khảo sát sự hiện diện của vi khuẩn escherichia coli sinh beta lactamases phổ rộng trên gà khỏe tại huyện long hồ tỉnh vĩnh long

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y


NGUYỄN HUỲNH ĐẢM


KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA VI KHUẨN
ESCHERICHIA COLI SINH BETA-LACTAMASES
PHỔ RỘNG TRÊN GÀ KHỎE TẠI HUYỆN
LONG HỒ TỈNH VĨNH LONG


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
NGÀNH THÚ Y


Cần Thơ, 2014

i

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
NGÀNH THÚ Y










Giảng viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện
ThS. BÙI THỊ LÊ MINH NGUYỄN HUỲNH ĐẢM
MSSV: 3103014
Lớp: CN10Y4A1 – Khóa 36


Cần Thơ, 2014
KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA VI KHUẨN
ESCHERICHIA COLI SINH BETA-LACTAMASES
PHỔ RỘNG TRÊN GÀ KHỎE TẠI HUYỆN
LONG HỒ TỈNH VĨNH LONG


ii

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y

Đề tài “Khảo sát sự hiện diện của vi khuẩn Escherichia coli sinh beta –
lactamases phổ rộng trên gà khỏe tại huyện Long Hồ tỉnh Vĩnh Long” do sinh
viên Nguyễn Huỳnh Đảm thực hiện tại Bộ môn Thú Y, Khoa Nông Nghiệp & Sinh
Học Ứng Dụng, Trƣờng Đại Học Cần Thơ từ tháng 8 năm 2014 đến tháng 12 năm
2014.


Cần Thơ, ngày….tháng… năm 2014 Cần Thơ, ngày….tháng… năm 2014
Duyệt Bộ Môn Giảng viên hƣớng dẫn


ThS. Bùi Thị Lê Minh


Cần Thơ, ngày….tháng… năm 2014
Duyệt Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng










iii

LỜI CẢM ƠN

Trải qua những năm tháng học tập tại trƣờng và những ngày tháng làm luận văn tốt
nghiệp, tôi xin:
Thành kính biết ơn!
Sự dạy dỗ, động viên và lo lắng của cha mẹ và những ngƣời thân trong gia đình
chính là nguồn động lực thúc đẩy tôi nổ lực và phấn đấu. Trong tận đáy lòng tôi xin
chân thành cám ơn những ngƣời thân yêu và kính dâng lên cha mẹ lòng biết ơn sâu
sắc, ngƣời đã dành cả cuộc đời mình cho tôi cất bƣớc đến trƣờng.
Xin chân thành biết ơn!
Cô Bùi Thị Lê Minh đã dành thời gian quý báo, hết lòng chỉ bảo, giúp đỡ và động
viên tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Cô Châu Thị Huyền Trang, cố vấn học tập đã luôn nhắc nhở và động viên tôi trong
suốt thời gian học tập ở trƣờng.
Quý Thầy, Cô Bộ môn Thú y và Bộ môn Chăn nuôi đã tận tình truyền đạt những
kiến thức và kinh nghiệm vô cùng quý báu với tôi trong suốt thời gian qua.
Chân thành cám ơn!
Xin cám ơn các anh chị Cao học Thú Y khóa 19, các bạn Dƣợc Thú Y khóa 36 và
các em sinh viên Dƣợc Thú Y khóa 37 học việc tại phòng thí nghiệm đã động viên
và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.

iv

TÓM LƢỢC

Đề tài được thực hiện từ tháng 8 năm 2014 đến tháng 12 năm 2014 nhằm mục tiêu
xác định tỷ lệ hiện diện E. coli sinh beta - lactamases trên gà khỏe xuất thịt từ một
số trại gà công nghiệp ở huyện Long Hồ tỉnh Vĩnh Long bằng phương pháp đĩa kết
hợp. Qua khảo sát 440 mẫu gồm 110 mẫu phân, 110 mẫu gan, 110 mẫu phổi và 110
mẫu thịt của 110 con gà khỏe gồm 55 gà thịt và 55 gà đẻ từ 20 trại gà công nghiệp,
kết quả cho thấy tỷ lệ hiện diện E. coli ESBL trên gà là 62,7% trong đó gà thịt có tỷ
lệ hiện diện E. coli ESBL (85,5%) cao hơn ở gà đẻ (40%). Sự hiện diện của E. coli
ESBL trên mẫu thịt, gan, phổi và phân lần lượt là 13,6%; 7,3%; 19,1% và 62,7%.

v

MỤC LỤC

TRANG TỰA i
TRANG DUYỆT ii
LỜI CẢM ƠN iii
TÓM LƢỢC iv
MỤC LỤC v
DANH MỤC VIẾT TẮT vii
DANH MỤC BẢNG viii
DANH MỤC HÌNH ix
CHƢƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƢƠNG 2 CƠ SỞ LÝ LUẬN 2
2.1 Giới thiệu vi khuẩn E. coli 2
2.1.1 Đặc điểm hình thái E. coli 3
2.1.2 Đặc điểm nuôi cấy E. coli 3
2.1.3 Đặc tính sinh hóa 4
2.1.4 Cấu trúc kháng nguyên 5
2.1.5 Sức đề kháng 6
2.1.6 Độc tố vi khuẩn 6
2.1.7 Tính gây bệnh 7
2.2 Giới thiệu về vi khuẩn sinh ESBL 7
2.3 Giới thiệu một số phƣơng pháp phát hiện vi khuẩn sinh ESBL 9
2.3.1 Phƣơng pháp ChromID ESBL agar 9
2.3.2 Phƣơng pháp đĩa đôi 9
2.3.3 Băng giấy E-test ESBL 9
2.3.4 Phƣơng pháp đĩa kết hợp 10

