chọn lọc cá thể bc1f1, bc2f2 mang qtl gen tăng số hạt trên bông của tổ hợp lai kd18 x kc25 bằng chỉ thị phân tử

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM




NGUYỄN THỊ LOAN




CHỌN LỌC CÁ THỂ BC
1
F
1
, BC
2
F
2
MANG QTL/ GEN TĂNG
SỐ HẠT TRÊN BÔNG CỦA TỔ HỢP LAI KD18 X KC25
BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ



Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học
Mã số : 60.42.02.01


Người hướng dẫn khoa học

TS. TRẦN ĐĂNG KHÁNH
TS. NGUYỄN VĂN GIANG



HÀ NỘI – 2015
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page i

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành bản luận văn này, tôi luôn nhận được sự giúp đỡ về nhiều mặt của
các cấp lãnh đạo, các tập thể và cá nhân.
Trước hết tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và kính trọng tới TS. Trần
Đăng Khánh, TS. Nguyễn Văn Giang những người đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi hoàn
thành bản luận văn này.
Luận văn được thực hiện tại Bộ môn Sinh học Phân tử, Bộ môn Kỹ thuật Di truyền,
Viện Di truyền Nông nghiệp. Tại đây, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của Ban lãnh đạo và
các cán bộ trong Bộ môn, Viện Di truyền trong suốt quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới khoa Công nghệ Sinh học, Ban Đào tạo sau Đại học,
Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi về kiến thức và chuyên
môn trong suốt hai năm học tập và làm luận văn.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới gia đình, người thân và
toàn thể bạn bè đã cổ vũ, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên
cứu.`
Trong quá trình thực hiện, không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận
được sự góp ý chân thành.
Một lần nữa tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà N
ội, tháng năm 2015

Tác giả





Nguyễn Thị Loan


Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page ii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tôi thực hiện
dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Trần Đăng Khánh, TS. Nguyễn
Văn Giang
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng
được sử dụng công bố ở bất cứ công trình khoa học nào.
Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn này
đã được ghi rõ nguồn gốc.

Tác giả

Nguyễn Thị Loan

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page iii

MỤC LỤC

Lời cảm ơn i
Lời cam đoan ii
Mục lục iii
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt v
Danh mục bảng vi
Danh mục hình vii
MỞ ĐẦU 1
1. Tính cấp thiết của đề tài 1
2. Mục đích và yêu cầu của đề tài 2
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của của đề tài 2
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Giới thiệu về giống lúa bố mẹ 3
1.1.1. Giống nhận QTL/gen KD18
3
1.1.2.Giống cho QTL/gen KC25
3
1.2. Cơ sở khoa học trong việc ứng dụng chọn giống nhờ chỉ thị phân tử 3
1.2.1. Chỉ thị phân tử
3
1.2.2. Tính ưu việt và những ứng dụng của chỉ thị phân tử
9
1.3. Những nghiên cứu chọn tạo giống lúa năng suất 16

1.3.1. Trên thế giới
16
1.3.2. Tại Việt Nam
21
Chương 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24
2.1. Vật liệu nghiên cứu 24
2.1.1. Các giống lúa nghiên cứu
24
2.1.2.Các chỉ thị phân tử và hóa chất thí nghiệm
24
2.2. Nội dung nghiên cứu 26
2.3. Phương pháp nghiên cứu 27
2.3.1. Phương pháp lai hữu tính - lai trở lại giữa giống cho và nhận QTL/gen
27
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page iv

2.3.2. Phương pháp nghiên cứu phòng thí nghiệm
29
2.3.3. Phương pháp xử lý số liệu
33
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34
3.1. Kết quả lai tạo thế hệ F
1,
BC
1
F
1,
BC
1

F
2
của tổ hợp KD18 x KC25 34
3.2. Tách chiết và tinh sạch ADN tổng số 34
3.3. Khảo sát đa hình giữa hai giống bố mẹ 35
3.4. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn lọc cá thể lai mang QTL/gen 36
3.4.1. Xác định con lai F
1
36
3.4.2. Chọn lọc các cá thể mang QTL/gen ở thế hệ BC
1
F
1
37
3.4.3. Chọn lọc các cá thể mang QTL/gen ở thế hệ BC
2
F
1
45
3.4.4. Chọn lọc các cá thể mang QTL/gen đồng hợp tử với KC25 ở thế hệ
BC
2
F
2
55
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58
Kết luận 58
Kiến nghị 58
TÀI LIỆU THAM KHẢO 59
PHỤ LỤC 65

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page v

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN : Axit Deoxyribonucleic
AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism - Đa hình chiều dài các
đoạn được nhân bản chọn lọc
RAPD : Random Amplification of Polymorphic DNA - Đa hình ADN được
nhân bản ngẫu nhiên
RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism – Đa hình chiều dài
mảnh phân cắt giới hạn
STS : Sequence Tagged Site – Xác định vị trí trình tự đã được đánh dấu
RGA : Resistance Gene Analog – Vùng tương đồng gen kháng
SNP : Single Nucleotide Polymorphisms – Đa hình nucleotide đơn
SSR : Simple Sequence Repeat - Sự lặp lại của trình tự đơn giản
Bp : Base pair – Cặp bazơ nitơ
cDNA : Complementary DNA – Thư viện ADN bổ trợ
cs : Cộng sự
ctv : Cộng tác viên
CTPT : Chỉ thị phân tử
dNTP : Deoxynucleotide triphosphate
MABC : Marker Assisted Backcrossing – Chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử kết
hợp lai trở lại
MAS : Marker Assisted Selection – Chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử
NST : Nhiễm sắc thể
PCR : Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợp
QTL/ QTLs : Quantity Trait Loci(s) - Locus kiểm soát tính trạng số lượng
TBE : Tris-Boric Acid-EDTA

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page vi

DANH MỤC BẢNG


STT Tên bảng Trang

2.1 Các chỉ thị cho đa hình giữa giống KD18 x KC25 tại vị trí QTL/gen 24
2.2 Các chỉ thị cho đa hình trên 12NST giữa giống KD18 x KC25 24
2.3 Thành phần các chất dùng cho mỗi phản ứng PCR với mồi SSR 29
2.4 Chương trình chạy của phản ứng PCR 30
3.1 Tỉ lệ phần trăm alen giống nhận gen của 32 cá thể BC
1
F
1
mang QTL/gen 42
3.2 Tỉ lệ phần trăm alen giống nhận gen của 15 cá thể BC
2
F
1
mang QTL/gen 51
3.3 Sự tương quan giữa số thế hệ với tỷ lệ kiểu gen của giống nhận gen được
chuyển vào con lai BC
n
F
1
55
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page vii

