Nghiên cứu tác dụng chống viêm của dịch chiết cây kim ngân ( lonicera japonica thunb caprifoliaceae ) kết hợp với anpha amylase

BỘ Y TÊ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
BÙI THỊ NGỌC THỰC
NGHIÊN cúu TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM CỦA DỊCH CHIÉr
■ ■
CÂY KIM NGÂN [LONICERA JAPONWA THUNB. CAPRIFOLIACEAR
KÍT HỢP VỚI ALPHA- AMYLASE
■
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 1999 -2004)
Người hướng dẫn: - ThS. Lê Thị Diễm Hồng
- GS.TS. Nguyễn Xuân Thắng
Nơi thực hiện: Bộ môn Hoá sinh - Trường ĐH Dược HN
Thời gian thực hiện: 2/2004 - 5/2004
IV £ M
2
"
2 i
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn õẫu 5ấc nhất tái G S .T ô N gu yễ n X u ân T h ắn g -
Chủ nhiệm Ỉ3Ộ môn Hoá ôinh Trường Đạ\ học Dược Hà nội và Th.5 Lê Thị D iễ m
Hẩng - Giảng viên Bộ môn Hoá ỡinh đẵ tận tình hướng dấn, giúp (đỡ tôi trong
suôt (\uá trình học tạp và ngiên cứu khoa học.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thây cô giáo dẵ trực tiếp
truyêVi đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong thời gian học tập tại
trường. Tôi cũng xin cảm ơn eự giúp đỡ và tạo điều kiện tối đa của cắc thầy cô
giáo và các cô kỹ thuật viên 3Ộ môn Hoá ỗinh Trường Đại học Dược Hà nội cho
tôi trong quá trình học tạp và thực hiện khoá luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn đến cha mẹ, những người thân và bạn bè dã
luôn động viên cổ vũ vằ giúp đỡ tôi trong quá trình học tệp và hoàn thành luân
văn tố t nghiệp.
Hà nội, tháng 5 năm 2004

Sinh viền: Bùi Thị Ngọc Thực
KÍ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẤT
BC
Bạch cầu
ESR
Erythrocyte sedimentation (Tốc độ lắng hồng cầu)
FKN
Flavonoid cây kim ngân
Km
Hằng số Michaelis Menten
u
Đơn vị hoạt độ enzym
Vmax
Tốc độ cực đại của phản ứng enzym
MỤC LỤC
Trang
Đặt vấn đ ề 1
Chương I: Tổng quan 3
1.1. Cơ sơ lý thuyết về viêm 3
1.2. Các thuốc chống viêm 6
1.3. Cây kim ngân

9
Chương II: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 12
2.1. Nguyên liệu 12
2.2. Súc vật thí nghiệm

14
2.3. Thiết bị dụng cụ

14
2.4. Hoá chất thí nghiệm 14
2.5. Phương pháp nghiên cứu 15
Chương ni: Thực nghiệm và kết quả 19
3.1. Ảnh hưởng của dịch chiết ũavonoid kim ngân toàn phần đối với hoạt
tính của a-amylase

.

19
3.2. Kết quả thử tác dụng trên in vivo 25
Chương IV: Bàn luận 29
Kết luận và đề xuất

32
Tài liệu tham khảo
ĐẶT VÂN ĐỂ
Viêm là một bệnh lý rất phổ biến, gặp ở nhiều bệnh, do nhiều nguyên
nhân gây ra. Nhìn chung, viêm là một phản ứng bảo vệ của cơ thể, giúp cơ thể
chống lại các tác nhân gây viêm. Tuy nhiên, nếu viêm nặng và kéo dài sẽ dẫn
đến những rối loạn chức năng của các cơ quan, bộ phận của cơ thể, gây ra
nhiều ảnh hưởng xấu, có khi nguy hiểm tới tính mạng của người bệnh. Vì
vậy, việc ngăn ngừa các yếu tố có hại của viêm là rất cần thiết và quan trọng.
Từ nhiều năm nay, các loại thuốc chống viêm có nguồn gốc hóa dược
đã ra đời và được ứng dụng rộng rãi như: thuốc có cấu trúc steroid và thuốc
chống viêm phi steroid. Các thuốc này có ưu điểm là tác dụng tốt và đạt hiệu
quả cao trong việc hạn chế và ngăn chặn quá trình viêm. Tuy nhiên, chúng có
nhiều yếu tố bất lợi đối với cơ thể như: suy giảm miễn dịch, xốp xương, teo
cơ, loét dạ dày tá tràng, ảnh hưởng tới quá trình đông máu, tạo máu
Chính vì vậy, việc sử dụng các enzym nội sinh có tác dụng chống viêm

