Nghiên cứu ảnh hưởng của flavonoid cây núc nác đối với an pha chymotrpsin liên quan đến quá trình viêm

B Ộ Y T Ế
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
LÊ HUY HÙNG
NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA FLAVONOID
CÂY NÚC NÁC ĐỐI VỚI a-CHYMOTRYPSIN
LIÊN QUAN ĐẾN QUÁ TRÌNH VIÊM
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ
##4)
Người hướng dẫn : ThS. Lê Thị Diễm Hồng
GS. TS. Nguyễn Xuân Thắng
Nơi thực hiện : Bộ môn Hoá Sinh
Trường đại học Dược Hà Nội
Thời gian thực hiện : 2/2004 - 5/2004
HÀ NỘI, 5 - 2004
M 9 ể j r
'JJ<ìi xin ểầu tỏ lỜMỹ ũểt ổn kđu, bắc tíỉi (ỖSP. Õ5P. 'ưVỹuyễn 0Guứn ùÁắnp
,<‘/m nẢiêm ếê môn Ịtâoá ámÁ ýuỀỜnp %€Ù ềwc %€&te 3fàb nôi nà ýAỈP. 9ĩê ịyhi
Qbiễm yÍM nỹ ỹ iầ n ỹ n iên /hì m ô n /lũ á ámÁ < àn ỹ to à n í/lê cá c iầ ầ ỹ Cũ aùứ) đ ã
aừíýt đĩi lôi ầortỹ buốt <ỊÚa hình ầoc ừìỷi nà n^iên cứa /ĩ/ioa ầoc.
'JJ ỉìi x in ỹ ử i ũti, cẩ m ổn đ ến các, tíià /ỷ, cô /ù Ỉ ỈPỖ Ỉ P , Ổ Ĩ P , Ị$ỈP c m tỹ to àn
th ê các cán /mì cô n ỹ n /m n m ên &Ô m â n ầ ơ á tin h A ư ĩĩn ỹ đ a i Aoc dbiứtc
■nổi. ' Aí/tữn<f Hỹưừì lu/m <jiúỷ) đõ ità lao điều ẳtôn ừ& 'HÂM cềm ừii ầmiy (ỊMÍ
Aì/nÁ tím ’< ■ u y /liêm .
k/m cãrtty x in ể đ ụ tỏ lồ n ỹ cở/m ổn đ ế n cÂa m e, rtÁ ữ nỹ ny i ti m ân, ifà
ếan /m đ ã lu ôn {tíìt iỹ niên c ổ IM n à ỹiúýi, đ ĩỉ ừ ìi {/t <my y ư ú faZi iÁ /loe fu/< tíầ
h o à n tíừ ii v/ì lu â n n ă n f s f n<ỷ/ùêý> .
>yùl noi -naàỷ
27
tíưínỹ 5 năm 2004
KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT
a-CT a-chymotrypsin

cox Cycloxygenase
FNN Flavonoid núc nác
IL Interleukin
MỤC LỤC
Đặt vấn đ ề

1
Chương 1: Tổng quan

3
1.1. Quá trình viêm

.
3
1.2. Enzym được sử dụng làm thuốc chống viêm 6
1.3. Dược liệu chống viêm 7
Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

11
2.1. Nguyên liệu 11
2.2. Súc vật thí nghiệm 12
2.3. Thiết bị, dụng cụ
12
2.4. Hoá chất thí nghiệm 12
2.5. Phương pháp nghiên cứu 13
Chương 3: Thực nghiệm và kết quả 17
3.1. Ảnh hưởng của dịch chiết ílavonoid núc nác toàn phần đối với hoạt tính
của a-chymotrypsin

17
3.2. Kết quả thử tác dụng chống viêm cấp của ílavonoid núc nác toàn phần trên
in vivo


.
21
Chương 4: Bàn luận 25
Kết luận và đề xuất 28
Tài liệu tham khảo 30
ĐẶT VÂN ĐỂ
Viêm là quá trình bệnh lý rất phổ biến, vì có vô số yếu tố cụ thể có thể gây
viêm và bất cứ cơ quan nào cũng có thể bị viêm. Nhìn chung viêm là một phản
ứng bảo vệ của cơ thể, giúp cho cơ thể chống lại các tác nhân gây viêm. Tuy
nhiên, nếu viêm nặng và kéo dài sẽ dẫn đến rối loạn chức năng của các cơ quan,
bộ phận của cơ thể, gây nhiều ảnh hưởng xấu, có khi gây nguy hiểm đến tính
mạng của người bệnh. Vì vậy việc phát huy tác dụng bảo vệ và ngăn ngừa các
yếu tố có hại của viêm là rất cần thiết và quan trọng.
Việc nghiên cứu và ứng dụng các thuốc chống viêm có cấu trúc steroid,
thuốc chống viêm phi steroid nhằm hạn chế quá trình viêm đã đáp ứng được yêu
cầu đó. Các thuốc này đa phần có nguồn gốc hoá dược, đã được sử dụng nhiều
năm nay. Bên cạnh các tác dụng chống viêm đa dạng và hiệu quả, chúng vẫn
chứa đựng những yếu tố bất lợi đối với cơ thể như gây suy giảm miễn dịch, xốp
xương, kích thích đường tiêu hoá, ảnh hưởng tới quá trình đông máu, tạo máu
Do vậy, xu hướng sử dụng các thuốc chống viêm chứa enzym như protease
nhằm khắc phục những nhược điểm của các thuốc chống viêm có nguồn gốc hóa
dược ngày càng phổ biến.
Bên cạnh đó, các hoạt chất chiết xuất từ dược liệu cũng có tiềm năng to lớn
với việc nghiên cứu thuốc chống viêm. Nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng
chống viêm của dược liệu cho thấy nhóm hoạt chất xuất hiện nhiều trong các