DANH MỤC HÌNH

STT Tên hình Trang

2.1 Các bước thí nghiệm trong chọn tạo giống lúa tăng số hạt trên bông
bằng phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử và lai trở lại 28
3.1 Kết quả chạy điện di trên gel Agarose 0,8% 35
3.2 Kết quả chạy điện di trên gel Agarose 3% 35
3.3 Kết quả chạy điện di trên polyacrylamide 4.5% 35
3.4 Kết quả chạy điện di trên gel Agarose 3% 36
3.5 Kết quả chạy điện di trên gel Agarose 3% 36
3.6 Kết quả chạy điện di trên gel Agarose 3% 37
3.7 Kiểm tra cây F
1
với RM21615 37
3.8 Kết quả chạy điện di trên polyacrylamide 4.5% 38
3.9 Kết quả chạy điện di trên polyacrylamide 4.5% 39
3.10 Kết quả chạy điện di trên gel Agarose 3% 40
3.11 Kết quả chạy điện di trên gel Agarose 3% 40
3.12 Kết quả chạy điện di trên gel Agarose 3% 40
3.13 Kết quả chạy điện di trên gel Agarose 3% 41
3.14 Kết quả chạy điện di trên gel Agarose 3% 41
3.15 Kết quả chạy điện di trên gel Agarose 3% 41
3.16 Tỷ lệ các cá thể mang nền di truyền giống mẹ ở thế hệ BC
1
F
1
43
3.17 Biểu đồ 32 cá thể thế hệ BC

1
F
1
(KD18/KC25) trên NST số 1, 2, 3, 4 44
3.18 Biểu đồ 32 cá thể thế hệ BC
1
F
1
(KD18/KC25) trên NST số 5, 6, 7, 8 44
3.19 Biểu đồ 32 cá thể thế hệ BC1F1 (KD18/KC25) trên NST số 9, 10, 11, 12
44
3.20 Biểu đồ của cá thể số 74 thế hệ BC
1
F
1
quần thể KD18/KC25 45
3.21 Biểu đồ của cá thể số 109 thế hệ BC
1
F
1
quần thể KD18/KC25 45
3.22 Kết quả chạy điện di trên polyacrylamide 4.5% 46
3.23 Kết quả chạy điện di trên gel Agarose 3% 47
3.24 Kết quả chạy điện di trên gel Agarose 3% 48
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page viii

3.25 Kết quả chạy điện di trên gel Agarose 3% 49
3.26 Kết quả chạy điện di trên gel Agarose 3% 49
3.27 Kết quả chạy điện di trên gel Agarose 3% 49

3.28 Kết quả chạy điện di trên gel Agarose 3% 49
3.29 Kết quả chạy điện di trên gel Agarose 3% 49
3.30 Kết quả chạy điện di trên gel Agarose 3% 50
3.31 Kết quả chạy điện di trên gel Agarose 3% 50
3.32 Kết quả chạy điện di trên gel Agarose 3% 50
3.33 Kết quả chạy điện di trên gel Agarose 3% 50
3.34 Tỷ lệ các cá thể mang nền di truyền giống mẹ (BC
2
F
1
) 52
3.35 Biểu đồ 15 cá thể thế hệ BC
2
F
1
(KD18/KC25) trên NST số 1, 2, 3 52
3.36 Biểu đồ 15 cá thể thế hệ BC
2
F
1
(KD18/KC25) trên NST số 4, 5, 6 53
3.37 Biểu đồ 15 cá thể thế hệ BC
2
F
1
(KD18 x KC25) trên NST số 7, 8, 9 53
3.38 Biểu đồ 15 cá thể thế hệ BC
2
F
1

(KD18 x KC25) trên NST số 10, 11, 12 53
3.39 Biểu đồ của cá thể số 61 thế hệ BC
2
F
1
quần thể KD18 x KC25 54
3.40 Biểu đồ của cá thể số 59 thế hệ BC
2
F
1
quần thể KD18 x KC25 54
3.41 Kết quả chạy điện di trên gel Agarose 3% 56
3.42 Kết quả chạy điện di trên gel Agarose 3% 56
3.43 Kết quả chạy điện di trên gel Agarose 3% 57
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 1

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài
Lúa (Oryza sativa L.) là một trong những cây lương thực chính đảm bảo an
ninh lương thực, ổn định xã hội ở nhiều quốc gia trên thế giới và được trồng tập
trung chủ yếu ở các nước châu Á, châu Phi và Mỹ La tinh. Ở nước ta, lúa gạo không
chỉ là nguồn lương thực tiêu dùng trong nước mà còn là mặt hàng xuất khẩu quan
trọng. Sản lượng lúa gạo toàn cầu năm 2013 đạt 496,3 triệu tấn, tăng 1% so với năm
2012. Trong đó, sản lượng lúa tại châu Á ước tính đạt 450,6 triệu tấn, tăng khoảng
1,1% so với năm 2012 (FAO, 2013).
Ngày nay, dân số ngày càng tăng nhanh đang gây áp lực lớn đến nền nông
nghiệp toàn cầu và đặc biệt ở các nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam (Bùi
Thị Kim Vi và cs, 2011). Diện tích đất nông nghiệp đặc biệt là đất canh tác lúa giảm

nhanh do sự chuyển dịch cơ cấu sản xuất nông nghiệp, bên cạnh quá trình đô thị hóa
và công nghiệp hóa diễn ra nhanh chóng. Một vấn đề đáng quan tâm là ảnh hưởng
tiêu cực của biến đổi khí hậu như lũ lụt, hạn hán, xâm nhập mặn làm sản lượng
lúa bị sụt giảm đáng kể. Để đáp ứng nhu cầu lương thực, nghiên cứu, cải tiến các
giống lúa có năng suất cao, chất lượng tốt là yếu tố quan trọng nhằm đảm bảo an
sinh xã hội, tăng thu nhập cho người dân.
Phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử và lai trở lại (MABC) đã được
ứng dụng thành công tại Viện Nghiên cứu lúa Quốc tế (IRRI) trong việc quy tụ
QTL/gen chịu ngập và chịu mặn vào một số giống lúa trồng phổ biến ở các nước
Đông nam châu Á như: Ấn Độ, Indonesia, Bangladet. Phương pháp MABC thiết
thực, hiệu quả trong việc quy tụ locus gen quy định tính trạng di truyền số lượng
(QTL) hay gen vào giống mới cho phép rút ngắn quá trình chọn lọc, chọn lọc được
những tính trạng khó hay nhiều gen cùng một lúc. Chọn giống bằng phương pháp
MABC sẽ giảm được giá thành, thời gian và cho hiệu quả cao hơn so với phương
pháp chọn giống truyền thống. Phương pháp này cho phép chọn lọc trực tiếp hệ gen
của từng cá thể trong quần thể. Việc ứng dụng chỉ thị phân tử kết hợp lai trở lại từ 2
đến 3 thế hệ có thể thu được cá thể với nền di truyền của giống mẹ và mang gen
chuyển. Các dòng này có thể cho tự thụ, thu hạt để thử nghiệm trên đồng ruộng.
Kết hợp phương pháp MABC và chọn giống truyền thống để tạo ra
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 2

dòng/giống lúa có khả năng năng suất cao, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài
“Chọn lọc cá thể BC
1
F
1
, BC
2
F