vi

CHƢƠNG 3 PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11
3.1 Phƣơng tiện nghiên cứu 11
3.1.1 Thời gian, địa điểm, đối tƣợng nghiên cứu 11
3.1.2 Hóa chất 11
3.1.3 Thiết bị và dụng cụ 11
3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 11
3.2.1 Phƣơng pháp lấy mẫu 11
3.2.2 Phƣơng pháp phân lập E. coli ESBL 12
3.2.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu 14
CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 15
4.1 Kết quả khảo sát sự hiện diện của E. coli ESBL trên gà thịt khỏe 15
4.2 Kết quả khảo sát sự hiện diện của E. coli ESBL trên gà đẻ khỏe 16
4.3 Kết quả khảo sát sự hiện diện của E. coli ESBL trên gà công nghiệp 18
CHƢƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 21
5.1. Kết luận 21
5.2. Đề nghị 21
TÀI LIỆU THAM KHẢO 22
PHỤ CHƢƠNG 24
1. Một số hình ảnh thu thập đƣợc trong thời gian nghiên cứu 24
2. Kết quả xử lí thống kê 26






vii

DANH MỤC VIẾT TẮT

Chữ viết tắt
Chữ viết đầy đủ
APEC
Avian Pathogenic E. coli
CFU
Colony Forming Unit
CLSI
Clinical and Laboratory Standards Institute
E. coli
Escherichia coli
EMB
Eosin Methyl Blue
ESBL
Extended-spectrum beta-lactamases
EPEC
Enteropathogenic E. coli
ETEC
Enterotoxigenic E. coli
EIEC
Enteroinvasive E. coli
EAEC
Enteroaggregative E. coli
EHEC
Enterohaemorrhagic E. coli
MC
MacConkey Agar
MHA
Mueller Hinton Agar

MR
Methyl Red
NA
Nutrient Agar
VP
Voges Proskauer







viii

DANH MỤC BẢNG

Bảng
Tựa bảng
Trang
2.1
Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E. coli
5
3.1
Dung lƣợng mẫu khảo sát
12
4.1
Tỷ lệ E. coli ESBL dƣơng tính trên gà thịt
15
4.2
Tỷ lệ E. coli ESBL dƣơng tính trên gà đẻ
16
4.3
Tỷ lệ sự hiện diện của E. coli ESBL trên gà thịt và gà đẻ
18

ix

DANH MỤC HÌNH

Hình
Tựa hình
Trang
2.1
Khuẩn lạc E. coli trên môi trƣờng MC
4
3.1
Quy trình nuôi cấy phân lập vi khuẩn E. coli ESBL
13
4.1
So sánh sự hiện diện của E. coli ESBL trên gà thịt
15
4.2
So sánh sự hiện diện của E. coli ESBL trên gà đẻ
17

4.3
So sánh sự hiện diện của E. coli ESBL trên gà thịt và gà đẻ
18

1

CHƢƠNG 1
ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây, ngành chăn nuôi gà đang phát triển mạnh mẽ với quy
mô lớn, việc phát triển đàn một cách nhanh chóng đã làm tăng nguy cơ lây lan dịch
bệnh, thậm chí phát sinh nhiều bệnh nguy hiểm gây thiệt hại lớn cho nhà chăn
nuôi, trong đó phải kể đến Colibacillosis do vi khuẩn Escherichia coli trên gà. Vi
khuẩn E. coli là nguyên nhân gây viêm rốn, viêm túi lòng đỏ ở gà con, viêm túi
khí, nhiễm trùng huyết và thƣờng kết hợp với Mycoplasma gallisepticum gây viêm
khớp, sƣng phù đầu, viêm màng bụng (Hồ Thị Việt Thu và Nguyễn Đức Hiền,
2012).
Vĩnh Long là một tỉnh có vị thế phát triển mạnh về chăn nuôi đặc biệt là chăn nuôi
gà theo mô hình công nghiệp, do đó sự ảnh hƣởng của E. coli trên đàn gà là không
thể tránh khỏi. Trong những năm gần đây, một số nghiên cứu cho thấy vi khuẩn
E. coli sinh men beta – lactamases phổ rộng là một trong những nguyên nhân gây
thất bại trong việc điều trị bệnh nhiễm khuẩn bằng kháng sinh do vi khuẩn tiết ra
men beta - lactamases phổ rộng làm bất hoạt kháng sinh nhóm beta – lactam và
một số nhóm kháng sinh khác. Vì vậy, việc nghiên cứu về vi khuẩn E. coli sinh
men beta – lactamases là rất cần thiết nên đề tài “Khảo sát sự hiện diện của vi
khuẩn Echerichia coli sinh beta – lactamases phổ rộng trên gà khỏe tại huyện
Long Hồ tỉnh Vĩnh Long” đƣợc thực hiện nhằm mục tiêu xác định tỷ lệ vi khuẩn
E. coli sinh men beta – lactamases dƣơng tính trên gà khỏe nuôi công nghiệp.

2

CHƢƠNG 2
CƠ SỞ LÝ LUẬN

2.1 Giới thiệu vi khuẩn E. coli
Vi khuẩn Escherichia coli thuộc họ Enterobacteriaeceae đƣợc bác sĩ ngƣời Đức là
Theodor Escherich (1858 - 1911) phân lập đầu tiên và đƣa ra đặc điểm của vi
khuẩn vào năm 1885. E. coli thƣờng xuất hiện rất sớm bên trong đƣờng ruột của
ngƣời và động vật sơ sinh (sau đẻ 2 giờ), chúng thƣờng ở phần sau của ruột, ít khi
xuất hiện ở dạ dày hay ruột non. Trong nhiều trƣờng hợp chúng đƣợc tìm thấy ở
niêm mạc của nhiều bộ phận khác nhau trong cơ thể (Nguyễn Nhƣ Thanh, 1997).
Trong các vi khuẩn đƣờng ruột loài Escherichia coli là loài phổ biến nhất, chúng
sinh sống bình thƣờng trong đƣờng ruột của ngƣời và động vật. Khi các điều kiện
nuôi dƣỡng, khẩu phần thức ăn, vệ sinh thú y kém, sức chống đỡ bệnh tật của con
vật yếu, thì E. coli trở nên cƣờng độc và có khả năng gây bệnh (Đào Trọng Đạt,
1999).
Theo Nataro and Kaper (1998) có 6 nhóm E. coli gây bệnh đƣợc biết đến đó là:
Enteropathogenic E. coli (EPEC) mang yếu tố bám dính và có khả năng xâm
nhiễm vào ruột non, phá hủy lớp tế bào biểu mô ruột, kèm theo biểu hiện sốt và
tiêu chảy. Vi khuẩn thuộc nhóm này thƣờng gây bệnh ở ngƣời, thỏ, chó, mèo, heo
và có thể ở ngựa.

