định danh vi khuẩn đối kháng với vi khuẩn gây bệnh cháy bìa lá lúa phân lập tại an giang

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC















LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐỊNH DANH VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG VỚI
VI KHUẨN GÂY BỆNH CHÁY BÌA LÁ LÚA
PHÂN LẬP TẠI AN GIANG




CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
TS. NGUYỄN ĐẮC KHOA NGUYỄN VĂN VINH
MSSV: 3102795

LỚP: CNSH K36





Cần Thơ, tháng 11/2013
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC















LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐỊNH DANH VI KHUẨN ĐỐI KHÁNG VỚI
VI KHUẨN GÂY BỆNH CHÁY BÌA LÁ LÚA

PHÂN LẬP TẠI AN GIANG




CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
TS. NGUYỄN ĐẮC KHOA NGUYỄN VĂN VINH
MSSV: 3102795
LỚP: CNSH K36





Cần Thơ, tháng 11/2013


PHẦN KÝ DUYỆT


CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN





TS. Nguyễn Đắc Khoa Nguyễn Văn Vinh

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG


LỜI CẢM TẠ
Trong thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp tại trường Đại học Cần Thơ, tôi đã
nhận được rất nhiều sự quan tâm và động viên từ gia đình, sự hướng dẫn và chỉ dạy tận
tình của quý thầy cô cùng sự giúp đỡ nhiệt tình của bạn bè để hoàn thành được luận văn
tốt nghiệp này.
Đầu tiên xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo cùng tất cả quý thầy cô Viện Nghiên
cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã tận tình truyền đạt kiến thức và tạo điều kiện
cho em học tập, nghiên cứu.
Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Đắc Khoa, người đã tận tâm dìu
dắt, chỉ dẫn và truyền đạt những kiến thức cũng như kinh nghiệm quý báu cho tôi trong
suốt thời gian học tập cũng như trong quá trình thực hiện thí nghiệm và viết luận văn.
Xin chân thành biết ơn cô Trần Thị Xuân Mai, cô Nguyễn Thị Liên và cô Nguyễn
Thị Pha – Phòng Thí nghiệm Công nghệ Gen Thực vật thuộc Viện Nghiên cứu và Phát
triển Công nghệ Sinh học đã hỗ trợ và tạo điều kiện tốt cho tôi trong suốt quá trình học
tập tại Viện cũng như trong thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp Đại học.
Thân gửi đến chị Võ Thị Phương Trang, anh Trần Quốc Tuấn, anh Trần Văn Bé
Năm, anh Đỗ Tấn Khang, anh Trần Văn Điệp và anh Trần Minh Đức lời cảm ơn chân
thành vì đã hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện luận văn. Chân thành cảm ơn bạn

Nguyễn Văn Cà, bạn Nguyễn Hoàng Khuyên và em Phan Trần Khải đã nhiệt tình giúp
đỡ, động viên và cho tôi những lời khuyên bổ ích trong thời gian học tập cũng như lúc
thực hiện đề tài.
Xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến cha mẹ đã luôn ủng hộ tôi về mọi phương
diện, là sức mạnh tinh thần giúp tôi vươn lên trong cuộc sống.
Cuối lời, xin chúc cha mẹ, quý thầy cô và các anh chị luôn dồi dào sức khỏe và luôn
thành công trong mọi lĩnh vực.
Cần Thơ, ngày 27 tháng 10 năm 2013


