khảo sát sự thay đổi hàm lượng của doxycycline trong huyết tương gia cầm theo thời gian bằng phương pháp hplc

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA HỌC TỰ NHIÊN
  





NGUYỄN VĂN NHỚ

KHẢO SÁT SỰ THAY ĐỔI HÀM LƯỢNG CỦA
DOXYCYCLINE TRONG HUYẾT TƯƠNG GIA CẦM
THEO THỜI GIAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH HÓA DƯỢC




Cần thơ, 2013
Luận văn tốt nghiệp đại học

SVTH: Nguyễn Văn Nhớ Hóa Dược K36
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
BỘ MÔN HÓA HỌC

NGUYỄN VĂN NHỚ


KHẢO SÁT SỰ THAY ĐỔI HÀM LƯỢNG CỦA
DOXYCYCLINE TRONG HUYẾT TƯƠNG GIA CẦM
THEO THỜI GIAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH HÓA DƯỢC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
TS. NGUYỄN TRỌNG TUÂN



Cần thơ, 2013
Luận văn tốt nghiệp đại học

SVTH: Nguyễn Văn Nhớ Hóa Dược K36
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Năm học 2013-2014
Đề tài: “Khảo sát sự thay đổi hàm lượng của doxycycline trong huyết tương
gia cầm theo thời gian bằng phương pháp HPLC”
LỜI CAM ĐOAN
Tôi tên là Nguyễn Văn Nhớ, là tác giả của Luận văn xin xác nhận đã chỉnh sửa
hoàn chỉnh theo những ý kiến và góp ý của các Thầy, Cô phản biện và Hội đồng

chấm bảo vệ luận văn.
Cần thơ, ngày 25 tháng 12 năm 2013

Nguyễn Văn Nhớ

Luận văn tốt nghiệp đại học
Chuyên ngành: Hóa Dược
Đã bảo vệ và được duyệt
Hiệu trưởng:………………………….
Trưởng Khoa:………………………….
Trưởng Chuyên ngành Cán bộ hướng dẫn

TS. Nguyễn Trọng Tuân
Luận văn tốt nghiệp đại học
SVTH: Nguyễn Văn Nhớ

Hóa Dược K36

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT
NAM
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN Độc lập - Tự Do - Hạnh phúc
BỘ MÔN HÓA HỌC   

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
1. Cán bộ hướng dẫn: TS. Nguyễn Trọng Tuân
2. Đề tài: Khảo sát sự thay đổi hàm lượng của doxycycline trong huyết
tương gia cầm theo thời gian bằng phương pháp HPLC.
3. Sinh viên thực hiện: Nguyễn Văn Nhớ

MSSV: 2102468 Lớp: Hóa Dược – Khóa 36
4. Nội dung nhận xét:
a. Nhận xét về hình thức luận văn tốt nghiệp:


b. Nhận xét về nội dung luận văn tốt nghiệp:


c. Nhận xét đối tượng sinh viên tham gia thực hiện đề tài:


d. Kết luận, đề nghị, điểm:


Cần thơ, ngày… tháng… năm 2013
Cán bộ chấm hướng dẫn
Luận văn tốt nghiệp đại học
SVTH: Nguyễn Văn Nhớ

Hóa Dược K36

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT
NAM
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN Độc lập - Tự Do - Hạnh phúc
BỘ MÔN HÓA HỌC   

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN
1. Cán bộ phản biện:

2. Đề tài: Khảo sát sự thay đổi hàm lượng của doxycycline trong huyết
tương gia cầm theo thời gian bằng phương pháp HPLC.
3. Sinh viên thực hiện: Nguyễn Văn Nhớ
MSSV: 2102468 Lớp: Hóa Dược – Khóa 36
4. Nội dung nhận xét:
a. Nhận xét về hình thức luận văn tốt nghiệp:


b. Nhận xét về nội dung luận văn tốt nghiệp:


c. Nhận xét đối tượng sinh viên tham gia thực hiện đề tài:


d. Kết luận, đề nghị, điểm:


Cần thơ, ngày… tháng… năm 2013
Cán bộ chấm phản biện
Luận văn tốt nghiệp đại học
SVTH: Nguyễn Văn Nhớ

Hóa Dược K36

Luận văn tốt nghiệp đại học
SVTH: Nguyễn Văn Nhớ

i

Hóa Dược K36

LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô đặc biệt là thầy cô bộ môn hóa
học, Khoa Khoa Học Tự Nhiên, trường Đại Học Cần Thơ, các Thầy, Cô đã truyền
đạt tận tình cho em kiến thức và những kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian
em theo học tại trường.
Em xin chân thành cảm ơn Cô, Chú, Anh, Chị công tác tại Trung Tâm R&D
đã giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo công ty Vemedim đã chấp nhận và
tạo điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành luận văn này.
Một lần nữa em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với gia đình đã động
viên giúp đỡ con thực hiện luận văn này. Cùng tất cả các bạn sinh viên ngành Hóa
dược, Khoa Khoa Học Tự Nhiên, trường Đại Học Cần Thơ đã hỗ trợ nhiệt tình và
giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.
Em xin chân thành cảm ơn!



