nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng tới sự hình thành vi thể (microvesicle) từ tế bào hồng cầu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM




LƯU THẢO LINH


NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN ẢNH HƯỞNG TỚI
SỰ HÌNH THÀNH VI THỂ (MICROVESICLE)
TỪ TẾ BÀO HỒNG CẦU




LUẬN VĂN THẠC SĨ






HÀ NỘI, 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LƯU THẢO LINH


NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN ẢNH HƯỞNG TỚI
SỰ HÌNH THÀNH VI THỂ (MICROVESICLE)
TỪ TẾ BÀO HỒNG CẦU



CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ : 60 42 02 01


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. NGUYỄN ĐỨC BÁCH


HÀ NỘI, NĂM 2015
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung
thực và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được
cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày 28 tháng 6 năm 2015

Tác giả luận văn






Lưu Thảo Linh
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page ii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp ngoài sự cố gắng của bản thân tôi đã nhận
được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ nhiệt tình của thầy cô, bạn bè và người thân.
Trước tiên, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới thầy
giáo TS. Nguyễn Đức Bách người đã định hướng nghiên cứu, tận tình chỉ bảo, giúp
đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp này.
Tôi xin được cám ơn chân thành TS. Nguyễn Hữu Đức và Th.S Phạm Thu
Giang, Bộ môn Công nghệ sinh học động vật, Khoa Công nghệ Sinh học đã tạo điều
kiện thuận lợi trong việc sử dụng các trang thiết bị, kính hiển vi huỳnh quang, máy
ly tâm trong quá trình tôi thực hiện luận văn tại Bộ môn.
Tôi cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các Thầy, Cô trong Khoa
Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam những người đã trực tiếp

giảng dạy, trang bị những kiến thức bổ ích trong suốt khoảng thời gian tôi học tập và
nghiên cứu.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Quỹ phát triển Khoa học và Công nghệ (NAFOSTED)
đã tài trợ cho đề tài nghiên cứu cơ bản mã số 106-YS.06-2013.16 để tôi có điều kiện
thuận lợi thực hiện luận văn này.
Cuối cùng, với tất cả lòng kính trọng và biết ơn vô hạn, tôi xin gửi lời cảm ơn
tới gia đình và bạn bè, những người luôn bên cạnh động viên giúp đỡ tôi trong quá
trình học tập và thực hiện đề tài.

Hà Nội, ngày 28 tháng 6 năm 2015
Học viên


Lưu Thảo Linh
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC HÌNH v
DANH MỤC BẢNG vi
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU vii
MỞ ĐẦU 1
1 Tính cấp thiết của đề tài 1
2 Mục đích nghiên cứu 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1 Tổng quan về vi thể 3

1.1.1 Giới thiệu về vi thể 3
1.1.2 Vi thể và khả năng truyền tín hiệu giữa các tế bào 5
1.1.3 Sự tương tác của vi thể với các tế bào 5
1.1.4 Khả năng vận chuyển protein của vi thể 6
1.1.5 Khả năng vận chuyển nucleic acid của vi thể 7
1.1.6 Tương tác giữa vi thể với màng tế bào đích 8
1.2 Nghiên cứu về sự hình thành vi thể ở tế bào 9
1.2.1 Sự hình thành và tiết của các vi thể 9
1.2.2 Sự hình thành vi thể ở tế bào hồng cầu 10
1.3 Vai trò sinh học của Ca
2+
12
1.3.1 Vai trò của Ca
2+
trong điều kiện sinh lý bình thường 12
1.3.2 Vai trò của Ca
2+
trong việc hình thành vi thể 14
Chương 2. NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
2.1 Đối tượng nghiên cứu 16
2.2 Phạm vi nghiên cứu 16
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page iv

2.3 Nội dung nghiên cứu 16
2.4 Phương pháp nghiên cứu 16
2.4.1 Chuẩn bịcác dung dịch và hóa chất 16
2.4.2 Chuẩn bị mẫu hồng cầu 20
2.4.3 Chuẩn bị tế bào hồng cầu mang Fluo-4 20
2.4.4 Xác định nồng độ Ca

2+
nội bào bằng huỳnh quang Fluo-4 21
2.4.5 Xác định sự xuất hiện của vi thể trên bề mặt tế bào 22
2.4.6 Xác định kích thước của vi thể 23
2.4.7 Xử lý và phân tích số liệu 23
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24
3.1 Xây dựng thang chuẩn Ca
2+
nội bào 24
3.2 Xác định nồng độ Ca
2+
nội bào ở điều kiện sinh lý 25
3.3 Ảnh hưởng của A23187 đến nồng độ Ca
2+
nội bào 26
3.4 Ảnh hưởng của LPA đến nồng độ Ca
2+
nội bào 28
3.5 Ảnh hưởng của PMA đến nồng độ Ca
2+
nội bào 31
3.6 Xác định ảnh hưởng của Ca
2+
nội bào đến sự hình thành vi thể 33
3.6.1 Ảnh hưởng của A23187 và Ca
2+
nội bào đến sự hình thành vi thể 33
3.6.2 Ảnh hưởng của LPA và Ca
2+
nội bào đến sự hình thành vi thể 34

3.6.3 Ảnh hưởng PMA và Ca
2+
nội bào đến sự hình thành vi thể 35
3.7 Nghiên cứu phương pháp thu nhận vi thể 36
3.8 Xác định kích thước của vi thể 37
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO 42


Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page v

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Kích thước vi thể 37
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page vi

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Các dạng cấu trúc màng được tiết ra từ tế bào 4
Hình 1.2 Sự tương tác giữa MV với tế bào thông qua hai cơ chế 8
Hình 1.3 Quá trình hình thành vi thể 12
Hình 3.1 Thang chuẩn Ca
2+
nội bào 24
Hình 3.2 Tế bào hồng cầu ở điều kiện sinh lý 25
Hình 3.3 Nồng độ Ca
2+

nội bào ở điều kiện sinh lý 26
Hình 3.4 Sự thay đổi cường độ huỳnh quang Fluo-4 27
Hình 3.5 Ảnh hưởng của A23187 đến nồng độ Ca
2+
nội bào 28
Hình 3.6 Ảnh hưởng của LPA tới nồng độ Ca
2+
nội bào 29
Hình 3.7 Biến động của Ca
2+
nội bào bởi LPA 30
Hình 3.8 Nồng độ Ca
2+
nội bào trong các khoảng thời gian 30
Hình 3.9 Ảnh hưởng của LPA tới nồng độ Ca
2+
nội bào 32
Hình 3.10 Biến động của Ca
2+
nội bào bởi PMA 32
Hình 3.11 Ảnh hưởng của PMA tới nồng độ Ca
2+
nội bào 33
Hình 3.12 Cảm ứng hình thành vi thể bởi A23187 và Ca
2+
33
Hình 3.13 Cảm ứng hình thành vi thể bởi LPA và Ca
2+
34
Hình 3.14 Cảm ứng hình thành vi thể bởi PMA và Ca

2+
35
Hình 3.15 Phương pháp thu nhận vi thể từ tế bào hồng cầu 36
Hình 3.16 Kích thước của vi thể đo bằng máy Zetasizer Nano 37




Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page vii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU

Kí hiệu tắt Nội dung
AM Acetoxymethyl

Ca
i
2+

Ca
2+
nội bào

DMSO Dimethyl sulfoxide
ESCs Tế bào gốc phôi (Embryonic stem cells)
GFP Green fluorescent protein
HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
LPA Lysophosphatidic acid
MV Vi thể (microvesicle)

PBS Đệm phosphate – Phosphate-buffered saline
PKC Protein kinase C
PMA Phorbol myristate acetate
PS Phosphatydilserine
PSGL-1 P-selectin glycoprotein ligand-1
TFs Các yếu tố mô (Tissue Factors)











Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Hiện nay để chuyển gene vào tế bào động vật người ta có thể sử dụng các
biện pháp vật lý, hóa học như vi tiêm, dung hợp màng khi có mặt calcium
phosphate, xung điện và các chất kích thích có bản chất phospholipid còn gọi là
liposome hay lipofectin hoặc thông qua hoạt động của các virus để chuyển gene.
Trong số các biện pháp này, các cấu trúc liposome tích điện dương thường được
dùng để mang và chuyển gene. Tùy thuộc vào mỗi loại tế bào và điều kiện khác
nhau mỗi loại kỹ thuật sẽ được áp dụng. Tuy nhiên, các kỹ thuật này còn có những
hạn chế chẳng hạn như hiệu quả chuyển gene còn thấp, không ổn định, gây đáp ứng

miễn dịch hoặc gây độc tế bào hoặc chỉ áp dụng trong điều kiện in vitro. Chính vì
vậy cần thiết phải phát triển một hệ thống mới có khả năng mang DNA để chuyển
gene hiệu quả hơn.
Vi thể (microvesicle/MV) là những cấu trúc có nguồn gốc từ màng tế bào có
kích thước từ 100 nm-1 µm, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau
(Anderson et al., 2005, Barteneva et al., 2013). Nghiên cứu trong những năm gần
đây cho thấy trong điều kiện in vivo, vi thể có thể mang các phân tử như protein,
nucleic acid bao gồm DNA, mRNA và miRNA đến tế bào đích thông qua cơ chế
dung hợp màng (EL Andaloussi et al., 2013, Lee et al., 2011, van Doormaal et al.,
2009, Yuan et al., 2009). Chính vì vậy vi thể có vai trò quan trọng trong giao tiếp
giữa các tế bào và chuyển gene.
Vi thể có thể hình thành ở hầu hết các tế bào kể cả tế bào hồng cầu. Do tế bào
hồng cầu có số lượng rất lớn, có khả năng vận chuyển đi khắp các mô, tế bào trong
cơ thể và dễ dàng thu nhận do không phải nuôi cấy, vì vậy các vi thể có nguồn gốc
từ tế bào hồng cầu người có thể được dùng để mang axit nucleic và chuyển gene. Để
nghiên cứu khả năng mang DNA và chuyển gene của vi thể từ tế bào hồng cầu cần
xác định được các điều kiện để tạo thành các vi thể. Chính vì vậy, chúng tôi tiến
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 2