Nguyễn Văn Vinh
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
i

TÓM TẮT
Bệnh cháy bìa lá (bạc lá) do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) gây ra
là một trong những bệnh nghiêm trọng trên ruộng lúa. Mục tiêu của đề tài là định danh
được 2 chủng vi khuẩn NMCM2 và VTTS1 phân lập tại An Giang có khả năng đối kháng
mạnh với vi khuẩn Xoo trên đĩa thạch và giúp giảm bệnh cháy bìa lá trong điều kiện nhà
lưới, tạo tiền đề cho việc sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh này. Quá trình định
danh vi khuẩn được thực hiện bằng cách kết hợp giữa phương pháp truyền thống sử dụng
Hệ thống phân loại Bergey và phương pháp hiện đại sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen
16S rRNA của vi khuẩn.
Chủng vi khuẩn NMCM2 là Bacillus stratophericus và chủng VTTS1 là Bacillus
safensis. Kết quả sử dụng Hệ thống phân loại Bergey cho thấy 2 chủng vi khuẩn NMCM2
và VTTS1 có khuẩn lạc màu trắng, tròn, lài và bìa gợn sóng trên môi trường thạch dinh
dưỡng. Cả 2 là vi khuẩn Gram dương, hình que, sinh nội bào tử, sống riêng lẻ, có khả
năng di động và kích thước lần lượt là 0,7-0,9 x 1,2-2,7 µm và 0,5-0,7 x 1,0-1,2 µm. Các
chủng vi khuẩn này không thuộc nhóm kỵ khí bắt buộc, cho phản ứng catalase dương tính

và có khả năng sử dụng nguồn carbon myo-inositol để sinh trưởng; trong đó, chủng
NMCM2 mẫn cảm với kháng sinh ampicillin. Kết quả của kỹ thuật giải trình tự gen 16S
rRNA của 2 chủng vi khuẩn cho thấy sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rRNA bằng cặp
mồi tổng 27F và 1492R hiện băng rõ và không có băng phụ, kích thước khoảng 1500 bp.
Số nucleotide được giải trình tự của 2 chủng vi khuẩn NMCM2 và VTTS1 tương đối cao,
lần lượt là 770 và 780. Độ tương đồng cao nhất khi so sánh trình tự đoạn gen 16S rRNA
của chủng NMCM2 với cơ sở dữ liệu GenBank của NCBI là 92% và của chủng VTTS1 là
94%. Khi định danh vi khuẩn, cần kết hợp linh hoạt giữa phương pháp truyền thống (sử
dụng hệ thống phân loại của Bergey) và phương pháp hiện đại (giải trình tự gen 16S
rRNA để tiết kiệm chi phí, thời gian và cho kết quả đáng tin cậy. Hai vi khuẩn B.
stratophericus và B. safensis không thuộc nhóm độc hại đối với môi trường, con người,
động vật và cây trồng nên có triển vọng được dùng để sản xuất chế sinh học phòng trừ
bệnh cháy bìa lá lúa sau khi thử nghiệm thành công trong điều kiện ngoài đồng.
Từ khóa: định danh, Bacillus stratophericus, Bacillus safensis, cháy bìa lá, bạc lá,
Xanthomonas oryzae pv. oryzae, lúa, đối kháng, phòng trừ sinh học.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
ii

