ứng dụng chỉ thị phân tử chọn lọc cá thể ưu tú chứa gen kháng bệnh bạc lá và mùi thơm từ một số tổ hợp lai lúa f2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM








HÀ THỊ VÂN ANH




ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ CHỌN LỌC CÁ THỂ
ƯU TÚ CHỨA GEN KHÁNG BỆNH BẠC LÁ VÀ
MÙI THƠM TỪ MỘT SỐ TỔ HỢP LAI LÚA F2


LUẬN VĂN THẠC SĨ




HÀ NỘI, NĂM 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM






HÀ THỊ VÂN ANH


ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ CHỌN LỌC CÁ THỂ
ƯU TÚ CHỨA GEN KHÁNG BỆNH BẠC LÁ VÀ
MÙI THƠM TỪ MỘT SỐ TỔ HỢP LAI LÚA F2



CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ : 60 42 02 01

Người hướng dẫn khoa học:
PGS.TS. PHAN HỮU TÔN



HÀ NỘI, NĂM 2015
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page iii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả
nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng
dùng bảo vệ ở bất kỳ học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã
được cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày 10 tháng 6 năm 2015
Tác giả


Hà Thị Vân Anh

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page iv

LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện luận văn, ngoài sự nỗ lực và cố gắng của bản
thân, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của rất nhiều cá nhân và tập thể.
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng, sự cảm ơn chân thành và sâu sắc
tới thầy PGS.TS. Phan Hữu Tôn, trưởng Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ
sinh học ứng dụng đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo tôi trong suốt quá trình tôi
thực hiện đề tài.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Tống Văn Hải cùng toàn bộ các cán bộ
đang công tác tại bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ sinh học ứng dụng –
Học viện Nông Nghiệp Việt Nam đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho
tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Qua đây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh chị và bạn bè
đã giúp đỡ, động viên trong suốt quá trình học tập cũng như thực tập tốt nghiệp.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới toàn thể gia đình đã luôn
là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày 10 tháng 6 năm 2015
Tác giả luận văn


Hà Thị Vân Anh
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page v

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN 1
LỜI CẢM ƠN iv
MỤC LỤC v
DANH MỤC BẢNG viii
DANH MỤC HÌNH x
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT xi
TÓM TẮT xii
MỞ ĐẦU 1
1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1
2 Mục đích và yêu cầu 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1 Tổng quan về bệnh bạc lá 3
1.1.1 Nguyên nhân, triệu chứng của bệnh bạc lá lúa 3
1.1.2 Tác hại của bệnh bạc lá lúa 5
1.1.3 Quy luật và các yếu tố ảnh hưởng đến phát sinh, phát triển bệnh 5
1.1.4 Các biện pháp phòng trừ bệnh bạc lá 8
1.1.5 Chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá bằng chỉ thị phân tử 9
1.2 Tổng quan về tính trạng mùi thơm của lúa 15
1.2.1 Các yếu tố cấu thành chất lượng của lúa 15
1.2.2 Bản chất hóa học của mùi thơm 17
1.2.3 Di truyền của tính trạng mùi thơm 18
1.2.4 Ứng dụng công nghệ sinh học trong nghiên cứu gen fgr của lúa gạo 19
CHƯƠNG 2 :VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
2.1 Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 22
2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 22
2.1.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 22
2.2 Nội dung nghiên cứu 22
2.3. Phương pháp nghiên cứu 23
2.3.1 Quy trình chọn lọc 23

2.3.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm ngoài đồng ruộng 23
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page vi

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 31
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32
3.1 Đặc điểm nông sinh học của các các thể được chọn lọc từ các quần thể
phân ly F2 32
3.1.1 Kết quả chọn lọc từ tổ hợp 251F2 (AIQ6 x IRBB4/7) 32
3.1.2 Kết quả chọn lọc từ tổ hợp 309F
2
( H56-2-2 x Hương thơm 1) 33
3.1.3 Kết quả chọn lọc từ tổ hợp 392F
2
(LC2 x Bắc thơm 7) 34
3.1.4 Kết quả chọn lọc từ tổ hợp 428F2 (10987 x 10861) 35
3.1.5 Kết quả chọn lọc từ tổ hợp 514F2 (KNL x 10921) 36
3.1.6 Kết quả chọn lọc từ tổ hợp 526F2 (11278 x 10911) 37
3.2 Kiểm tra gen kháng bệnh bạc lá Xa4, Xa7 bằng kỹ thuật PCR 38
3.2.1 Kết quả kiểm tra gen kháng bạc lá các cá thể được chọn lọc từ tổ hợp lai
251F2 (AIQ6 x IRBB4/7) 39
3.2.2 Kết quả kiểm tra gen kháng bạc lá các cá thể được chọn lọc từ tổ hợp lai
309F
2
( H56-2-2 x Hương thơm 1) 40
3.2.3 Kết quả kiểm tra gen kháng bạc lá các cá thể được chọn lọc từ tổ hợp lai
392F
2
(LC2 x Bắc thơm 7) bằng chỉ thị DNA 42
3.2.4 Kết quả kiểm tra gen kháng bạc lá các cá thể được chọn lọc từ tổ hợp lai

428F2 (10987 x 10861) bằng chỉ thị DNA 43
3.2.5 Kết quả kiểm tra gen kháng bạc lá các cá thể được chọn lọc từ tổ hợp lai
514F2 (KNL x 10921) bằng chỉ thị DNA 44
3.2.6 Kết quả kiểm tra gen kháng bạc lá các cá thể được chọn lọc từ tổ hợp lai
526F2 (11278 x 10911) bằng chỉ thị DNA 44
3.3 Kết quả đánh giá mùi thơm và khả năng mang gen mùi thơm 46
3.3.1 Kết quả đánh giá mùi thơm bằng phương pháp kiểm tra với KOH 1,7% . 47
3.3.2 Kết quả xác định gen mùi thơm bằng phương pháp PCR 53
3.3.3 So sánh kết quả kiểm tra với KOH 1,7% và kết quả xác định gen bằng
PCR 57
3.4 Tổng hợp kết quả kiểm tra gen Xa4, Xa7 và gen thơm fgr của các cá thể
được chọn lọc từ các tổ hợp lai 58
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page vii