Cần thơ, ngày tháng năm 2013
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Văn Nhớ
Luận văn tốt nghiệp đại học
SVTH: Nguyễn Văn Nhớ

ii

Hóa Dược K36

TÓM TẮT

Đối với mỗi loại dược phẩm thì việc xác định các chỉ số dược động học rất
cần thiết. Đề tài “Khảo sát sự thay đổi hàm lượng của doxycycline trong huyết
tương gia cầm theo thời gian bằng phương pháp HPLC” được thực hiện nhằm
xác định hàm lượng doxycycline trong huyết tương gia cầm sau khi sử dụng
thuốc. Từ đó tạo cơ sở khoa học sử dụng doxycycline đúng, hợp lý, an toàn và
hiệu quả. Đề tài được thực hiện bằng phương pháp chiết pha rắn SPE và sau đó
được định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC.
Qua quá trình thực hiện đề tài đã thu được các kết quả: xác định được hiệu
suất thu hồi của phương pháp chiết SPE, H% = 96,7%, giá trị LOD = 0,18,
LOQ = 0,6, RSD = 6,18, R = 0,999 của phương pháp HPLC.
Nồng độ doxycycline trong huyết tương đạt mức cao nhất ở thời điểm 2 giờ
sau khi sử dụng thuốc và sau 48 giờ vẫn còn tồn tại trong máu nên cần chú ý đến
thời gian ngưng sử dụng thuốc trước khi giết.
Từ khóa: HPLC, SPE, doxycycline.
Luận văn tốt nghiệp đại học
SVTH: Nguyễn Văn Nhớ

iii

Hóa Dược K36

ABSTRACT

For each drug, the determination of pharmacokinetic indices are necessary.
The project “Survey changes in content of plasma doxycycline birds over time by
HPLC method” was implemented in order to determine the concentration of
doxycycline in plasma of poultry after use drug. From that point, we create a true,
reasonable, safe and effective scientific basis of using doxycycline. The topic is
performed by using Solid Phase Extraction method and quantified by High

Performance Liquid Chromatography.
The results of the topic are: determining the efficiency of recovery of the
SPE extraction method, H% = 96.7%, the values of LOD = 0,18, LOQ = 0,6,
RSD = 6,18, R = 0,999 of the HPLC method.
The concentration of Doxycycline in plasma is peak at 2 hours after using
drugs and still exists in the blood after 48 hours. Therefore, we need to pay
attention to the time of discontinuation of using drugs before killing.
Key words: HPLC, SPE, doxycycline.
Luận văn tốt nghiệp đại học
SVTH: Nguyễn Văn Nhớ

iv

Hóa Dược K36

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan kết quả luận văn này được hoàn thành dựa trên kết quả nghiên
cứu thực nghiệm của tôi và các kết quả nghiên cứu này chưa được dung cho bất
kì luận văn cùng cấp nào.
Cần Thơ, ngày …tháng…năm 2013
Sinh viên cam đoan

Nguyễn Văn Nhớ
Luận văn tốt nghiệp đại học
SVTH: Nguyễn Văn Nhớ

v

Hóa Dược K36

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN i
TÓM TẮT ii
ABSTRACT iii
LỜI CAM ĐOAN iv
MỤC LỤC v
DANH MỤC HÌNH vii
DANH MỤC BẢNG viii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮC ix

Chương 1. MỞ ĐẦU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục tiêu đề tài 1
1.3 Nội dung đề tài 2

Chương 2. TỔNG QUAN 3
2.1 Sơ lược về doxycycline 3
2.1.1 Cấu tạo 3
2.1.2 Tính chất 3
2.1.3 Phương pháp xác định 5
2.2 Phương pháp chiết tách 6
2.2.1 Chuẩn bị mẫu phân tích 6
2.2.2 Một số phương pháp chiết tách 7
2.3 Phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 16
2.3.1 Lịch sử phát triển HPLC 16
2.3.2 Khái niệm và nguyên tắc hoạt động của HPLC 17
2.3.3 Phân tích định tính 22
2.3.4 Phân tích định lượng 22
2.3.5 Hiệu suất thu hồi 25

2.3.6 Xác định RSD, LOD, LOQ . 25
2.3.7 Các thông số đặc trưng trong sắc ký lỏng hiệu năng cao 27
2.3.8 Ứng dụng của sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 28

Chương 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29
3.1 Phương tiện nghiên cứu 29
3.1.1 Thiết bị 29
3.1.2 Dụng cụ 29
3.1.3 Hóa chất 29
3.2 Thực nghiệm 29
3.2.1 Địa điểm tiến hành 29
3.2.2 Bố trí thí nghiệm và lấy mẫu 29
3.2.3 Khảo sát tính tuyến tính theo nồng độ của doxycycline 31
Luận văn tốt nghiệp đại học
SVTH: Nguyễn Văn Nhớ

vi

Hóa Dược K36

3.2.4 Xác định hiệu suất thu hồi 33
3.2.5 Khảo sát sự thay đổi hàm lượng doxycycline trong huyết tương
gia cầm theo thời gian 35

Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37
4.1 Kết quả khảo sát tính tuyến tính theo nồng độ của doxycycline 37
4.2 Kết quả tính hiệu suất thu hồi 38
4.3 Kết quả khảo sát sự thay đổi hàm lượng doxycycline trong
huyết tương gia cầm theo thời gian 39
4.3.1 Mẫu tiêm (IM 10) 39

4.3.2 Mẫu uống (PO 10, PO 20, PO 30) 41
Chương 5. KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 49
Kết luận 49
Kiến nghị 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO 51
PHỤ LỤC 54
Luận văn tốt nghiệp đại học
SVTH: Nguyễn Văn Nhớ

vii

Hóa Dược K36

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Công thức cấu tạo doxycycline 3
Hình 2.2 Sơ đồ chiết Soxhlet 9
Hình 2.3 Hình dạng cột SPE 11
Hình 2.4 Cấu tạo bộ chiết SPE 12
Hình 2.5 Các bước tiến hành kỹ thuât chiết SPE 14
Hình 2.6 Hệ thống HPLC 18
Hình 2.7 Đồ thị phương pháp ngoại chuẩn 23
Hình 3.1 Trại thử nghiệm, công ty Vemedim, quận Ô Môn, TP.Cần Thơ 30
Hình 3.2 Lấy mẫu máu từ trại thực nghiệm 31
Hình 3.3 Cân phân tích 4 số 32
Hình 3.4 Hệ thống HPLC 33
Hình 3.5 Quy trình chiết doxycycline bằng phương pháp SPE 34
Hình 3.6 Hệ thống máy cô quay chân không 35
Hình 3.7 Máy siêu âm 35
Hình 4.1 Đồ thị biểu diễn phương trình đường chuẩn của doxycycline 37

Hình 4.2 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của nồng độ doxycycline
trong huyết tương theo thời gian mẫu IM 10. 40
Hình 4.3 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của nồng độ doxycycline
trong huyết tương theo thời gian mẫu PO 10. 42
Hình 4.4 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của nồng độ doxycycline
trong huyết tương theo thời gian mẫu PO 20 44
Hình 4.5 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của nồng độ doxycycline
trong huyết tương theo thời gian mẫu PO 30 46
Hình 4.6 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của nồng độ doxycycline trong
huyết tương theo thời gian mẫu: IM 10 , PO 10, PO 20 và PO 30. 47


Luận văn tốt nghiệp đại học
SVTH: Nguyễn Văn Nhớ

viii

Hóa Dược K36

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1 Các chất hấp phụ dùng trong kỹ thuật chiết pha rắn 13
Bảng 2.2 Các dung môi thường dùng trong chiết pha rắn
có tính phân cực tăng dần dựa vào hằng số điện môi. 16
Bảng 3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 30
Bảng 4.1 Kết quả xây dựng đường chuẩn của doxycycline. 37
Bảng 4.2 Kết quả SD, RSD, LOD, LOQ của doxycycline từ đường chuẩn 38
Bảng 4.3 Kết quả phân tích hiệu suất thu hồi 38
Bảng 4.4 Kết quả phân tích hàm lượng doxycycline trong huyết tương
gia cầm mẫu IM 10 39
Bảng 4.5 Kết quả phân tích hàm lượng doxycycline trong huyết tương

gia cầm mẫu PO 10 41
Bảng 4.6 Kết quả phân tích hàm lượng doxycycline trong huyết tương
gia cầm mẫu PO 20 43
Bảng 4.7 Kết quả phân tích hàm lượng doxycycline trong huyết tương
gia cầm mẫu PO 30 45
Luận văn tốt nghiệp đại học
SVTH: Nguyễn Văn Nhớ

ix

Hóa Dược K36

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Ký hiệu Tên
ACN Acetonitrile
EDTA Etilendiamin tetraacetic axit
GC Gas Chromatography
HPLC
High performance liquid
chromatography
LC Liquid Chromatography
LOD Limit of detection
LOQ Limit of quantitation
Mẫu PT Mẫu phân tích
Mẫu T Mẫu trắng
MeOH Methanol
ppm Parts Per milion
RSD Relative Standard Deviation
SD Standard Deviation
SPE Solid phase extraction

SPME
Solid Phase Micro
Extraction
TFA Trifluoroacetic acid
THF Tetra Hidro Furan
TLC Think layer chromatography
TT Thể trọng
UV-VIS Ultraviolet-