MỤC LỤC
Trang
PHẦN KÝ DUYỆT

LỜI CẢM TẠ

TÓM TẮT

MỤC LỤC

DANH SÁCH BẢNG

DANH SÁCH HÌNH

TỪ VIẾT TẮT

CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU

1.1. Đặt vấn đề

1.2. Mục tiêu đề tài

CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1. Bệnh cháy bìa lá lúa

2.1.1. Lịch sử

2.1.2. Triệu chứng

2.1.3. Tác nhân gây bệnh

2.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của bệnh

2.2. Biện pháp phòng trừ bệnh

2.2.1. Biện pháp canh tác

2.2.2. Biện pháp sử dụng giống kháng

2.2.3. Biện pháp hóa học

2.2.4. Biện pháp sinh học

2.3. Phương pháp định danh vi khuẩn

2.3.1. Phương pháp truyền thống - Hệ thống phân loại Bergey

2.3.1.1. Khảo sát hình thái và cấu tạo của vi khuẩn



i

ii

v

vi

viii

1

1

2

3

3

3

4

6

7

8

8

8

9

9

11

11

11

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
iii

2.3.1.2. Khảo sát các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn

2.3.2. Phương pháp hiện đại - Giải trình tự gen 16S rRNA của vi khuẩn

2.3.2.1. Ly trích vật liệu di truyền của vi khuẩn

2.3.2.2. Khuếch đại đoạn gen 16S rRNA của vi khuẩn

2.3.2.3. Điện di sản phẩm PCR

2.3.2.4. Giải trình tự đoạn gen 16S rRNA

2.3.2.5. So sánh trình tự đoạn gen 16S rRNA với cơ sở dữ liệu

2.4. Một số nghiên cứu định danh vi khuẩn gần đây

CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Phương tiện

3.1.1. Thời gian

3.1.2. Địa điểm

3.1.3. Vật liệu thí nghiệm

3.1.4. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm

3.1.4.1. Dụng cụ thí nghiệm

3.1.4.2. Thiết bị thí nghiệm

3.1.5. Hóa chất

3.2 Phương pháp

3.2.1. Phương pháp truyền thống-Hệ thống phân loại Bergey

3.2.1.1. Khảo sát hình thái và cấu tạo của vi khuẩn

3.2.1.2. Khảo sát các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn

3.2.2. Phương pháp hiện đại - Giải trình tự gen 16S rRNA của vi khuẩn

3.2.2.1. Kỹ thuật giải trình tự gen 16S rRNA

3.2.2.2. So sánh trình tự với cơ sở dữ liệu GenBank của NCBI

CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ THẢO LUẬN

4.1. Kết quả sử dụng hệ thống phân loại Bergey

15

19

19

20

21

21

22

22

24

24

24

24

24

24

24

24

24

25

25

25

27

28

28

32

34

34

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
iv

4.2. Kết quả giải trình tự gen 16S rRNA của vi khuẩn

4.3. Định danh vi khuẩn bằng cách kết hợp khảo sát các đặc tính sinh hóa với kết
quả giải trình tự gen 16S rRNA

4.3.1. Chủng vi khuẩn NMCM2

4.3.2. Chủng vi khuẩn VTTS1

CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1 Kết luận

5.2 Đề nghị

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

Tiếng Anh

Website

PHỤ LỤC


39


44

44

47

50

50

51

52

52

56

61




Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
v

DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 1.
Bảng 2.
Bảng 3.
Bảng 4.

Bảng 5.
Bảng 6.
Diện tích nhiễm cháy bìa lá lúa vụ Thu Đông qua 5 năm tại An Giang

Thành phần phản ứng PCR

Thành phần phản ứng gắn huỳnh quang

Các đặc tính khác nhau giữa các nhóm vi khuẩn sinh nội bào tử trong
nhóm 18 của Hệ thống phân loại Bergey

Giá trị OD, nồng độ DNA ban đầu và nồng độ DNA sau pha loãng

Các đặc tính dùng để phân biệt hai vi khuẩn Bacillus stratophericus và
Bacillus aerophilus


4

30

32


37

39


45



Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
vi

DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 1.

Hình 2.
Hình 3.
Hình 4.
Hình 5.
Hình 6.

Hình 7.

Hình 8.

Hình 9.

Hình 10.


Hình 11.


Hình 12.

Hình 13.

Hình 14.


Hình 15.


Hình 16.

Triệu chứng bệnh cháy bìa lá trên ruộng lúa

Giọt dịch vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae

Phân nhóm vi khuẩn hình cầu và hình que Gram âm

Phân nhóm vi khuẩn hình cầu và hình que Gram dương

Các phân nhóm chính trong Hệ thống phân loại Bergey

Khuẩn lạc của 2 chủng vi khuẩn NMCM2 (A) và VTTS1 (B) trên môi trường
thạch dinh dưỡng sau 2 ngày nuôi cấy

Hình nhuộm Gram của 2 chủng vi khuẩn NMCM2 (A) và VTTS1 (B) dưới
kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần

Hình nhuộm bào tử của 2 chủng vi khuẩn NMCM2 (A) và VTTS1 (B) dưới
kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần

Khảo sát khả năng di động của 2 chủng vi khuẩn NMCM2 (A) và VTTS1
(B)

Khảo sát hoạt tính catalase của 2 chủng vi khuẩn NMCM2 (A) và VTTS1
(B)

Sản phẩm khuếch đại gen 16S rRNA của 2 chủng vi khuẩn NMCM2 và
VTTS1

Trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng vi khuẩn NMCM2

Trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng vi khuẩn VTTS1

Kết quả tìm kiếm trình tự tương đồng với trình tự 16S rRNA của chủng
NMCM2 bằng công cụ Blastn trên NCBI

Kết quả tìm kiếm trình tự tương đồng với trình tự 16S rRNA của chủng
VTTS1 bằng công cụ Blastn trên NCBI.

Vòng vô khuẩn được tạo ra do chủng NMCM2 mẫn cảm với kháng sinh
ampicillin

6
6
15
16
34

35

35

36

38

38

40
41

41

42

43

46
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
vii

Hình 17.



Hình 18.



Kết quả dương tính làm đổi màu môi trường từ xanh sang vàng trong khảo
sát khả năng sử dụng nguồn carbon myo-inositol của chủng vi khuẩn
NMCM2

Kết quả dương tính làm đổi màu môi trường từ xanh sang vàng trong khảo
sát khả năng sử dụng nguồn carbon carbon myo-inositol của chủng vi khuẩn
VTTS1

46


48






Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
viii

TỪ VIẾT TẮT



APHA American Public Health Association
ĐBSCL Đồng bằng Sông Cửu Long
ĐHCT Đại học Cần Thơ
FAO Food and Agriculture Organization
IRRI International Rice Research Institute
MR Methyl Red
NCBI National Center for Biotechnology Information
NC&PT Nghiên cứu và phát triển
NN&PTNT Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn
PCR Polymerase Chain Reaction
RPM Revolutions per minute
VP Voges Proskauer

Xoo Xanthomonas oryzae pv. oryzae








Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
1

CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Dân số thế giới tăng nhanh, đạt 7 tỷ người vào ngày 31/10/2011 (United Nations
Population Fund, 2011). Theo Tổ chức Lương Nông Thế giới (FAO), cuộc khủng hoảng
lương thực toàn cầu rất có thể xảy ra, đặc biệt khi dân số thế giới sẽ đạt 9,1 tỷ vào năm
2050 (FAO, 2009). Để đảm bảo an ninh lương thực cho 9,1 tỷ người, sản lượng lương
thực toàn cầu phải tăng 70% so với năm 2006. Đây là một thách thức lớn trong khi diện
tích đất canh tác ngày càng giảm, điều kiện thời tiết bất lợi và dịch bệnh ngày càng tăng.
Việt Nam đang đứng trước nhiều thách thức về an ninh lương thực dù là quốc gia
xuất khẩu gạo lớn thứ 2 thế giới với hơn 7 triệu tấn/năm. Mỗi năm, dân số tăng thêm 1
triệu người, sẽ cần thêm 200.000 tấn lúa (Đào Quốc Luận, 2011), trong khi diện tích đất
sản xuất lương thực liên tục giảm cả số lượng và chất lượng. Từ năm 2000-2010, Việt
Nam mất 270.000 ha đất trồng lúa do canh tác chưa hợp lý, suy thoái đất, xâm nhập mặn
vùng cửa sông và phát triển hạ tầng kinh tế (Bộ Tài nguyên và Môi trường, 2011). Nếu
mực nước biển dâng 1m, khoảng 39% diện tích Đồng bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL),
10,5% diện tích Đồng bằng Sông Hồng và trên 2,5% diện tích các tỉnh ven biển miền
Trung sẽ có nguy cơ bị ngập (Bộ Tài nguyên và Môi trường, 2012).