cũng được coi trọng như a-chymotrypsin, papain, serratiopeptidase, a-
amylase Chúng là những chất gần gũi với cơ thể, ít gây những ảnh hưởng
xấu tới cơ thể, phần nào khắc phục được nhược điểm của nhóm thuốc chống
viêm steroid và phi steroid, nhất là chúng có thể dùng cho các bệnh nhân
không sử dụng được thuốc chống viêm có nguồn gốc hóa dược.
Song song với hướng nghiên cứu về các enzym chống viêm thì các
nghiên cứu về dược liệu trên quá trình viêm đã và đang được chú ý. Ở nước ta
có nhiều loại dược liệu có tác dụng chống viêm tốt. Nhiều công trình nghiên
cứu cho thấy nhóm hoạt chất xuất hiện nhiều trong các dược liệu có khả năng
chống viêm là các ílavonoid. Cây kim ngân là một trong những cây thuốc phổ
biến ở Việt nam có thành phần là Aavonoid được dùng như một vị thuốc
chống viêm, chống dị ứng và giải độc.
1
Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành đề tài:
"Nghiên cứu tác dụng chống viêm của dịch chiết cây kim ngân (Lonicera
japonica Thunb. Caprỉfoliaceae) kết họp với alpha- amylase "
Đề tài được thực hiên nhằm một số mục tiêu:
1. Bước đầu tìm hiểu tác dụng của dịch chiết ílavonoid toàn phần của cây kim
ngân đối với hoạt động của a-amylase trên in vitro.
2. Nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp của dịch chiết Aavonoid toàn phần
của cây kim ngân khi kết hợp với a-amylase trên in vivo.
2
Chương I
TỔNG QUAN
1.1. c ơ sở LÝ THUYẾT VỂ VIÊM
Viêm là quá trình bệnh lý rất nguy hiểm, vì :
- Có vô số yếu tố cụ thể có thể gây viêm
- Bất cứ cơ quan và mô nào cũng có thể bị viêm.
Cách đây hơn 2000 năm Celcius đã đặt nền móng quan trọng khi ông
đưa ra một khái niệm tổng kết về viêm, với 4 tính chất : sưng, nóng, đỏ, đau.

Từ đó, người ta thấy viêm không phải là một bệnh cụ thể mà là một biểu hiện
bệnh lý nói chung, gặp ở nhiều bệnh khác nhau. Tuy nhiên, Celcius mới nêu
các biểu hiện bên ngoài, mang tính chất hình thái của viêm. Galen bổ xung
thêm một tính chất mới là viêm gây rối loạn chức năng.
Tóm lại, có thể nói viêm là phản ứng của cơ thể tại mô liên kết biểu
hiện bằng sự thực bào tại chỗ, có tác dụng loại trừ tác nhân gây viêm và sửa
chữa tổn thương; đồng thời kèm theo các biểu hiện bệnh lý.
Như vậy, viêm vừa là một phản ứng bảo vệ cơ thể chống lại yếu tố gây
bệnh, vừa là phản ứng bệnh lý vì quá trình viêm gây ra tổn thương, hoại tử, rối
loạn chức năng cơ quan có thể ở mức độ rất nặng nề, nguy hiểm [2, 202].
1.1.1. Nguyên nhân gây viêm
* Nguyên nhân bên ngoài
- Do nhiễm khuẩn, virút, ký sinh trùng, các sản phẩm chuyển hoá, kháng
nguyên ngoại lai
-Tác nhân lý, hoá học: Chấn thương, nhiệt, bức xạ ion, tác dụng của acid,
kiềm, các hoá chất.
* Nguyên nhân bên trong
- Hoại tử tổ chức, xuất huyết, tắc mạch, rối loạn thần kinh dinh dưỡng.
- Hình thành phức hợp miễn dịch, sự thay đổi nội sinh chất giao bào [10, 6].
3
1.1.2 Phân loại viêm
* Theo nguyên nhân: Viêm nhiễm trùng và viêm vô trùng.
* Theo vị trí: Viêm nông, viêm sâu, viêm ngoài, viêm trong.
* Theo thành phần dịch rỉ viêm: Viêm thanh dịch, viêm tơ huyết, viêm mủ.
* Theo tính chất:
- Viêm đặc hiệu: thường là viêm mãn tính do phản ứng kháng nguyên kháng thể.
- Viêm không đặc hiệu: thường là viêm cấp [2, 203].
1.1.3. Các phản ứng xảy ra trong quá trình viêm.
Trong quá trình viêm, tại ổ viêm và trong cả cơ thể diễn ra hàng loạt các
phản ứng, theo nhiều giai đoạn khác nhau. Các phản ứng này được tóm tắt như