Visible
Luận văn tốt nghiệp đại học
SVTH: Nguyễn Văn Nhớ

1

Hóa Dược K36

Chương 1. MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Hiện nay ở nước ta, việc nghiên cứu sinh dược học của thuốc là một lĩnh
vực tương đối mới, đang ngày càng được quan tâm. Một trong những vấn đề đánh
giá sinh dược học của thuốc là mức độ hấp thu thuốc và nồng độ thuốc đạt được
trong huyết tương. Thuốc kháng sinh được sử dụng ngày càng nhiều vào các mục
đích: phòng, trị bệnh cho người và vật nuôi. Tuy nhiên trong chăn nuôi, do thiếu
hiểu biết, người chăn nuôi đã sử dụng thuốc kháng sinh trong điều trị chưa đúng
nguyên tắc, không có cơ sở khoa học dẫn đến những hậu quả nghiêm trọng như:
- Tạo sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh, giảm hiệu lực của thuốc,
gây khó khăn cho công tác phòng và điều trị.
- Ngoài việc có thể gây độc hại cho gia súc, thuốc kháng sinh còn tồn lưu

trong thịt, trứng, sữa ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm chăn nuôi
và gây hại cho sức khoẻ người tiêu dùng.
Trong số rất nhiều các loại kháng sinh đang lưu hành trên thị trường,
doxycycline là loại thuốc kháng sinh thuộc nhóm tetracycline có hoạt phổ kháng
khuẩn rộng đang được sử dụng rộng rãi trong việc phòng trị bệnh cho vật nuôi,
đặc biệt ở gia súc gia cầm.
Vấn đề đặt ra là tồn dư của kháng sinh trong gia súc gia cầm ảnh hưởng xấu
đến sức khoẻ cộng đồng và môi trường, là một trong những nguyên nhân gây
bệnh cho con người và làm tăng nguy cơ xuất hiện nguồn gen kháng thuốc ở các
chủng vi sinh vật, đặc biệt vi sinh vật gây bệnh. Xuất phát từ nhu cầu trên của
thực tiễn, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Khảo sát sự thay đổi hàm lượng của
doxycycline trong huyết tương gia cầm theo thời gian bằng phương pháp
HPLC” với sự giúp đỡ của Công ty Cổ Phần sản xuất Kinh Doanh Vật Tư và
Thuốc Thú Y (Vemedim).
Doxycycline là một kháng sinh thuộc nhóm tetracyclin có sức mạnh tiêu
diệt được cả vi khuẩn gram (-) và gram (+). Nó nhạy cảm với vi khuẩn kỵ khí và
vi khuẩn đường ruột nên được dùng để điều trị bệnh nhiễm trùng ruột, nó có ưu
điểm đặc biệt là nó không gây nhiễm độc gan mạnh cho người dùng.
1.2. Mục tiêu đề tài
Khảo sát sự thay đổi hàm lượng của doxycycline trong huyết tương gia cầm
theo thời gian bằng phương pháp HPLC.
Xác định hàm lượng thuốc trong huyết tương gia cầm sau khi tiêm thuốc.
Từ đó tạo cơ sở khoa học sử dụng doxycycline đúng, hợp lý, an toàn và hiệu quả.
Luận văn tốt nghiệp đại học
SVTH: Nguyễn Văn Nhớ

2

Hóa Dược K36

1.3. Nội dung đề tài
Phân tích định tính
Dựa vào HPLC để phân tích định tích doxycycline dựa vào thời gian lưu của
mẫu thử và mẫu chuẩn.
Phân tích định lượng
Xây dựng đường chuẩn.
Tính toán hiệu suất thu hồi.
Xác định giới hạn phát hiện (LOD).
Xác định giới hạn định lượng (LOQ).
Tiến hành định lượng doxycycline trong huyết tương của các mẫu tiêm
(IM 10) và mẫu uống (PO 10, PO 20, PO 30) ở những khoảng thời gian khác
nhau.
Luận văn tốt nghiệp đại học
SVTH: Nguyễn Văn Nhớ

3

Hóa Dược K36

CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN


2.1 Sơ lược về doxycycline
2.1.1 Cấu tạo
Công thức phân tử:
C
22
H
24
N

2
O
8
,H
2
O
Khối lượng phân tử: 462.5 g/mol.
Công thức cấu tạo:

OH
OH
OH
OH
CONH
2
O O
N(CH
3
)
2
OH
CH
3
H
D
C
B
A
1
2

3
4
4a
5
5a
11a
12
12a
6
7
8
9
10
11
H


Hình 2.1 công thức cấu tạo doxycycline
Tên hóa học: (4S,4aR,5S,5aR,6R,12aS) – 4 – dimethylamino-
1,4,4a,5,6,11,12a-octahydro-3,5,10,12,12a-pentahydroxy -6α-methyl-1,11-dioxo-
2-naphtacen carboxamid.
Tên khác: 6-deoxy-5-oxytetracycline.
2.1.2 Tính chất [1], [2]
2.1.2.1 Tính chất vật lý
Doxycycline dạng bột tinh thể màu vàng, có vị đắng.
Tan rất ít trong nước nhưng tan nhiều trong acid loãng hoặc trong hydroxyd
kiềm loãng và tan vừa phải trong ancol, không tan trong cloroform và ether.
Nhiệt độ nóng chảy 201
o
C.