ĐBSCL là vùng sản xuất lúa lớn nhất cả nước, có sản lượng lúa đạt 24,6 triệu tấn
vào năm 2012, chiếm 56% sản lượng lúa cả nước (Sở NN&PTNT Vĩnh Long, 2012).
Điều kiện thời tiết ngày càng khắc nghiệt, nắng nóng mưa nhiều, đan xen nhiều cơn bão,
là điều kiện thuận lợi cho sâu bệnh hại lúa phát triển. Trong đó, bệnh cháy bìa lá (bạc lá)
là một trong những bệnh hại lúa nguy hiểm nhất (Ezuka và Kaku, 2000). Từ những năm
1978, bệnh cháy bìa lá bùng phát thành dịch ở vùng ĐBSCL làm thiệt hại năng suất
khoảng 40% (Nguyễn Vĩnh Phúc và Nguyễn Thị Lang, 2005).
An Giang có 262.286 ha canh tác lúa (Cục Thống kê An Giang, 2009), là một trong
những tỉnh sản xuất lúa gạo trọng điểm của cả nước. Trong các loại dịch hại, bệnh cháy
bìa lá xảy ra thường xuyên và trên diện tích lớn. Theo Nguyễn Trung Thành (2011), An
Giang đang đẩy mạnh sản xuất lúa thơm với các giống Jasmine 85, VD 20, OM4900…
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
2

Các giống này thường là các giống nhiễm bệnh cháy bìa lá nặng nên đã gây ảnh hưởng
nhiều đến năng suất và chất lượng của hạt.
Đứng trước những thách thức về vấn đề an ninh lương thực, bên cạnh việc lai tạo ra
các giống lúa siêu năng suất hoặc có khả năng chịu mặn cao thì việc phòng trị cũng như
hạn chế tác hại của sâu bệnh hại lúa nói chung và bệnh cháy bìa lá nói riêng là một vấn đề
đang được quan tâm nghiên cứu. Theo Cao et al. (2003) và Lee et al. (2002), để kiểm soát
bệnh cháy bìa lá, thuốc hóa học và giống kháng là 2 biện pháp thường được nghiên cứu
và ứng dụng, tuy nhiên các biện pháp này chưa thu được kết quả cao và còn tồn tại nhiều
hạn chế. Chưa có thuốc đặc trị, bên cạnh đó sử dụng thuốc hóa học làm ô nhiễm môi
trường, tiêu diệt thiên địch, có thể làm cho vi khuẩn gây bệnh kháng thuốc, lưu tồn thuốc
trên sản phẩm, bệnh bùng phát và gây hại trên diện rộng. Tuyển chọn và lai tạo giống
kháng tốn nhiều thời gian và kinh phí trong khi gen kháng dễ mất tác dụng sau một thời
gian triển khai ngoài đồng. Do vậy, phòng trừ sinh học sử dụng vi sinh vật đối kháng là
biện pháp có triển vọng để hạn chế bệnh cháy bìa lá, biện pháp này an toàn với sức khỏe
con người, không gây ô nhiễm môi trường và góp phần quan trọng trong việc phát triển

nền nông nghiệp bền vững và hiệu quả.
Qua khảo sát khả năng đối kháng của vi khuẩn được phân lập tại tỉnh An Giang với vi
khuẩn gây bệnh cháy bìa lá lúa trên đĩa thạch và khả năng giúp giảm bệnh cháy bìa lá của
các vi khuẩn này trong điều kiện nhà lưới, Võ Thị Phương Trang (2013) đã tìm ra được 2
chủng vi khuẩn có hiệu quả cao. Đề tài này được thực hiện nhằm mục đích định danh 2 vi
khuẩn trên, tạo tiền đề cho việc sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh cháy bìa lá, là
một bệnh rất quan trọng trên ruộng lúa tại An Giang cũng như ĐBSCL, Việt Nam và trên
thế giới.
1.2. Mục tiêu đề tài
Định danh được 2 chủng vi khuẩn phân lập tại An Giang có khả năng đối kháng mạnh
với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae trên đĩa thạch và giúp giảm bệnh cháy bìa lá
trong điều kiện nhà lưới bằng 2 phương pháp:
1. Phương pháp truyền thống: sử dụng hệ thống phân loại Bergey
2. Phương pháp hiện đại: sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen 16S rRNA của vi khuẩn.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
3

CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Bệnh cháy bìa lá lúa
2.1.1. Lịch sử
Bệnh cháy bìa lá được phát hiện và ghi nhận lại từ rất sớm (1884-1885) tại vùng
Fukuoka, Nhật Bản (Tagami và Mizukami, 1962). Sau đó, bệnh cũng được ghi nhận ở Châu
Âu, Bắc Australia, Châu Phi và Mỹ. Bệnh gây tác hại nghiêm trọng ở hầu hết các nước, đặc
biệt ở Châu Á (Nhật Bản, Trung Quốc, Philippines, Ấn Độ…), làm giảm từ 6-60% năng
suất (Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân, 1999). Một số nước trong khu vực Đông Nam Á, bệnh
cháy bìa lá lúa đã gây hại nghiêm trọng cho ngành trồng lúa và đã làm giảm năng suất tới
50% (Khush et al., 1990), thậm chí có thể lên tới 80% (Singh et al., 1997).
Từ thập niên 1960, bệnh cháy bìa lá gây hại ở hầu hết các quốc gia trồng lúa, đặc
biệt trên các giống lúa có năng suất cao lá như TN1 và IR8 (Ray và Sengupta, 1970).

Năm 1954, 90,000-150,000 ha ruộng lúa ở Nhật bị ảnh hưởng và thiệt hại 22,000-110,000
tấn. Tại Ấn Độ, bệnh được ghi nhận từ năm 1951 và đến năm 1963 bệnh bùng phát thành
dịch. Tại Philippines, thiệt hại vào mùa mưa lên đến 22,5%, thiệt hại vào mùa khô khoảng
7,2% đối với những giống mẫn cảm (Exconde, 1973).
Theo Phạm Văn Biên et al. (2003), bệnh đã gây hại ở Việt Nam từ lâu trên các giống
lúa mùa cũ; đặc biệt trong mùa mưa, bệnh cháy bìa lá là một trong những tác nhân gây ảnh
hưởng đến sản lượng lúa của Việt Nam. Những năm 1970-1975, bệnh cháy bìa lá đã gây
thành dịch hại rộng lớn ở các tỉnh Đồng bằng Sông Hồng trên giống lúa Trân Châu lùn và
các giống lúa mùa địa phương, trên giống NN8 mức độ nhiễm bệnh lên tới 60-100% làm
giảm năng suất từ 30-60%. Gần đây bệnh phổ biến trên một số giống lúa lai nhập nội. Bệnh
cháy bìa lá có chiều hướng gia tăng và trở thành một trong những bệnh gây ảnh hưởng
nghiêm trọng trong cả 2 vụ lúa ở miền Bắc Việt Nam (Phan Hữu Tôn, 2004).
Bệnh cháy bìa lá cũng được ghi nhận bùng phát thành dịch ở vùng ĐBSCL từ những
năm 1978 làm thiệt hại về năng suất khoảng 40%. Năm 1984, bệnh bùng phát thành dịch
trên 77.000 ha. Đến năm 1991-1992 bệnh tái phát ở các tỉnh Long An, Tiền Giang, Hậu
Giang Có khoảng 10.000 ha lúa IR50404 và OM269 bị thiệt hại, trên 200.000 ha trồng
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
4

các giống lúa khác bị nhiễm ở hầu hết các tỉnh ĐBSCL, mức thiệt hại khoảng 10-15%
(Nguyễn Vĩnh Phúc và Nguyễn Thị Lang, 2005).
Theo Nguyễn Trung Thành (2011), bệnh cháy bìa lá lúa đã gây hại trong vụ Thu
Đông của tỉnh An Giang trong 5 năm liên tiếp từ 2006 đến 2010 với diện tích gần 42.000
ha, chiếm 10% tổng diện tích canh tác (Bảng 1). Trong đó, diện tích lúa Thu Đông nhiễm
bệnh cháy bìa lá tăng dần theo các năm.
Bảng 1. Diện tích nhiễm cháy bìa lá lúa vụ Thu Đông qua 5 năm tại An Giang
(Nguyễn Trung Thành, 2011)
Diện tích nhiễm (ha)
Vụ