3.4.1 Kết quả kiểm tra gen kháng bệnh bạc lá Xa4, Xa7 và gen thơm fgr các cá
thể được chọn lọc từ tổ hợp 251F2 (AIQ6 x IRBB4/7) 58
3.4.2 Kết quả kiểm tra gen kháng bệnh bạc lá Xa4, Xa7 và gen thơm fgr các cá
thể được chọn lọc từ tổ hợp 309F
2
( H56-2-2 x Hương thơm 1) 59
3.4.3 Kết quả kiểm tra gen kháng bệnh bạc lá Xa4, Xa7, gen thơm fgr các cá
thể được chọn lọc từ tổ hợp 392F2 ( LC2 x Bắc thơm 7) 60
3.4.4 Kết quả kiểm tra gen kháng bệnh bạc lá Xa4, Xa7, gen thơm fgr các cá
thể được chọn lọc từ tổ hợp 428F2 (10987 x 10861) 61
3.4.5 Kết quả kiểm tra gen kháng bệnh bạc lá Xa4, Xa7, gen thơm fgr các cá
thể được chọn lọc từ tổ hợp 514F2 (KNL x 10921) 62
3.4.6 Kết quả kiểm tra gen kháng bệnh bạc lá Xa4, Xa7, gen thơm fgr các cá
thể được chọn lọc từ tổ hợp 526F2 (11278 x 10911) 63
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 65

1 Kết luận 65
2 Đề nghị 66
TÀI LIỆU THAM KHẢO 67





Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page viii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các loại DNA markers thông dụng 10
Bảng 1.2 Bản đồ liên kết di truyền với gen quy định tính trạng nông sinh học
quan trọng với RFLP đánh dấu 11
Bảng 2.1 Các tổ hợp phân ly F2 sử dụng trong nghiên cứu 22
Bảng 2.4 Thành phần cho 1 phản ứng PCR phát hiện gen kháng bạc lá 28
Bảng 2.5 Các Primer dùng trong PCR phát hiện gen kháng bạc lá lúa 28
Bảng 2.6 Chu kỳ nhiệt cho gen Xa4, Xa7 29
Bảng 2.7 Chỉ thị DNA sử dụng để phát hiện gen mùi thơm 30
Bảng 2.8 Thành phần cho 1 phản ứng PCR phát hiện gen thơm 30
Bảng 2.9 Chu kỳ nhiệt cho gen thơm fgr 30
Bảng 3.1 Một số đặc điểm nông sinh học chính các cá thể được chọn lọc từ tổ
hợp 251F2 33
Bảng 3.2 Một số đặc điểm nông sinh học chính các cá thể được chọn lọc từ tổ
hợp 309F2 34
Bảng 3.3 Một số đặc điểm nông sinh học chính các cá thể được chọn lọc từ tổ
hợp 392F2 35
Bảng 3.4 Một số đặc điểm nông sinh học chính các cá thể được chọn lọc từ tổ

hợp 428F2 36
Bảng 3.5 Một số đặc điểm nông sinh học chính các cá thể được chọn lọc từ tổ
hợp 514F2 37
Bảng 3.6 Một số đặc điểm nông sinh học chính các cá thể được chọn lọc từ tổ
hợp 526F2 38
Bảng 3.7 Kết quả đánh giá cảm quan mùi thơm các mẫu cá thể 48
Bảng 3.8 So sánh kết quả đánh giá mùi thơm bằng phương pháp sử dụng KOH
1,7% và kết quả kiểm tra gen fgr bằng phương pháp PCR. 57
Bảng 3.9 Tổng hợp kết quả kiểm tra gen Xa4, Xa7, gen thơm fgr các cá thể
được chọn lọc tổ hợp 251F2 58
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page ix

Bảng 3.10 Tổng hợp kết quả kiểm tra gen Xa4, Xa7, gen thơm fgr các cá thể
được chọn lọc tổ hợp 309F2 ( H56-2-2 x Hương thơm 1) 59
Bảng 3.11 Tổng hợp kết quả kiểm tra gen Xa4, Xa7, gen thơm fgr các cá thể
được chọn lọc tổ hợp 392F2 (LC2 x Bắc thơm 7) 60
Bảng 3.12 Tổng hợp kết quả kiểm tra gen Xa4, Xa7, gen thơm fgr các cá thể
được chọn lọc tổ hợp 428F2 (10987 x 10861) 61
Bảng 3.13 Tổng hợp kết quả kiểm tra gen Xa4, Xa7, gen thơm fgr các cá thể
được chọn lọc tổ hợp 514F2 (KNL x 10921) 62
Bảng 3.14 Tổng hợp kết quả kiểm tra gen Xa4, Xa7, gen thơm fgr các cá thể
được chọn lọc tổ hợp 526F2 (11278 x 10911) 63
Bảng 3.15 Đặc điểm của 4 mẫu cá thể kháng bạc lá được chọn 64
Bảng 3.16 Đặc điểm của 9 mẫu cá thể chất lượng tốt được chọn 64

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page x

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hoạt động của bộ 4 mồi được mô tả trong nghiên cứu của Bradburry
và cộng sự (2005). 21
Hình 1.2 Vi trí gen thơm trên nhiễm sắc thể số 8 21
Hình 3.1 Ảnh điện di sản phẩm gen Xa4 các cá thể trong tổ hợp lai 251F2
(AIQ6 x IRBB4/7) 39
Hình 3.2 Ảnh điện di sản phẩm gen Xa7 các cá thể trong tổ hợp lai 251F2 40
Hình 3.3 Ảnh điện di sản phẩm gen Xa4 sau khi tiến hành phản ứng PCR của
tổ hợp lai 309F
2
( H56-2-2 x Hương thơm 1) 40
Hình 3.4 Ảnh điện di sản phẩm gen Xa7 sau khi tiến hành phản ứng PCR của
tổ hợp lai 309F
2
( H56-2-2 x Hương thơm 1) 41
Hình 3.5 Ảnh điện di sản phẩm gen Xa4 sau khi tiến hành phản ứng PCR của
tổ hợp lai 392F
2
(LC2 x Bắc thơm 7) 42
Hình 3.6 Ảnh điện di sản phẩm gen Xa7 sau khi tiến hành phản ứng PCR của
tổ hợp lai 392F
2
(LC2 x Bắc thơm 7) 42
Hình 3.7 Ảnh điện di sản phẩm gen Xa4 sau khi tiến hành phản ứng PCR của
tổ hợp lai 428F2 (10987 x 10861) 43
Hình 3.8 Ảnh điện di sản phẩm gen Xa7 sau khi tiến hành phản ứng PCR của
tổ hợp lai 428F2 (10987 x 10861) 43
Hình 3.9 Ảnh điện di sản phẩm gen Xa4 sau khi tiến hành phản ứng PCR của
tổ hợp lai 514F2 (KNL x 10921) 44
Hình 3.10 Ảnh điện di sản phẩm gen Xa7 sau khi tiến hành phản ứng PCR của
tổ hợp lai 514F2 (KNL x 10921) 45