ở hình 1.1:
4
QUÁ TRÌNH VIÊM
(Xâm nhập các tác nhân gây viêm )
PHẢN ỨNG TẠI CHỖ
Giãn, chậm tuần hoàn mao mạch
Tăng độ nhớt máu, dò rỉ nội mô
Ngưng hồng cầu, đông vón tiểu cầu
Giải phóng các chất trung gian hoá học
Hình thành cục máu đông
__
^ 1 .
Tích tụ BC trung tính, lympho
Tăng thực bào, phá huỷ mô
Tăng enzym huyết thanh
Giải phóng enzym lysosom bào tương
Tăng sinh và phì đại nội mô
PHẢN ÚNG HỆ THỐNG
Tăng thân nhiệt
Đau
Tăng BC hạt, lympho bào
Tăng ESR, fibrinogen
Tăng protein c hoạt hoá
Giảm albumin
Tăng a, p, Y globulin
Giảm sắt, tăng đồng
Tăng glycoprotein
Tăng mucoprotein
(4).
GIAI ĐOẠN TOÀN THỂ

TẾ BÀO CHẾT VÀ HOẠI TỬ
(ế)
PHỤC HỚI
THOÁT DỊCH MÀNG TÊ BÀO
(Tế bào nội mô, bạch cầu, dưỡng bào, màng trong bào tương)
Hình 1.1.Các phản ứng tại chỗ và hệ thông của quá trình viêm [16,28].
5
1.2. CÁC THUỐC CHỐNG VIÊM
1.2.1. Thuốc chống viêm steroid.
Là nhóm thuốc có cấu trúc giống với các hormon steroid của vỏ thượng
thận như hydrocortison, prednisolon, dexamethason, betamethason. Nhóm
thuốc này ức chế phospholipase A2 thông qua kích thích tổng hợp lipocortin,
do đó làm giảm tổng hợp leucotrien và prostaglandin, nên có tác dụng chống
viêm. Các thuốc này có tác dụng chống viêm do mọi nguyên nhân cơ học, hoá
học, miễn dịch và nhiễm khuẩn. Tuy nhiên, chúng có nhiều tác dụng phụ đối
với cơ thể như loét dạ dày- tá tràng, loãng xương, xốp xương, teo cơ, suy
thượng thận cấp khi dừng đột ngột .[13, 632].
1.2.2. Thuốc chống viêm phi steroid
Là nhóm thuốc chống viêm nhưng không có cấu trúc steroid như
aspirin, indomethacin, piroxicam, diclofenac, Cơ chế chống viêm của nhóm
thuốc này là ức chế enzym cyclooxygenase (COX) nên làm giảm sự tổng hợp
prostaglandin. Bên cạnh hiệu quả đạt được trong lâm sàng thì nhóm thuốc này
cũng có nhiều yếu tố bất lợi đối với cơ thể như gây loét dạ dày, suy thận, chảy
máu kéo dài [13, 631].
1.2.3. Amylase
• Một số nghiên cứu về enzym chống viêm.
Các enzym có tác dụng chống viêm như a-chymotrysin,
serratiopeptidase, chymopapain, a-amylase được sử dụng ngày càng rộng
rãi. Bên cạnh các thuốc chống viêm steroid và phi steroid, các enzym có ưu
điểm là những chất gần gũi với cơ thể con người đã phần nào giảm được các

tác dụng không mong muốn. Mặc dù có nguồn gốc, cấu tạo và cơ chất khác
nhau, nhưng các enzym này đều có khả năng chống viêm trên cả động vật
thực nghiệm và người. Cơ chế tác động của các enzym này còn chưa thực sự
làm sáng tỏ, tuy nhiên chúng đã đạt hiệu quả cao trong các chỉ định chống
6
viêm, giảm phù nề và sử dụng hỗ trợ trong các bệnh lý viêm nhiễm đường hô
hấp, giảm tiết dịch nhầy, ức chế dịch rỉ viêm.
• Nguồn gốc và tính chất.
Amylase xúc tác cho phản ứng thủy phân tinh bột, glycogen, các
polysaccharid tương tự. Amylase được chia làm 3 loại:
> a-amylase (1,4-a-D-glucan-glucanohydrolase) có trong nước bọt và tuyến
tụy, hạt hoà thảo nẩy mầm, nấm mốc, vi khuẩn. Nó phân giải liên kết 1,4-
glicozid ở giữa chuỗi polysaccharid tạo thành dextrin phân tử thấp. Dưới tác
dụng của enzym này, dung dịch tinh bột nhanh chóng bị mất khả năng tạo
màu với iod và bị giảm độ nhớt mạnh. a-Amylase bền với nhiệt nhưng kém
bền với acid.
> P-amylase có nhiều ở hạt, củ thực vật. Nó xũc tác cho phản ứng thuỷ phân
liên kết l,4-glycozid từ đầu không khử tạo thành chủ yếu maltose và dextrin
phân tử lớn. Ị3-amylase mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 70°c, nhưng bền với acid
hơn a-amylase.
> Glucoamylase có nhiều ở vi sinh vật, gan động vật. Nó xúc tác cho phản
ứng thuỷ phân liên kết 1,4- và 1,6- glycozid bắt đầu từ đầu không khử của
chuỗi polysaccharid. sản phẩm chủ yếu là glucose và dextrin. Nó bị mất hoạt
tính ở nhiệt độ trên 70°c. Glucoamylase hoạt động mạnh ở pH 3,5-5,5 [8, 78].
a-amylase nước bọt là thành phần chính của nước bọt có nhiều chức
năng trong khoang miệng, Trong hệ thống tiêu hoá, đây là enzym có vai trò
chủ yếu ở giai đoạn đầu của qúa trình sinh ra các oligosaccharid:
a-amylase a-amylase
Tinh b ột