Nhiệt độ sôi 685,2
o
C.
2.1.2.2 Tính chất hóa học
Phát huỳnh quang trong môi trường kiềm.
Nhóm dimethylamin ở vị trí 4 tạo nên tính kiềm. Cũng như các kháng sinh
thuộc họ tetracycline khác thì khi kết hợp với các ion hóa trị 2 và 3 (Fe
3+
, Cu
2+
,
Fe
2+
, Co
2+
, Zn
2+
) cho ra phức chelate không tan, kém hấp thu qua ruột.
Cho phản ứng tạo màu với Fe
3+
.
Luận văn tốt nghiệp đại học
SVTH: Nguyễn Văn Nhớ

4

Hóa Dược K36

Dược động học [3]
Hấp thu: Doxycyclin được hấp thu tốt qua đường tiêu hóa (95% liều uống),

nồng độ huyết tương tương đương khi uống hoặc tiêm doxycyclin. Vì các
tetracyclin dễ phức hợp với các cation hóa trị 2 hoặc hóa trị 3, như calci, magnesi,
nhôm, nên các thuốc có chứa các cation nói trên, cũng như thức ăn và sữa có chứa
calci đều làm ảnh hưởng đến hấp thu doxycyclin.
Phân bố: Doxycyclin phân bố rộng trong cơ thể vào các mô và dịch tiết,
gồm cả nước tiểu và tuyến tiền liệt. Thuốc tích lũy trong các tế bào lưới - nội mô
của gan, lách, và tủy xương, và trong xương, ngà răng, và men răng chưa mọc.
Chuyển hóa: Có thể uống doxycyclin 2 lần/ngày, vì thuốc có thời gian bán
thải dài (15 - 20 giờ). Phần lớn các tetracyclin thải trừ chủ yếu qua thận, mặc dù
tetracyclin cũng được tập trung ở gan và thải trừ qua mật vào ruột, và chúng lại
được tái hấp thu một phần qua sự tái tuần hoàn ruột - gan. Có sự khác biệt quan
trọng trong trường hợp doxycyclin là doxycyclin không thải trừ giống như các
tetracyclin khác, mà thải trừ chủ yếu qua phân, thứ yếu qua nước tiểu (qua thận),
và không tích lũy nhiều như các tetracyclin khác ở người suy thận, do đó là một
trong những tetracyclin an toàn nhất để điều trị nhiễm khuẩn ở người bệnh này.
Tác dụng: Doxycycline là kháng sinh phổ rộng có tác dụng kìm khuẩn,
thuốc ức chế vi khuẩn tổng hợp protein đồng thời thuốc có thể gây thay đổi ở
màng bào tương, doxycycline có phạm vi kháng khuẩn rộng với vi khuẩn ưa khí
và kỵ khí, gram âm và gram dương và cả một số vi khuẩn kháng thuốc tác dụng
với màng tế bào như: Rickettsia, Coxiella burnetii, Mycoplasma pneumoniae,
Mycobacterium,…
Doxycycline không có tác dụng trị nấm lâm sàng, trong các tetracycline thì
doxycycline ít độc với gan hơn.
Chỉ định: Doxycycline được chỉ định trong các trường hợp sau: Viêm phổi,
nhiễm khuẩn đường hô hấp (viêm họng, viêm amidan, viêm xoang, viêm tai giữa,
viêm phế quản,…), nhiễm khuẩn đường tiết niệu (viêm thận-bể thận, viêm bàng
quan, viêm niệu đạo,…), nhiễm khuẩn da và mô mềm (chốc lỡ, mụn nhọt, viêm
mô tế bào, nhiễm khuẩn vết thương…), nhiễm khuẩn đường tiêu hóa.
Chống chỉ định: Chống chỉ định với bệnh nhân mẫn cảm với bất kì một
tetracycline nào. Do việc sử dụng các thuốc nhóm tetracycline trong quá trình

phát triền của răng có thể gây biến màu răng vĩnh viễn và thuốc có thể gắn vào và
ảnh hưởng đến sự phát triển của xương nên không dùng cho phụ nữ mang thai,
trẻ em dưới 8 tuổi.
Luận văn tốt nghiệp đại học
SVTH: Nguyễn Văn Nhớ

5

Hóa Dược K36

2.1.3 Phương pháp xác định [1], [4]
2.1.3.1 Định tính
Theo phương pháp hóa học: Cho doxycycline phản ứng với acid sulfuric
đậm đặc thì thấy xuất hiện kết tủa màu vàng. Sau đó cho phản ứng với dung dịch
kẽm clorid 50% chuyển sang mất màu.
Phản ứng phát huỳnh quang: Hòa tan chế phẩm trong dung dịch NaOH
loãng, thấm lên giấy lọc, sấy ở 60
o
C, soi UV 360 nm phát hiện vết có màu vàng.
Sắc ký lớp mỏng
Tiến hành sắc ký với các điều kiện:
Hệ dung môi : Nước - methanol - dicloromethan (6 : 35 : 59).
Dung dịch thử: Lấy một lượng mẫu thử có chứa doxycycline hòa tan trong
dung môi và lọc, thu được dung dịch thử.
Dung dịch đối chiếu: Hoà tan 1 mg doxycyclin hyclate cho vào bình định
mức 10 mL, định mức tới vạch bằng acetonitrile.
Cách tiến hành: Chấm riêng biệt 1 µL mỗi dung dịch trên lên bản mỏng. Sau
khi triển khai dung môi đi được khoảng 15 cm, lấy bản mỏng ra để khô ở nhiệt độ
phòng. Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 365 nm.
Vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải phù hợp với vết chính trên

sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu về vị trí màu sắc và kích thước.
Đo vị trí các vết và vị trí mực dung môi di chuyển được rồi tính giá trị R
f

của từng vết. So sánh R
f
của vết bên dung dịch chuẩn và vết bên dung dịch mẫu
để xác định xem trong mẫu có chứa chất cần phân tích hay không.
b
a
R
f


a: Đoạn đường di chuyển của chất phân tích.
b: Đoạn đường di chuyển của pha động.
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Nguyên tắc phân tích định tính của phương pháp là: so sánh thời gian lưu
của các peak trong mẫu phân tích với thời gian lưu của các peak trong mẫu chuẩn.
2.1.3.2 Định lượng [4]
Phương pháp HPLC
Dung dịch chuẩn gốc 1000 ppm: Cân chính xác 10.6 mg doxycyclin hyclate
chuẩn đã cho vào bình định mức 10 mL, thêm 6 mL ACN, lắc siêu âm cho tới khi
hoà tan hoàn toàn thêm ACN tới vạch, lắc đều.
Luận văn tốt nghiệp đại học
SVTH: Nguyễn Văn Nhớ

6

Hóa Dược K36

Dung dịch chuẩn 10 ppm: Hút 1mL dung dịch chuẩn gốc cho vào bình định
mức 100 ml, thêm pha động tới vạch, lắc đều.
Dung dịch thử: Cân một lượng chất thử, chuyển vào trong bình định mức
100 mL. Thêm khoảng 75 mL dung môi pha loãng, trộn đều và lắc siêu âm cho
tới khi tan hoàn toàn, thêm dung môi vừa đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc
0,45 µm.
Điều kiện sắc ký:
Cột: RP – C18 Gemini Phenomenex 250 x 4.6 mm, 5 µm.
Pha động: ACN: MeOH: TFA 0,15% (23:25:52).
Detector UV 225 nm.
Tốc độ dòng: 1 mL/phút.
Thể tích tiêm: 20 µL.
Cách tiến hành:
Tiến hành sắc ký lần lượt với dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Ghi lại sắc
ký đồ của doxycyclin.
Tính hàm lượng doxycyclin, có trong mẫu dựa vào diện tích peak thu được
trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn và dung dịch thử.
Ngoài ra còn có các phương pháp để xác định doxycycline như: Phương
pháp đo huỳnh quang, phương pháp so màu, phương pháp định lượng trong môi
trường khan…
2.2 Phương pháp chiết tách
2.2.1 Chuẩn bị mẫu phân tích [5],[6]
Chuẩn bị mẫu là công việc cần thiết cho quá trình phân tích nhằm tách các
chất cần xác định ra khỏi mẫu. Công việc này rất quan trọng vì nó ảnh hưởng trực
tiếp kết quả phân tích.
Yêu cầu chung của quá trình chuẩn bị mẫu:
- Dụng cụ phải sạch không bị nhiễm bẩn.
- Dung môi chiết tách phải tinh khiết không lẫn tạp chất.
- Không làm nhiễm mẫu.

- Không đưa chất khác vào gây ảnh hưởng đến kết quả phân tích.
- Làm giàu mẫu một cách thích hợp.
Mẫu phải được lấy theo một quy trình lấy mẫu đã được ban hành của phòng
thí nghiệm, người lấy mẫu phải được huấn luyện phương pháp lấy mẫu và đồng
thời mẫu được lấy phải có khối lượng lớn hơn khối lượng mẫu cần phân tích và
lấy đúng theo yêu cầu.
Luận văn tốt nghiệp đại học
SVTH: Nguyễn Văn Nhớ

7

Hóa Dược K36

2.2.2 Một số phương pháp chiết tách [7],[8]
2.2.2.1 Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng (Liquid – liquid extraction)
Nguyên tắc cơ bản của quá trình chiết lỏng – lỏng là sự phân bố của một
chất tan vào hai pha lỏng, hai pha này không hòa tan vào nhau.
Khi thêm một cấu tử thứ ba vào hệ dung môi có hai cấu tử không tan hoàn
toàn vào nhau hoặc tan có giới hạn thì sự hòa tan của cấu tử này vào hai cấu tử
kia theo một tỉ lệ nhất định ở một nhiệt độ nhất định gọi là hằng số phân bố
Nernst K.