2
mang QTL/ gen tăng số hạt trên bông của tổ hợp
lai KD18 x KC25 bằng chỉ thị phân tử”.
2. Mục đích và yêu cầu của đề tài
+ Mục đích của đề tài
Sử dụng phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử kết hợp lai trở lại trong
quy tụ QTL/gen tăng số hạt trên bông vào giống lúa KD18 đang được trồng phổ
biến ở Việt Nam, để chọn ra 1-2 cá thể KD18 x KC25 mang QTL/gen tăng số hạt
trên bông có nền di truyền cao nhất giống giống nhận gen.
+ Yêu cầu của đề tài
- Tạo được quần thể F
1
, BC
1
F
1,
BC
2
F
1
của tổ hợp lai KD18 x KC25 - Xác
định được cá thể trong quần thể F
1
, BC
1
F
1,
BC
2
F

1
mang QTL/gen quy định tính
trạng tăng số hạt trên bông.
- Xác định cá thể trong quần thể BC
1
F
1,
BC
2
F
1
mang QTL/gen tăng số hạt
trên bông và có nền di truyền cao nhất giống KD18.
- Xác định cá thể trong quần thể BC
2
F
2
mang QTL/gen tăng số hạt trên bông
đồng hợp tử với KC25
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của của đề tài
+ Ý nghĩa khoa học của đề tài
- Ứng dụng chỉ thị phân tử kết hợp phương pháp lai trở lại để chọn lọc nhanh và
chính xác các cá thể mang QTL/gen tăng số hạt trên bông, nhờ vậy rút ngắn thời gian,
công sức chọn lọc trên đồng ruộng, giảm số lượng lớn cá thể gieo trồng hàng vụ và
giúp khắc phục được những hạn chế của phương pháp chọn giống truyền thống.
+ Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
- Những thành công bước đầu trong quy tụ QTL/gen tăng số hạt trên bông nhờ
sử dụng chỉ thị phân tử ở lúa sẽ mở ra khả năng ứng dụng rộng rãi trong công tác chọn
tạo giống nói chung, không chỉ đối với tính trạng năng suất mà còn đối với nhiều đặc
tính nông học đáp ứng nhu cầu lương thực con người.

- Những cá thể trong quần thể BC
1
F
1,
BC
2
F
1,
BC
2
F
2,
triển vọng được chọn lọc
trong đề tài này sẽ trồng thử nghiệm, đánh giá, chọn ra các dòng lúa có năng suất
phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 3

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu về giống lúa bố mẹ
1.1.1. Giống nhận QTL/gen KD18
KD18 gọi tắt của giống lúa Khang dân 18 là giống lúa thuần được trồng khá
phổ biến ở các tỉnh đồng bằng sông Hồng và được nhập nội từ Trung Quốc vào
nước ta từ những năm 90 của thế kỷ trước. Là giống lúa có tiềm năng năng suất cao,
đẻ nhánh khá, chịu rét khá. Có bộ lá đứng, gọn, kháng sâu bệnh khá. Chịu thâm
canh trung bình.
- Thời gian sinh trưởng:
+ Vụ xuân muộn: 120 – 130 ngày
+ Vụ mùa: 100 – 105 ngày

- Năng suất trung bình: 220 – 280 Kg/ sào (360m
2
)
- Mật độ trung bình: 40 – 45 khóm/m2.
1.1.2.Giống cho QTL/gen KC25
KC25 là giống nhập nội từ Hàn Quốc mang QTL/gen tăng số hạt trên bông
được sử dụng làm giống cho QTL/gen.
1.2. Cơ sở khoa học trong việc ứng dụng chọn giống nhờ chỉ thị phân tử
1.2.1. Chỉ thị phân tử
Chỉ thị phân tử (hay chỉ thị phân tử ADN) là những chỉ thị có bản chất là đa
hình ADN. Nó có thể là những dòng phân tử ADN có sẵn hay dưới dạng thông tin
về trình tự được lưu giữ và chuyển tải trong những tệp dữ liệu được lưu trữ trong
máy tính hay trên mạng Internet (ví dụ như trình tự các cặp mồi SSR, STS, RAPD,
AFLP ).
Năm 1998 Bert Collard và David Mackill đã trình bày về chọn lọc dựa trên
chỉ thị phân tử, cơ sở khoa học là tất cả cơ quan sống được hình thành từ các tế
bào, các tế bào sống được điều khiển bằng vật liệu di truyền gọi là ADN. Phân tử
ADN được tạo thành chuỗi dài chứa các N (Adenin [A]; Cytosin [C]; Guanine
[G] và Thymine [T], chỉ mỗi phần nhỏ của chuỗi ADN tạo thành các gen mang mã
di truyền cho các protein, phần còn lại chủ yếu của ADN không mã hóa. Các vật
liệu di truyền tổ chức bên trong các NST (ví dụ cây Arabidopsis thaliana có 5
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 4

NST), tập hợp bộ nhiễm sắc thể gọi là genome. Trong 1 cá thể lưỡng bội (NST theo
các cặp) có 2 allen của một gen, mỗi allen có nguồn từ một bố, mẹ. Chỉ thị phân tử
không xem xét như các gen bình thường khi chúng không có ảnh hưởng sinh học
mà xem xét như các mốc điểm trong genome. Chúng ta có thể nhận biết trình tự
ADN truyền đạt di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác dựa vào kiểm tra ADN
phản ánh được chỉ thị hình thái. ADN là cơ sở nhận biết các tính trạng bằng chỉ thị

hóa sinh là cơ sở gen tạo ra protein, số chỉ thị này có thể dò tìm toàn bộ genome và
thông tin cung cấp cho nhà tạo giống phụ thuộc vào chỉ thị sử dụng, mỗi chỉ thị có
ưu và nhược điểm khác nhau. Trong thực tế, số lượng các chỉ thị ADN là rất lớn,
nếu chỉ tính một sai khác rất nhỏ giữa hai cá thể đã dẫn đến một số lượng lớn sai
khác các chỉ thị ADN giữa 2 cá thể đó.
Chỉ thị phân tử ADN là những chỉ thị có bản chất là đa hình, về mặt nguyên
tắc một chỉ thị ADN lý tưởng phải đạt các yêu cầu sau: Bản chất cho đa hình cao, di
truyền đồng trội, xuất hiện nhiều trong genome, dễ tiếp cận, phân tích nhanh và dễ
dàng. Tuy nhiên, gần như không thể tìm thấy một nào có thể thỏa mãn tất cả những
điều kiện trên. Tùy thuộc vào những nghiên cứu mà người ta sử dụng một hệ thống
chỉ thị thỏa mãn được một số điều kiện (Nguyễn Duy Bảy và cs, 2001). Bên cạnh
đó chỉ thị phân tử ADN có những ưu điểm vượt trội so với chỉ thị hình thái và chỉ
thị isozyme ở một số đặc tính:
1/Đo lường trực tiếp các vật liệu di truyền;
2/Có nhiều chỉ thị trong quần thể;
3/Đo lường không chi phối ảnh hưởng của môi trường và ảnh hưởng có tính chất
phát triển.
Vì những ưu thế trên nên ngày nay trong công tác nghiên cứu chọn giống cây
trồng thường hay sử dụng chỉ thị phân tử ADN hơn.
Chỉ thị phân tử được chia làm ba loại chính:
1.2.1.1. Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN
* Chỉ thị RFLP (Restriction fragment length polymorphism - Đa hình chiều
dài mảnh phân cắt giới hạn)
Chỉ thị này được các nhà di truyền học lần đầu tiên giới thiệu trong nghiên
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 5