Enterotoxigenic E. coli (ETEC) vi khuẩn thuộc nhóm này thƣờng có khả năng
mang yếu tố kháng nguyên bám dính và sinh độc tố đƣờng tiêu hóa. Vi khuẩn
nhóm này thƣờng gây bệnh tiêu chảy trên ngƣời, heo, cừu, gà, bò, chó và ngựa.
Enteroinvasive E. coli (EIEC) vi khuẩn xâm nhiễm vào biểu mô tế bào ruột, làm
dung giải thể thực bào. Vi khuẩn thuộc nhóm này chủ yếu đƣợc phân lập ở ngƣời.
Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) phân lập đƣợc từ ngƣời và động vật nhai lại.
Nhóm này thƣờng sản sinh yếu tố xâm nhiễm, độc tố Shiga (Stx). Quá trình xâm
nhiễm và gây bệnh thƣờng gây nên những bệnh lý tế bào rất nặng.
Enteroaggregative E. coli (EAEC) có khả năng sản sinh ra yếu tố bám dính và
xâm nhập đƣợc xác định là yếu tố liên quan đến bệnh tiêu chảy của heo con sau cai
sữa. Vi khuẩn nhóm này có thể tìm thấy ở ngƣời và ở heo, bò.
Diffusely adhering E. coli (DAEC) có thể tìm thấy trong ruột non, đặc biệt là ở trẻ
em từ 12 tháng tuổi trở lên. Trong một nghiên cứu trên những đứa trẻ ở bệnh viện
giữa độ tuổi từ 1 tháng tuổi đến 14 tuổi, đa số những bệnh nhân nhiễm DAEC đều

3

bị ói mửa. Một vài nghiên cứu cho thấy DAEC là nguyên nhân của bệnh tiêu chảy.
DAEC đƣợc xem là tác nhân gây bệnh trên những trẻ sơ sinh hơn là những đứa trẻ
tập đi và biết đi.
2.1.1 Đặc điểm hình thái E. coli
Escherichia coli là một loại trực khuẩn hình gậy ngắn, gram âm, kích thƣớc 2 -
3µm x 0,6µm. Trực khuẩn có hình cầu, đứng riêng lẻ đôi khi xếp thành chuỗi
ngắn. Phần lớn E. coli di động do có lông ở quanh thân, nhƣng một số không thấy
di động. Vi khuẩn không sinh nha bào, có khả năng hình thành giáp mô khi gặp
môi trƣờng tốt. Nếu cố định bằng axit osmic rồi quan sát dƣới kính hiển vi thấy tế
bào E. coli có nhân đó là một khối tối nằm trong nguyên sinh chất màu sáng
(Nguyễn Nhƣ Thanh, 1997).
2.1.2 Đặc điểm nuôi cấy E. coli
E. coli phát triển dễ dàng trên các môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng, một số còn

phát triển ở môi trƣờng đơn giản. E. coli là trực khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy
tiện, có thể sống đƣợc ở nhiệt độ từ 5 - 40°C, nhiệt độ thích hợp là 37°C, pH thích
hợp là 7,2 – 7,4, phát triển đƣợc ở pH 5,5 – 8,0.
Trên môi trƣờng EMB (Eosin Methyl Blue) khuẩn lạc E. coli to, tròn, hơi lồi,
bóng, màu thẫm tím, có ánh kim (Lƣu Hữu Mãnh, 2010).
Trên môi trƣờng NA (Nutrient Agar) và môi trƣờng TSA (Trypticase Soy Agar)
sau 18 – 24 giờ ủ trong tủ ấm 37°C hình thành những khuẩn lạc tròn, màu trắng
nhạt, mặt khuẩn lạc hơi lồi, đƣờng kính 2 – 3 mm (Đào Trọng Đạt, 2001).
Môi trƣờng nƣớc thịt vi khuẩn phát triển tốt, môi trƣờng rất đục, có cặn màu tro
nhạt lắng xuống đáy, đôi khi có màu xám nhạt trên mặt môi trƣờng, môi trƣờng có
mùi phân thối. Trên môi trƣờng Meller Kauffman và môi trƣờng Malasit, E. coli
không mọc, môi trƣờng Vinson Blai thì E. coli bị ức chế (Nguyễn Nhƣ Thanh và
ctv., 1997).
Trên môi trƣờng thạch máu: sau 24 giờ nuôi cấy ở 37°C, vi khuẩn E. coli hình
thành khuẩn lạc to, ƣớt, lồi, viền không gọn, màu sáng, kích thƣớc từ 1 – 2 mm, có
thể có hoặc không có dung huyết tùy thuộc vào chủng.
Trên môi trƣờng MC (MacConkey Agar) vi khuẩn E. coli hình thành khuẩn lạc
tròn đều màu hồng nhạt, mặt khuẩn lạc hơi lồi, kích thƣớc 2 – 3 mm (Nguyễn
Ngọc Hải, 2012).