dược liệu có khả năng chống viêm là các ílavonoid. Cây núc nác là dược liệu có
thành phần chính là hỗn hợp các ílavonoid với hàm lượng khá cao. Trên cơ sở đó
chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu tác dụng chống viêm của cây núc nác (Oroxỵlum
indicum Vent. Bignoniaceae) và thử tác dụng chống viêm khi kết hợp núc nác với
a-chymotrypsin.
1
Đê tài được thực hiện nhằm một sô mục tiêu sau:
1. Bước đầu tìm hiểu tác dụng núc nác đối với a-chymotrypsin trên in vitro.
2. Tìm hiểu tác dụng chống viêm của núc nác khi kết hợp với a-chymotrypsin
trên in vivo.
2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. QUÁ TRÌNH VIÊM.
1.1.1. Định nghĩa.
Theo Ado (1973): Viêm là phản ứng tại chỗ của mạch máu, tổ chức liên
kết và hệ thần kinh liên quan tới khả năng phản ứng của cơ thể.
Theo Vũ Triệu An thì viêm là phản ứng của cơ thể mà nền tảng của nó là
phản ứng tế bào. Phản ứng này được hình thành và phát triển phức tạp dần trong
quá trình tiến hóa của sinh vật [2, 202].
1.1.2. Nguyên nhân gây viêm
1.1.2.1. Nguyên nhân bên ngoài.
- Cơ học: từ sây sát nhẹ đến chấn thương nặng gây phá huỷ tế bào và mô, làm
phóng thích ra các chất gây viêm nội sinh.
-V ật lý: nhiệt độ quá cao hay quá thấp làm thoái hoá protid tế bào gây tổn
thương enzym; tia xạ (UV, tia X) do tạo ra các gốc oxy tự do gây phá huỷ một
enzym oxy hóa, còn gây tổn thương AND.
- Hoá học: các acid, kiềm mạnh, các chất hoá học khác (thuốc trừ sâu, các độc
tố ) gây huỷ hoại tế bào hoặc phong bế các hệ enzym chủ yếu.
- Sinh học: là nguyên nhân phổ biến nhất, gồm virut, vi khuẩn, ký sinh trùng,
nấm [2, 202].

1.1.2.2. Nguyên nhân bên trong.
- Hoại tử tổ chức, xuất huyết, tắc mạch, rối loạn thần kinh dinh dưỡng.
- Hình thành phức hợp miễn dịch, sự thay đổi nội sinh chất giao bào [8, 6-8].
1.1.3. Phân loại viêm.
❖ Theo nguyên nhân: Viêm nhiễm trùng và viêm vô trùng.
❖ Theo vị trí: Viêm nông, viêm sâu, viêm ngoài, viêm trong.
♦♦♦ Theo thành phần dịch rỉ viêm: Viêm thanh dịch, viêm tơ huyết, viêm mủ.
3
❖ Theo tính chất:
- Viêm đặc hiệu: Thường là viêm mãn tính do phản ứng kháng nguyên kháng thể.
- Viêm không đặc hiệu: Thường là viêm cấp [2, 203].
1.1.4. Các phản ứng xẩy ra trong quá trình viêm.
1.1.4.1. Các phản ứng chính tại ổ viêm.
♦ Phản ứng tuần hoàn:
Phản ứng này xẩy ra rất sớm sau tổn thương và phát triển ở mức độ khác nhau,
phụ thuộc vào sự trầm trọng của tổn thương và theo mọt trình tự như sau:
> Co mạch chớp nhoáng xuất hiện ở các tiểu động mạch, xẩy ra ngay khi có
tác nhân kích thích, do hưng phấn thần kinh co mạch và các cơ trơn bị kích
thích.
> Sau khi co mạch chớp nhoáng ở các tiểu động mạch là hiện tượng giãn
mạch. Đầu tiên là giãn các tiểu động mạch rồi mao mạch và các tiểu tĩnh
mạch dẫn đến tăng tuần hoàn tại chỗ nhằm cung cấp năng lượng cho hoạt
động tại ổ viêm và đưa nhiều bạch cầu tới ổ viêm làm nhiệm vụ bảo vệ [8,
53].
> Phản ứng tuần hoàn quá mạnh trên dẫn đến các rối loạn nghiêm trọng như
giãn mạch cực độ, dòng máu chảy chậm dần, gây tăng tính thấm thành
mạch làm thoát dịch rỉ viêm giàu protein vào các mô quanh huyết quản [2,
204].
♦ Phản ứng tê bào:
Phản ứng tế bào là phản ứng cơ bản nhất phản ánh khả năng bảo vệ của cơ thể