Trong đó:
 C
a
: là nồng độ của chất tan trong pha (a).
 C

b
: là nồng độ của chất tan trong pha (b).
 S
a
,S
b
: là độ tan của hai cấu tử.
Hằng số phân bố của một chất cho biết khả năng hòa tan của chất đó với hai
pha lỏng không hòa tan vào nhau tại thời điểm cân bằng, hệ số phân bố của một
chất ít thay đổi theo nhiệt độ và nồng độ của chất đó trong dung dịch ban đầu, tuy
nhiên nó phụ thuộc nhiều vào dung môi (độ phân cực, tính ưa nước…), pH, lực
ion…
Chiết lỏng – lỏng là một kỹ thuật tách đơn giản nhất được sử dụng để làm
sạch hoặc tách một cấu tử riêng hoặc một loại cấu tử khỏi mẫu. Mẫu rắn hoặc
lỏng được chiết bằng dung môi thích hợp. Sự lựa chọn dung môi chiết phụ thuộc
vào tính tan của chất phân tích ở trong dung môi đó và phụ thuộc vào sự dễ dàng
tách được chất cần tách ra khỏi mẫu.
Quá trình chiết lỏng-lỏng được tiến hành theo 3 bước:
Bước 1: Cho dung môi thích hợp tiếp xúc với dung dịch chứa chất phân tích.
Bước 2: Phân tách thành hai pha: dịch chiết và dịch bã.
Bước 3: Tách và thu hồi dung môi chiết từ hai pha dịch chiết và dịch bã.
Sự làm giàu chất và hiệu quả của phương pháp chiết phụ thuộc tỉ số thể tích
của mẫu và dung môi chiết, phụ thuộc hệ số phân bố của chất cần phân tích trong
dịch chiết và dịch bã. Tỷ lệ thể tích của mẫu và dung môi không thể lấy quá rộng
vì nó ảnh hưởng đến độ chính xác khi định lượng. Hệ số phân bố có thể cải thiện
nhờ thay đổi pH mẫu, khử muối…
b
a
b
a

S
S
C
C
K 
Luận văn tốt nghiệp đại học
SVTH: Nguyễn Văn Nhớ

8

Hóa Dược K36

Ưu điểm [9]
Được ứng dụng rất có hiệu quả vào các mục đích tách, phân li, làm giàu các
chất, đặc biệt khi cần tách một lượng rất nhỏ các tạp chất ra khỏi một lượng lớn
các chất khác. Ưu điểm lớn nhất của phương pháp là quá trình thực hiện nhanh.
Thông thường là vài phút là có thể thực hiện được một phép chiết. Các thiết bị
chiết lại rất đơn giản, khi tiến hành chiết, trừ phiễu chiết, thường người ta không
đòi hỏi thiết bị gì thêm.
Nhược điểm [7]
Là do phải lắc bình lóng nhiều lần nên ở những lần chiết sau dung môi trong
bình lóng tạo nhũ tương, gây khó khăn trong việc tách pha thành hai lớp. Sử dụng
một lượng lớn dung môi và chỉ sử dụng dung môi không trộn lẫn nên việc lựa
chọn dung môi rất khó khăn, thao tác thí nghiệm phức tạp và hiệu suất làm giàu
không cao.
2.2.2.2 Kỹ thuật chiết rắn - lỏng
Chiết rắn-lỏng là quá trình phân bố các chất tan giữa hai pha lỏng và rắn.

Được áp dụng để tách các chất phân tích ra khỏi mẫu vật rắn như thực vật, đất,
các mẫu sinh học,… bằng dung môi thích hợp. Các chất phân tích trong mẫu rắn

thường nằm ở thành nang nhỏ hoặc phân tán trong chất rắn, vì vậy cần nghiền
nhỏ để tăng bề mặt tiếp xúc giữa dung môi và chất phân tích. Tùy vào thuộc tính
phân cực của chất cần tách mà lựa chọn dung môi chiết phù hợp.
a. Chiết bằng phương pháp xay trộn với dung môi [7]
Áp dụng đối với mẫu rau cải, thịt cá. Dung môi phải đi sâu được vào nền
mẫu vì vậy cần xay nhuyễn mẫu để tạo diện tích tiếp xúc lớn giữa mẫu và dung
môi. Sau đó, dùng dung môi thích hợp để hòa tan chất phân tích. Mục đích của
quá trình này là tách chất phân tích ra khỏi nền mẫu và hạn chế đến mức tối thiểu
chất đồng trích ly.
b. Chiết bằng phương pháp cơ học trộn rung (Vortex) [7]
Áp dụng cho các mẫu rau cải đã xắt nhuyễn, hạt nhỏ, chất lỏng. Mẫu được
trộn đều với dung môi ở tốc độ cao, với tác động mạnh của lực cơ học, dung môi
sẽ thấm sâu vào bên trong các cơ thịt, mô tế bào và làm phá vỡ cấu trúc của
chúng thành những mảnh vụn. Do đó chất phân tích dễ dàng phân bố vào pha hữu
cơ hơn. Dịch chiết thu được sau quá trình này cần phải xử lý tiếp để loại bỏ hết
tạp chất.
Luận văn tốt nghiệp đại học
SVTH: Nguyễn Văn Nhớ