4


Hình 2.1: Khuẩn lạc E. coli trên môi trƣờng MC
()
2.1.3 Đặc tính sinh hóa
Đặc tính lên men các loại đƣờng: Nhóm Escherichia coli gồm những trực khuẩn
di động hoặc không di động, có khả năng lên men sinh hơi các loại đƣờng

Glucoza, Fructoza, Galactoza, Lactoza, Maniton, Mannit, Levuloza, Xyloza. Lên
men không chắc chắn với các loại đƣờng Dulciton, Sacaroza, Lactose trong khi đó
vi khuẩn Salmonella thì không có đặc tính này, đây là đặc điểm quan trọng để
phân biệt vi khuẩn E. coli và Salmonella (Nguyễn Nhƣ Thanh và ctv., 1997).
Vi khuẩn E. coli đƣợc định danh bằng các phản ứng sinh hóa qua các môi trƣờng
KIA (Kliler Iron Agar), Simmons Citrate, VP (Voges – Proskauer), MR (Methyl
Red), LIM (Lysine Indole Motility Medium) (Nguyễn Ngọc Hải, 2012).
Môi trƣờng Trypton dùng để kiểm tra tính sinh Indole của vi khuẩn. Trên môi
trƣờng này, sau khi nhỏ thuốc thử Kovac’s vào nếu trên bề mặt môi trƣờng xuất
hiện vòng đỏ thì phản ứng dƣơng tính và ngƣợc lại nếu trên bề mặt môi trƣờng
không xuất hiện vòng đỏ thì Indole âm tính.
Môi trƣờng MR dùng để kiểm tra tính sử dụng đƣờng của vi khuẩn. Nhỏ lên bề
mặt môi trƣờng vài giọt thuốc thử Methyl Red, phản ứng dƣơng tính sẽ có vòng đỏ
xuất hiện trên bề mặt môi trƣờng và ngƣợc lại.
Môi trƣờng VP dùng để kiểm tra tính di động và tính sinh aceton của vi khuẩn. Vi
khuẩn có khả năng di động sẽ làm đục môi trƣờng. Ngƣợc lại, vi khuẩn không có
khả năng di động thì chỉ thấy vi khuẩn mọc theo đƣờng que cấy, môi trƣờng
xung quanh trong. Trên môi trƣờng VP, sau khi cho thuốc thử VP1 (α-napthol),
VP2 (KOH) vào nếu trên bề mặt môi trƣờng có vòng đỏ thì chứng tỏ vi khuẩn có
khả năng sinh aceton. Ngƣợc lại, nếu trên bề mặt môi trƣờng không xuất hiện vòng
đỏ thì vi khuẩn không có khả năng sinh aceton.

5

Môi trƣờng Simmons citrate dùng để kiểm tra khả năng sử dụng citrate thay nguồn
carbon của vi khuẩn. Trên môi trƣờng này, vi khuẩn cho kết quả dƣơng tính khi
màu của môi trƣờng chuyển từ xanh lá cây sang xanh dƣơng. Cho phản ứng âm
tính khi môi trƣờng vẫn giữ nguyên màu xanh lá.
Bảng 2.1: Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E. coli (Nguyễn Ngọc Hải, 2012)
Phản ứng sinh hóa

Kết quả
Di động
Glucose
Lactose
H
2
S
Indole
Methyl red
Voges Proskauer
Citrate
Dƣơng tính
Dƣơng tính
Dƣơng tính
Âm tính
Dƣơng tính
Dƣơng tính
Âm tính
Âm tính
2.1.4 Cấu trúc kháng nguyên
Cấu trúc kháng nguyên của E. coli rất phức tạp, có 3 loại kháng nguyên: kháng
nguyên thân O (Somatic), kháng nguyên H (Flagellar) và kháng nguyên vỏ K
(Capsular). Cho đến nay ngƣời ta đã xác định đƣợc 175 type kháng nguyên O, 80
type kháng nguyên K và 56 type kháng nguyên H.
Kháng nguyên O (Somatic – kháng nguyên thân)
Đây là thành phần chính của vi khuẩn và cũng đƣợc coi là yếu tố độc lực của vi
khuẩn. Kháng nguyên O đƣợc coi là ngoại độc tố, đƣợc tìm thấy màng ngoài vỏ vi
khuẩn và thƣờng xuyên phóng thích vào môi trƣờng nuôi cấy. Tất cả kháng
nguyên O đều cƣ trú bề mặt, do vậy có thể liên kết trực tiếp với hệ thống miễn
dịch. Kháng nguyên O khi gặp kháng huyết thanh tƣơng ứng sẽ xãy ra phản ứng

ngƣng kết gọi là “hiện tƣợng ngƣng kết O” thân vi khuẩn ngƣng kết với nhau dƣới
dạng những hạt khô, rất khó tan khi lắc. Kháng nguyên O chịu nhiệt, khi đun ở
100°C trong vòng 2 giờ 30 phút vẫn giữ đƣợc tính kháng nguyên, giữ đƣợc khả
năng ngƣng kết và kết tủa. Không bị cồn phá hủy, có tính chất của một
lipopolysaccharide. Đặc tính của kháng nguyên O và kháng nguyên H giống các
trực khuẩn đƣờng ruột khác. Kháng nguyên O là thành phần gây đáp ứng miễn
dịch đối với vật chủ. Ngƣời ta có thể tách chiết kháng nguyên O của vi khuẩn
E. coli bằng các loại dung môi hữu cơ hoặc bằng phƣơng pháp tổ hợp gene để sản