cứu lập bản đồ các gen liên quan đến bệnh ở người. Năm 1980 Bostein đã chỉ ra
rằng trong chỉ thị RFLP, enzym giới hạn được sử dụng để cắt ADN genome thành
nhiều mảnh ADN có độ dài khác nhau. Các đa hình RFLP sinh ra bởi những đột

biến tự nhiên ở những điểm cắt enzym giới hạn trong ADN bộ gen như đảo đoạn,
thêm hoặc mất đoạn ADN tùy thuộc vào mỗi giống, mỗi loài thậm chí mỗi cá thể.
Mỗi loài sinh vật có một bộ gen đặc hiệu trong cấu trúc. Vì vậy khi sử dụng những
enzym giới hạn để cắt phân tử ADN của hệ gen, các đoạn cắt ra của ADN với kích
thước hay chiều dài khác nhau có thể được dùng như các dấu hiệu di truyền để xem
xét các mẫu nhiễm sắc thể. Sự nhận biết các đoạn cắt được thực hiện nhờ kỹ thuật
lai với các ADN mẫu dò.
Chỉ thị RFLP là chỉ thị đồng trội nghĩa là có khả năng biểu hiện tất cả các
alen của cùng một locus gen. Do vậy có thể phân biệt được các thể đồng hợp tử
(AA hoặc aa) và các cá thể dị hợp tử (Aa). Đây là đặc điểm ưu việt của chỉ thị
RFLP. Hạn chế của phương pháp này là tốn nhiều thời gian và công sức, đòi hỏi có
phòng thí nghiệm với nhiều trang thiết bị kỹ thuật cao, đặc biệt là tiêu hao một
lượng lớn ADN mà số lượng đa hình thu được khá ít, thậm chí ở một số loài khó
nhận được đa hình (Lưu Thị Ngọc Huyền, 2003).
1.2.1.2. Chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản ADN
Phản ứng chuỗi trùng hợp hay kĩ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
do Kary Mullis đưa ra, giúp phát hiện sự đa hình ADN dựa trên cơ sở nhân bản các
đoạn ADN với số lượng lớn dựa trên nguyên lí tái bản của ADN trong tự nhiên.
* Chỉ thị RAPD (RADNomly Amplified Polymorphic ADNs – Đa hình các
đoạn ADN khuyếch đại ngẫu nhiên)
Chỉ thị RAPD hay còn gọi là PCR – RAPD được hình thành dựa trên
nguyên lý của kỹ thuật PCR được William phát triển vào năm 1990. Trong chỉ thị
RAPD không cần dùng cặp mồi đặc hiệu để nhân đoạn ADN nhất định mà dùng các
mồi đơn ngẫu nhiên để nhân các đoạn ADN một cách ngẫu nhiên. Mồi ngẫu nhiên
là đoạn oligonucleotide dài khoảng từ 6 – 12 nucleotide, nhiệt độ kết cặp thấp. Do
tính ngẫu nhiên nên các đoạn mồi này vừa là mồi xuôi, vừa là mồi ngược. Các đoạn
này sẽ bắt cặp với trình tự bổ sung trong hệ gen của sinh vật để nhân bản. Sự đa
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 6

hình phát hiện được khi sử dụng kỹ thuật RAPD có thể là do sự thay đổi bazơ
nucleotit ở vị trí gắn mồi, hoặc sự thêm hay mất nucleotit nằm trong vùng khuếch
đại. (Williams J.G et al, 1990)
* Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism – Đa hình chiều
dài các đoạn ADN nhân bản chọn lọc)
Chỉ thị AFLP dựa trên nguyên tắc sử dụng enzym giới hạn và PCR. Để thiết
kế được các mồi đặc trưng trước hết cắt các mẫu nghiên cứu bằng enzym giới hạn.
Khi xử lý enzym giới hạn ADN sẽ bị cắt thành vô số mảnh có kích thước khác
nhau. Mỗi mảnh cắt, đều biết trước trình tự nucleotide của chúng ở hai đầu cắt. Dựa
vào trình tự ở hai đầu cắt thiết kế các đoạn gắn (adaptor). Sau đó dùng enzym ligase
để nối các đoạn ADN thích ứng vào hai đầu ADN đã cắt. Dựa vào trình tự adaptor
ta thiết kế mồi PCR. Mồi PCR gồm hai phần: Một phần có trình tự bổ sung với
adaptor và phần kia là những nucleotide được thêm vào tùy ý, thường từ 1 – 3
nucleotide. Với mồi thiết kế như vậy thì chỉ có những đoạn ADN có trình tự ở hai
đầu bổ sung với trình tự mồi mới được nhân bản.
Ưu điểm của phương pháp này là lượng ADN sử dụng cho nghiên cứu ít,
băng ADN ổn định, khả năng ứng dụng rộng rãi và do có thể bổ sung các nucleotide
khác nhau khi thiết kế mồi nên số lượng mồi có thể thiết kế được và tiềm năng ứng
dụng rất lớn. AFLP còn cung cấp một lượng đa hình ADN lý tưởng từ ADN của bất
kỳ nguồn gốc nào từ đơn giản đến phức tạp. AFLP cũng được coi là công cụ hiệu
quả nghiên cứu tính đa hình di truyền, tìm chỉ thị liên kết, xây dựng bản đồ di
truyền mật độ cao. Đặc biệt được dùng trong phân tích ADN từ nhiều nguồn gốc
với mức độ phức tạp khác nhau.
* Chỉ thị STS (Sequence Tagged Site – Xác định vị trí trình tự đã được
đánh dấu)
STS là một đoạn ADN ngắn gồm khoảng 60- 1000bp có thể được phát hiện
bằng kỹ thuật PCR. Nó cho phép xác định những vị trí được đánh dấu bằng cách sử
dụng các trình tự nucleotide đã biết trước của ADN trong genome.
STS là chỉ thị nhân bản trực tiếp những locus đã biết bằng việc sử dụng cặp
mồi PCR được thiết kế, theo trình tự đoạn đầu và đoạn cuối của những locus đặc