► Oligosaccharid ► Maltose + Glucose
a-amylase có pH tối ưu khoảng 7,0 giống hầu hết các protein và các
enzym khác. Nếu pH quá thấp thì nó chuyển thành dạng proton và mất hiệu
lực. a-amylase bị ức chế bởi sự có mặt của ure và các amid khác. Nếu trong
7
máu nồng độ acid cao hoặc có mặt các amid thì tỷ lệ enzym giảm xuống dẫn
đến Vmax và Km tăng cao. a-amylase được kích hoạt bởi sự có mặt của anion
Cl'. Anion này rất cần cho sự có mặt của enzym này. Nó gắn vào vị trí hoạt
động của enzym và kích thích sự thay đổi cấu trúc cho phép enzym tiến hành
phá vỡ tinh bột hoặc glycogen.
• Cấu trúc của a-amylase
a-amylase là một glycoprotein gồm 1 chuỗi polypeptid đơn với khoảng
496 acid amin có 2 nhóm SH và 4 liên kết disulíid và 1 ion Ca2+. Nó chứa một
lượng lớn acid amin có mùi thơm (tryptophan 5,3%, tyrosin 5,5%) và a-
amylase chứa nhiều acid amin có nhóm OH (threonin + serin, 9,5%) và mang
đặc tính riêng của nhóm acid hay dạng amid.
a-amylase giống như hầu hết các protein và các enzym khác đều có
chứa những chuỗi xoắn a và chuỗi thẳng (3. Những cấu trúc thứ cấp này gắn
chặt với nhau bằng liên kết hydro.
Cấu trúc sơ cấp của a-amylase gồm một phần chính của chuỗi xoắn và
chuỗi thẳng liên kết với nhau. Hai chuỗi này nối với nhau bằng cách sắp xếp
những acid amin thấm nước thành những đường vòng và những vòng xoắn mà
hầu hết là valin, prolin, glycin. Glycin cũng có mặt vì góc liên kết nhận một
dãy giá trị để không gây ra mâu thuẫn không gian giữa các nguyên tử trên bề
mặt chuỗi và những nguyên tử ở khung chính. Cấu trúc sơ cấp còn chứa một
lượng lớn acid aspartic và glutamic (là những chất làm cho cấu trúc sơ cấp gắn
kết hơn) và đây được coi là chỉ điểm của cấu trúc liên kết sơ cấp bởi vì các
acid amin này tạo điều kiện thuận lợi cho liên kết hydro [15].
• Tác dụng của a-amylase.
a-amylase được dùng trong các sản phẩm tiêu hoá thức ăn có chứa tinh

bột và biến đổi tinh bột thành đường lên men trong công nghiệp làm bánh và
công nghiệp lên men.
8
a-amylase từ các nguồn khác nhau được sử dụng như một thành phần
của các chế phẩm enzym tiêu hoá và được sử dụng theo đường uống để giảm
viêm đường hô hấp và sưng phù tại chỗ. Một số chế phẩm chống viêm, giảm
phù nề như Maxilase (Sanoíi-Synthelabo), Megamylase (Leurquin
Mediolanum) [18, 1549].
1.3. CÂY KIM NGÂN
• Tên khoa học: Lonỉcera japonica Thunb., thuộc họ kim ngân
Capriỷoliaceae.
• Tên gọi khác: Dây nhẫn đông.
• Bộ phận dùng:
+ Hoa kim ngân (Flos Lonicera) là hoa phoi hay sấy khô của cây kim
ngân.
+ Cành và lá kim ngân (Caulis cum íolium Lonicerae) là cành và lá
phơi hay sấy khô của cây kim ngân [7, 75].
• Thành phần hoá học:
+ Cây chứa tanin và một saponin. ĩ
+ Hoa chứa một Aavonoid là scolymosid (lonicerin) có cấu tạo luteolin-
7-rutinosid (-caroten, -cryptoxanthin, auroxanthin).
+ Lá chứa loganin [13, 346].
Gần đây, một số công trình nghiên cứu đã chứng minh rằng một số
dược liệu chứa Aavonoid có tác dụng chống viêm rõ rệt và cây kim ngân cũng
là một trong những cây thuốc thể hiện tác dụng chống viêm tốt. Người ta cho
rằng hiệu lực chống viêm của cây kim ngân (Lonicera japonica) trong bệnh
phù chân do chất dẫn truyền receptor 2 kích hoạt proteinase. Đồng thời từ cây
kim ngân (Lonicera japonica) đã phân lập được các hoạt chất có tác dụng
chống viêm là lonicerosid A, B, c và xác định cấu trúc của chúng [19, 165-
171], [17, 333-335].