6

xuất vaccine phòng bệnh hoặc gây miễn dịch để chế kháng huyết thanh chẩn đoán
(Nguyễn Vĩnh Phƣớc, 1970).
Kháng nguyên H (Flagelar – kháng nguyên lông)
Kháng nguyên H là kháng nguyên kém chịu nhiệt, đƣợc cấu tạo bởi protein. Ở
100°C trong vòng 2 giờ 30 phút tính kháng nguyên, khả năng ngƣng kết của kháng
nguyên đều bị hủy (Đào Trọng Đạt và ctv., 1999). Kháng nguyên H của vi khuẩn
E. coli không có vai trò về bám dính, đồng thời không có vai trò đáp ứng miễn
dịch nên ít đƣợc quan tâm nghiên cứu, nhƣng nó có ý nghĩa lớn trong việc xác
định giống, loài của vi khuẩn và bảo vệ vi khuẩn khỏi bị tiêu diệt trong tế bào đại
thực bào, giúp vi khuẩn sống lâu và tồn tại trong đại thực bào.
Kháng nguyên K (Capsular – kháng nguyên bề mặt)
Kháng nguyên K còn đƣợc gọi là kháng nguyên vỏ, kháng nguyên màng tế bào.
Đƣợc cấu tạo bởi polysaccharide hoặc protein. Loại này chỉ có ở một số loại vi
khuẩn đƣờng ruột. Những chủng có kháng nguyên L và B thƣờng không chịu nhiệt
và không tìm thấy giáp mô (Nguyễn Nhƣ Thanh và ctv., 1997).
2.1.5 Sức đề kháng
Vi khuẩn có thể bị vô hoạt ở nhiệt độ 60°C trong 30 phút, ở 70°C vi khuẩn bị vô
hoạt trong 2 phút, trong điều kiện đông khô vi khuẩn có thể sống lâu. Vi khuẩn có
khả năng đề kháng với nhiều loại kim loại nặng nhƣ: arsenic, đồng, kẽm, thủy

ngân và các chất sát trùng nhƣ hỗn hợp amonium, oxy già, formadehyde và
chlorhexidine (Hồ Thị Việt Thu và ctv., 2012).
Các chất tiêu độc bình thƣờng nhƣ phenol, formol, vôi ở nồng độ thông thƣờng
cũng làm E. coli chết rất nhanh. Tuy nhiên, ở môi trƣờng bên ngoài các chủng
E. coli độc có thể tồn tại đến 4 tháng (Nguyễn Nhƣ Thanh và ctv., 1997).
2.1.6 Độc tố vi khuẩn
E. coli là trực khuẩn thƣờng trú ở đƣờng ruột của ngƣời và loài động vật máu
nóng, hầu hết các chủng E. coli đều vô hại. Tuy nhiên do sự suy giảm miễn dịch
hoặc có sự tổn thƣơng niêm mạc ở đƣờng tiêu hóa mà ngay cả chủng E. coli thông
thƣờng cũng có thể gây bệnh. Vi khuẩn E. coli tạo ra 2 loại độc tố là: nội độc tố và
ngoại độc tố (Lê Văn Tạo và ctv., 2006).
Nội độc tố (Endotoxin): thành phần chính Lypopolysacharid (LSP) và Lipid A cấu
tạo nên thành phần tế bào vi khuẩn, khi tế bào vỡ ra thì các chất này đƣợc giải
phóng và gây độc cho tế bào vật chủ, là độc tố chủ yếu của trực khuẩn đƣờng ruột.
Nội độc tố có thể chiết xuất bằng nhiều phƣơng pháp phá vỡ tế bào bằng cơ học,
chiết xuất bằng axit trichloaxetic hoặc phenol dƣới tác dụng của enzyme. Nội độc

7

tố có cấu trúc polysaccharide thuộc về kháng nguyên hoàn toàn và có tính đặc hiệu
cao đối với các chủng của mỗi serotype.
Ngoại độc tố (Exotoxin): do chính tế bào vi khuẩn tiết ra môi trƣờng xung quanh
vi khuẩn trong quá trình sinh trƣởng phát triển của chúng. Loại độc tố này chỉ có ở
vi khuẩn có độc lực, có khả năng gây bệnh. Ngoại độc tố là một chất không chịu
nhiệt, dễ bị phá hủy ở 56°C trong vòng 15 – 30 phút. Dƣới tác động của formol và
nhiệt độ, ngoại độc tố thành giải độc tố. Ngoại độc tố có hƣớng ngoại thần kinh và
gây hoại tử. Hiện nay việc chiết xuất ngoại độc tố chƣa thành công mà chỉ có thể
phát hiện trong canh trùng của những chủng mới phân lập đƣợc.
2.1.7 Tính gây bệnh
Vi khuẩn E. coli gây bệnh trên gia cầm là nhóm APEC (Avian Pathogenic E. coli)

thuộc serotype O1, O2, O78 gây bệnh đƣờng ruột là do kết hợp với nhiều yếu tố
ngoại cảnh và nhân tố mở đƣờng (Lê Hồng Mận, 1999). Bệnh tiêu chảy do E. coli
thƣờng xảy ra ở gà 1 – 10 ngày tuổi, kéo dài đến 9 tuần tuổi. Trong tự nhiên vi
khuẩn tồn tại khắp nơi nền chuồng, máng ăn, nƣớc uống, chuồng trại ẩm thấp chật
chội, mật độ nuôi cao, biên độ nhiệt thƣờng xuyên thay đổi, stress có thể là những
điều kiện phát sinh mầm bệnh. Nguồn lây bệnh chủ yếu là từ gà bệnh và gà khỏe
mang trùng bài xuất mầm bệnh ra môi trƣờng nuôi nhốt, ngoài ra nguồn bệnh có
thể do các loài gặm nhấm lây truyền sang hoặc có thể từ công nhân mang mầm
bệnh từ môi trƣờng ngoài vào (Nguyễn Xuân Bình, 2005).
Vi khuẩn E. coli có thể lây qua đƣờng tiêu hóa, qua vết thƣơng ngoài da, qua niêm
mạc đƣờng hô hấp bị tổn thƣơng, ngoài ra trứng có thể nhiễm E. coli từ buồng
trứng hoặc ống dẫn trứng của gà mẹ, có khoảng 26,5% trứng nhiễm E. coli từ gà
mẹ bị nhiễm E. coli (Hồ Thị Việt Thu và ctv., 2012).
Triệu chứng: ủ rũ, mệt mỏi, tụm lại từng đám, xù lông, tiêu chảy phân có màu
vàng nhạt, hậu môn dính bết phân. Bệnh tích: viêm màng bao tim, viêm cơ tim,
bao tim dầy đục do tích tụ của dịch tiết có fibrin, trƣờng hợp kéo dài màng bao tim
dính vào cơ tim. Viêm màng gan, gan sƣng, sậm, có màu xanh của mật. Viêm
xoang vùng đầu, làm cho vùng đầu sƣng. Viêm ruột có nhiều hạt ở manh tràng, tá
tràng, màng treo ruột, gan và không có sự hiện diện ở lách (Hồ Thị Việt Thu và
ctv., 2012).
2.2 Giới thiệu về vi khuẩn sinh ESBL
ESBL là viết tắt của từ Extended Spectrum Beta - lactamase, một loại enzyme
đƣợc sản xuất bởi một số vi khuẩn. Men beta - lactamse phổ rộng (ESBL) đƣợc
tìm thấy lần đầu tiên năm 1983 tại Đức, thƣờng gặp trong các chủng vi khuẩn
đƣờng ruột đặc biệt là Klebsiella sp., E. coli… khi các chủng vi khuẩn sinh ESBL