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 7

trưng này. Các đoạn mồi STS chứa khoảng 20 nucleotide nên có tính đặc hiệu cao
với PCR. Mỗi một STS được xác định tại một điểm trên bản đồ như là một mốc
trong genom (Trịnh Đình Đạt, 2006). Ở cây lúa, các STS được coi như là mốc
chuẩn và người ta đã xác lập được các STS liên kết với một số gen kháng sâu bệnh,
sử dụng để phát hiện tính đa hình xây dựng bản đồ di truyền liên kết như STS liên
kết với gen kháng stress, chịu lạnh ở lúa (Lê Duy Thành, 2000). Nhờ đó việc tìm
kiếm các gen kiểm soát hoặc liên quan chặt chẽ đến một tính trạng di truyền nào đó
có thể được tiến hành dễ dàng. Sử dụng trong lĩnh vực chọn giống dựa vào các dấu
phân tử STS để tìm kiếm các gen quan tâm trong quần thể và phân tích nguồn gen,
nghiên cứu mối quan hệ họ hàng giữa các loài.
* Chỉ thị RGA (Resistance Gene Analog – Vùng tương đồng gen kháng)
Khi so sánh trình tự ADN của những gen kháng đã phân lập từ nhiều loài thực
vật khác nhau, các nhà khoa học đã thấy rằng những gen này có chung những vùng
lặp lại, như vùng lặp lại giàu leucin (Leucine Rich Repeat: LRR), vùng vị trí liên kết
nucleotit (Nucleotit Binding Site: NBS) và vùng protein Kinaza (PK) (Grant et al.,
1995). Bản chất của kỹ thuật RGA là những cặp mồi ADN được xây dựng dựa vào
những vùng bảo tồn nằm trong gen kháng. Bởi vậy, sản phẩm “nhận dạng” ADN có
thể là một vùng hoặc toàn bộ gen kháng. Kỹ thuật RGA đã được dùng để tách, lập
bản đồ gen kháng và phân tích đa dạng di truyền. (Chen et al., 1999). Những mồi
RGA đã sử dụng cũng tách biệt những giống lúa có hệ gen di truyền Indica từ hệ
gen di truyền japonica. Ngoài ra, mối liên kết giữa chỉ thị RGA với gen kháng bệnh
rỉ sắt cũng được phát hiện (Chen X. M et al., 1998).
* Chỉ thị SNPs (Single nucleotide polymorphism - Đa hình của các nucleotit đơn)
SNP là những biến dạng của chuỗi trình tự ADN được tìm thấy với tần suất
cao nhất trong genome người. Theo phân tích chi tiết chuỗi trình tự của những phần
nào đó trong genome, ADN từ hai cá thể khác nhau phần lớn đều giống nhau với số
cặp base khác biệt nhau nằm ở trong khoảng cho phép 500-1000bp. Một cặp base ở

một vị trí nào đó sẽ biểu thị sự khác nhau của cá thể có tính chất phổ biến, và một
cặp base khác là biến dị, ít phổ biến hơn ở cùng một vị trí. Nếu cặp base ít phổ biến
hơn xuất hiện nhỏ hơn 1% trong quần thể, người ta gọi vị trí cặp base đó là một
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 8

SNP. Hiện nay, người ta đã công bố 3 triệu SNP trong genome người, nhiều hơn bất
cứ chỉ thị phân tử nào đã được công bố trước đó. Chỉ thị SNP được áp dụng vào đầu
những năm 2000, từ genome người cho đến genome các sinh vật khác như cây
Arabidopsis, cây lúa (Oryza sativa L.).
1.2.1.3. Chỉ thị dựa trên cơ sở những chuỗi có trình tự lặp lại
Chuỗi lặp lại có trật tự (TADNemly Repeated Sequence) là những trình tự
lặp lại một cách có trật tự từ đầu đến cuối trong một hệ gen, thường được gọi là
ADN vệ tinh, tiểu vệ tinh hay vi vệ tinh tuỳ thuộc vào số lượng bản sao của chúng
trong hệ gen và tính chất của chuỗi. Thực ra, một số chuỗi lặp lại cũng thuộc loại
chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bội ADN như chỉ thị vi vệ tinh. Tuy nhiên, do chúng có
bản chất là chuỗi lặp lại nên có thể xếp chung vào một nhóm riêng.
* Tiểu vệ tinh (Minisatellite)
Tiểu vệ tinh là loại chuỗi lặp lại nhiều lần, có đơn vị lặp lại gồm từ 6
nucleotid trở lên (thường vào khoảng 15bp), bao phủ một vùng từ 0,5-3kb. Không
giống như ADN vệ tinh, tiểu vệ tinh được tìm thấy ở những vùng dị nhiễm sắc và
thường thay đổi rất nhiều về kích thước. Có 2 loại ADN tiểu vệ tinh. Đó là ADN
đầu mút NST và ADN tiểu vệ tinh siêu biến. ADN đầu mút NST nằm ở vai NST,
gồm một vài kilobase. ADN tiểu vệ tinh siêu biến nằm ở vùng phụ đầu mút NST.
* Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeats - Sự lặp lại của trình tự đơn giản)
SSR là chỉ thị khuyếch đại các đoạn lặp lại đơn giản hay còn gọi là vi vệ tinh
(Microsatellites)
Chỉ thị này được phát triển bởi Litt và Luty năm 1989. Là những đoạn ADN
lặp lại một cách có trật tự, gồm những đơn vị lặp lại từ 2- 6 nucleotide, theo kiểu lặp
lại ngắn và vài chục lần. Hiện tượng tồn tại các SSR trong cơ thể sinh vật Eukaryote

là khá phổ biến, tuỳ từng loài mà số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể
thay đổi từ một đến hàng chục và số lượng đơn vị lặp lại có thể biến động từ 2 đến
hàng trăm ngàn lần hoặc nhiều hơn (Lê Thị Ánh Hồng, 2002).
SSR là chỉ thị đồng trội có ưu điểm là dễ thực hiện, khả năng phát hiện đa
hình rất cao, nhưng quá trình thiết kế mồi rất tốn kém mà mỗi loại mồi lại chỉ đặc
trưng cho một loài. Tuy nhiên, SSR là một loại chỉ thị chính xác và hữu hiệu trong
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 9

nghiên cứu đa dạng di truyền, phân loại các giống vật nuôi, cây trồng khác nhau
trong cùng một loài động vật hay thực vật. Người ta sử dụng chỉ thị SSR trong phân
tích hệ gen để chọn giống, xây dựng bản đồ liên kết gen, chọn lọc tính kháng bệnh,
nghiên cứu một số tính trạng liên quan đến năng suất cây trồng, các bệnh hại và sử
dụng trong việc phân định sự sai khác giữa các giống trong cùng một loài phụ do
khả năng cho phép đánh giá mức độ alen thuộc một locus.
Chỉ thị SSR được nghiên cứu lần đầu tiên trên người (Hamada et al, 1982).
Sau đó chỉ thị này đựơc dùng trong nghiên cứu di truyền ở lúa (Caldo et al, 1998)
và nhiều loài sinh vật khác. Bộ gen Eukaryote có nhiều đoạn ADN lặp lại, các đoạn
lặp ADN có kích thước dài ngắn khác nhau tuỳ từng loài.
1.2.2. Tính ưu việt và những ứng dụng của chỉ thị phân tử
1.2.2.1 Tính ưu việt của chỉ thị phân tử
Trong những năm gần đây việc nghiên cứu hệ gen sinh vật sử dụng các chỉ
thị phân tử được phát triển nhanh chóng. Chỉ thị phân tử cho phép xác định được
các chỉ tiêu trực tiếp của kiểu gen thông qua việc xác định các trình tự nhất định của
các gen hay các trình tự đặc hiệu liên kết chặt với các gen mang các tính trạng mong
muốn. Bằng việc sử dụng các chỉ tiêu phân tích trực tiếp kiểu gen, khắc phục ảnh
hưởng của các yếu tố môi trường, theo dõi và phát hiện được các gen mong muốn,
sự biến đổi của chúng qua các thế hệ khi chưa có sự biểu hiện ra kiểu hình. Điều
này giúp công tác chọn tạo giống tiến hành một cách chính xác, rút ngắn thời gian
và chi phí.