chống viêm, và trong các phản ứng này bạch cầu đóng vai trò quan trọng nhất.
Hoạt động của bạch cầu tại ổ viêm gồm hai hiện tượng xẩy ra kế tiếp nhau.
> Bạch cầu thoát mạch.
Khi dòng bạch cầu chảy chậm, bạch cầu tách ra khỏi dòng trục lăn chậm
theo vách mao mạch và tiểu tĩnh mạch rồi dừng lại ở một điểm gọi là vách
4
I
tụ hạch cầu. Dưới tác dụng của chất trung gian hoá học như: interleukin-
l(EL-l), yếu tố giãn mạch protacyclin, yếu tố giãn cơ nguồn gốc nội mô,
bạch cầu tăng khả năng bám dính vào các tế bào nội mô [15, 351-354].
> Thực bào và mất hạt:
Thực bào là hiện tượng bạch cầu nuốt và tiêu huỷ đối tượng thực bào.Tại ổ
viêm, các bạch cầu được hoạt hoá và khi được hoạt hoá, khả năng thực bào
của chúng tăng lên rõ rệt [8, 68-69].
1.1.5. Các chất trung gian hoá học tham gia vào quá trình viêm.
Sau tác động ban đầu của viêm, nhiều chất trung gian hoá học được giải
phóng ra, duy trì và khuyếch đại phản ứng viêm. Những chất này có nguồn gốc
huyết tương, tê bào và tổn thương mô. Các chất trung gian hoá học gồm có:
• Các amin hoạt mạch.
Histamin được giải phóng ra do sự mất hạt của các dưỡng bào khi đáp ứng với
các kích thích: Tổn thương vật lý (chấn thương, bỏng), phản ứng miễn dịch
gắn kháng thể với dưỡng bào, các đoạn của bổ thể dược gọi là các độc tố gây
phản vệ, các protein giải phóng histamin xuất phát từ các bạch cầu, các
cytocin. Histamin gây giãn các tiểu động mạch và tăng tính thấm thành mạch
của các tiểu tĩnh mạch. Serotonin giải phóng từ tiểu cầu bị kích thích khi kết
dính với sợi tạo keo, phức hợp kháng nguyên-kháng thể, yếu tố hoạt hoá tiểu
cầu. Nồng độ serotonin tăng trong máu khi viêm. Serotonin có tác động tương
tự như histamin [8, 82-83].
• Các protease của huyết tương.
Hệ thống bổ thể, trong đó đặc biệt có C5a và C3a làm tăng tính thấm thành

mạch và gây giãn mạch, chủ yếu do giải phóng histamin bởi các dưỡng bào
[8, 84-85].
5
1.1.6. Các thuốc chống viêm.
1.1.6.1. Thuốc chống viêm steroid.
Là nhóm thuốc có cấu trúc giống với các hormon của tuyến vỏ thượng
thận. Cơ chế chống viêm là do ức chế enzym phospholipase A2 do đó ức chế sự
tạo thành acid arachidonic từ màng phospholipid, dẫn tới ức chế tổng hợp
prostaglandin. Bầng thực nghiệm, đã xác định được rằng các thuốc chống viêm
steroid làm ổn định màng lysosom nên ức chế sự giải phóng các enzym lysosom
trong đó có phospholipase A2 [10, 632]. Tuy nhiên trong sử dụng lâm sàng nhóm
thuốc này bộc lộ khá nhiều tác dụng phụ như ức chế miễn dịch, xốp xương, hội
chứng suy thượng thận khi ngừng thuốc, bệnh về cơ, giảm phát triển chiều cao ở
trẻ em
1.1.6.2. Thuốc chông viêm phi steroid.
Thuốc có tác dụng chống viêm nhưng không có cấu trúc steroid, ngoài ra
còn có tác dụng giảm đau ngoại vi và hạ nhiệt. Cơ chế chống viêm của nhóm
thuốc này là ức chế enzym cycloxygenase (COX), do đó làm giảm quá trình tổng
hợp các prostaglandin và thromboxan từ acid arachiđonic. Gần đây, người ta
nhận thấy cycloxygenase có các isoenzym (COX1 và COX2). Sự tổng hợp các
prostaglandin là do vai trò của COX2. ở trạng thái sinh lý, COX1 tham gia vào
tổng hợp prostaglandin E2 và prostaglandin I2 có vai trò sinh lý trong bảo vệ thận
và dạ dày. Các thuốc chống viêm phi steroid không chọn lọc, ức chế cả COX1
gây ra các tác dụng phụ như loét dạ dày, suy thận, chảy máu kéo dài [14, 617-
655].
1.2. ENZYM ĐƯỢC sử DỤNG LÀM THUỐC CHỐNG VIÊM.
1.2.1. a-chymotrypsin.
a-chymotrypsin là enzym thuỷ phân protein, thu dược do hoạt hoá
chymotrypsinogen chiết xuất từ tuỵ bò. Hoạt tính của thuốc không ít hơn 5
6