8

thì đồng nghĩa với việc chúng kháng lại rất nhiều kháng sinh, đặc biệt là nhóm
cephaslosporin. Đây là gánh nặng thực sự trong trong điều trị nhiễm trùng trực

khuẩn gram âm. Những vi khuẩn sinh ESBL có thể mắc do lây truyền từ ngƣời này
sang ngƣời khác, hoặc do sự chọn lọc do việc dùng kháng sinh (Paterson, 2005).
Một số nghiên cứu E. coli ESBL trên gà ở nƣớc ngoài cho thấy:
Theo Li Yuan et al. (2009), khảo sát sự hiện diện của vi khuẩn E. coli ESBL trên
51 mẫu gan gà thịt bệnh tại 14 trại gà ở tỉnh Hà Nam, Trung Quốc với tỷ lệ dƣơng
tính là 60,8%.
Kết quả nghiên cứu của Sunday Akidarju Mamza et al. (2010), khảo sát sự hiện
diện của vi khuẩn E. coli ESBL tại Nigeria ở 400 con gà trên các cơ quan phổi,
lách, ổ nhớp, ruột chiếm tỷ lệ lần lƣợt phổi 16,9%, lách 15,5%, ổ nhớp 4,9% và
ruột 9,7%.
Theo Leverstein - Van Hall et al. (2011), kiểm tra tỷ lệ dƣơng tính E. coli ESBL
trên 98 mẫu thịt gà bán lẻ tại 12 cửa hàng ở Utrecht, Hà Lan là 94%. Trong đó phát
hiện có 39% kiểu gen thuộc các kiểu gen đƣợc tìm thấy ở ngƣời. Nghiên cứu này
cũng cho thấy các gen E. coli sinh ESBL có thể truyền từ gia cầm sang ngƣời
thông qua các thức ăn bị nhiễm E. coli ESBL.
Kết quả của Ilse Overdevest et al. (2011), phân tích 262 mẫu thịt gà ở Hà Lan cho
thấy có 209 mẫu E. coli ESBL dƣơng tính, chiếm tỷ lệ là 79,8%.
Theo Valeria Bortolaia et al. (2010), E. coli ESBL đƣợc sinh ra trên các yếu tố di
truyền di động do đó có thể truyền qua cả chiều dọc và chiều ngang giữa các dòng
vi khuẩn khác nhau.
Theo kết quả nghiên cứu của Annemieke Smet (2008), phân tích 498 mẫu phân từ
5 trại gà thịt công nghiệp ở Bỉ, phát hiện 133 mẫu E. coli ESBL dƣơng tính, chiếm
tỷ lệ 26,7%.
Trong khoảng 10 năm trở lại đây, tại Việt Nam bắt đầu quan tâm đến các vi khuẩn
gram âm sinh ESBL, tuy vậy vẫn chƣa có nhiều nghiên cứu về vấn đề này. Các
nghiên cứu đa phần đƣợc thực hiện với đối tƣợng là ngƣời ở các bệnh viện lớn. Tỷ
lệ vi khuẩn đƣờng ruột sinh ESBL dao động lớn tùy theo từng khu vực, cao nhất là
ở bệnh viện Chợ Rẫy với 61% các chủng Klebsiella và 52,6% các chủng E. coli
sinh ESBL. Ở bệnh viện Việt Đức nghiên cứu cho thấy tỷ lệ E. coli ESBL dƣơng
tính là 34,2% (Nguyễn Thị Yến Chi, 2011).

Theo kết quả nghiên cứu của Hồ Thị Kim Hoa và ctv. (2012) phát hiện sự hiện
diện của một số vi khuẩn sinh ESBL ở trong chất thải chăn nuôi. Phân tích 45 mẫu
bằng kỹ thuật PCR phát hiện có 37 mẫu chứa gen TEM, 4 mẫu chứa gen SHV và