hành đề tài “Nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng tới sự hình thành vi thể
(microvesicle) từ tế bào hồng cầu” tập trung vào việc xác định các điều kiện ảnh
hưởng tới sự hình thành vi thể và thu nhận vi thể từ tế bào hồng cầu.
2. Mục đích nghiên cứu
- Xác định được các điều kiện để cảm ứng để hình thành vi thể ở tế bào hồng cầu
- Phát hiện sự xuất hiện vi thể thông qua protein gắn huỳnh quang annexin V-FITC
- Xác định kích thước của vi thể
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về vi thể
1.1.1. Giới thiệu về vi thể
Vi thể là những cấu trúc có kích thước nhỏ được hình thành và giải phóng từ
các cấu trúc màng của tế bào. Đến nay vi thể được phát hiện ở nhiều loại tế bào khác
nhau trong cơ thể như: tế bào xương, tiểu cầu, hồng cầu, tế bào ung thư (Anderson
et al., 2005, Barteneva et al., 2013). Tùy thuộc vào kích thước người ta chia các cấu
trúc màng tiết ra từ màng tế bào thành 3 dạng khác nhau: exosome (40 – 100 nm); vi
thể hay còn gọi là microvesicle (0,1 -1,0 µm) và các thể apotosis hay còn gọi là
apoptotic body (1,0-4,0 µm) (Hình 1.1) (Gyorgy et al., 2011, Ludwig and Giebel,
2012, Raposo and Stoorvogel, 2013). Trong số 3 dạng này, exosome có nguồn gốc
nội sinh được hình thành từ các bào quan có cấu trúc màng bên trong tế bào.
Exosome đã được tìm thấy trong hầu hết các loại tế bào. Gần đây, các exosome
được phát hiện thấy trong huyết tương, nước tiểu và sữa của động vật có vú
(Huebner et al., 2015, Reinhardt et al., 2012, Zhou et al., 2012). Khác với exosome,
vi thể là những phần tách ra từ màng tế bào và giải phóng ra môi trường (Gyorgy et
al., 2011, Lee et al., 2011). Nghiên cứu gần đây cho thấy vi thể có mặt trong huyết
tương với kích thước khoảng 100-400 nm (Vidal, 2010). Không giống như các
exosome và microvesicle, các thể apoptosis là một dạng cấu trúc có kích thước lớn,
được tách ra khỏi tế bào đang trong giai đoạn chết lập trình (apoptosis). Apoptosis
được xem như một phần của các quá trình sinh học như thay thế tế bào bình thường,
các hoạt động của hệ thống miễn dịch, sự phát triển của phôi thai (Antwi-Baffour
et al., 2010, Elmore, 2007, Ouyang et al., 2012). Các thể apotosis có thể được xem
như là các mảnh tế bào chết lớn được bao bọc bởi màng tế bào.
Nhiều nghiên cứu về sự hình thành và giải phóng vi thể khỏi tế bào cũng
như vai trò của vi thể trong các quá trình sinh học đã cho thấy, vi thể có mặt ở huyết
tương, nước tiểu, sữa và dịch não tủy. Trong hệ tuần hoàn, phần lớn MV có nguồn
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 4

gốc từ tiểu cầu, phần ít hơn có nguồn gốc từ các tế bào máu khác, mức độ MV từ
hồng cầu tăng lên trong quá trình của một số bệnh lý như bệnh sốt rét và bệnh tế bào
hình liềm (Barteneva et al., 2013). Đối với tế bào hồng cầu, những tế bào chưa
trưởng thành tiết ra exosome trong khi đó tế bào trưởng thành tiết ra các
microvesicle (Lee et al., 2011, de Vooght et al., 2013). Sự giải phóng vi thể từ tế
bào hồng cầu người cũng đã được phát hiện và được cho là có liên quan tới sự hình
thành các cục máu đông và sự loại bỏ các tế bào đang ở trạng thái apoptosis bởi đại
thực bào (Antwi-Baffour et al., 2010, Nguyen et al., 2011). Tuy nhiên, cơ chế hình
thành và giải phóng MV từ tế bào hồng cầu cũng như vai trò của chúng vẫn chưa
được làm sáng tỏ.


Hình 1.1. Các dạng cấu trúc màng được tiết ra từ tế bào
Ba nhóm cấu trúc màng tiết ra từ tế bào: exosome; thể apotosis; vi thể.
MVB (Multivesicular bodies) – Thể đa túi. (Gyorgy et al., 2011)

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 5

1.1.2. Vi thể và khả năng truyền tín hiệu giữa các tế bào
Gần đây nhiều nghiên cứu cho thấy vi thể có nguồn gốc từ tiểu cầu tham gia
vào quá trình hình thành các cục máu đông. Sự mất đối xứng về phân bố của các
thành phần lipid màng và sự vận chuyển của phosphatydil serine (PS) từ lớp màng
trong ra màng ngoài là một tín hiệu để giúp các yếu tố tham gia vào quá trình đông
máu nhận ra và gắn (Cocucci et al., 2009, Ratajczak et al., 2006, Zwaal et al., 2004).
Những khiếm khuyết trong quá trình đông máu được phát hiện ở những bệnh nhân
mắc hội chứng Scott có liên quan đến rối loạn trong quá trình vận chuyển của các
thành phần phospholipid màng (Zwaal et al., 2004). Sau khi tiểu cầu được hoạt hóa,
vi thể được giải phóng khỏi màng tế bào đi vào huyết tương và tương tác với các