Hình 3.11 Ảnh điện di sản phẩm gen Xa4 sau khi tiến hành phản ứng PCR của
tổ hợp lai 526F2 (11278 x 10911) 45
Hình 3.12 Ảnh điện di sản phẩm gen Xa7 sau khi tiến hành phản ứng PCR của
tổ hợp lai 526F2 (11278 x 10911) 46
Hình 3.13 Ảnh điện di sản phẩm gen thơm của tổ hợp lai 251F2 53
Hình 3.14 Ảnh điện di sản phẩm gen thơm của tổ hợp lai 309F2 54
Hình 3.15 Ảnh điện di sản phẩm gen thơm của tổ hợp lai 392F2 54
Hình 3.16 Ảnh điện di sản phẩm gen thơm của tổ hợp lai 428F2 55
Hình 3.17 Ảnh điện di sản phẩm gen thơm của tổ hợp lai 514F2 55
Hình 3.18 Ảnh điện di sản phẩm gen thơm của tổ hợp lai 526F2 56
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page xi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Tên viết tắt Tên đầy đủ
AFLP Amplified fragment length polymorphism
ALP Amplicon length polymorphism
AP - PCR Arbitrary primer-PCR
BVTV Bảo vệ thực vât
CNSH Công nghệ sinh học
DA F DNA amplification fingerprinting
DHT Dị hợp tử
ĐHT Đồng hợp tử
ĐC Đối chứng
MRDHV- DNA
Moderately repeated, dispersed, and highly variable
DNA(minisatellite)
NS Năng suất
NST Nhiễm sắc thể
PCR Polymerase Chain Reaction

RAPD Random amplified polymorphic DNA
RFLP Restriction fragment length polymorphism
SSCP Single strand conformation polymorphism
SSR Simple sequence repeat (microsatellite)
TGST Thời gian sinh trưởng
TL Tỷ lệ
Xoo Xanthomonas oryzae. pv. oryzae




Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page xii

TÓM TẮT
Ứng dụng chỉ thị phân tử DNA nhằm chọn lọc những cá thể tốt trong các
quần thể phân ly chứa đồng thời các gen kháng bệnh bạc lá hữu hiệu Xa4, Xa7 và
gen mùi thơm fgr làm vật liệu cho công tác chọn tạo giống kháng bệnh có năng suất
cao, phẩm chất tốt, cơm thơm dẻo là một việc làm vô cùng có ý nghĩa. Thí nghiệm
được thực hiện trên 6 quần thể phân ly 251F
2
(AIQ6 x IRBB4/7), 309F
2
(H56-2-2 x
Hương thơm 1), 392F
2
(LC2 x Bắc thơm 7), 428F2 (10987 x 10861), 514F2 (KNL
x 10921), 526F2 (11278 x 10911).
Sau khi có kết quả theo dõi một số đặc điểm nông sinh học, năng suất, các
yếu tố cấu thành năng suất trên 6 quần thể phân ly đã chọn được 65 cá thể có năng

suất cao, phẩm chất tốt hơn so với cây bố mẹ ở từng cặp lai. Tiến hành chạy PCR
các cá thể tốt đã chọn được 32 cá thể mang gen kháng ĐHT, và 28 cá thể mang gen
thơm fgr. Trong đó có 15 cá thể mang gen kháng Xa4, 17 cá thể mang gen kháng
Xa7, 4 cá thể mang cả 2 gen kháng Xa4/Xa7 và 9 cá thể vừa mang gen kháng (Xa4
hoặc Xa7) vừa mang gen thơm. Đặc biệt có được 1 cá thể quy tụ cả 2 gen kháng và
gen thơm. Các cá thể vừa mang gen kháng ĐHT vừa mang gen thơm fgr này chính
là nguồn vật liệu quý giá trong công tác chọn tạo giống vừa có khả năng kháng bệnh
bạc lá vừa có năng suất cao, chất lượng tốt, gạo thơm ngon. Bên cạnh đó, các cá thể
còn chứa gen kháng DHT cần được tiếp tục chọn tạo trong các thế hệ phân ly.








Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 1

MỞ ĐẦU
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Lúa là cây lương thực chiếm tỉ trọng cao trong tổng sản lượng lương thực
hàng năm, cung cấp gần 80% nhu cầu tinh bột trung bình cho người dân Việt Nam.
Tuy nhiên, Việt Nam có khí hậu nhiệt đới là điều kiện thuận lợi cho nhiều loại sâu
bệnh hại phát triển. Trong đó, bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv.
oryzae gây ra, là một bệnh đặc biệt nguy hiểm đối với cây lúa. Bệnh có khả năng
gây giảm năng suất nghiêm trọng, thiệt hại lên đến 30-60%, hoặc có thể dẫn đến
mất trắng (Lã Vĩnh Hoa, Tống Văn Hải và cs., 2010). Cho đến nay, chưa có loại
thuốc hóa học nào đặc trị bệnh bạc lá, việc tạo ra các giống lúa có khả năng kháng

bệnh bền vững được xem là hướng phòng chống bệnh hiệu quả nhất, cả về mặt kinh
tế và môi trường.
Đã có trên 30 gen kháng bệnh bạc lá được phát hiện ở lúa trồng và lúa dại
(Ninox-Lui et al., 2006; Singh et al., 2007; Siriporn Korinsak, 2009). Tuy nhiên
mỗi gen kháng chỉ kháng được một hay một số chủng vi khuẩn nhất định, trong khi
đó mỗi vùng trồng lúa lại tồn tại nhiều chủng vi khuẩn khác nhau, vì vậy nếu giống
chỉ chứa một gen kháng thì sau một thời gian ngắn sẽ bị nhiễm bệnh. Vấn đề đặt ra
là cần phải quy tụ nhiều gen kháng vào một giống để giống đó có khả năng kháng
được nhiều chủng vi khuẩn khác nhau. Theo kết quả nghiên cứu của Phan Hữu Tôn
và cộng sự (2005) thì các gen Xa4, Xa7 kháng được hầu hết các chủng vi khuẩn ở
miền Bắc Việt Nam.

Bên cạnh đó, ngày nay khi kinh tế đã khá ổn định, chất lượng cuộc sống
được nâng cao nên nhu cầu về các sản phẩm lúa gạo có chất lượng cao của con
người ngày càng tăng. Hiện nay, một giống lúa muốn phát triển ngoài sản xuất đòi
hỏi: thời gian sinh trưởng ngắn, thấp cây, chống đổ tốt, năng suất cao, chất lượng và
có khả năng chống chịu sâu bệnh tốt. Người ta cũng đã tìm ra được gen fgr, Waxy là
những gen quy định mùi thơm và hàm lượng amylose ở các giống lúa tẻ.
Trên thế giới, với sự phát triển của công nghệ sinh học, rất nhiều gen đã
được định vị trên bản đồ, được xác định chỉ thị phân tử DNA liên kết. Ứng dụng
công nghệ này nhằm chọn tạo ra được các giống lúa mới có chất lượng cao, cơm

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 2

dẻo thơm và kháng bệnh bạc lá bền vững sẽ nâng cao thu nhập cho người dân, cung
cấp gạo ngon cho thị trường và tạo được nông sản sạch, không gây ô nhiễm môi
trường. Tuy nhiên, các tính trạng tốt này lại nằm rải rắc trong từng giống, nên cần
được quy tụ lại trong các giống lai nhằm tạo ra một giống vừa có năng suất, chất
lượng tốt, cảm ôn, cơm dẻo, thơm mà lại kháng bệnh bạc lá tốt.