9

không có mẫu nào chứa gen CTX-M. Từ các mẫu dƣơng tính, 357 chủng đƣợc
kiểm tra kháng sinh đồ, kết quả có 40,9% chủng vi khuẩn kháng với ít nhất 1
kháng sinh và 52% chủng vi khuẩn kháng từ 2 kháng sinh trở lên.
2.3 Giới thiệu một số phƣơng pháp phát hiện vi khuẩn sinh ESBL
2.3.1 Phƣơng pháp ChromID ESBL agar
Môi trƣờng ChromID ESBL do hãng Bio - Merieux (Pháp) sản xuất, đã đƣợc
nhiều nƣớc trên thế giới sử dụng. Đây là môi trƣờng đƣợc khuyến cáo dùng để
sàng lọc các vi khuẩn đƣờng ruột Enterobacteriaceae sinh ESBL. Việc xác định vi
khuẩn sinh ESBL đặc biệt quan trọng trong việc phòng và giám sát dịch tể bệnh
nhiễm khuẩn. Môi trƣờng chứa kháng sinh cefpodoxime và chất màu. Chất màu
đƣợc thêm vào dễ dàng phát hiện các phản ứng do enzyme của vi khuẩn nếu có
trong môi trƣờng. Vì vậy có thể đồng thời vừa định danh vi khuẩn vừa phát hiện vi
khuẩn đề kháng. Nếu vi khuẩn sinh ESBL sẽ kháng với cefpodoxime và có khả
năng phát triển trên môi trƣờng ChromID ESBL tạo thành các khuẩn lạc có màu
sắc khác nhau, đặc trƣng cho một số loài vi khuẩn (Nguyễn Sâm, 2009).
2.3.2 Phƣơng pháp đĩa đôi
Phƣơng pháp đĩa đôi đƣợc các nhà nghiên cứu ngƣời Pháp tiến hành cuối những
năm 1980. Sau đó tác giả ngƣời Anh David M Livermore và các cộng sự đã tiếp
tục nghiên cứu và đề xuất thêm một số tiêu chuẩn kỹ thuật cho thử nghiệm. Các
ESBL có khả năng phân hủy các cephalosporin phổ rộng nhƣng bị ức chế bởi acid
clavulanic và mở rộng vòng vô khuẩn của đĩa kháng sinh cephalosporin khi đặt
gần một đĩa kháng sinh chứa acid clavulanic (Livermore DM, 2002).
2.3.3 Băng giấy E-test ESBL
Băng giấy E-test là khoanh plastic mỏng, kích thƣớc 5 × 60 mm, một mặt không

thấm nƣớc, một mặt đƣợc tẩm kháng sinh với các nồng độ khác nhau. Băng giấy
E-test ESBL là một loại băng E-test đặc biệt, có một phần chứa các nồng độ kháng
sinh cephalosporin phổ rộng đƣợc pha loãng từ thấp đến cao, tính bằng µg/ml,
phần còn lại chứa cephalosporin phổ rộng kết hợp clavulanic acid kết hợp. ESBL
bị ức chế bởi clavulanic acid nên E. coli và K. pneumoniae sinh ESBL sẽ có vùng
ức chế vi khuẩn ở phần chứa kháng sinh kết hợp clavulanic acid, phần còn lại
không có chất ức chế dẫn đến kháng sinh bị ESBL phân hủy nên vùng ức chế vi
khuẩn nhỏ hơn hoặc không có vùng ức chế do vi khuẩn không bị kháng sinh ức
chế hoặc chỉ bị ức chế ở nồng độ kháng sinh cao (Bradford PA, 1994).

10

2.3.4 Phƣơng pháp đĩa kết hợp
Sử dụng một khoanh giấy kết hợp cephalosporin với acid clavulanic 30µg và một
khoanh giấy cephalosporin 30µg. Nếu đƣờng kính ức chế ở khoanh kết hợp lớn
hơn khoanh còn lại 5 mm thì kết luận vi khuẩn sinh ESBL.
Tiêu chuẩn CLSI yêu cầu với phƣơng pháp này cần phải thực hiện đồng thời trên
cả hai hệ thống là: ceftazidime 30µg, ceftazidime – acid clavulanic 10µg;
cefotaxime 30µg, cefotaxime – acid clavulanic 10µg (Nguyễn Thị Yến Chi, 2011).

11

CHƢƠNG 3
PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phƣơng tiện nghiên cứu
3.1.1 Thời gian, địa điểm, đối tƣợng nghiên cứu
Thời gian thực hiện: từ tháng 08 năm 2014 đến tháng 12 năm 2014.
Địa điểm lấy mẫu: mẫu đƣợc lấy tại một số trại gà công nghiệp thuộc địa bàn
huyện Long Hồ tỉnh Vĩnh Long.
Địa điểm phân tích mẫu: Bộ Môn Thú Y, khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng
Dụng, trƣờng Đại Học Cần Thơ.
Đối tƣợng nghiên cứu: gà thịt và gà đẻ khỏe.
3.1.2 Hóa chất
Hóa chất sử dụng: cồn 70
o
, 90
o

, nƣớc cất, Natri clorua, thuốc thử VP1 (α-napthol
5%), VP2 (KOH 40%), Kovac’s, BaCl
2
.2H
2
O 1%, H
2
SO
4
1%. MacConkey Agar
(MC), Nutrient Agar (NA), Nutrient Broth (NB), Simmons Citrate Agar, Voges
Proskauer (VP), Methyl Red (MR), Trypton Water (Indol), Glyceryl, Muller -
Hilton Agar (MHA).
3.1.3 Thiết bị và dụng cụ
Máy autoclave, microwave, tủ lạnh, tủ sấy vô trùng, tủ ấm, tủ sấy khô, cân điện tử,
máy lắc vortex, đĩa petri, đèn cồn, ống hút, ống đong các loại, bếp đun cách thủy,
ống nghiệm, que cấy, que chang, pipet, micropipet các loại, cốc thủy tinh, bình
định mức, cân điện tử, kéo, kẹp, tampon vô trùng, đũa thủy tinh, thƣớc đo vòng vô
khuẩn, thùng trữ lạnh, túi nylon, khẩu trang, găng tay và một số dụng cụ khác.
3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.2.1 Phƣơng pháp lấy mẫu
Số lƣợng gà thu thập là 110 con gồm 55 gà thịt và 55 gà đẻ từ 20 trại gà công
nghiệp tại huyện Long Hồ tỉnh Vĩnh Long.
Mỗi con gà thu thập 4 loại mẫu gồm gan, thịt, phổi và phân.
Số lƣợt phân tích mẫu 110 × 4 = 440 lƣợt.