9
• Một số đặc điểm của nhóm hoạt chất ílavonoid:
Flavonoid là nhóm hoạt chất thường gặp trong thực vật, gặp nhiều trong
nhiều loại cây cỏ khác nhau. Cho đến nay khoảng 3000 Aavonoid đã được xác
định cấu trúc. Phần lớn ílavonoid có mầu vàng hoặc xanh. Đây là một nhóm
hoạt chất có nhiều tác dụng sinh học quan trọng.
Các Aavonoid có tác dụng sinh học gọi chung là bioAavonoid. Tác dụng
sinh học của bioílavonoid rất đa dạng, trên nhiều cơ quan và hệ cơ quan khác
nhau với hiệu quả khá rõ rệt. Một số tác dụng của biollavonoid có thể kể đến
là:
Flavonoid có khả năng điều hoà làm giảm tính thấm thành mạch, chống
lại hiện tượng thoát dịch ra khỏi lòng mạch.
Flavonoid có khả năng tiêu diệt gốc tự do. Giả thiết cho rằng, khi vào cơ
thể ílavonoid tạo thành các gốc tự do bền vững ít hoạt động hơn các gốc tự do
hình thành trong quá trình viêm, ung thư Từ đó, các ílavonoid thể hiện
được các chức năng chống viêm và bảo vệ tế bào gan. Flavonoid ngăn cản sự
oxy hoá màng tế bào gan dẫn đến ngăn chặn quá trình huỷ hoại cấu trúc và
chức năng của gan, ngăn cản sự hoại tử mô và sự phân huỷ phospholipid màng
tế bào.
Flavonoid có tác dụng ức chế enzym cyclooxygenase và lipoxygenase
là enzym xúc tác sự tổng hợp các prostaglandin từ phospholipid. Điều này góp
phần giải thích cơ chế chống viêm và chống dị ứng của các chất Aavonoid và
các dược liệu chứa Aavonoid. Flavonoid có khả năng hoạt hoá enzym
histaminase và một số enzym khác để hạn chế sự giải phóng histaminase và
các chất trung gian khác trong cơ thể gây ra hiện tượng viêm nhiễm, dị ứng,
choáng phản vệ [12, 11-18].
• Tác dụng dược lý của cây kim ngân:
+ Tác dụng kháng khuẩn: Kim ngân có phổ kháng khuẩn rộng. Nước
sắc hoa kim ngân có tác dụng ức chế rất mạnh đối với liên cầu khuẩn, tụ cầu
10