microkatal trong lmg. a-chymotypsin ở dạng bột kết tinh hay bột vô định hình
màu trắng hay trắng vàng, tan trong nước [12, 336].
ở dung dịch, a-chymotrypsin có hoạt tính mạnh nhất ở pH=8. Độ ổn định
tốt nhất ở pH=3 và hoạt tính bị ức chế có thể phục hồi được [16, 1689].
a-chymotrypsin có trọng lượng 21.600, cấu tạo bởi 3 chuỗi peptid, sô
lượng acid amin là 241.
Tác dụng thuỷ phân của a-chymotrypsin phụ thuộc vào trạng thái cơ chất,
a-chymotrypsin chỉ thuỷ phân những protein đã bị biến tính mà không tác động
tới các protein mà vẫn giữ được cấu trúc không gian từ bậc 2 trở lên [6, 15].
1.2.2. Tác dụng của a-chymotrypsin.
a-chymotrypsin thuỷ phân các kinin, được giải phóng bởi kininogen thông
qua yếu tố Hageman. a-chymotrypsin kìm hãm tiết chế leucotrien từ bạch cầu
đơn nhân trung tính, a-chymotrypsin thuỷ phân íibrin, quá trình này được tăng
cường bởi tác dụng của heparin, dextran sulíat trong dung dịch NaCl 0,1M.
Ion Ca2+ đóng vai trò là chất ổn định cấu trúc và tăng cường hoạt tính thuỷ
phân protein este hoá của a-chymotrypsin.
a-chymotrypsin có tác dụng của một enzym phân giải protein, a-
chymotrypsin được dùng uống, tiêm bắp hoặc dùng tại chỗ để chống viêm và
điều trị một số chấn thương, với tính chất là một endopeptidase tuyến tuỵ. Ngoài
ra còn được chỉ định trong các trường hợp chống phù nề, kháng viêm trong chấn
thương, viêm nhiễm, dùng tại chỗ hoặc tiêm bắp trong các khoa: nội, tai mũi
họng, phụ, ngoại, da liễu [10, 138].
1.3. DƯỢC LIỆU CHỐNG VIÊM.
1.3.1. Vài nét về dược liệu chỏng viêm.
7
Y học cổ truyền phương đông chẩn đoán và điều trị bệnh dựa theo thuyết
âm dương ngũ hành. Theo quan điểm này thì bệnh tật là sự mất cân bằng giữa hai
mặt đối lập trong cơ thể . Mục đích của việc điều trị bệnh là lập lại cân bằng vốn
có của cơ thể.
Một phương pháp chữa bệnh khác là giải độc cho cơ thể . Cơ thể có thể bị

nhiễm bệnh từ bên ngoài hay bên trong. Các cây thuốc có khả năng giải độc cho
cơ thể thuộc nhóm thanh nhiệt giải độc. Nhiều vị thuốc được dùng phổ biến với
mục đích trên như bồ công anh, ké đầu ngựa, cúc hoa hay kim ngân hoa
Qua một số công trình khảo sát và nghiên cứu về nhóm thuốc thanh nhiệt
giải độc cho thấy các cây này có thể thuộc nhiều loài thực vật khác nhau nhưng
đều chứa hợp chất ílavonoid đáng kể. Do đó, ílavonoid có thể giả thiết là các hợp
chất có tính chất sinh học và chính chúng gây nên tác dụng chống viêm, giải độc
của các cây thuốc thuộc nhóm thanh nhiệt giải độc.
Flavonoid là nhóm hoạt chất thường gặp trong thực vật, gặp trong nhiều
loại cây cỏ khác nhau. Cho đến nay khoảng 3000 ílavonoid đã được xác định cấu
trúc, phần lớn ílavonoid có mầu vàng hoặc xanh [9, 1].
Các ílavonoid có tác dụng sinh học được gọi là bioflavonoid. Tác dụng sinh
học của bioílavonoid rất đa dạng, trên nhiều cơ quan và hệ cơ quan khác nhau với
hiệu quả rõ rệt. Một số tác dụng của ílavonoid có thể kể đến là:
❖ Flavonoid có khả năng điều hoà làm giảm tính thấm thành mạch, chống lại
hiện tượng thoát mạch ra khỏi lòng mạch.
❖ Flavonoid có khả năng tiêu diệt gốc tự do. Giả thiết cho rằng khi vào cơ thể
ílavonoid tạo thành các gốc tự do bền vững ít hoạt động hơn các gốc tự do
hình thành trong quá trình viêm, ung thư từ đó, các ílavonoid thể hiện
chức năng chống viêm và bảo vệ tế bào gan. Khả năng chống oxy hoá của
ílavonoid chống lại quá trình huỷ hoại cấu trúc và chức năng gan, ngăn cản
ip
sự hoại tử mô và sự phân huỷ phospholipid màng tế bào, loại trừ các tác
nhân gây độc hại, giảm quá trình peroxy màng tế bào.
❖ Flavonoid hoạt hoá enzym histamin và có khả năng ức chế giải phóng
histamin, ức chê sự hình thành trung gian phản ứng dị ứng.
❖ Với quá trình viêm, tlavonoid ức chế cyclogenase và 5-lypoxygenase, hạn
chế quá trình tổng hợp các chất trung gian gây viêm như prostaglandin và
leucotrien.
❖ Nhiều ílavonoid làm giảm nhiễm trùng ở liều cao, làm mất hoạt tính virut