thành phần đại thực bào, bạch cầu trung tính và các tiểu cầu khác thông qua tương
tác phân tử của các thụ thể trên bề mặt của các tế bào (Polgar et al., 2005). Ngoài
khả năng tham gia vào quá trình hình thành cục máu đông, vi thể giải phóng từ tiểu
cầu còn kích hoạt các phản ứng tế bào khác nhau khi chúng kích hoạt tế bào nội mô
(Barry et al., 1997), bạch cầu trung tính đa nhân (Miyamoto et al., 1998), bạch cầu
đơn nhân (Barry et al., 1999) và ảnh hưởng đến chức năng của các tế bào tạo máu
khác (Ratajczak et al., 2006). Một số nghiên cứu về vi thể có nguồn gốc từ bạch cầu
trung tính cho thấy vi thể kích hoạt thụ thể MAC-1 là một intergrin (thụ thể màng là
cầu nối cho tương tác tế bào với tế bào, tế bào với ma trận ngoại bào) có khả năng
hoạt hóa tiểu cầu (Andrews and Berndt, 2004).
1.1.3. Sự tương tác của vi thể với các tế bào
Vi thể được tách ra từ màng tế bào nên chúng mang các thụ thể vốn là những
protein màng, chính vì vậy vi thể có đóng vai trò tương tác giữa các tế bào, gắn với
kháng kháng nguyên, kháng thể. Chẳng hạn thụ thể CD41 có nguồn gốc từ tiểu cầu có
thể tương tác với các tế bào nội mô hoặc các tế bào khối u, kích thích quá trình tương
tác và kết dính tế bào. Vi thể cũng đóng vai trò trung gian vận chuyển các thụ thể,
protease, các phân tử kích thích kết dính tế bào, các phân tử tín hiệu chẳng hạn như
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 6

DNA, mRNA và các miRNA. Nghiên cứu gần đây cho thấy các tế bào ung thư giải
phóng lượng lớn các vi thể chứa các yếu tố kích thích ngưng kết tế bào, các chất điều
hòa sinh trưởng. Những thành phần này tham gia vào kích thích kết dính với tế bào
biểu mô, kích thích đáp ứng viêm và đại thực bào (Lee et al., 2011).
1.1.4. Khả năng vận chuyển protein của vi thể
Trong suốt thời gian dài trước đây, các vi thể được coi đơn thuần như là các
mảnh vụn của tế bào (cellular debris), nhưng gần đây quan niệm này đã thay đổi
(Lee et al., 2011). Việc tiết các MV ra khoảng gian bào được mô tả lần đầu tiên bởi
Wolf (1967) khi nghiên cứu các hạt nhỏ bao xung quanh tiểu cầu khi chúng được
hoạt hóa (Wolf, 1967). Tiếp đó những phát hiện cho thấy các bào quan có cấu trúc

tương tự, còn gọi là exosomes, có khả năng mang enzyme 5′ exonucleotidase gắn
với các tế bào glioma (Trams et al., 1981). Các MV cũng vận chuyển lipids, proteins
và các axit nucleic (DNA, mRNA, miRNA, mtRNA) và vận chuyển chúng từ tế bào
này đến tế bào khác (Lee et al., 2011).
Một ví dụ về cơ chế giao tiếp giữa các tế bào thông qua MV được báo cáo
gần đây là sự vận chuyển trung gian qua MV của một thông điệp tế bào chết bằng
cách đóng gói caspase-1 (Sarkar et al., 2009). Hiện tượng này được tìm thấy rằng
nội độc tố bạch cầu đơn nhân kích thích gây ra sự chết tế bào của các tế bào cơ trơn
mạch máu bằng cách tiết MV có chứa caspase-1. Con đường cảm ứng apotosis
xuyên bào này phụ thuộc vào chức năng của caspase-1 trong các tế bào mục tiêu. Nó
cũng được đề nghị rằng MV có thể góp phần lây lan các tác nhân nhiễm trùng nhất
định chẳng hạn như virus suy giảm hệ miễn dịch người hoặc các prion (Fackler and
Peterlin, 2000, Fevrier et al., 2004). Dựa vào đặc điểm sinh học và chức năng của
các MV, gần đây các MV đã bắt đầu được nghiên cứu và sử dụng làm phương tiện
để vận chuyển thuốc, DNA hoặc protein tới các tế bào đích.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 7

1.1.5. Khả năng vận chuyển nucleic acid của vi thể
Epigenetics là lĩnh vực nghiên cứu để giải thích những biến đổi về mặt kiểu
hình mà không liên quan đến sự biến đổi về trình tự DNA trong genome. Có nhiều
cơ chế liên quan đến epigenetics trong đó có hoạt động của các dạng RNA khác
nhau (Holoch and Moazed, 2015). Trong quá trình đồng nuôi cấy hiện tượng truyền
thông tin giữa các tế bào khác nhau đã được phát hiện thấy. Gần đây người ta đã
chứng minh rằng các vi thể có nguồn gốc từ khối u có thể chuyển không chỉ các
nhân tố quyết định bề mặt tế bào mà còn cả mRNA của các tế bào khối u tới các tế
bào khác. Tương tự, Ratajczak và cs. (2006) đã chứng minh rằng vi thể có nguồn
gốc từ các tế bào gốc phôi chuột (embryonic stem cells -ESCs) có thể kích thích quá
trình tái lập trình (re-program) của các tế bào đích. Một số nghiên cứu về MV có