khuẩn, vi khuẩn thương hàn, trực khuẩn lỵ Shigella, trực khuẩn lỵ coli, phế
cầu khuẩn. Nước sắc lá kim ngân vói nồng độ 1,2-20% có tác dụng ức chế
trực khuẩn lỵ Shigella, 5-20% ức chế vi trùng phó thương hàn A, 100% ức
chế tụ cầu khuẩn.
+ Tác dụng trên đường huyết: Sau khi cho thỏ uống nước sắc hoa kim
ngân thì lượng đường huyết tăng, hiện tượng này kéo dài 5-6 giờ mới trở lại
bình thường.
+ Tác dụng ngăn chặn choáng phản vệ: Năm 1966, Đỗ Tất Lợi, Bùi
Năng An và Bùi Chí Hiếu (Hội nghị thuốc nam lần thứ 4, Hà Nội) đã báo cáo
nước sắc kim ngân có khả năng ngăn chặn choáng phản vệ trên chuột lang:
Khi cho chuột uống nước sắc kim ngân, không thấy có sự thay đổi đáng kể số
lượng và hoạt tính tế bào hạt (mastocytes) ở màng treo ruột của các súc vật
này. Hàm lượng histamin ở phổi chuột lang bị choáng phản vệ lớn hơn 1,5 lần
chỉ số này ở chuột lang bình thường hoặc ở chuột uống nước sắc kim ngân
trước khi gây choáng phản vệ.
+ Độ độc: Cũng theo các tác giả trên, cho chuột nhắt trắng uống nước
sắc kim ngân trong thời gian 7 ngày với liều gấp 150 lần liều điều trị cho
người (tính theo gam thể trọng), không dẫn đến sự thay đổi đáng kể trong phủ
tạng và 100% chuột sống sót. Điều này chứng tỏ rằng nước sắc kim ngân thực
tế không độc.
• Công dụng và liều dùng:
+ Công dụng: Thường dùng trị mụn nhọt, ban sởi, mày đay, lở ngứa,
nhiệt độc, tả lị, ho do phế nhiệt. Người ta còn dùng kim ngân trị dị ứng (viêm
mũi dị ứng và một số trường hợp dị ứng khác) và trị thấp khớp.
+ Liều dùng: Ngày dùng 4-15g hoa hay 10-16g cành lá dưới dạng thuốc
sắc, hãm, cao, rượu thuốc hoặc hoàn tán. Có thể dùng riêng kim ngân hay phối
hợp với nhiều vị thuốc khác [7, 76-77].
11
Chương II
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.1. NGUYÊN LIỆU.
2.1.1. Cây kim ngân.
Là phần trên mặt đất phơi và sấy khô của cây kim ngân: Lonicera
ịaponica Thunb., thuộc họ kim ngân Capriỷoliaceae.
Nguyên liệu trên được mua tại các cơ sở mua bán dược liệu, đối chiếu
theo tiêu chuẩn của Dược điển Việt nam III [5, 394-395].
2.1.2. Flavonoid kim ngân toàn phần.
Để có được ílavonoid toàn phần từ cây kim ngân trong nghiên cứu,
chúng tôi đã tiến hành chiết tách ílavonoid toàn phần từ cây kim ngân theo
quy trình tóm tắt như sau: Dược liệu được sấy ở 60-65°C trong tủ sấy một giờ,
đem tán nhỏ thành bột. Sau đó cân 500g bột dược liệu, chiết theo phương pháp
ngấm kiệt với cồn 70°. Dịch chiết thu được đem cô cách thuỷ đến cắn. Hoà tan
cắn trong 500 ml nước cất, lọc loại tạp. Dịch lọc cho vào bình gạn lắc với
ether đầu hoả cho đến khi dịch chiết ether không màu. Đun cách thuỷ dịch
chiết nước 15 phút để loại hết ether. Tiếp tục lắc dịch chiết với cloroíorm trên
bình gạn cho đến khi dịch chiết cloroíorm không màu. Đun cách thuỷ dịch
chiết nước 15 phút để loại hết cloroíorm. Dịch nước cho vào bình gạn, chiết
bằng ethyl acetat, gộp dịch chiết ethyl acetat, cô cách thuỷ hết dung môi ethyl
acetat, thu được cắn Aavonoid toàn phần. Quy trình được thực hiện có thể mô
tả như sơ đồ sau:
12
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình chiết tách ýlavonoid toàn phần từ kim ngân
2.1.3. a-amylase.
Nước bọt người được pha loãng ở các nồng độ khác nhau để tiến hành
thử trên in vitro.
13
Viên nén bao phim Maxilase của hãng Sanoíi-Synthelabo có chứa a-
amylase có hàm lượng 3000 Ư dùng để tiến hành thử trên in vivo.
2.1.4. Dung dịch cơ chất tinh bột 1% pH= 6,8.
Dung dịch đệm phosphat pH=6,8

Dinatri hydrophosphat 28,8g
Kali dihydrophosphat 11,45 g
Nước cất vừa đủ 1000 ml
Dung dịch tinh bột 1%: Hoà lg tinh bột trong 5-10 ml nước lạnh rồi đổ
dần lOml dung dịch đệm phosphat pH= 6,8 đang sôi vào, tráng cốc bằng một
ít nước lạnh. Tiếp tục đun sôi trong 1 phút rồi để nguội ở nhiệt độ phòng.
Thêm nước cất vừa đủ lOOml. Bảo quản
ở tủ lạnh. Chuẩn bị dung dịch tinh
bột dùng trong ngày.
2.1.5. Dung dịch albumin 5mg/ml.
Hoà tan 75mg albumin bovine kết tinh vào 15ml NaCl 0,9% thành dung
dịch albumin 5mg/ml.
2.2. Súc vật thí nghiệm.
Chuột cống trắng đực và cái nuôi trong cùng điều kiện, cân nặng từ
100-130g, do trại chăn nuôi súc vật học viện 103 cung cấp.
2.3. Thiết bị dụng cụ.
- Máy đo quang Trung Quốc 752
- Tủ sấy
- Tủ lạnh
- Máy điều nhiệt
- Dụng cụ đo thể tích chân chuột
- Cân phân tích và cân kỹ thuật Sartorius
2.4. Hoá chất thí nghiệm.
Thuốc thử Gomall [14 ,223].
Dung dịch HCL 0,1N
14
Dung dịch iod phân tích
Dung dịch iod gốc:
Iod 0,5g
Kali iodua 5,0g

Nước cất vừa đủ 200ml
Dung dịch Iod phân tích:
Dung dịch iod gốc 2ml
Dung dịch HCL 0,1N vừa đủ lOOml
2.5. Phương pháp nghiên cứu.
2.5.1. Phương pháp định lượng protein nước bọt bằng phản ứng biure.
a) Nguyên tắc
Protein của nước bọt sẽ phản ứng vói thuốc thử Gomall tạo thành màu
tím hồng. So với biểu đồ mẫu để định lượng protein trong nước bọt,
b) Tiến hành
• Vẽ biểu đồ mẫu:
Bảng 2./. Thể tích các thuốc thử dùng để vẽ biểu đồ mẫu.
Ống
1 2 3 4 5 6
Dung dịch albumin 5mg/ml (ml)
0 0,3 0,5 0,6 0,8
1,0
Dung dịch NaCl 0,9% (ml)
1,0
0,7 0,5 0,4 0,2 0
Thuốc thử Gomall (ml)
4,0 4,0 4,0
4,0 4,0 4,0
Lắc và để 30 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó đem đo quang ở bước sóng
550nm, cuvet lcm, mẫu trắng là ống 1. Vẽ biểu đồ: Trục hoành ghi lượng
albumin (mg), trục tung ghi mật độ quang học (D).
• Định lượng protein của nước bọt. Tiến hành như sau:
Bảng 2.2. Thể tích các thuốc thử để định lượng proteỉn của nước bọt.
Ống
Ống thử