nhờ cơ chế chống sao chép [9, 17].
1.3.2. Cây núc nác.
- Tên khoa học: Oroxylum inđicum(L.),Vent, họ chùm ớt Bignoniaceae.
- Các tên khác: So đo thuyền, lên may, mộc hồ diệp, ung ca, nam hoàng bá,
hoàng bá nam, thêu tầng chỉ
- Bộ phận dùng: Cây núc nác cho hai vị thuốc.
+ Vỏ núc nác (Cortex Oroxyli): vỏ thân phơi hay sấy khô của cây núc nác.
+ Hạt núc nác (Semen Oroxyli): Hạt phơi hay sấy khô của cây núc nác.
- Thành phần hoá học:
Vỏ núc nác chứa một lượng nhỏ alcaloid, tanin. Thành phần chủ yếu là
một số dẫn xuất ílavonoid ở dạng tự do hay heteroid. Các ílavonoid thường gặp
là:
+ Oroxylin A: Công thức phân tử là C6H120 5, cấu trúc 5-7 dihydroxy 6-
methoxy ílavon, trọng lượng phân tử 284.
Tinh thể màu vàng chanh, độ chảy 230-232°C. Tan trong cồn, aceton,
benzen nóng, kiềm, ether, acid acetic đặc.
+ Baicain hay noroxylin: Công thức phân tử 5-6-7 trihydroxyílavon. Trọng
lượng phân tử là 270,2.
9
Tinh thể màu vàng, hình lăng trụ, độ chảy 254-255 °c. Tan trong cồn,
ether, aceton, acid acetic đặc, kiềm loãng, ít tan trong cloroíbrm và nitro benzen.
+ Crycin: Công thức phân tử 5-7 dihydroxylavon, trọng lượng phân tử
254,23.
Tinh thể màu vàng nhạt, chứa trong vỏ rễ, độ chảy 276°c. Không tan trong
nước, tan trong dung dịch kiềm, ít tan trong cồn, cloroííom và ether, có thể thăng
hoa
+ Tetuin: Là Baicain kết hợp với glucose ở vị trí số 6
Tinh thể màu vàng nhạt, độ chảy 112°c
- Công dụng và liều dùng:
Vỏ núc nác chữa đi ngoài, kiết lị, chữa dị ứng.

Liều dùng: Ngày 10-15 vỏ khô dưới dạng nước sắc thuốc [7, 726-728].
10
CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU.
2.1.1. Vỏ núc nác.
Là vỏ thân phơi hay sấy khô của cây núc nác: Oroxylum indicum Vent.,
thuộc họ Chùm ớt Bignoniaceae.
Nguyên liệu trên được mua ở các cơ sở mua bán dược liệu, đối chiếu theo
tiêu chuẩn dược điển Việt Nam I, tập II [5, 270-271].
2.1.2. Điều chế ílavonoid toàn phần.
Vỏ thân núc nác được chặt nhỏ, phơi khô ngoài nắng nhẹ, sấy khô 70-
80°c cho thật khô rồi xay nhỏ. Bột dược liệu được chiết bằng cồn theo phương
pháp ngấm kiệt. Tập trung dịch chiết rồi thu hồi còn 1/10 thể tích. Tiếp tục đun
cách thuỷ, cho từ từ nước cất đun sôi làm loãng độ cồn. Khi dung dịch trở nên
vẩn đục, lấy ra để chỗ lạnh, ílavonoid sẽ tủa xuống. Lọc qua phễu lọc hút chân
không, rửa tủa hai lần bằng nước cất, sấy khô tủa ở 70°c thu được bột vàng nâu.
Tinh chế bằng cách hoà tan trong cồn (với lượng tối thiểu) đun cách thuỷ 15 phút
cho tan hoàn toàn. Tẩy mầu bằng than hoạt, đun cách thuỷ 15 phút, lọc nóng loại
than hoạt trên phễu hút chân không, dịch lọc thu dược đun sôi cách thuỷ rồi làm
loãng độ cồn bằng nước cất đun sôi cho đến khi xuất hiện tủa vàng, để qua đêm ở
nhiệt độ lạnh Aavonoid sẽ tủa xuống. Lọc tủa bằng phễu hút chân không, rửa tủa
hai lần bằng nước cất, sấy khô ở 90-100°C cho đến khô, ta thu được bột mầu
vàng đem thử tác dụng sinh học [4, 18].
11
2.1.3. a-chymotrypsin.
a-chymotrypsin dạng ống tiêm, mỗi ống chứa 5mg a-chymotrypsin/5ml-
biệt dược hãng Leurquin, Italia.
2.1.4. Cơ chất casein.
Casein hộp lOOg hoá chất của Hungary.

Cân chính xác l,2g casein cho vào cốc có mỏ, thêm dung dịch đệm
phosphat 0,03M (pH=7,5) vừa đủ lOOml. Đun sôi cách thuỷ trong thời gian 60
phút, vừa đun vừa khuấy, lọc qua gạc, pH cuối cùng của dung dịch bằng 7,2.
Chú ý: Dung dịch casein chỉ pha đủ dùng trong 1-2 ngày và phải được bảo quản
trong tủ lạnh, trước khi dùng phải lắc đều.
2.2. SÚC VẬT THÍ NGHIỆM
Chuột cống trắng đực và cái, nuôi trong cùng điều kiện, cân nặng từ 100-
130g. Do trại chăn nuôi súc vật thí nghiệm Học viện 103 cung cấp.
2.3. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ:
- Máy đo quang trung quốc 752.
- Máy ly tâm, tủ lạnh, tủ sấy, thiết bị điều nhiệt.
- Dụng cụ đo thể tích chân chuột.
- Cân phân tích và cân kỹ thuật Sartorius
2.4. HOÁ CHẤT THÍ NGHIỆM
- Thuốc thử Gornall.
- Dung dịch nước muối sinh lý 0,9 %.
- Acid tricloacetic 10%
Acid tricloacetic lOg
Nước cất vừa đủ lOOml
12
- Dung dịch đệm phosphat 0,03 (pH=7,5).
Na2HP04.12H20 10,745 lg
KH2P 04 4,0827g
Nước cất vừa đủ 1000,0ml
2.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứ u .
2.5.1. Phương pháp xác định hoạt tính enzym.
♦ Nguyên tắc:
Dưới tác dụng của enzym, protein bị thuỷ phân giải phóng ra các peptid có
các acid amin. Xác định lượng protein còn lại bằng cách tủa với lại acid tri-
cloacetic.Tủa này phản ứng với thuốc thử Gornall cho màu tím hồng. Đo quang