Trên rất nhiều loại cây trồng hiện nay người ta đã thiết lập bản đồ chi tiết về
các chỉ thị ADN liên kết với nhiều gen quy định các tính trạng nông sinh học khác
nhau, trên cơ sở đó đã tiến hành chọn lọc gián tiếp dựa trên các chỉ thị phân tử này.
Nhờ vào những ưu điểm của chỉ thị phân tử đó là:
- Tìm và phát hiện những cá thể có chứa một gen nhất định nào đó trong
quần thể đang phân ly, trên cơ sở tìm sự có mặt của một mẫu ADN đánh dấu liên
kết chặt với gen đó chứ không phải dựa vào kiểu hình của nó.
- Đánh giá từng cá thể trong quần thể ở bất kì giai đoạn sinh trưởng nào: tế
bào, mô hay toàn bộ cơ thể, trong bất kì điều kiện môi trường đánh giá nào, cùng
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 10

một lúc đánh giá được nhiều tính trạng khác nhau trên một cá thể sinh vật.
- Loại trừ được ảnh hưởng của mối tương tác giữa các alen khác nhau của
một locus hoặc giữa các locus khác nhau lên sự biểu hiện tính trạng.
- Tăng hiệu quả và độ chính xác của chọn lọc đặc biệt đối với những tính
trạng khó biểu hiện ra kiểu hình.
- Số lượng các chỉ thị phân tử là cực kỳ lớn, giúp cho nhà chọn giống phân
biệt được sự sai khác rất nhỏ giữa hai cá thể sinh vật có họ hàng gần nhau, thậm chí
khác nhau chỉ do đột biến nhỏ hoặc do tái tổ hợp, phân biệt được giữa các alen, các
chủng sinh lý gây bệnh.
- Là công cụ hữu hiệu để khẳng định quyền tác giả đối với các loại giống cây
trồng, vật nuôi, phát hiện các loại bệnh di truyền trong y tế, phát hiện tội phạm
1.2.2.2. Những ứng dụng của chỉ thị phân tử
* Phân tích đa dạng di truyền
Nhờ sự ra đời của các loại chỉ thị phân tử đã cung cấp cho các nhà khoa học
một công cụ hữu ích trong việc nghiên cứu di truyền thực vật nói chung cũng như
nghiên cứu đa dạng di truyền, chọn tạo giống thực vật nói riêng. Ưu điểm của trong
phân tích đa dạng di truyền là rút ngắn thời gian chọn lọc đối với các tính trạng
không hoặc khó đánh giá thông qua kiểu hình. Các chỉ thị phân tử thường được sử

dụng để nghiên cứu, xác định mối quan hệ di truyền các cá thể trong cùng một loài
hoặc giữa các loài là cơ sở cho việc phân loại dưới loài, phát hiện loài mới và mối quan
hệ tiến hoá giữa loài. Đặc biệt, nghiên cứu đa dạng di truyền có thể giúp tiên đoán
khả năng cho ưu thế lai giữa các cặp bố mẹ. (Cặp bố mẹ nào có khoảng cách di
truyền xa hơn thường sẽ cho ưu thế lai lớn hơn).
RFLP là một trong những chỉ thị hình thành sớm nhất được sử dụng trong
nghiên cứu đa hình di truyền. Năm 1992 Wangz đã sử dụng chỉ thị RFLP để thiết kế
sơ đồ cây chủng loại phát sinh ở lúa (Wangz et al. 1992). Chỉ thị RAPD đã được
dùng để xác định đa dạng cấu trúc ADN cây họ đậu (Jena et al. 2004). Lưu Minh
Cúc và cộng sự đã sử dụng SSR để khảo sát đa dạng di truyền một số giống lúa nếp
phục vụ cho xây dựng quy trình tính khác biệt của giống lúa hỗ trợ cho khảo
nghiệm DUS (Lưu Minh Cúc, 2010). Chỉ thị phân tử ADN còn được ứng dụng
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 11

trong nghiên cứu sự sai khác ADN giữa các giống đột biến so với các giống gốc ở
thực vật.
* Tìm chỉ thị phân tử liên kết gen và lập bản đồ gen
Một trong những ứng dụng quan trọng của chỉ thị phân tử ADN là tìm chỉ thị
liên kết gen (Gene tagging) và lập bản đồ gen. Chỉ thị ADN cũng cho phép các nhà
chọn giống thực vật đặt chính xác các QTL vào bản đồ phân tử. Bản đồ đối với tính
trạng số lượng (QTL) thường có rất ít thông tin về sự kiểm soát của gen. Nhưng nó
vô cùng quan trọng, vì hầu như các tính trạng chống chịu với điều kiện bất lợi đều
yêu cầu bản đồ QTL. Người ta cần phải quét từ đầu đến cuối bộ genome với những
chỉ thị bao phủ toàn bộ các NST, với mật độ trung bình 10cM giữa 2 chỉ thị. Thông
qua đó, người ta xác định những khu vực giả định có chứa các gen điều khiển tính
trạng số lượng mà ta đang nghiên cứu.
Những chỉ thị được ứng dụng trong chọn giống cây trồng phải liên kết chặt
với gen mục tiêu, trên cơ sở bản đồ di truyền phân tử.
Bản đồ di truyền lúa đầu tiên được thiết lập bởi Nagao và Takashuki năm

1963, gồm 12 nhóm liên kết. Vào những năm 70 của thế kỷ 20, nhiều nhà di truyền
chọn giống đã đề xuất bản đồ di truyền của lúa thiết lập nhờ các thể ba (Trisomic). Sau
đó bản đồ di truyền liên kết ở lúa được thiết lập trên cơ sở các chỉ thị đột biến hình thái
và các chỉ thị izozym (Ishikawa et al, 1991; Wu et al, 1993).
Hiện nay, các nhà khoa học đã xác định có khoảng trên 30 gen chính kháng
bệnh bạc lá, 30 gen kháng đạo ôn, trên 20 gen kháng rầy nâu và một số QTL kháng
đạo ôn và rầy nâu đã được phát hiện. Ngoài ra, nhiều gen và QTL có liên quan đến
các tính trạng khác của cây lúa như chịu ngập, hạn, mặn, chịu độc nhôm, chịu thiếu
phốt-pho, bất dục đực nhân nhậy cảm quang chu kỳ, bất dục đực nhân nhậy cảm
nhiệt độ, gen tương hợp rộng cũng được lập bản đồ phân tử để đưa vào sử dụng
trong chọn giống. Lưu Thị Ngọc Huyền bằng kỹ thuật AFLP để xác định chỉ thị
phân tử liên kết gen kháng rầy nâu ở lúa CR203. Michael J. Thomson đã lập bản đồ
QTL và bằng chỉ thị phân tử và lai trở lại tạo giống lúa chống chịu mặn (Thomson.
2010). Nguyễn Thị Lan Hoa đã sử dụng các chỉ thị SSR cho đa hình lập bản đồ các
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 12