12

Bảng 3.1: Dung lƣợng mẫu khảo sát

Loại mẫu
Gà thịt
Gà đẻ
Thịt
55
55
Gan
55
55
Phổi
55
55
Phân
55
55
Tổng mẫu
220
220
Lấy mẫu cơ quan: tiến hành mổ những con gà khỏe, lấy mẫu ở các cơ quan phổi,
gan, thịt, mỗi thứ lấy khoảng 25g rồi cho vào túi vô trùng có ghi ký hiệu.
Lấy mẫu phân gà: dùng tăm bông vô trùng đƣa vào lỗ huyệt của gà để lấy phân rồi
đƣa ngay vào ống nghiệm vô trùng có chứa môi trƣờng chuyên chở cary blair, có
ghi ký hiệu.
Các loại mẫu đƣợc bảo quản lạnh rồi đƣa về phòng thí nghiệm phân tích.
3.2.2 Phƣơng pháp phân lập E. coli ESBL
Phân lập vi khuẩn E. coli ESBL bằng phƣơng pháp đĩa kết hợp theo CLSI (2014).
Mẫu đƣợc ria cấy trực tiếp trên môi trƣờng MC có kháng sinh ceftazidime 2mg/l
rồi ủ ở 37
o
C trong 24 giờ. Chọn các khuẩn lạc E. coli giả định là các khuẩn lạc có

màu hồng nhạt, mặt khuẩn lạc hơi lồi, kích thƣớc 2 – 3 mm. Sau đó làm thuần vi
khuẩn bằng cách chọn 10 khuẩn lạc dùng que cấy ria trên môi trƣờng NA đem ủ ở
37
o
C trong 24 giờ. Vi khuẩn E. coli sau khi đƣợc cấy thuần trên môi trƣờng NA,
tiến hành kiểm tra đặc tính sinh hóa của vi khuẩn trên các môi trƣờng Trypton
(Indol), MR - VP, Simmons citrate.
Vi khuẩn E. coli thƣờng sinh Indole, khi thử với thuốc thử Kovac’s thì xuất hiện
vòng màu đỏ trên bề mặt.
Phản ứng Methyl Red dƣơng tính, có vòng đỏ xuất hiện trên bề mặt môi trƣờng.
Phản ứng Voges Proskauer âm tính, môi trƣờng không đổi màu.
Phản ứng Citrate âm tính, môi trƣờng vẫn giữ nguyên màu xanh lá cây.
Sau khi khẳng định vi khuẩn E. coli, tiến hành pha huyễn dịch vi khuẩn có độ đục
tƣơng ứng với độ đục chuẩn MacFarland 10
8
CFU/ml. Các đĩa kháng sinh bảo
quản theo đúng yêu cầu của nhà sản xuất. Không dùng kháng sinh quá hạn, kháng
sinh ẩm ƣớt. Khi lấy từ tủ lạnh ra phải để ra ngoài 1-2 giờ để cho nhiệt độ trong lọ
bằng nhiệt độ phòng.

13

Phƣơng pháp tiến hành: dùng tăm bông vô trùng tẩm huyển dịch vi khuẩn rồi dàn
đều vi khuẩn lên khắp mặt thạch MHA. Chờ mặt thạch khô, dùng kẹp vô trùng để
đặt từng đĩa kháng sinh ceftazidime 30µg, ceftazidime 30µg + acid clavulanic
10µg, cefotaxime 30µg và cefotaxime 30µg + acid clavulanic 10µg lên đĩa thạch.
Đem ủ ở 37
o
C trong 16-18 giờ.
Đọc kết quả: Nếu đƣờng kính vòng vô khuẩn của đĩa kháng sinh kết hợp với acid

clavulanic trừ đi đƣờng kính vòng vô khuẩn của đĩa kháng sinh tƣơng ứng không
có acid clavulanic mà lớn hơn hoặc bằng 5 mm thì khẳng định vi khuẩn là E. coli
ESBL.
Mẫu
Cấy trên môi trƣờng MC có kháng sinh ceftazidime 2mg/l
37
0
C/24
h

Chọn 10 khuẩn lạc E. coli giả định cấy thuần lên NA
37
0
C/24
h

Kiểm tra đặc tính sinh hóa


Indole (+) MR (+) VP (-) Citrat (-)

Khẳng định E. coli

Tạo huyễn dịch vi khuẩn 10
8
CFU/ml

Cấy lên MHA và đặt khoanh giấy kháng sinh

37
0
C/16
h
-18
h
Đo đƣờng kính vòng vô khuẩn

Khẳng định E. coli ESBL (≥ 5mm)

Giữ giống
Hình 3.1: Quy trình nuôi cấy phân lập vi khuẩn E. coli ESBL
Ceftazidime + acid clavulanic
- ceftazidime ≥ 5 mm

Cefotaxime + acid clavulanic
- cefotaxime ≥ 5 mm
37
0
C/24
h


14

3.2.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu
So sánh sự khác nhau giữa các tỷ lệ E. coli sinh men beta – lactamases phổ rộng
bằng phép thử Chi bình phƣơng sử dụng phần mềm Minitab version 16 và Chi
square yates.

15

CHƢƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả khảo sát sự hiện diện của E. coli ESBL trên gà thịt khỏe
Qua khảo sát sự hiện diện của E. coli ESBL từ 55 gà thịt khỏe ở trại gà công
nghiệp thuộc huyện Long Hồ tỉnh Vĩnh Long bằng phƣơng pháp đĩa kết hợp, kết
quả đƣợc trình bày ở bảng 4.1 và hình 4.1:

Bảng 4.1: Tỷ lệ E. coli ESBL dƣơng tính trên gà thịt khỏe
Loại mẫu
Số mẫu khảo sát (n=55)
Số mẫu dƣơng tính
Tỷ lệ dƣơng tính (%)
Thịt
15
27,3
ab
Gan
7
12,7
b
Phổi
19
34,5
a
Phân
47
85,5
c
Những chữ số a, b, c trong cùng một cột giống nhau thì khác nhau không có ý nghĩa thống kê (P>0,05).
Những chữ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P<0,05).


Hình 4.1: So sánh sự hiện diện của E. coli ESBL trên gà thịt khỏe