nguồn gốc từ một số tế bào biểu mô của người cho thấy vi thể cũng có thể hoạt động
như một phương tiện để chuyển mRNA giữa các tế bào. Các vi thể gắn với các tế
bào bằng cách tương tác với các intergrin α4 và β1 trên bề mặt của chúng sau đó
chuyển RNA như một dạng tải nạp mRNA từ vi thể đến tế bào đích. Quá trình này
đã được chứng minh bằn cách gắn các mRNA với gene mã hóa protein có khả năng
phát huỳnh quang GFP (Deregibus et al., 2007).
Các nhà khoa học cũng đã chứng minh được vi thể có nguồn gốc từ các
tế bào gốc người cũng có thể mang mRNA của người chuyển đến các tế bào
chuột ở điều kiện in vivo. Kết quả các mRNA này có thể được dịch mã thành
công ở chuột. Yuan và cs. (2009) đã chỉ ra rằng bên cạnh mRNA thì MV có thể
chuyển microRNA trong các tế bào mục tiêu. Họ đã chứng minh các MV vó
nguồn gốc từ ESCs chứa nhiều microRNA và chúng có thể chuyển một tập hợp
con microRNA tới phôi nguyên bào sợi (Yuan et al., 2009). Trong quá trình
biểu hiện gene, các microRNA có thể được tế bào sử dụng để điều hòa quá trình
dịch mã một cách tự nhiên. Điều này mở ra khả năng cho các ứng dụng tế bào
gốc để thay đổi sự biểu hiện của các gen ở các tế bào lân cận thông qua hoạt
động chuyển các microRNA chứa trong vi thể.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 8

1.1.6. Tương tác giữa vi thể với màng tế bào đích
Cho đến nay cơ chế tương tác giữa các vi thể với màng tế bào đích còn chưa
sáng tỏ, tuy nhiên hai cơ chế có thể áp dụng để giải thích cho sự tương tác này đó là
thực bào và dung hợp màng (Templeton, 2002, Losche et al., 2004, D'Souza-
Schorey and Clancy, 2012). Với cả hai cơ chế trên, việc tiếp xúc giữa các MV với
màng tế bào đích có ý nghĩa rất quan trọng (Lee et al., 2011). Quá trình thực bào và
dung hợp màng giữa tế bào và các MV được trình bày trong Hình 1.2. Trong trường
hợp dung hợp màng, các MV tương tác với màng tế bào đích thông qua sự nhận diện
và gắn của các phân tử protein và thụ thể tương ứng của chúng, cuối cùng sẽ dẫn
đến dung hợp màng (van Doormaal et al., 2009).

Hình 1.2. Sự tương tác giữa MV với tế bào thông qua hai cơ chế
Cơ chế thực bào (A) và cơ chế dung hợp màng (B)

Các yếu tố mô (Tissue Factors -TFs) thường phân bố trên bề mặt các vi thể
với chức năng kết dính với màng tế bào đích thông qua cơ chế liên quan đến P-
selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1). Cả hai yếu tố TFs và PSGL-1 đều có thể
tồn tại đồng thời trên bề mặt của vi thể và tế bào đích. Nghiên cứu sử dụng kháng
thể đặc hiệu để khóa PSGL đã làm giảm dung hợp tế bào (Del Conde et al., 2005).
Cho đến nay, các thụ thể phổ biến được biết nhiều nhất là CD40, CD62 và các
integrin (Kotowicz et al., 2000). Nghiên cứu cơ chế lựa chọn các phân tử để mang
của các vi thể và sự tương tác giữa các vi thể với màng tế bào sẽ rất hữu ích trong
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 9

việc làm sáng tỏ quá trình truyền tín hiệu, điều hòa hoạt động gene và tương tác tế
bào (D'Souza-Schorey and Clancy, 2012).
Trong quá trình kết dính và dung hợp màng, Ca
2+
được coi là yếu tố rất quan
trọng tham gia vào quá trình tương tác này. Các nghiên cứu đã cho thấy, Ca
2+
liên
quan trực tiếp đến sự hình thành các vi thể cũng như kết dính tế bào (Nguyen et al.,
2011, Steffen et al., 2011). Ca
2+
hoạt hóa scramblase dẫn đến phá vỡ phân bố không
đồng đều của các thành phần lipid giữa hai lớp màng theo sau đó phosphatidyl

serine (PS) được chuyển từ lớp màng trong ra lớp màng ngoài. Sự tương tác giữa PS
và Ca
2+
cũng có thể góp phần vào sự kết dính giữa các cấu trúc màng tế bào
(Nguyen et al., 2011, Steffen et al., 2011).
1.2. Nghiên cứu về sự hình thành vi thể ở tế bào
1.2.1. Sự hình thành và tiết của các vi thể
Trong điều kiện sinh lý bình thường, các phospholipid trong màng tế bào phân
bố không đồng đều giữa hai lớp màng. Vì vậy, hai lớp màng sẽ khác nhau về thành
phần phospholipid (Mandal et al., 2005). Cho đến nay, mô hình màng tế bào được
nghiên cứu kỹ nhất là màng tế bào hồng cầu. Ở tế bào hồng cầu, sphingomyelin (SM)
và phospholipid choline (PC) phân bố chủ yếu ở lớp màng ngoài, trong khi đó các
amino phospholipids như phosphatidyl serine (PS) và phosphatidyl ethanolamine (PE)
lại nằm chủ yếu ở lớp màng trong (Woon et al., 1999).
Sự phân bố không đồng đều của các thành phần phospholipid giữa hai lớp
màng được duy trì nhờ hoạt động của: flippase, floppase và scramblase (Bevers et
al., 1999). Khi nồng độ Ca
2+
nội bào tăng, tế bào sẽ ở trạng thái kích thích,
scramblase và floppase sẽ được hoạt hóa và flippase bị bất hoạt. Trong điều kiện
này, sự phân bố không đồng đều của các thành phần phospholipid giữa hai lớp màng
sẽ bị phá vỡ. Biến đổi rõ rệt nhất là sự vận chuyển của phosphatidyl serine (PS) từ
lớp màng trong ra lớp màng ngoài, đây cũng là một dấu hiệu của quá trình tự chết
(apoptosis). Tiếp sau quá trình này là sự hình thành và tiết các vi thể ra khỏi màng
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 10

