn, cành, củ, mô sẹo, hạt, …. Kết quả nghiên
cứu cho thấy chiếu xạ đột biến vào lúc hạt đang nảy mầm, cây con thì đạt hiệu quả
cao hơn so với hạt ở trạng thái nghỉ và cây trưởng thành (Trần Thượng Tuấn, 1992).
1.5 TẠO GIỐNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỘT BIẾN KẾT HỢP VỚI KỸ
THUẬT NUÔI CẤY MÔ
Ngày nay, các dạng đột biến nhân tạo là nguồn vật liệu khởi đầu ngày càng
được ứng dụng rộng rãi nhờ tạo được các biến dị có ích. Bằng phương pháp gây đột
biến nhân tạo, các nhà chọn giống có thể thu được những biến dị chưa từng có trong
tự nhiên (Trần Thượng Tuấn, 1992).

11

Việc kết hợp giữa phương pháp gây đột biến với nuôi cấy mô tế bào sẽ làm
tăng tần số biến dị lên nhiều lần và giúp rút ngắn thời gian trong công tác chọn tạo
giống mới (Theo Lê Trần Bình và ctv., 1997).
Theo Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang (2007), trong nhiều loài cây trồng,
người ta có thể khai thác đột biến thông qua nuôi cấy tế bào soma. Tế bào soma
được nuôi cấy trong môi trường có auxin, thường ở dạng 2,4-D (2-4 mg/l). Mô sẹo
là những khối tế bào có tính chất chưa phân hóa chức năng có thể được xử lý với
tác nhân gây đột biến. Chồi mầm có thể được chiếu xạ ở liều lượng 20-60Gy.
Theo Dương Tấn Nhựt (2009) cho rằng nuôi cấy mô sẹo sẽ cho tính nhạy cảm
hơn đối với xử lý bức xạ và đòi hỏi liều thấp (2-5 Gy) hơn là các đoạn thân hoặc
chiếu xạ các hạt giống; với các liều tương đối cao hơn (15-20 Gy) các mẫu sẽ bị
chết hoặc mất đi khả năng tái sinh. Ví dụ, nuôi cấy mô sẹo tái sinh của cây chà là
được chiếu xạ trên 25 Gy cho khả năng sống sót rất thấp. Ở khoai lang, 10 Gy là
liều gây chết đối với nuôi cấy mô sẹo.
Theo Chahal và Gosal (2002) tạo đột biến kết hợp nuôi cấy mô có những ưu
điểm sau:
+ Nhiều yếu tố có tính chất ngoại cảnh có thể được kiểm soát tốt hơn.
+ Có ít cơ hội cho sự hình thành thể khảm nếu cây tái sinh có nguồn gốc từ
một tế bào.
+ Tần suất đột biến thường khá cao bởi vì mỗi tế bào đều được tiếp xúc trực
tiếp với tác nhân gây đột biến.
1.6 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ KHẢ NĂNG TẠO BIẾN DỊ VÀ TÁI SINH
CHỒI BẰNG PHƯƠNG PHÁP GÂY ĐỘT BIẾN KẾT HỢP VỚI KỸ THUẬT
NUÔI CẤY MÔ
Theo Hồ Tân (2010), khi chiếu xạ tia gamma ở liều chiếu xạ 45 Gy đã ảnh
hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của hai loại chồi hoa hồng Nhung in vitro.
Tỷ lệ chồi còn sống sau 6 tuần giảm còn 77,5%, số chồi, chiều cao chồi, số rễ, chiều
dài rễ và tỷ lệ chồi ra rễ đều giảm so với đối chứng, tỷ lệ biến đổi hình thái 38,6%,
tỷ lệ lá biến đổi hình thái 48,1%, tỷ lệ cây biến đổi hình thái 23,8% đều tăng so với

đối chứng. Chiếu xạ bằng tia gama có ảnh hưởng đến thời gian nở hoa, độ bền của
hoa, đường kính hoa và số lượng cánh hoa. Ở liều chiếu xạ 45 Gy đã tạo được hoa
có kích thước, số lượng cánh hoa và độ bền ưu thế hơn so với đối chứng và liều
chiếu 30 Gy. Sử dụng mẫu cấy là chồi bên cho tỷ lệ sống thấp hơn so với chồi ngọn,