phổ hấp thụ ở bước sóng 530nm, cuvet 1 cm.
♦ Tiến hành:
Pha loãng a-chymotrypsin trong dung dịch NaCl 0,9% đến độ pha loãng
thích hợp.
Tiến hành định lượng enzym theo bảng sau:
Bảng 2.1: Thể tích các thuốc thử đem dùng để xác định hoạt tính enzym.
Thuốc thử
ống cơ chất(ml)
Ống thử (ml )
Dung dịch casein 1,2%
2,0
2,0
Dung dịch acid tricloacetic 10%
2,5
0
Dung dịch NaHC032%
2,0
1,9
Dịch men pha loãng
0
0,1
Lắc đều các ống, ủ ấm ở nhiệt độ 40°c trong thời gian theo dõi thích hợp.
Sau thời gian ủ cần thiết, thêm vào ống thử 2,5ml dung dịch acid tricloacetic
10%, lắc đều, để ở nhiệt độ phòng 10 phút. Ly tâm các ống lấy tủa. Thêm vào
13
mỗi ống 4ml thuốc thử Goraall, khuấy cho tan hết tủa. Để yên ở nhiệt độ phòng
trong thời gian 30 phút, đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng 530nm, cuvet lem.
- Tương tự khi xác định khả năng thuỷ phân của a-chymotrypsin kết hợp với dịch
chiết ílavonoid núc nác toàn phần, cắn lìavonoid núc nác toàn phần được pha
loãng thành các nồng độ thích hợp tạo thành dịch chiết Aavonoid núc nác toàn

phần.
Đơn vị hoạt động của enzym được tính là Katal hoặc ịiKatal (1 ịiKatal =
10 ' 6Katal). Katal là lượng enzym (a-chymotrypsin) xúc tác thuỷ phân 1 mol cơ
chất (casein) trong thời gian 1 giây.
Công thức tính kết quả như sau:
A . 106 . 209 . B
y M-Katal _
23600 . 103. t . m
A: Lượng casein bị thuỷ phân, tính bằng mg.
B: Hệ số pha loãng của dịch enzym.
23600 X 103: Trọng lượng phân tử của casein, tính bằng mg.
209: Số dây nối của một phân tử casein.
t: Thời gian thực hiện phản ứng, tính bằng giây,
m: Số lượng enzym đem thử, tính bằng mg.
2.5.2. Phương pháp gày viêm.
Phương pháp gây viêm cấp theo mô hình của Winter [18]: Tiêm 0,05 ml
dung dịch dextran 6% vào bề mặt dưới bàn chân sau của chuột.
2.5.3. Phương pháp thử tác dụng chống viêm.
Sử dụng phương pháp đo phù chân chuột theo mô hình của Winter [18].
Đo thế tích bàn chân sau của chuột tới khớp cổ chân vào thời điểm trước
khi tiêm thuốc và khi chân chuột phù to nhất sau khi tiêm thuốc.
- Lô chứng: Chuột được uống dung dịch NaCl 0,9%.
14
- Lô chuột thử dược liệu : Chuột được uống dược liệu bằng một kim cong đầu tù
vào các thời điểm 60 phút, 30 phút trước khi gây viêm và sau khi gây viêm 30
phút.
- Lô chuột thử với a-chymotrypsin: Sau khi gây viêm 2 giờ chuột được tiêm
màng bụng a-chymotrypsin.
- Lô thử tác dụng kết hợp: Chuột được uống dược liệu và tiêm a-chymotrypsin
vào các thời điểm như ở các lô chuột thử dược liệu và lô chuột thử a-

chymotrypsin.
- Lô so sánh: Chuột dược uống Indomethacin vào thời điểm 30 phút trước khi gây
viêm.
Tính kết quả:
Tỷ lệ phần trăm độ tăng thể tích chân chuột so với thời điểm trước khi gây
viêm được tính theo công thức:
V2-V 1
AV% =

X 100%
V,
Trong đó : AV%: phần trăm độ tăng thể tích chân chuột.
Vj : thể tích chân chuột trước khi gây viêm .
V2 : thể tích chân chuột sau khi gây viêm .
Từ đó tính ra trị số trung bình tỷ lệ phần trăm tăng thể tích chân chuột
trong cùng một lô và sai sô chuẩn của nó: AV% ± SE.
Tính tỷ lệ % ức chế phù để đánh giá tác dụng chống viêm cấp tính của
thuốc theo công thức:
ÀVC% - AVt%
1 % =

X 100%
AVC%
15
Trong đó : 1% : Tỷ lệ ức chế phù.
ÀVC%: Sô trung bình (%) độ tăng thể tích chân chuột ở lô
chứng.
AVt%: Số trung bình (%) độ tăng thể tích chân chuột ở lô thử
2.5.4. Phương pháp xử lý số liệu.
Số liệu được xử lý bằng phương pháp thống kê toán học với sự trợ giúp của