do sự phân giải của bộ khung nâng đỡ tế bào (cytoskeleton) bởi sự hoạt hóa của
proteinase khi nồng độ Ca
2+

nội bào tăng lên (Hugel et al., 2005).
Sự hình thành các vi thể được bắt đầu bằng dấu hiệu màng tế bào phồng ra ở
một vài vị trí. Các vị trí phồng ra sẽ lớn dần cuối cùng tách khỏi màng tế bào. Quá
trình này phụ thuộc chủ yếu vào nồng độ Ca
2+
nội bào, sự hoạt hóa của calpain và
việc tái sắp xếp lại cấu trúc của bộ khung nâng đỡ tế bào. Nhiều công bố cho thấy
phosphatidyl serine và một số protein nằm ở lớp màng ngoài của các vi thể. Ngoài
ra, các yếu tố stress, chẳng hạn stress bởi các chất oxy hóa mạnh, cũng cảm ứng
hình thành các vi thể ở nhiều tế bào dạng tế bào khác nhau (Lang et al., 2003,
Mandal et al., 2005, Nguyen et al., 2011).
1.2.2. Sự hình thành vi thể ở tế bào hồng cầu
Các thành phần của màng tế bào hồng cầu đóng vai trò quan trọng trong việc
hình thành và giải phóng vi thể, chính vì vậy xác định được vai trò của các thành phần
màng tế bào hỗ trợ rất nhiều cho việc giải thích cơ chế hình thành các vi thể. Màng tế
bào hồng cầu bao gồm một lớp phospholipid kép mà bị xuyên qua bởi các protein
xuyên màng (ví dụ như band 3, glycophorin A và glycophorin C, kháng nguyên liên kết
Rhesus). Gắn vào mạng lưới khung xương tế bào bao gồm α- Spectrin, β- Spectrin và
actin qua protein 4.1R, protein 4.2 và ankyrin. Các protein màng và protein bộ khung
xương tế bào hồng cầu có chức năng duy trì tính toàn vẹn của màng tế bào và cũng để
tạo tính biến dạng và độ bền cơ học cho tế bào hồng cầu (Mohandas et al., 1980). Bên
cạnh đó, một số protein màng tế bào hồng cầu có chức năng vận chuyển. Ví dụ, glucose
transporter 1 (GLUT1) và aquaporin-1 điều khiển vận chuyển glucose và nước. Ngoài
ra, có nhiều kênh ion xuyên màng để điều hòa các gradient ion và trạng thái hydrate hóa
của các tế bào hồng cầu (Thomas et al., 2011).
Trong trạng thái nghỉ, các phospholipid màng tế bào hồng cầu được phân bố
bất đối xứng trên toàn lớp kép, có nghĩa là các phospholipid chứa choline trung tính,
như phosphatidyl choline và sphingomyelin, có ở mặt ngoài của tế bào hông cầu trong
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 11

khi các phospholipid có chứa amin, như phosphatidyl serine, phosphatidyl inositol và
phosphatidyl etanolamin có ở mặt trong của màng (Zwaal and Schroit, 1997). Bên
cạnh bộ khung xương tế bào hồng cầu, sự bất đối xứng của các phospholipid trên
màng là rất cần thiết cho việc duy trì sự ổn định, khả năng biến dạng và độ bền tế bào
hồng cầu (Manno et al., 2002). Sự phân bố bất đối xứng của các phospholipid được
kiểm soát chặt chẽ bởi ba enzyme quan trọng. Đầu tiên là một flipase phụ thuộc ATP
bơm các phospholipid có chứa amin từ mặt ngoài vào mặt trong của màng. Thứ hai
là một floppase phụ thuộc ATP mà điều khiển sự di chuyển ngược lại của các
phospholipid có chứa choline từ mặt trong ra mặt ngoài của màng với tốc độ chậm
hơn so với các flippase. Protein cuối cùng tham gia vào quá trình này là scramblase.
Protein này được kích hoạt bởi cation hóa trị 2, cho phép điều khiển sự chuyển dịch
hai chiều của các phospholipid theo gradient nồng độ của chúng để theo xu hướng
hình thành phân bố đối xứng của các phospholipid (Graham, 2004). Sự phá vỡ cấu
trúc phân bố bất đối xứng và của các phospholipid màng và sự dịch chuyển ra ngoài
của phosphatidyl serine là những bước quan trọng trong quá trình hình thành và giải
phóng vi thể ở tế bào hồng cầu (Graham, 2004) (Hình 1.3). Như vậy, các yếu tố
kích thích tế bào gây ra sự thay đổi sắp xếp của các protein màng, cấu trúc mảng
phospholipid, sự di chuyển ra lớp màng ngoài của phosphatidylserine và giải phóng
vi thể.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 12