Với mục đích quy tụ nhiều gen kháng hữu hiệu vào các giống lúa tốt. Trong
thời gian qua nhóm nghiên cứu Lúa bộ môn Sinh học phân tử và CNSH Ứng dụng -
Khoa CNSH - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tiến hành lai tạo được rất nhiều
các tổ hợp F2 tốt từ nguồn gen kháng bệnh bạc lá và chất lượng. Để chọn lọc được
các cá thể tốt từ các tổ hợp phân ly F2 kháng bệnh bạc lá, chất lượng, làm cơ sở tạo
ra các giống lúa thuần năng suất cao, chất lượng tốt, chống chịu sâu bệnh, đặc biệt
là bệnh bạc lá, chúng tôi tiến hành đề tài: “Ứng dụng chỉ thị phân tử chọn lọc cá
thế ưu tú chứa gen kháng bệnh bạc lá và mùi thơm từ một số tổ hợp lai lúa F2.”
2. Mục đích và yêu cầu
Mục đích
- Chọn lọc được các cá thể có các đặc tính nông sinh học tốt, năng suất cao,
mang gen kháng bệnh bạc lá Xa4, Xa7 đồng hợp tử và gen mùi thơm fgr từ quần thể
phân ly F2 của một số tổ hợp lai.
Yêu cầu
- Đề ra được một số chỉ tiêu nông sinh học, năng suất và các yếu tố cấu thành
năng suất của các cá thể được chọn lọc.
- Sử dụng được chỉ thị phân tử DNA để xác định các cá thể trên có chứa các
gen mục tiêu không.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 . Tổng quan về bệnh bạc lá
1.1.1 Nguyên nhân, triệu chứng của bệnh bạc lá lúa
1.1.1.1. Nguyên nhân
Bệnh bạc lá lúa được phát hiện đầu tiên ở Fukuoka - Nhật Bản vào năm
1884. Ban đầu các nhà nghiên cứu lầm tưởng nguyên nhân gây nên triệu chứng
bệnh là do axit đất. Nhưng sau đó, các nhà khoa học chỉ ra nguyên nhân của nó là

do vi khuẩn gây nên và theo Ishiyama, 1922 nó thuộc loại Bacillus oryzae. Cuối
cùng đã xác định là do vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây nên (Yamamoto T et al.,
1977).
Theo Tagami Y và OU thì vi khuẩn Xanthomonas có hình gậy ngắn tròn ở
hai đầu. Kích thước 1 - 2µm x 0,8 - 1µm, có một tiêm mao, nhuộm màu gram âm và
không hình thành nha bào. Tế bào vi khuẩn có màng nhầy bao bọc và được liên kết
với nhau thành một khối vững chắc ngay cả trong nước. Khuẩn lạc màu vàng rơm,
dịch vi khuẩn tiết ra kết thành các hạt keo màu vàng, không hòa tan trong nước (Tạ
Minh Sơn, 1987).
Con đường xâm nhập của vi khuẩn bạc lá Xanthomonas oryzea pv.oryzae: Vi
khuẩn xâm nhập có tính chất thụ động có thể xâm nhập qua thủy khổng, lỗ khí trên
mút lá, mép lá đặc biệt qua vết thương xây xát trên lá. Khi tiếp xúc với bề mặt có
màng nước vi khuẩn dễ dàng xâm nhập vào bên trong qua các lỗ khí, qua vết
thương mà sinh sản nhân lên về mặt số lượng theo các bó mạch dẫn lan rộng đi.
Trong điều kiện mưa ẩm thuận lợi cho sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh, trên bề
mặt vết bệnh tiết ra các giọt dịch vi khuẩn. Thông qua sự va chạm giữa các lá lúa,
nhờ mưa gió truyền lan bệnh sang các lá lúa khác để tiến hành xâm nhiễm lặp lại
nhiều lần trong quá trình sinh trưởng của cây lúa.
Cho nên tuy là một loại bệnh có cự ly truyền nhiễm lây lan hẹp song với
phạm vi không gian khá rộng, giọt keo vi khuẩn hình thành với số lượng nhiều, đó
chính là một trong những nguyên nhân quan trọng làm bệnh phát triển mạnh sau
những đợt mưa gió vào cuối vụ xuân và trong suốt vụ mùa ở nước ta.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 4

1.1.1.2. Đặc điểm triệu chứng
Ở vùng nhiệt đới, bệnh bạc lá có 3 triệu chứng điển hình đó là: bạc lá, vàng
nhợt và héo xanh (còn được gọi là Kresek).
Bệnh bạc lá gây hại trong suốt quá trình sinh trưởng và phát triển của cây,

vết bệnh điển hình thời kỳ cấy trên đồng ruộng sau khi đẻ nhánh - trỗ - chín sữa,
trường hợp nghiêm trọng bệnh xuất hiện ngay giai đoạn mạ. Khi bị bệnh, vết
bệnh xuất hiện ở mép lá, mút lá, sau đó lan dần vào phiến lá theo đường
gợn sóng hoặc lan thẳng xuống gân chính. Trong điều kiện ẩm, nhiệt độ tương
đối cao, hoặc buổi sáng sớm, trên vết bệnh có thể xuất hiện giọt dịch vi
khuẩn màu vàng, gặp trời nắng tạo thành dạng hạt keo vi khuẩn màu hổ phách,
màu nước vối hay màu mật ong. Thường thì giữa mô bệnh và mô khỏe có ranh giới
rõ ràng theo đường gợn sóng, màu vàng hoặc khô vàng, có khi có một đường chỉ
viền màu nâu sẫm đứt quãng hay không đứt quãng.
Theo Lê Lương Tề, ở Việt Nam bệnh bạc lá có triệu chứng chủ yếu là bạc lá.
Tác giả còn cho biết triệu chứng bạc lá trên đồng bằng sông hồng chia làm hai dạng:
Bạc lá gợn vàng và bạc lá tái xanh. Loại hình bạc lá gợn vàng là phổ biến ở hầu hết
các giống và các mùa vụ, còn bạc lá héo xanh thường chỉ xuất hiện trên một số
giống lúa. Còn theo Tạ Minh Sơn thì trong cùng một điều kiện, mức độ lây nhiễm
như nhau thì các giống địa phương cây cao còn giữ nguyên hình dạng lá bệnh, còn
các giống mới nhập nội thấp cây thì lá thường bị táp đi dễ mủn nát .
Có thể căn cứ vào những đặc điểm triệu chứng trên để phát hiện bệnh. Tuy
nhiên, nhiều khi vết bệnh quá cũ hoặc biến đổi quá nhiều theo giống và điều kiện
bên ngoài, nhất là ở mạ do vậy có thể nhầm lẫn với những hiện tượng khô đầu lá
sinh lý. Vì vậy, để phát hiện được bệnh sớm và chính xác cần có thêm phương pháp
chẩn đoán. Theo Gao Z. và cs (2003) một cách thử nghiệm đơn giản để phát hiện
bệnh là cắt mẫu lá có vết bệnh điển hình rồi nhúng trong dung dịch fuchsin loãng.
Các nhà khoa học của Học viện nông nghiệp Việt Nam cũng đã tham khảo phương
pháp giọt dịch và phương pháp ép trên lam kính để phát hiện giọt dịch vi khuẩn.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 5