chương trình Excel.
16
CHƯƠNG 3: THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1. ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH CHIẾT FLAVONOID NÚC NÁC TOÀN PHẦN ĐỐI
VỚI HOẠT TÍNH CỦA Ot-CHYMOTRYPSIN.
3.1.1. Ảnh huởng của nồng độ dịch chiết flavonoid núc nác toàn phần đối với
hoạt tính của a-chymotrypsin.
Với mục đích tìm ra nồng độ thích hợp nhất của dịch chiết ílavonoid núc
nác toàn phần kích thích hoạt tính của a-chymotrypsin mạnh nhất, chúng tôi tiến
hành xác định hoạt tính của a-chymotrypsin khi kết hợp các nồng độ của dịch
chiết ílavonoid núc nác toàn phần trong cùng một điều kiện: Nhiệt độ 40°c, thời
gian 30 phút, pH=8. Do điều kiện thời gian có hạn nên chúng tôi sơ bộ khảo sát
một số nồng độ. Kết quả thu được trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết f lavonoid núc nác toàn phần đối
với hoạt tính của a-chymotrypsin.
: Nồng độ
dịch chiết FNN (%)
Hoạt tírih enz,ym
(ỊiKatai/lĩĩig prọtein)
% prơtein
bị thuỷ phân
% ihaỵ đổi
hoạt tírih
p
0
128,4 ±7,2
20,4 ± 0,2
100
0,01
160,5 ± 11,2

25,5 ± 0,3
122,3
<0,01
0,05
193,8 ± 16,7
30,8 ± 0,9
151,1
<0,01
0,1
147,3 ± 12,0 23,4 ± 0,7
114,7
<0,01
Ghi chú: Kết quả trên là giá trung bình ±S.E của 3 lần thí nghiệm, mỗi lần xác
định 3 lần.
a-chymotrypsin sử dụng có hàm lượng là 0,5mg/ml.
Kết quả trên bảng 3.1 cho thấy: Nồng độ dịch chiết núc nác 0,05% có khả
tính lên lới 151,1% (P<0,01). Với các nồng độ khác khả năng kích thích đều kém
hơn.
3.1.2. Ảnh hưởng của thời gian đối với hoạt tính của a-chymotrypsin khi kết
hợp với dịch chiết flavonoid núc nác toàn phần 0,05 %.
Thời gian ảnh hưởng đến khả năng thuỷ phân của a-chymotrypsin. Khi
thời gian tăng thì khả năng thuỷ phân của a-chymotrypsin càng tăng nhưng đến
một mức độ nào đó khả năng thuỷ phân của a-chymotrypsin sẽ tăng chậm. Thí
nghiệm tiến hành xác định khả năng thuỷ phân của a-chymotrypsin khi kết hợp
với dịch chiết ílavonoid núc nác toàn phần 0,05% trong thời gian 5', 15', 30', 45',
60' ở cùng điều kiện: Nhiệt độ 40°c, pH=8, kết quả được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2 Anh hưởng của thời gian đối với hoạt tính của a-chymotrypsin khi
kết hợp với dịch chiết f lavonoid núc nác toàn phần 0,05%.
Thời
gian

(phúl)
Loại thuốc :
kếi M I I
Hoại độ enzym
(ụKatal/ímg
protein) ;
%pVQiẹm
bị thuỷ phân
% thay đổi
Hoạt tính

5
a-CT
360,2 ± 20,0
15,3 ± 1,5
100
a-CT + FNN
440,2 ± 36,8
18,7+1,9
122,7 <0,01
15
a-CT
230,6 ± 19,6
15,4+1,6
100
a-CT + FNN
310,0 ±27,0 20,7 ± 2,2
131,3 <0,01
30
a-CT

128,4+ 11,2
20,4 ± 1,9
100
a-CT + FNN
193,9 ± 17,2
30,8 ± 2,7 151,1
<0,01
45
a-CT
115,4 ±6,4
24,2 ± 2,3
100
a-CT + FNN
150,2 ± 14,6
31,5 ± 3,0
130,0 <0,01
60
a-CT
105,3 ± 8,6 26,6 ± 2,7
100
a-CT + FNN 129,8 ± 10,2
32,8 ± 3,4
123,5 < 0,01
Ghi chú: Kết quả trên là giá trung bình ±S.E của 3 lần thí nghiệm, mỗi lần xác
định 3 lần.
a-chymotrypsin sử dụng có hàm lượng là 0,5mg/ml.
18
Từ kết quả bảng 3.2 cho thấy: ở các thời gian 5', 15', 30', 45', 60' khả năng
thuỷ phân protein của a-chymotrypsin khi kết hợp với dịch chiết Aavonoid núc
nác toàn phần mạnh hơn khi dùng a-chymotrypsin đơn độc. Như vậy nũc nác có

tác dụng kích thích hoạt tính của a-chymotrypsin khi thay đổi thời gian thuỷ
phân.
3.1.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đối với hoạt tính của a-chymotrypsin khi kết
hợp với dịch chiết Aavonoid núc nác toàn phần 0,05%.
Để tìm ra nhiệt độ thích hợp nhất cho khả năng kích thích hoạt tính cuả
dịch chiết ílavonoid núc nác toàn phần 0,05% đối với a-chymotrypsin, thí
nghiệm tiến hành khảo sát khả năng thuỷ phân của oc-chymotrypsin khi kết họp
với dich chiết Aavonoid núc nác toàn phần 0,05% ở các nhiệt độ 20°c, 30HC,
40°c, 50HC trong cùng điều kiện thời gian 30 phút, pH=8, kết quả thu được ở
bảng 3.3.
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đôi với hoạt tính của a-chymotrypsỉn khi kết
hợp với dịch chiếtýĩavonoid núc nác toàn phần 0,05%.
Nhiệt
độ
Loại thuốc
kết hợp
Hoạt độ enzym
(p,Katal/lmg protein)
% protein
bị thuỷ phân
% thay đổi
hoạt tính
p
20°c
a-CT
119,6 ±7,0
10,6 ± 1,1
100
a-CT + FNN
154,6 ±13,2