Hình 1.3. Quá trình hình thành vi thể
Sau khi tế bào bị kích thích dẫn tới sự phân phối lại các protein, cấu trúc của mảng
phospholipid, sự di chuyển ra ngoài của phosphatidylserine và tạo thành vi thể
1.3. Vai trò sinh học của Ca
2+

1.3.1. Vai trò của Ca
2+
trong điều kiện sinh lý bình thường
Ca
2+
đóng vai trò quan trọng trong sinh lý và sinh hóa của sinh vật và tế bào
vì Ca
2+
liên quan trực tiếp hoặc gián tiếp tới các con đường truyền tín hiệu như
truyền xung thần kinh, vận động cơ và thụ tinh.
Trong tế bào, Ca
2+
được dự trữ trong một số bào quan như ti thể hoặc
mạng lưới nội chất. Mỗi loại tế bào, mô khác nhau có nồng độ Ca
2+
nội bào
khác nhau. Thông thường, trong một tế bào điển hình, nồng độ nội bào của Ca
2+
khoảng 100 nM, tuy nhiên ở tế bào hồng cầu người hàm lượng Ca
2+
nội bào rất
thấp từ 30 đến 60 nM, điều này có thể là do tế bào hồng cầu trưởng thành không
chứa bào quan (Tiffert and Lew, 1997, Tiffert et al., 1993). So với dịch ngoại
bào, nồng độ Ca
2+
thấp hơn khoảng 12.000 lần khi tế bào ở trạng thái nghỉ. Sự
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 13

chênh lệch gradient nồng độ này được duy trì thông qua màng bởi các bơm Ca
2+

sử dụng năng lượng ATP. Khi ở trạng thái kích thích, hàm lượng Ca
2+
nội bào
tăng lên rất nhanh đến 400 nM hoặc cao hơn nhiềuđặc biệt ở các tế bào cơ và
thần kinh.
Khi nồng độ Ca
2+
nội bào tăng đột ngột sẽ kích hoạt scramblase và ức chế
flippase, kết quả dẫn đến phá vỡ phân bố bất đối xứng của các thành phần
phospholipid màng và sự di chuyển của phosphatidyl serine ra lớp màng ngoài. Đồng
thời với các quá trình này, sự gia tăng của Ca
2+
nội bào cũng kích hoạt các enzyme
phân giải protein như calpain dẫn đến phá vỡ các điểm kết nối giữa khung xương tế
bào và màng tế bào, tạo thuận lợi cho sự hình thành và giải phóng các vi thể khỏi
màng tế bào. Kết quả nghiên cứu của Knowles và cs. (1997) cho thấy, bộ khung
xương tế bào hồng cầu không bị hỏng nhưng co lại vào trong tế bào khi màng tế bào
biến dạng dưới áp lực (shear stress) (Knowles et al., 1997). Điều này có thể giải thích
cho sự giải phóng các vi thể khỏi các thành phần khung xương tế bào. Một nghiên cứu
mô phỏng màng tế bào hồng cầu đã chứng minh rằng khung xương tế bào có thể phá
vỡ tái sắp xếp lại một cách linh động, chính nhờ điều này dẫn đến khả năng chuyển từ
thể rắn sang thể lỏng của màng tế bào hồng cầu dưới các điều kiện kích thích khác
nhau. Bucki và cs. (1998) cho rằng việc duy trì phân bố bất đối xứng của
phospholipid không liên quan đến sự tạo thành vi thể cảm ứng bởi Ca
2+
(Bucki et al.,
1998).

Cho đến nay, cơ chế phân tử cơ bản chính xác của sự tạo thành MV ở tế bào
hồng cầu vẫn còn chưa sáng tỏ hoàn toàn bởi vì có sự tham gia của rất nhiều yếu tố
liên quan, chẳng hạn như dòng Ca
2+
, các áp lực hoặc sự suy giảm ATP và các yếu tố
khác chưa biết có thể dẫn đến hình thành và giải phóng vi thể. Ngoài ra, việc phân loại
có chọn lọc các thành phần màng nhất định trong cấu trúc của vi thể cũng là một điều
bí ẩn cần giải thích. Mặc dù quá trình lưu trữ máu được cho là tương tự như sự lão hóa
tế bào hồng cầu trong cơ thể thì vai trò của các protein khung xương tế bào liên quan
đến sự hình thành vi thể vẫn có thể khác nhau trong điều kiện in vitro và in vivo. Hơn
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 14

thế nữa các kiểu hình thái khác nhau của tế bào hồng cầu cũng có thể liên quan hoặc
ảnh hưởng tới sự hình thành vi thể là khác nhau. Chẳng hạn, mặc dù hồng cầu của các
bệnh nhân bị hội chứng Scott có đồng thời hình thái bình thường và bất thường nhưng
không có sự khác biệt về thành phần khung tế bào của hai dạng tế bào này. Khi bị
kích thích với calcium ionophore A23187 sự hình thành vi thể xảy ra kém hiệu quả ở
các bệnh nhân này (Dasgupta et al., 2009). Như vậy, luôn có sự khác biệt về quá trình
hình thành và giải phóng vi thể từ tế bào hồng cầu, quá trình này phụ thuộc vào hình
thái tế bào và các yếu tố kích thích tác động lên tế bào.
Nồng độ Ca
2+
nội bào của tế bào hồng cầu trong các điều kiện sinh lý có thể
được đo bằng các phương pháp khác nhau thông qua các phức Ca
2+
hoặc quang phổ
nguyên tử hấp thụ hoặc đánh dấu huỳnh quang. Phương pháp xác định bằng huỳnh
quang rất phổ biến hiện nay. Các chất gắn đặc hiệu Ca
2+