Ống trắng
Dung dịch nước bọt (ml)
1,0
0
Dung dịch NaCl 0,9% (ml)
0
1,0
Thuốc thử Gomall (ml)
4,0
4,0
15
Lắc và để 30 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó đem đo quang ở bước sóng
550nm, cuvet lcm. So với biểu đồ mẫu và tính ra lượng protein trong lml
dung dịch nước bọt.
c) Tính kết quả
Tính lượng protein (P) trong lml nước bọt:
P(mg/ml) = c X B
Trong đó: C: Nồng độ protein (mg/ml) tính theo biểu đồ.
B: Độ pha loãng dung dịch protein trong nước bọt.
2.5.2. Phương pháp xác định hoạt độ của enzym
a) Nguyên tắc
a-amylase thuỷ phân tinh bột tạo thành các dextrin có phân tử lượng
khác nhau. Khi cho tác dụng với iod chúng sẽ tạo màu. Đo cường độ màu sẽ
tính được hoạt độ của a-amylase.
b) Tiến hành
Nước bọt được pha loãng thành các nồng độ khác nhau bằng nước cất.
Tiến hành định lượng enzym như sau:
Bảng 23. Tỉú[ tích các thuốc thử để xác đinh hoai độ enzym.
__________
Dung dịch

Ống thử
Ống cơ chất
Dung dịch tinh bột 1% (ml)
2,0 ml 2,0ml
ủ 37°c trong 5 phút
Nước bọt đã pha loãngthích hợp (ml)
l,0ml
Oml
Lắc đều để ủ 37°c trong 5 phút. Sau đó lấy ở mỗi ống 0,1 ml cho vào 2
ống nghiệm khác đã có 10,0ml dung dịch iod phân tích, lắc đều rồi đem đo
quang ở bước sóng 656nm, cuvet lcm.
Xác định khả năng thuỷ phân tinh bột của ct-amylase khi kết hợp với
dịch chiết ílavonoid toàn phần: cắn ílavonoid toàn phần của kim ngân được
pha loãng thành các nồng độ thích hợp tạo thành dịch chiết ílavonoid toàn
phần.
16
Ông thử: Thêm lml dịch chiết ílavonoid toàn phần .
c) Tính kết quả
% tinh bột bị thuỷ phân:
2.5.3.Phương pháp gây viêm.
Phương pháp gây viêm cấp theo mô hình của Winter [20]: Tiêm 0,05ml
dung dịch dextran 6% vào mặt dưới gan bàn chân sau của chuột.
2.5.4. Phương pháp thử tác dụng chống viêm.
Sử dụng phương pháp đo phù chân chuột theo mô hình của Winter [20].
Đo thể tích bàn chân sau từ gan bàn chân tới khuỷu vào thời điểm trước
khi tiêm thuốc và khi chân chuột phù to nhất sau khi tiêm thuốc.
Lô chứng: Chuột được uống dung dịch NaCl 0,9%.
Lô chuột thử dược liệu: Chuột được uống dịch chiết dược liệu bằng một
kim cong đầu tù vào thời điểm 60 phút trước khi gây viêm, 30 phút trước khi
gây viêm và 30 phút sau khi gây viêm.