Nhẹ
Trung
bình
Nặng
Tổng
Diện tích
gieo trồng (ha)
Tỷ lệ (%)
diện tích
nhiễm
Thu Đông 2006
1.687,0

462,0

5,0

2.154,0

43.826

4,91

Thu Đông 2007
7.097,0

208,0

40,0

7.345,0

58.849

12,48

Thu Đông 2008
5.180,0

322,2

12,2

5.514,4

94.421

5,84

Thu Đông 2009
11.233,7

1.263,0

0,0

12.496,7

91.269

13,69

Thu Đông 2010
13.690,0

287,0

15,0

13.992,0

115.037

12,16

Mức độ tác hại của bệnh phụ thuộc vào giống, thời kỳ nhiễm bệnh của cây và mức
độ nhiễm bệnh. Nếu cây lúa bị bệnh ngay từ khi đẻ nhánh thì mức độ bị bệnh về sau
thường rất nặng, ảnh hưởng rõ rệt hơn đến năng suất, có thể làm giảm từ 41% trở lên, nếu
bị bệnh từ thời kỳ lúa làm đòng đến trổ thì tác hại có thể vẫn còn lớn, trung bình làm giảm
năng suất của cây lúa khoảng 30%. Nhưng nếu ở thời kỳ cuối chín sữa đến chín chắc thì
mức độ tác hại sẽ ít hơn 10% (Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân, 1999). Bệnh cháy bìa lá
làm giảm khả năng quang hợp, giảm khả năng thụ phấn của bông lúa, làm tăng số hạt lép,
hạt lửng, giảm lượng đạm và protein thô trong hạt. Nếu gặp điều kiện thời tiết thuận lợi
thì khả năng lây lan bệnh rất nhanh và có thể bị mất trắng (Ou, 1972).
2.1.2. Triệu chứng
Bệnh cháy bìa lá lúa có thể tấn công cây lúa suốt thới kỳ mạ đến khi lúa chín, nhưng
có triệu chứng điển hình ở thời kỳ cây lúa trên ruộng từ sau đẻ nhánh đến trổ và chín sữa
(Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân, 1999; Vũ Triệu Mân et al., 2007). Theo Võ Thanh
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