có khả năng phát huỳnh
quang như fura-2, indol 1, fluo-3 và fluo-4 đang được sử dụng phổ biến. Đối với tế
bào hồng cầu việc áp dụng fura-2 để đo Ca
2+
nội bào là khó khăn bởi vì sự ảnh hưởng
của haemoglobin. Chính vì vậy fluo-4 được sử dụng phù hợp trong việc xác định hàm
lượng Ca
2+
nội bào (Kaestner et al., 2006). Theo một số nghiên cứu, hàm lượng Ca
2+

nội bào ở tế bào hồng cầu rất thấp dao động trong khoảng từ 30 đến 60 nM.
1.3.2. Vai trò của Ca
2+
trong việc hình thành vi thể
Nhiều nghiên cứu cho thấy khi nồng độ Ca
2+
nội bào tăng sẽ dẫn đến phá vỡ
phân bố bất đối xứng của các thành phần lipid trên lớp màng kép của tế bào. Ở tế
bào hồng cầu, khi nồng độ Ca
2+
nội bào tăng có thể dẫn đến thay đổi sự phân bố bất
đối xứng của các thành phần phospholipid trong lớp màng kép của tế bào hồng cầu,
tiểu cầu người. Sự bất đối xứng của các phospholipid màng bị thay đổi khi tế bào
hồng cầu được nhận thêm Ca
2+
bằng cách sử dụng ionophore A23187. Ở nồng độ
Ca
2+
nội bào trung bình (50-100 µM) các hiệu ứng liên quan đến sự thay đổi phân bố

của các thành phần phospholipid chính trong tế bào hồng cầu người có thể được
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 15

phát hiện bằng các kỹ thuật đánh dấu huỳnh quang hoặc kiểm tra sự biến đổi các đặc
điểm vật lý của màng (Williamson et al., 1992, Romero and Romero, 1999).
Lysophosphatidic acid (LPA) là một dạng lipid trung gian quan trọng trong
các quá trình sinh lý bệnh khác nhau. LPA có thể kích thích mở một kênh vận
chuyển Ca
2+
trong tế bào hồng cầu người. Do đó, khi có mặt của Ca
2+
, LPA kích
thích dòng Ca
2+
đi vào tế bào và hệ quả dẫn đến phosphatidyl serine bộc lộ trên lớp
màng ngoài của tế bào, quá trình này có thể dẫn đến hình thành vi thể (Nguyen et
al., 2011).
Các caspase là những cysteine proteinase đặc hiệu với aspartate tồn tại như
các enzyme tiền thân tiềm ẩn nhưng một khi được kích hoạt bởi các tín hiệu tự chết
của hồng cầu, chúng thúc đẩy quá trình này bởi sự phân giải hạn chế đặc hiệu các
protein của các tế bào chất chủ chốt. Trong các điều kiện sinh lý, các procapscapse
có mặt trong tế bào hồng cầu trưởng thành. Sự tăng đột ngột Ca
2+
nội bào cũng kích
hoạt của caspase liên quan tới ức chế hoạt động của aminophospholipid flippase dẫn
tới hình thành vi thể (Mandal et al., 2005, Orrenius et al., 2003)

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 16

Chương 2. NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
- Tế bào hồng cầu người
- Vi thể tách ra từ tế bào hồng cầu người
2.2. Phạm vi nghiên cứu
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ sinh
học ứng dụng; Phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ sinh học Động vật – Khoa
Công nghệ Sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam
- Thời gian: từ tháng 5/2014 đến tháng 5/2015
2.3. Nội dung nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu của đề tài bao gồm:
- Xác định nồng độ Ca
2+
nội bào (Ca
i
2+
) sử dụng chất gắn huỳnh quang đặc
hiệu và kính hiển vi huỳnh quang.
- Khảo sát ảnh hưởng của lysophosphatidic acid và chất hoạt hóa protein
kinase C (phorbol 12-myristate 13-acetate/PMA) đến nồng độ Ca

2+
nội bào
- Xác định ảnh hưởng của Ca
i
2+
đến sự hình thành vi thể
- Nghiên cứu phương pháp thu nhận vi thể
- Xác định kích thước của vi thể
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Chuẩn bị các dung dịch và hóa chất
a) Dung dịch đệm sinh lý: NaCl 140 mM, KCl 7.5 mM, HEPES (4-(2-
hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) 10 mM, Glucose 10 mM (chuẩn pH
= 7,4 bằng NaOH 0,1 M).
b) Annexin Binding buffer: Đệm phosphate (PBS) 10 mM, CaCl
2
2 mM
(chuẩn pH 7,4).
c) Dung dịch Heparin: Heparin được sử dụng để chống đông máu với hàm
lượng 25 U/mL máu hoặc 0,01 - 0,1 mL heparin/mL máu.