1.1.2. Tác hại của bệnh bạc lá lúa
Bệnh bạc lá gây thiệt hại đáng kể về năng suất và chất lượng hạt, là bệnh phổ

biến và tàn phá mùa màng nghiêm trọng trên toàn thế giới (Khan, 1996). Tác hại
của bệnh chủ yếu là làm cho lá đòng sớm tàn, khô xác, giảm quang hợp, tăng lượng
hạt lép, dẫn đến giảm năng suất lúa.
Bệnh có thể làm giảm 60% năng suất hạt hàng năm (Mew et al., 1981), ở Nhật
Bản hàng năm có từ 300000 - 400000 ha lúa bị bệnh nặng, với năng suất giảm từ 20 -
30 %, có nơi tới 50%, thậm chí lên tới 80% (Singh et al., 2007). Năm 1986, tại
Australia bệnh bạc lá lúa làm giảm năng suất tới 30 - 50%, với biểu hiện hạt lủng nhiều
hơn và giảm trọng lượng hạt. Ở Philippin, bệnh thường làm giảm 22.5% năng suất vào
vụ mưa, và 7.2%, có khi lên tới 9.5 - 18% năng suất vào mùa khô (Exconde, 1973).
Ở Việt Nam, bệnh bạc lá đã được phát hiện từ lâu trên các giống lúa mùa cũ.
Trong những năm gần đây, bệnh gây hại trên cả hai loại lúa lai và lúa thuần, đặc
biệt gây hại nặng trên các giống lúa lai nhập nội từ Trung Quốc. Theo tổng kết báo
cáo một số kết quả nghiên cứu lúa lai thì có những năm trước ta có khoảng hơn
350.000 ha lúa bị nhiễm nặng ở vụ mùa và cả vụ xuân, trong đó hàng trăm ha bị mất
trắng như vụ mùa năm 2002 ở Đan Phượng, Phú Xuyên, Bắc Ninh, Ninh Bình.
Cũng theo số liệu năm 2004 trên tạp trí BVTV số 03, bệnh bạc lá lúa xuất hiện ở
tỉnh Hà Nam, Hải Phòng, Phú Thọ, Điện Biên, Bắc Giang, Nghệ An, Thanh Hóa
với tổng diện tích là 3770 ha trong đó diện tích nhiễm nặng là 560 ha. Tỷ lệ bệnh
phổ biến là 8 - 20% số lá, nơi cao là 50 - 70% số lá.
Mức độ tác hại của bệnh phụ thuộc vào giống, thời kỳ nhiễm của cây sớm
hay muộn và mức độ nặng hay nhẹ. Năm 1970 trên diện tích lúa mùa cấy giống
NN8 bị bệnh ở mức độ 60- 100%, giảm năng suất từ 30- 60%. Theo báo cáo của
phòng bệnh cây Viện Bảo Vệ Thực Vật, 1998 thì tác hại của bệnh ngày càng lớn khi
mức độ bị bệnh càng nặng.
Tác hại chủ yếu của bệnh làm lá úa, đặc biệt là lá đòng sớm tàn, nhanh
chóng bị khô chết, bộ lá úa xơ xác ảnh hưởng tới hiệu quả quang hợp tích luỹ chất
khô, dẫn đến giảm khối lượng 1000 hạt, tỉ lệ lép cao, năng suất sút kém (Nguyễn
Văn Viết và cs, 2005).

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 6

1.1.3 Quy luật và các yếu tố ảnh hưởng đến phát sinh, phát triển bệnh
1.1.3.1 Quy luật phát sinh, phát triển của bệnh bạc lá lúa
Mỗi vùng lãnh thổ lại có một số chủng vi khuẩn bạc lá đặc trưng, phụ thuộc vào
cơ cấu các giống lúa và điều kiện tự nhiên của vùng: Philipin 6 chủng, Nhật Bản 12
chủng, Ấn Độ 9 chủng,… (Tika et al., 1999).
Ở Việt Nam, nhiều nghiên cứu trước đó đã xác định được 14 chủng vi khuẩn bạc
lá lúa có mặt ở miền Bắc Việt Nam (Du P.V and Le Cam Loan, 2007). Trong nghiên cứu
về bệnh bạc lá ở 15 tỉnh miền Bắc, Nguyễn Văn Viết và cộng sự (2005) đã nhận thấy các
nhóm chủng Xoo thường xuất hiện đan xen, ở một địa phương có thể xuất hiện nhiều
nhóm chủng, trái lại một nhóm chủng có thể hiện diện ở nhiều địa phương, trên một vết
bệnh đôi khi có thể tồn tại một hoặc một số chủng vi khuẩn nhất định.
Bệnh bạc lá phát sinh phát triển mạnh ở vụ mùa các tỉnh phía Bắc. Bệnh phát
triển, lây lan nhanh trong điều kiện nhiệt độ 26 - 29°C, ẩm độ 90 %, đặc biệt khi có
mưa to và gió lớn làm rập nát lá lúa tạo thuận lợi cho bệnh truyền lan (Phan Hữu
Tôn, 2004). Bởi vậy, vụ mùa bệnh thường gây tác hại nặng hơn vụ xuân. Vụ chiêm
xuân bệnh phát triển mạnh vào tháng 5 - 6, còn vụ mùa là tháng 8 - 9 khi có nhiều
mưa bão gây tổn thương cho lá lúa. Những đợt mưa tháng 8 không những tạo vết
thương trên lá mà còn làm cho vi khuẩn sinh sản nhanh, số lượng keo vi khuẩn hình
thành nhiều, tạo điều kiện cho sự xâm nhiễm và truyền lan nhanh chóng.
Nhìn chung giai đoạn mẫn cảm nhất của cây lúa với bệnh là giai đoạn
làm đòng đến chín sữa (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 2001).
1.1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự phát sinh và phát triển của bệnh
Hạt giống, tàn dư cây bệnh, cỏ dại là những nguồn gây bệnh chính, ngoài ra,
đất, nước cũng như dạng viên keo vi khuẩn trên lá cũng có ý nghĩa nhất định trong
việc lan truyền bệnh cho vụ sau (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 2004).
Bệnh phát sinh phát triển mạnh khi nhiệt độ không khí tương đối cao, độ ẩm
cao, trong những đợt mưa gió, bão vào lúc lúa ở giai đoạn làm đòng cho đến khi thu
hoạch. Sự phát triển và tác hại của bệnh phụ thuộc vào điều kiện thời tiết đồng thời