nhóm liên kết genome và xác định vị trí gen kháng bệnh xanh lùn ở cây bông cỏ
(Nguyễn Thị Lan Hoa, 2009).
* Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử
Từ lâu, các nhà chọn giống đã quan tâm đến các chỉ thị hình thái liên kết với
một số tính trạng nông học quan trọng và sử dụng chúng như một phương tiện hữu
ích trong quy trình tạo giống mới. Với chỉ thị hình thái các nhà chọn giống phải
đánh giá kiểu hình của cả một quần thể nhằm phát hiện những cá thể chứa gen
mong muốn.
Mặt khác chỉ thị hình thái vốn có số lượng không nhiều, những chỉ thị liên
kết với gen quan tâm lại càng hiếm gặp vì thế giá trị thực tiễn của chỉ thị hình thái
trong chọn giống gặp nhiều hạn chế. Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ các
nhà chọn giống bắt đầu quan tâm đến vấn đề chọn giống nhờ chỉ thị phân tử và lai
trở lại -MABC) với ý đồ sử dụng các chỉ thị phân tử liên kết với các gen mong

muốn trong chọn tạo giống mới.
Thông thường, trong quy trình chọn tạo giống truyền thống, người ta đưa
nguồn gen mới có tính trạng mong muốn vào 1 giống khác bằng phương pháp lai
trở lại liên tục qua 5-6 thế hệ, hoặc chọn lọc cá thể trong quần thể phân ly từ thế hệ
F
2
đến các thế hệ tiếp theo. Bằng phương pháp này việc đưa gen lặn vào tổ hợp lai,
hoặc du nhập cùng một lúc vài gen mong muốn vào một dòng ưu việt thường gặp
rất nhiều khó khăn hoặc đôi khi không thể thực hiện được (Mohan et al., 1997). Còn
đối với quy trình chọn giống nhờ chỉ thị phân tử, nguồn gen mới nhập được phát
hiện gián tiếp thông qua các chỉ thị phân tử liên kết chặt với những gen đó.
Nguyên lý của phương pháp MABC là (Marker Assisted Backcross) chuyển
một QTL/gen từ dòng cho gen vào dòng nhận gen trong khi chọn lọc sự hội nhập
của dòng cho thông qua phần còn lại của hệ gen. (Thomson et al. 2009; Septiningsih
et al. 2009; Singh et al. 2009). Việc sử dụng các chỉ thị phân tử cho phép khảo sát di
truyền của con lai ở mỗi thế hệ, đẩy nhanh tốc độ của quá trình chọn lọc, vì thế tăng
cường nền di truyền qua mỗi thế hệ. Theo mô hình của (Jung et al. 2010) và
(Collard BCY. 2008) chỉ cần chọn lọc đến thế hệ BC3 thì tỷ lệ gen của cá thể nhận
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 13

có thể đạt 98% hệ gen của các cá thể lai trong quần thể. Từ đó có thể thấy rằng đây
là phương pháp thiết thực, hiệu quả trong việc chuyển locus gen quy định tính
trạng di truyền số lượng (QTL) hay gen vào giống mới đồng thời rút ngắn quá
trình chọn lọc. Ưu điểm chính của phương pháp MABC là: (1) Chọn lọc bằng chỉ
thị phân tử đối với locus gen đích; (2) Chọn lọc nền di truyền đối với hệ gen cây bố
mẹ tái tổ hợp, (3) Tiến gần đến locus quan tâm trên bản đồ liên kết, và (4) Chọn
giống ngẫu nhiên kiểu gen mới với một số tính trạng quan tâm. Hiệu quả của các
sản phẩm MABC sẽ được thể hiện trên đồng ruộng (Singh et al. 2009; Sarkar et al.
2009). Chọn lọc MABC có ba bước khi áp dụng:

* Bước thứ nhất: Sử dụng để chọn lọc trực tiếp locus tính trạng mục tiêu,
những tính trạng rất khó chọn lọc dựa trên kiểu hình hoặc những tính trạng quy
định bởi gen lặn.
* Bước thứ hai: Chọn lọc các chỉ thị nằm về hai phía của gen mục tiêu để
giảm tối thiểu các gen không mong muốn kéo theo, bước này còn gọi là chọn lọc
tái tổ hợp (recombinant selection).
* Bước thứ ba: Chọn lọc bằng chỉ thị phân tử trên các nhiễm sắc thể khác
trên các thế hệ con cái lai trở lại đã chọn lọc tính trạng mục tiêu. Như vậy chọn lọc
lai trở lại nhờ sử dụng chỉ thị phân tử có thể giảm ít nhất là 2 nhưng có thể 3 thậm
chí là 4 thế hệ lai trở lại so với chọn lọc lai trở lại truyền thống.
Trên thế giới có nhiều nước ứng dụng phương pháp MABC trong chọn giống
cây trồng. Từ những năm 90 của thế kỷ trước, Australia đã đưa được các QTL điều
kiển tính trạng hàm lượng lignin thấp vào giống Bạch đàn phát triển nhanh, tạo ra
giống bạch đàn ưu tú cho ngành công nghiệp sản xuất giấy (
Brondani, et al, 1998
).
Tại Thái Lan, một số dự án lớn đã và đang được thực hiện để đưa những gen kháng
bệnh vào giống lúa Jasmine là một giống lúa thơm có thương hiệu, nhằm tạo ra
giống mới Super Jasmine (
Theerayut. 2013)
. IRRI đã thành công trong việc đưa
một số gen chống chịu ở các giống lúa hoang dại vào giống lúa trồng, đã lập bản đồ
chính xác QTL liên kết với tính trạng chịu ngập (Sub1) nằm trên nhiễm sắc thể số 9,
và đã thành công đưa vào 6 giống lúa cho vùng ngập bằng phương pháp chọn
giống nhờ chỉ thị phân tử và lai trở lại. Sáu giống lúa được chuyển gen Sub1 là
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 14

những giống phổ biến được nông dân trồng ở Nam và Đông Nam châu Á; Swarna,
Sambha Mahsuri, IR64, BR11, TDK1 và CR1009, những giống này đã được trồng