Lô chuột thử với a-amylase: Cho chuột uống a-amylase với các nồng
độ khác nhau vào thời điểm 1 giờ sau khi gây viêm.
Lô chuột thử tác dụng kết hợp: Cho chuột uống dịch chiết dược liệu và a-
amylase vào các thời điểm giống như lô thử dịch chiết dược liệu và lô thử a-
amylase.
Lô so sánh: Chuột được uống indomethacin vào thời điểm 30 phút trước
khi gây viêm.
17
• Tính kết quả:
Tỷ lệ phần trặm tăng thể tích chân chuột so với thời điểm trước
khi gây viêm được tính theo công thức :
v2-v,
AV%= xl00%
V!
Trong đó : AV%: Phần trăm độ tăng thể tích chân chuột.
V1: Thể tích chân chuột trước khi gây viêm .
V2: Thể tích chân chuột sau khi gây viêm .
Từ đó tính ra trị số trung bình tỷ lệ phần trăm tăng thể tích chân chuột trong
cùng một lô và sai số chuẩn của nó: AV% ± S.E.
Tính tỷ lệ % ức chế phù để đánh giá tác dụng chống viêm cấp tính của
thuốc theo công thức:
AVC% - AVt%
1% = X 100%
AVC%
Trong đó : 1% là tỷ lệ ức chế phù.
AVC%: số trung bình (%) độ tăng thể tích chân chuột ở lô
chứng.
____
ÀVt%: số trung bình (%) độ tăng thể tích chân chuột ở lô thử.
2.5.5. Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê toán học với sự trợ giúp
của chương trình Excel
18
Chương III
THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1. ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH CHIẾT FLAVONOID KIM NGÂN
TOÀN PHẦN ĐỐI VỚI HOẠT TÍNH CỦA ALPHA-AMYLASE.
• Kết quả xác định sơ bộ hàm lượng a-amylase trong nước bọt.
+ Kết quả vẽ biểu đồ mẫu của albumin chuẩn 5mg/ml.
Tiến hành vẽ biểu đồ mẫu theo phương pháp đã nêu ở phần 2.5.1. Kết quả thu
được như sau:
Bảng 3.1. Kết quả đo quang của dung dịch albumin.
Ống
1
2
3 4 5
6
Dung dịch albumin
5mg/ml (ml)
0
0,3 0,5
0,6 0,8
1,0
Lượng albumin
tương ứng (mg)
0
1,5
2,5 3,0
4,0
5,0

Mật độ quang
0
0,062
0,095
0,120 0,160
0,201
Lượng albumin tương ứng (mg)
Hình 3.1. Biểu đồ mẫu của albumin chuẩn 5mg/ml
19
+ Sơ bộ xác định hàm lượng a-amylase của nước bọt.
Trước khi tiến hành các thử nghiệm in vitro, nước bọt người được xác
định sơ bộ hàm lượng a-amylase theo như phương pháp đã nêu ở mục 2.5.1.
Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.2. Kết quả đo quang của dung dịch nước bọt
Ống thử
Thể tích dung dịch nước bọt (ml)
Mật độ quang (D)
1 1,0
0,140
2
1,0
0,142
3
1,0 0,131
4
1,0 0,134
5
1,0
0,128
Trung bình

1,0 0,135
Như vậy, mật độ quang trung bình thu được là 0,135, đối chiếu với biểu đồ
mẫu của albumin 5mg/ml thì suy ra hàm lượng a-amylase của nước bọt là
3,5mg/ml. Dựa vào kết quả này để tiến hành các thử nghiệm tiếp theo.
3.1.1. Ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết Aavonoid kim ngân toàn phần
đối vói hoạt tính của a-amylase
Với mục đích tìm ra nồng độ thích hợp nhất của dịch chiết Aavonoid
kim ngân toàn phần kích thích hoạt tính của a-amylase mạnh nhất, chúng tôi
tiến hành xác định hoạt tính của a-amylase khi kết hợp với dịch chiết
Havonoid kim ngân toàn phần ở các nồng độ khác nhau trong cùng điều kiện
như đã nêu ở phần 2.5.2. Kết quả thu được trình bày trong bảng sau:
20
Bảng 3.3: Ẳnh hưởng của nồng độ dịch chiếtỷlavonoid kim ngân toàn phần
đối với hoạt tính của a-amyỉase.
Nồng độ
dịch chiết FKN
% tinh bột bị
thuỷ phân
%thay đổi
hoạt tính
p
0
31,5 ±0,7
100,00
0,005
49,7 ±2,1
157,8
p<0,01
0,01
49,7 ± 0,7

157,8
p<0,01
0,02
47,6 ±1,9
151,1
p<0,01
0,05
51,8 + 1,9
164,4
p<0,01
0,1
47,6 ± 0,4 150,4
p<0,01
Ghi chú: Kết quả trên sử dụng giá trị trung bình ±S.E của 3 lần thí nghiệm,
mỗi lần xác định hoạt độ enzym 3 lần. a-amylase sử dụng là lượng a-amylase
có trong lml nước bọt được pha loãng 100 lần.
Kết quả ở bảng 1 cho thấy: dịch chiết ílavonoid kim ngân toàn phần với
nồng độ 0,05% có khả năng kích thích hoạt tính của a-amylase mạnh nhất, %
thay đổi hoạt tính lên đến 164,4% (P<0,01). Với nồng độ lớn hơn hoặc nhỏ
hơn khả năng kích thích giảm đi.
3.1.2. Ảnh hưởng của thời gian đối với hoạt tính của a-amylase khi kết
hợp vói dịch chiết Aavonoid kim ngân toàn phần 0,05%
Để theo dõi sự ảnh hưởng của thời gian lên hoạt tính của a-amylase khi
kết hợp với dịch chiết ílavonoid kim ngân toàn phần 0,05%, thí nghiệm xác
định hoạt độ của a-amylase được tiến hành trong thời gian 5', 20', 40', 60' ở
cùng điều kiện như đã nêu ở phần 2.5.2. Kết quả trình bày ở bảng sau:
21