9

Hóa Dược K36

c. Chiết bằng phương pháp chiết Soxhlet [7]

Hình 2.2 Sơ đồ chiết Soxhlet
Chưng cất hồi lưu liên tục mẫu với dung môi hữu cơ, làm chất phân tích
trong mẫu tan vào dung môi hữu cơ. Chất phân tích phải tan tốt vào trong dung
môi hữu cơ, pha chiết phải tinh khiết, bền, không làm hỏng chất phân tích, nhiệt
độ thích hợp. Thích hợp cho các mẫu rắn như lá cây, rau quả, đất…

Ưu điểm
Tiết kiệm dung môi, không phải tốn công lọc và bổ sung thêm dung môi
mới như các kỹ thuật chiết khác, tương đối trích được hết chất. Ly trích tự động
liên tục.
Nhược điểm
Không chiết được lượng lớn mẫu, không chiết được các chất kém bền nhiệt
do dịch lượng mẫu chiết phụ thuộc vào kích thước của máy Soxhlet chiết liên tục
bị đun nóng ở nhiệt độ sôi của dung môi hơn nữa giá thành thiết bị khá cao, dễ hư
hỏng, dễ vỡ và khó thay thế.
d. Chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn (supercritical fluid method) [7]
Tuy đã được biết đến cách đây rất lâu (1879) nhưng mãi đến thập niên 1980,
phương pháp này mới được áp dụng rộng rãi trong kỹ thuật chiết các hợp chất
thiên nhiên ra khỏi thực vật như tinh dầu cà phê, trà, gia vị…
Một hợp chất sẽ hiện diện ở trạng thái siêu tới hạn khi hợp chất đó có nhiệt
độ và áp suất cao hơn giá trị tới hạn tương ứng của nó.
Ưu điểm
Chất lỏng siêu tới hạn có khả năng khuếch tán thấm vào bên trong mẫu
chiết nhiều so với sự chiết bằng dung môi theo các phương pháp khác.
Luận văn tốt nghiệp đại học
SVTH: Nguyễn Văn Nhớ

10

Hóa Dược K36

Chất lỏng siêu tới hạn có độ nhớt thấp, có áp suất hơi cao. Đồng thời có sự
chọn lọc cao đối với chất cần chiết tách, phù hợp với loại hợp chất nhạy với nhiệt
độ và là phương pháp thân thiện với môi trường.
Nhược điểm
Thiết bị chuyên dùng, đắt tiền. Sự hiện diện của nước trong mẫu chiết

thường gây khó khăn cho quá trình chiết, không thích hợp đối với mẫu chiết ở
dạng lỏng. Phương pháp này thường sử dụng dung môi là CO
2
lỏng nên không
phù hợp để chiết các hợp chất có tính phân cực.
e. Kỹ thuật chiết pha rắn (Solid phase extraction, SPE) [7], [10], [8]
Ngày nay hơn 50% các phương pháp làm sạch mẫu trong kỹ thuật sắc ký
đều sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn. Ứng dụng cho nhiều loại nền mẫu khác nhau
như: các loại mẫu môi trường, mẫu dược phẩm, mẫu sinh hóa, mẫu thực phẩm…
Kỹ thuật chiết pha rắn là sự tương tác giữa các chất tan trong một dung dịch
lên trên chất hấp thu.
Kỹ thuật chiết pha rắn thường được áp dụng nhằm các mục đích sau:
- Xác định mức độ phân cực của một hợp chất chưa biết.
- Làm giàu mẫu nhằm làm tăng độ nhạy cho quá trình phân tích mẫu, loại
bỏ các tạp chất gây nhiễu nền không mong muốn, thay đổi nền mẫu của
chất phân tích.
- Phân chia hỗn hợp ban đầu chứa các hợp chất từ không phân cực đến
phân cực thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau.
Các cấu tử cần phân tích và các chất cản trở nằm trong pha lỏng. Khi cho
chất lỏng chảy qua cột nhồi chứa chất hấp thu, quá trình chiết tách xảy ra theo các
trường hợp sau:
- Các cấu tử cần phân tích được lưu giữ lại trên chất hấp thu, còn các chất
cản trở không bị lưu giữ được thải ra khỏi cột theo dòng chảy, sau đó
chất cần phân tích được rửa giải ra khỏi cột bằng dung môi hoặc hệ
dung môi thích hợp.
- Ngược lại, các chất cản trở bị lưu giữ lại trên chất hấp thu, còn cấu tử
cần phân tích không bị lưu giữ chảy ra khỏi cột theo dòng chảy.
Trong đa số trường hợp, các cấu tử cần phân tích và các chất cản trở cùng bị
giữ lại trên cột chất hấp thu. Khi đó cần rửa chọn lọc bằng những dung môi đủ
mạnh để loại bỏ các chất cản trở, nhưng lại đủ yếu để các cấu tử cần phân tích