13,7 ±1,3
128,9
<0,01
30°c
a-CT
123,6 ± 8,6
18,6 ± 1,7
100
a-CT + FNN
170,8 ± 16,2
25,7 ± 2,6
138,7 <0,01
40°c
a-CT
128,4+13,0 20,4 ± 2,0
100
a-CT + FNN
193,6 + 19,8
30,8 ± 2,9
151,1 <0,01
50°c
a-CT
50,8 ± 5,2 18,7+1,7
100
a-CT + FNN
66,0 ± 6,5
24,3 ± 2,6
130,1 <0,01
Ghi chú: Kết quả trên là giá trung bình ±S.E của 3 lần thí nghiệm, mỗi lần xác
định 3 lần.

19
a-chymotrypsin sử dụng có hàm lượng là 0,5mg/ml.
Kết quả trong bảng 3.3 cho thấy: Khi nhiệt độ tăng thì khả năng thuỷ phân
của a-chymotrypsin tăng, nhưng tăng đến một lúc nào đó thì khả năng thuỷ phân
của nó sẽ tăng chậm. Thí nghiệm cho thấy nhiệt độ thích hợp nhất cho khả năng
thuỷ phân của a-chymotrypsin là 40°c. .
3.1.4. Ảnh hưởng của sự kết hợp các nồng độ của a-chymotrypsin với dịch
chiết Aavonoid núc nác toàn phần 0,05%.
Khi thay đổi nồng độ của a-chymotrypsin thì hoạt tính của a-
chymotrypsin khi kết hợp với dịch chiết ílavonoid núc nác toàn phần cũng thay
đổi. Để tìm ra được nồng độ thích hợp nhất của a-chymotrypsin khi kết hợp với
dịch chiết ílavonoid núc nác toàn phần mà cho phần trăm thay đổi hoạt tính cao
nhất, thí nghiệm tiến hành xác định khả năng thuỷ phân của a-chymotrypsin khi
kết hợp các nồng độ của a-chymotrypsin với dịch chiết ílavonoid núc nác toàn
phần 0,05% trong cùng điều kiện: Nhiệt độ 40°c, thời gian 30 phút, pH=8. Kết
quả thu được ở bảng 3.4.
Bảng 3.4 Anh hưởng của sự kết hợp các nồng độ của a-chymotrypsin với dịch
chiết flavonoid núc nác toàn phần 0,05%.
Loại thuốc kết hợp
Hoạt độ enzym
(nKatal/lmg pratein)
% protein bị
thu ỷ phân
% thay đổi
hoạt tính
p
a-CT 0,005%
126,4 ± 12,1 14,5 ± 1,4
100
a-CT 0,005% +FNN

151,7 ± 15,0
17,4 ± 1,7
120,0
<0,01
a-CT 0,01%
171,9 ± 16,2
19,8 ±2,0
100
a-CT 0,0 ĩ % + FNN 237,0 ± 23,0
27,3 ± 3,0
137,8 < 0,01
a-CT 0,05%
220,0 ± 20,0
20,4+ 1,9 100
a-CT 0,05% + FNN
332,5 ± 32,0
30,8 ± 3,1 151,1
<0,01
Ghi chú: Kết quả trên là giá trung bình ±S.E của 3 lần thí nghiệm, mỗi lần xác
định 3 lần.
20
Kết qủa trong bảng 3.4 cho thấy a-chymotrypsin với nồng độ 0,05% khi
kết hợp với dịch chiết ílavonoid núc nác toàn phần cho phần trăm thay đổi hoạt
tính cao nhất là 151,1% so với dùng đơn độc là 100% với p < 0,01.
3.2. KẾT QUẢ THỬ TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM CÂP CỦA DỊCH CHIẾT
FLAVONOID NÚC NÁC TOÀN PHẦN TRÊN IN V1VO.
3.2.1. Theo dõi sự thay đổi thể tích chân chuột.
Thí nghiệm được tiến hành trên 5 chuột, trọng lượng từ 100-130g. Các
chuột được đánh dấu từ gan bàn chân tới khuỷu để đo thể tích chân chuột khi
chưa gây viêm. Sau khi đánh dấu theo thứ tự, chuột được tiêm dưới gan bàn chân

phải sau 0,05ml dung dịch dextran 6%. Cứ cách 1 giờ sau khi tiêm lại đo thể tích
chân chuột 1 lần. Dựa theo công thức ở mục 2.5.3 tính được độ tăng thể tích chân
chuột. Kết quả được trình bày trong bảng 3.5 và hình 3.1.
Bảng 3.5 Sụ biến đổi thể tích chân chuột gây phù bằng dextran 6% theo thời
gian _______________________________________________________
Thời gian
(giờ)
Thể tích chân chụột (|xl)
Sự thay đổi thể tích
chân chuột (%)
0 220
0
1
295
34,1 ±5,1
<0,01
2 325
47,7 ± 8,2
< 0,01
3 340
54,5 ± 3,6
<0,01
4
310
40,9 ± 3,6
<0,01
Ghi chú: Sô' liệu ở bảng trên là kết quả trung bình độ tăng thể tích chân chuột ±
S.E của 5 chuột.
Quy ước: Thể tích chân chuột ỏ thời điểm 0 giờ (chưa gây viêm) là 0%.
21