phụ thuộc vào giống lúa, thời kỳ nhiễm bệnh và các biện pháp kỹ thuật canh tác như
bón phân, tưới tiêu… làm ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 7

Devadath (1985) cho biết nhiệt độ tối thích làm cho bệnh phát triển là 24,3 -
34,0
0
C. Ở nhiệt độ dưới 18
0
C hoặc trên 37,2
0
C đều kìm hãm sự phát triển của bệnh.
Nhiệt độ ảnh hưởng rất rõ khi tiến hành lây nhiễm nhân tạo. Vết bệnh phát triển ở 25
- 28
0
C nhiều hơn là vết bệnh phát triển ở 17 - 21
0
C. Nhiệt độ thích hợp nhất cho lây
nhiễm bệnh là 21,3 - 32,7
0
C. Theo Tạ Minh Sơn (1996) ngoài nhiệt độ được coi là
yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của bệnh thì độ ẩm là nhân tố cho sự
hình thành và phát triển của bệnh khi độ ẩm thấp đạt 60,3% đến 77,5% sẽ hạn chế sự
phát triển của bệnh.
Sự phát triển của bệnh biến đổi theo mùa rõ rệt. Gió bão không những là nhân
tố lan truyền vi khuẩn mà còn tạo ra các vết thương cơ học trên lá lúa cho vi khuẩn
xâm nhập. Ở miền Bắc nước ta bệnh phát sinh gây hại ở tất cả các vụ trồng lúa nhưng
bệnh gây nặng nhất vào vụ mùa.

Ảnh hưởng của kỹ thuật trồng trọt đối với sự phát sinh phát triển của bệnh
diễn ra tương đối phức tạp. Trong các yếu tố kỹ thuật thì phân bón, nhất là phân bón
vô cơ có ảnh hưởng rất rõ rệt đến mức độ phát sinh, phát triển của bệnh. Các dạng
đạm vô cơ dễ làm cho cây lúa nhiễm bệnh mạnh hơn phân chuồng ủ hoại mục.
Với chân đất màu mỡ nhiều chất hữu cơ thì bệnh phát triển mạnh hơn những
chân đất xấu cằn cỗi. Theo Tạ Minh Sơn (1996) thì vi khuẩn xâm nhiễm
mạnh, dễ dàng trong điều kiện ruộng ngập nước do đó nên cấy thưa, giữ
mực nước vừa phải sẽ làm giảm tác hại của bệnh. Còn Theo Vũ Triệu Mân
và Lê Lương Tề (2004) thì trong điều kiện đất chua, ngập úng, thiếu ánh
sáng, bệnh phát triển sớm và mạnh hơn.
Giống cũng là một yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của bệnh bạc lá. Các
giống lúa cũ, lúa địa phương (Di Hương, Tám thơm, Tám Xoan, Tẻ tép, Ngân
Tuyết) nhiễm bệnh nhẹ hơn so với các giống lúa nhập nội có thời gian sinh trưởng
ngắn phàm ăn (Khang Dân, Sán Ưu, Nhị Ưu 838, Q5). Theo điều tra của Hà Bích
Thu và cộng sự (2002, Viện bảo vệ Thực vật) thì các giống lúa lai Trung Quốc nhập
nội từ năm 1993 - 1997 hầu hết đều bị nhiễm bạc lá với tỷ lệ bệnh 50% - 80%, cấp
bệnh phổ biến là 5 - 7, nếu bệnh nặng thì năng suất giảm 20% - 50%.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 8

1.1.4. Các biện pháp phòng trừ bệnh bạc lá
1.1.4.1. Biện pháp canh tác
Sử dụng kết hợp các kỹ thuật trong canh tác nhằm hạn chế nguồn bệnh và sự
phát triển của bệnh. Bao gồm các kỹ thuật: vệ sinh đồng ruộng, diệt trừ cỏ dại; xử lý
hạt giống trước khi trồng; bón phân cân đối, tăng cường bón phân hữu cơ, bón đạm
sớm và tập trung.
Ưu điểm: dễ thực hiện, không gây ô nhiễm môi trường, thực hiện tốt còn có
tác dụng giảm thiểu các loại sâu bệnh hại khác.
Nhược điểm: tốn công lao động, hiệu quả không cao.

1.1.4.2. Biện pháp hóa học
Dùng các loại thuốc hợp chất đồng, chất kháng sinh Streptomycin hoặc các chất
như MBAMT, acid Oxolinic, Ningnamycin,… Các chất này có bản chất kháng vi
khuẩn gram âm, chỉ sử dụng khi bệnh phát triển mạnh và lan tràn nhanh. Có thể kết
hợp sử dụng các chất tăng đề kháng của cây lúa với vi khuẩn như acid Salicylic,…
Biện pháp này mang lại hiệu quả đáng kể khi sử dụng đúng lúc, tuy nhiên
ngoài nhược điểm gây tốn kém về mặt kinh tế ra thì hậu quả nghiêm trọng nhất do
sử dụng các hóa chất này là làm mất cân bằng sinh thái, đặc biệt là mất cân bằng về
thành phần vi sinh vật đất.
1.1.4.3. Biện pháp sinh học
Sử dụng vi sinh vật đối kháng: Một số loài vi sinh vật có khả năng đối kháng
với vi khuẩn Xoo đã được tìm thấy như: Pseudomonas fluorescens và một số chủng
Bacillus được phân lập từ các mẫu đất vùng rễ lúa có khả năng ức chế sự phát triển
của X. oryzae pv. oryzae trong phòng thí nghiệm (Gnanamanickam et al., 1999),
hay chủng Lysobacter APMus được phân lập từ rễ lúa của tỉnh Yunnan, Trung
Quốc, có khả năng ức chế sự phát triển của nhiều loại nấm và vi khuẩn gây bệnh
thực vật, trong đó có X. oryzae pv. oryzae (Jin et al., 2008). Đây là một hướng đi
mới trong chiến lược phòng chống bệnh bạc lá hứa hẹn mang lại hiệu quả cao. Tuy
nhiên, biện pháp này chỉ mới được tiến hành nghiên cứu và thử nghiệm trong những
bước đầu tiên mà chưa thực sự được ứng dụng một cách rộng rãi.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 9