với diện tích hàng triệu ha, đạt năng suất từ 1-3,5 tấn/ha trong điều kiện ngập hoàn
toàn trong giai đoạn lúa con gái. Phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử và lai
trở lại (MABC) cũng đã thành công trong việc chọn tạo giống lúa chịu mặn bằng
việc chuyển QTL Saltol có khả năng chịu mặn nằm trên nhiễm sắc thể số 1, và đã
thành công trên ba giống lúa trồng đại trà BR11, BRRI dhan28 và IR64.
Chọn giống bằng chỉ thị phân tử MAS (Marker Assisted Selection): thay vì
phải đánh giá kiểu hình của cả một quần thể nhằm phát hiện những cá thể chứa gen
mong muốn, người ta chỉ cần đi tìm những cá thể riêng biệt mang các chỉ thị hình
thái liên kết với các gen đó. Tuy nhiên các chỉ thị hình thái vốn có số lượng không
nhiều, còn những chỉ thị (liên kết với gen quan tâm) lại càng hiếm gặp, vì thế giá trị
thực tiễn của chỉ thị hình thái trong chọn giống còn gặp nhiều hạn chế (Lưu Minh
Cúc, 2009)
. Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, đặc biệt là chỉ thị
phân tử, các nhà chọn giống bắt đầu quan tâm nhiều hơn tới vấn đề chọn giống nhờ
chỉ thị phân tử MAS (Marker Assisted Selection) với ý đồ sử dụng các chỉ thị phân
tử liên kết với các gen mong muốn trong chọn tạo giống mới. Khi lập bản đồ đa gen
đã nêu ra những ưu thế của chỉ thị phân tử so với chỉ thị hình thái như sau
(Tanksley. 1993):
+ Kiểu gen của các locus chỉ thị phân tử có thể được xác định tại bất kỳ giai
đoạn nào và ở bất cứ mức độ nào: Tế bào, mô hay toàn bộ cơ thể, trong khi kiểu
hình của phần lớn các chỉ thị hình thái chỉ có thể phân biệt được trong những giai
đoạn nhất định và thường ở mức độ toàn bộ cơ thể.
+ Số lượng các chỉ thị phân tử là cực kỳ lớn, trong khi số lượng các chỉ thị
hình thái rất hạn chế (Tạ Hồng
Lĩnh, 2013)
.
+ Các alen khác nhau của chỉ thị phân tử thường không liên kết với các hiệu
ứng có hại, trong khi việc đánh giá các chỉ thị hình thái thường hay đi kèm với
những hiệu ứng kiểu hình không mong muốn.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 15

+ Các alen của các chỉ thị phân tử phần lớn là đồng trội, vì thế cho phép phân
biệt mọi kiểu gen ở bất kỳ thế hệ phân ly nào, còn các alen của các chỉ thị hình thái
thường tương tác theo kiểu trội-lặn, do đó bị hạn chế sử dụng trong nhiều tổ hợp lai.
+ Đối với chỉ thị hình thái, các hiệu ứng lấn át thường làm sai lệch việc đánh
giá các cá thể phân ly ở trong cùng một quần thể phân ly, còn đối với chỉ thị phân
tử, hiệu ứng lấn át hoặc cộng tính rất hiếm gặp (Tạ Hồng
Lĩnh, 2013)
.
Ngày nay, phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử là một phương tiện
hữu hiệu, trợ giúp đắc lực cho chọn giống truyền thống nhằm khắc phục những trở
ngại mà công tác chọn giống truyền thống rất khó giải quyết. Sự phát triển của công
nghệ chỉ thị phân tử đã giải phóng các nhà chọn giống khỏi một lượng lớn công việc
khi phải chọn lọc, phát hiện một lượng ít ỏi những cá thể quan tâm trong số vô vàn
các cá thể khác nhờ việc xác định sự có mặt hay vắng mặt của chỉ thị phân tử liên
kết với những alen đặc hiệu mà không cần đánh giá kiểu hình. Phương pháp này
còn có thể giúp chọn lọc những cá thể mang nhiều tổ hợp gen cần thiết và loại bỏ
các nhiễu do các tương tác trong cùng alen hay giữa các alen gây ra - những tương
tác này thường không thể phát hiện được bằng các phân tích kiểu hình. Phương
pháp này đặc biệt hiệu quả trong trường hợp cần đưa gen lặn hoặc thậm chí đưa
cùng lúc nhiều gen khác nhau vào một nền gen ưu việt.
Như vậy, chỉ thị phân tử làm tăng thêm hiệu quả sàng lọc trong các chương
trình chọn giống nhờ cung cấp thêm:
+ Khả năng chọn lọc ngay từ giai đoạn cây con đang nẩy mầm trong khi
nhiều dấu hiệu biểu hiện chỉ có thể sàng lọc khi chúng được biểu hiện ở những giai
đoạn muộn hơn trong quá trình sống nếu chỉ sử dụng phương pháp chọn giống
truyền thống (ví dụ: Chất lượng quả và hạt, tính bất dục đực, khả năng phản ứng
chu kỳ quang).
+ Khả năng sàng lọc những dấu hiệu mà việc đánh giá các đặc tính này khó

khăn, đắt tiền, tốn thời gian (ví dụ như hình thái rễ, tính kháng hay nhiễm đối với
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 16

các dịch hại hoặc đối với những nòi, những bệnh đặc hiệu, hay tính chống chịu
những điều kiện gây sốc sinh học như hạn, mặn, các chất độc).
+ Khả năng phân biệt trạng thái đồng hợp hay dị hợp của nhiều locus trong
cùng một thế hệ mà không cần kiểm tra thế hệ sau.
+ Khả năng chọn lọc đồng thời vài đặc tính trong cùng một thời gian, do vậy
mà có thể đưa vào cùng lúc vài gen có giá trị về mặt nông học, ví dụ đưa vào cùng
một lúc nhiều gen kháng dịch hại khác nhau.
Trong những năm gần đây, các nhà khoa học đã đưa ra các phương pháp
luận và phân tích cặn kẽ một vài mô hình MAS. Theo một số mô hình thì chỉ cần
tiến hành lai trở lại qua 4 thế hệ, chứ không cần đến 6 thế hệ, ngay cả khi quần thể
chọn giống có kích thước nhỏ và các dữ liệu về chỉ thị phân tử bị hạn chế (
Frisch
etal . 1999; Hospital etal. 1992).
Trong một số trường hợp thuận lợi, đôi khi các
nhà chọn giống chỉ cần lai trở lại 3 thế hệ là có thể đạt được mục tiêu của mình.
Để đánh giá các giống lúa có mùi thơm Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu đã
nghiên cứu di truyền mùi thơm trên lúa và nhận thấy rằng gen mùi thơm được kiểm
soát bởi một gen lặn và chỉ thị ADN liên kết với gen mùi thơm từ đó có thể phát hiện
thể đồng hợp tử và dị hợp tử ngay từ thế hệ ban đầu. (Nguyễn thị Lang và cs, 2004).
Lưu Thị Ngọc Huyền đã dùng chỉ thị SSR để tạo giống lúa thuần kháng rầy
nâu cho ĐBSH và ĐBSCL (Lưu Thị Ngọc Huyền, 2010). Lã tuấn Nghĩa cũng sử
dụng chỉ thị SSR để tạo giống lúa kháng bệnh đạo ôn có năng suất chất lượng cao
(Lã Tuấn Nghĩa, 2011).
1.3. Những nghiên cứu chọn tạo giống lúa năng suất
1.3.1. Trên thế giới
Một trong những ứng dụng quan trọng của chỉ thị phân tử là xác định chỉ thị

phân tử liên kết QTL/gen và lập bản đồ QTL/gen. Với sự ra đời của hàng loạt các
kỹ thuật chỉ thị phân tử đã cho phép xác định những QTL liên kết đến các tính trạng
nông sinh học, yếu tố cấu thành năng suất. Nghiên cứu xác định chỉ thị phân tử và
lập bản đồ QTL/gen điều khiển một tính trạng năng suất hay yếu tố cấu thành năng
suất là một việc làm khó vì năng suất hay yếu tố cấu thành năng suất là tính trạng di