Chọn tạo giống kháng: là biện pháp khả thi và mang lại hiệu quả cao nhất trong
công tác phòng chống lại bệnh bạc lá lúa hiện nay. Ưu điểm của phương pháp này là có
thể ứng dụng rộng rãi ở tất cả các nơi trồng lúa trên thế giới, việc phòng chống bệnh
mang tính chất chủ động, lại không gây ô nhiễm môi trường và tạo ra nông sản sạch.
1.1.5. Chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá bằng chỉ thị phân tử
1.1.5.1. Cơ sở khoa học của chọn giống kháng bệnh bạc lá

Trong lịch sử phát triển cây trồng con người luôn phải chống lại các bệnh và
dịch hại cây trồng. Những năm 60 là kỷ nguyên thuốc hóa học đã đưa vào sử dụng
cho cây lúa nhưng việc sử dụng thuốc hóa học một cách tùy tiện đã gây hại cho con
người và môi trường sống. Do đó, cần phải có những phương hướng mới có hiệu
quả nhất đó là sử dụng giống kháng bệnh.
Vấn đề chọn giống kháng bạc lá đã được đưa ra tranh cãi gay gắt ở Nhật Bản
vào những năm 60. Các nhà chọn giống cây trồng cho rằng có thể chọn được giống
chống bệnh bạc lá, nhưng các nhà bảo vệ thực vật không đồng ý và cho rằng không thể
chọn giống chống bệnh mà phải sử dụng thuốc bảo vệ thực vật. Đến những năm 80,
viện lúa quốc tế IRRI đã xác định bản chất di truyền tính chống bệnh bạc lá là do gen
quy định. Cây lúa chống bệnh này được chọn ra từ giống lúa nhiễm bệnh, nó được đặt
tên là Kono 35. Giống này cung cấp gen chống chịu cho nhiều giống lúa ở Nhật Bản.
Ở Indonesia, đã sử dụng giống lúa Polita 1/1 do họ tạo ra vào năm 1971 và
một số giống lúa khác của Viện nghiên cứu lúa Quốc tế làm vật liệu cho nhiều cặp
lai chống bệnh bạc lá. Theo Khush (1989) thì Ấn Độ sử dụng nguồn gen chống
bệnh bạc lá từ các giống IR20, IR22, IR26….làm bố mẹ cho nhiều cặp lai. Một số
giống như IR20 được đưa vào sản xuất đại trà ở Ấn Độ.
Ở Philippin và Việt Nam, giáo sư Khush (1991) cho biết Philippin và Việt
Nam là khu vực sử dụng rộng rãi nhất các giống chống bệnh bạc lá của IRRI (ở
Philippin có tới 65% khu vực sản xuất, ở Việt Nam trước năm 1975 có khoảng 30%
diện tích trồng lúa sử dụng các giống này). Các giống đó là IR20, IR22, IR26,
IR8…. Ông còn cho biết có trên 100 giống lúa có kiểu gen kháng bệnh được sử
dụng vào chương trình chọn tạo giống kháng bệnh.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 10

Từ các nghiên cứu trên cho thấy vì tính kháng bệnh bạc lá là do gen quy
định, chúng ta có thể tạo giống kháng bệnh với sự liên kết của các gen kháng. Bằng
phương pháp này có thể tạo được những giống lúa mới vừa kết hợp được những đặc

tính nông sinh học tốt của các giống vừa mang gen kháng bệnh bạc lá.
1.1.5.2. Ứng dụng công nghệ sinh học trong nghiên cứu và chọn giống kháng
bệnh bạc lá
Sự phát triển của công nghệ sinh học, đặc biệt là công nghệ gen đã mang đến
những bước tiếng đáng kể trong nghiên cứu và chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá.
Vi khuẩn Xanthomonas oyzae pv. Oyzae có thể được xác định nhanh chóng bằng
cách sử dụng các chỉ thị phân tử. Adachi và T. Oku (2000) đề xuất sử dụng 2 đoạn
mồi XOR-F và XOR-R2 để nhân đoạn DNA, đoạn DNA này nằm giữa hai gen tổng
hợp nên cấu tử 16S và 23 S của ribosome vi khuẩn bạc lá.
Hiện nay chỉ thị phân tử DNA được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu di
truyền và chọn giống. Chỉ thị DNA đánh dấu gen gồm 10 phương pháp, sắp xếp theo
thứ tự thường được sử dụng như trong bảng 1.1
Bảng 1.1. Các loại DNA markers thông dụng
Marker Tên đầy đủ
RFLP Restriction fragment length polymorphism
ALP Amplicon length polymorphism
AFLP Amplified fragment length polymorphism
RAPD Random amplified polymorphic DNA
DAF DNA amplification fingerprinting
SSR Simple sequence repeat (microsatellite)
AP - PCR Arbitrary primer-PCR
SSCP Single strand conformation polymorphism
MRDHV - DNA Moderately repeated, dispersed, and highly variable
DNA(minisatellite)
STS Sequence Tagged site
* Chỉ thị phân tử liên quan một số gen kháng bệnh bạc lá lúa

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 11

Với sự phát triển của công nghệ sinh học, người ta đã xác định được các chỉ
thị liên quan đến tính kháng bệnh. Đối với bệnh bạc lá, xác định 7 gen kháng bệnh
bạc lá và đánh dấu bằng phương pháp RFLP, kết quả được tổng hợp ở bảng sau:
Bảng 1.2. Bản đồ liên kết di truyền với gen quy định tính trạng nông sinh
học quan trọng với RFLP đánh dấu
Gen Tính trạng Nguồn cho

NST

RFLP và độ
liên k
ết

Tài liệu tham khảo

Xa1 Chống bạc lá Kogyoku 4
Npb235
3.3cM
Npb197
7.2cM
Yoshimura et al.
1992
Xa2 Chống bạc lá Tetep 4
Npb235
3.4cM
Npb197
9.4cM

Yoshimura et al.
1992

Xa3 Chống bạc lá Chugoku45

11
Npb181
2.3cM
Npb78
3.5cM
Yoshimura et al.
1992
Xa4 Chống bạc lá IR20 11
Npb181
1.7cM
Npb78
1.7cM
Yoshimura et al.
1992
xa5 Chống bạc lá
IR1545-
339
5
RG556
0-1cM
McCouch et
al.1991
xa13 Chống bạc lá Long grain 8
RZ28
5.1cM
Zhang et al.1994
Xa21

Chống bạc lá
O.
longistamin
ata
11
pTA818,pTA248
0-1cM
RG103
Ronald et al. 1992

Chỉ thị phân tử đã được ứng dụng thành công trong việc xác định các gen
kháng (Nelson et al., 1996), trong việc tổ hợp nhiều gen kháng để tạo thành giống
chứa gen kháng (Huang et al., 1997), trong chuyển gen kháng bằng phương pháp
nuôi cấy mô, dung hợp tế bào trần (Kelly, 1995).
Từ năm 1997-2004, Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long đã sử dụng phương
pháp sử dụng chỉ thị phân tử kết hợp với lây nhiễm nhân tạo bằng 9 race vi khuẩn

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 12

phổ biến trong đánh giá khả năng kháng bệnh của 348 giống lúa địa phương thu
thập được ở duyên hải Trung Bộ và đồng bằng sông Cửu Long. Kết quả đã thu được
17 giống mang gen xa13, 6 giống mang gen Xa4, 4 giống mang gen xa5, 3 giống
mang gen Xa7, 3 giống mang gen Xa14. Kiểm tra độ tin cậy của phương pháp chỉ
thị phân tử trong nghiên cứu phát hiện gen kháng ở quần thể con lai giữa
IR24/Barer đối với gen xa5 cho thấy độ chính xác lên tới 93,3% (Lang N.T and Buu
B.C, 2003). Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang (2003, 2007) cũng đã sử dụng chỉ thị
phân tử để kiểm tra tổ hợp BC4F4 của IR24 với giống lúa địa phương mang gen
kháng Xa4, xa5, xa13 với độ chính xác cao.
* Kỹ thuật PCR trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật tổng hợp nhân tạo
các đoạn DNA với tốc độ nhanh chưa từng thấy và độ chính xác cao được thực hiện
trong máy chu trình nhiệt (máy PCR).
Kỹ thuật PCR được Karry Mullis phát minh vào năm 1985 và tiếp tục được
hoàn thiện phát triển thông qua sự phân lập và sản xuất thành công enzyme tổng
hợp DNA chịu nhiệt từ vi khuẩn Thermus aquaticus, sự thiết kế thành công các máy
chu trình nhiệt cho phép thay đổi nhanh chóng và chính xác nhiệt độ cho từng giai
đoạn phản ứng. Cho đến nay, kỹ thuật PCR được xem như là một trong những
phương pháp nền quan trọng nhất của công nghệ sinh học hiện đại.
Ngày nay, đã có nhiều gen quan trọng của các loại cây trồng được phân lập
bản đồ liên kết với các đoạn DNA genom, đặc biệt là gen kháng bệnh ở các cây
lương thực chính (Melchinger et al., 1990 ; Kelly, 1995; Penner et al., 1995; Miklas
et al., 1996). Dựa trên bản đồ này, kỹ thuật PCR xác định gen kháng bạc lá đã được
xây dựng. Kỹ thuật này ngày càng được sử dụng rộng rãi bởi tính khả thi, tính hiệu
quả và tính tinh tế.
G.S.Khush, N.Huang et al,. (1997) đã sử dụng kỹ thuật PCR thông qua việc
sử dụng các DNA marker để dự đoán các genotypre của vi khuẩn bạc lá ở thế hệ
phân ly F2 của dòng lúa dại O.longistaminata, có ý nghĩa cung cấp một công cụ
mạnh mẽ để tăng hiệu quả gạo chăn nuôi. Kết quả trong 34 cá thể có 31 cá thể mang
gen kháng RR, 3 cá thể mang gen Rr, tính chính xác của phân tích PCR là 91.2%.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 13

Sử dụng kỹ thuật chuỗi phản ứng liên kết men (PCR) để xác định loại vi
khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae bằng 2 gen mồi (primer): XOR-R2 và XOR-
F đặc hiệu (Odachi et al., 1990). Bùi Trọng thủy và Phan Hữu Tôn (2004) đã nghiên
cứu khả năng kháng bệnh bạc lá 16 dòng lúa đa gen của IRRI-Nhật Bản được sử
dụng làm cây chỉ thị (Tester) chứa đa gen kháng với một số chủng vi khuẩn
Xanthomonas oryzae pv oryzae gây bệnh bạc lá lúa phổ biến ở miền Bắc Việt Nam

đã cho kết luận chủng Y9 là chủng có độc tính rất cao, có thể lây nhiễm cho nhiều
dòng lúa chứa các gen kháng bệnh bạc lá khác nhau và các tổ hợp gen có chứa gen
Xa7 như : Xa1/Xa7; Xa3/Xa7; Xa4/Xa7 có khả năng kháng các chủng Y1, Y5, Y6,
Y7, Y8 và Y10 . Đây là những chủng vi khuẩn có phạm vi phân bố rộng rãi ở vùng
đồng bằng sông Hồng, khu IV cũ, các tỉnh miền núi phía Bắc, nhưng có phản ứng
nhiễm với chủng Y9, chủng này phân bố ở Hà Nội, Hưng Yên, Hòa Bình và Tuyên
Quang.
Tại Việt Nam, kỹ thuật PCR được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu bệnh
bạc lá và chọn giống lúa kháng bệnh ở các trung tâm chọn giống.
Trong các năm 2000-2005, Phan Hữu Tôn và cộng sự tiến hành việc tìm
kiếm nguồn gen kháng từ các giống lứa địa phương bằng kỹ thuật PCR kết hợp lây
nhiễm nhân tạo. Năm 2000, theo kết quả nghiên cứu đã công bố của Phan Hữu Tôn
thì trên cơ sở điều tra 145 giống lúa địa phương, phát hiện được 12 giống chứa gen
xa5 và 2 giống chứa gen Xa7. Năm 2004 tiếp tục điều tra trên 120 giống lúa địa
phương, ông công bố thêm 8 giống chứa gen xa5. Năm 2005, điều tra trên 500
giống lúa địa phương thu được kết quả: 56 giống chứa gen Xa4, 36 giống chứa gen
xa5, 16 giống chứa gen Xa7 và không giống nào chứa gen Xa21.
Nghiên cứu đa dạng tập đoàn giống lúa có tính khác nhau với bệnh bạc lá
bằng kĩ thuật RAPD, tác giả Đinh Thị Phòng đã sử dụng 21 mồi ngẫu nhiên với 36
giống lúa thu được tổng số 392 phân đoạn ADN được nhân lên. Tất cả 21 mồi
RAPD đều cho tính đa hình. Sự sai khác về hệ số tương đồng di truyền giữa các
giống khoảng 22% - 64 %. Có tổng số 36 giống lúa có tính kháng bệnh bạc lá khác
nhau có thể sử sử dụng như là những nguyên liệu để xác định nhóm gen kháng của