5

Hoàng và Nguyễn Thị Nghiêm (1993), bệnh cháy bìa lá gồm ba dạng triệu chứng: héo
xanh (kresek), vàng lá và cháy bìa lá.
Theo Ou (1972), triệu chứng “kresek” được hai nhà khoa học người Indonesia là
Reitsma và Schure tìm thấy vào năm 1950. Một hoặc hai tuần lễ sau khi cấy, các lá bị
bệnh trở nên xanh xám nhạt và bắt đầu gập, cuộn lại dọc theo gân chính. Ở lúa cấy có lá
bị cắt, bên dưới mặt cắt có đốm úng nước, sau đó đổi sang màu xanh xám, toàn bộ lá bị
cuộn lại và héo, tiếp đến là bẹ lá. Vi khuẩn truyền theo mạch dẫn đến những vùng tăng
trưởng của cây non và bệnh lây truyền đến gốc các lá khác, khiến cho cây non bị chết toàn
bộ.
Triệu chứng vàng lá thường xuất hiện vào giai đoạn lúa lớn. Khi cây lúa bị nhiễm
bệnh, các lá già vẫn xanh bình thường, các lá non bị vàng nhạt không đồng đều, trên
phiến lá có sọc rộng màu vàng hoặc vàng xanh nhạt. Trong các lá vàng này không tìm
thấy vi khuẩn, nhưng ở các đốt và lóng ngay bên dưới lá bệnh sẽ có rất nhiều vi khuẩn. Vi
khuẩn ở đây sẽ nhân mật số và hạn chế việc đưa dinh dưỡng lên lá làm cho lá bị vàng.
Triệu chứng có thể xuất hiện sau khi vi khuẩn xâm nhiễm 20-30 ngày (Ou, 1972).
Triệu chứng cháy bìa lá thường xuất hiện ở giai đoạn lúa trổ, tuy nhiên cũng có khi
bệnh gây hại trên mạ. Trên mạ, bìa của các lá bên dưới có những đốm úng nước nhỏ, đốm
lớn dần ra làm lá trở nên vàng và khô héo. Trên lá lúa triệu chứng bệnh thể hiện rõ rệt
hơn, tuy có thể biến đổi ít nhiều theo giống lúa và điều kiện bên ngoài nhưng vết bệnh có
những đặc điểm điển hình chung như ban đầu trên phiến lá có những đường kẻ dài không
đều, hoặc ở chóp lá tạo thành một sọc dài nhũng nước hay ở hai bên bìa lá, khi đẫm nước
vết bệnh sẽ lan dài ra những vết có màu vàng và phát triển dần ra tạo thành màu vàng xám
khô chạy theo hai bìa lá (Agrios, 2005), rìa lá bị quăn queo và lan ra khắp lá, vết bệnh lan
nhanh chóng xuống phần bẹ lá, lá bị khô nhanh chóng và cuộn lại (Sharma, 2006). Vết
bệnh đầu tiên xuất hiện ở chóp lá hay mép lá thường nhỏ, trông giống như những giọt dầu
có màu xanh xám nhạt, sau đó vết bệnh lan rộng trở nên vàng và héo khô nhanh chóng.
Các vết bệnh có thể xuất hiện ở một hoặc cả hai rìa mép lá, sau đó phát triển rộng phủ kín
cả mặt lá, các vết bệnh sau đó biến thành màu nâu xám (Hình 1). Vào sáng sớm có thể

quan sát giọt dịch khuẩn có màu trắng sữa hoặc vàng sáp trên bề mặt của các vết bệnh còn
non, những giọt dịch khuẩn này có hình tròn nhỏ nhanh chóng khô đi có màu vàng nhạt,
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
6

màu nâu hổ phách, chúng dễ rơi và nổi trên mặt nước (Hình 2) (Lê Lương Tề, 2000; Lê
Lương Tề và Vũ Triệu Mân, 1999).

Hình 1. Triệu chứng bệnh cháy bìa lá trên ruộng lúa (Ảnh: Trần Quốc Tuấn)



Hình 2. Giọt dịch vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Nguyễn Trung Thành, 2011)
2.1.3. Tác nhân gây bệnh
Theo Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân (1999), bệnh cháy bìa lá lúa do vi khuẩn
Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) gây ra (Kloepper, 1993). Ngoài tên gọi trên, vi
khuẩn còn có một số tên khác như: Xanthomonas oryzae (Uyeda et Ishiyama) Dowson
(Ou, 1972), Pseudomonas oryzae Uyeda et Ishiyama (Ishiyama, 1922) hoặc Phytomonas
oryzae Magrou (Ou,1972), Xanthomonas campestris pv. oryzae (Ishiyama) (Ou,1972);
Bacillus oryzae Hori et Bokura (Bokura, 1911); Bacterium oryzae (Uyeda et Ishiyama)
(Ou, 1972).
Theo Ou (1972), vi khuẩn Xoo Gram âm, có hình que hai đầu hơi tròn, có một roi ở
một đầu, kích thước tế bào là 0,55-0,75 x 1,35-2,17 µm với vi khuẩn lấy từ khuẩn lạc trên
môi trường và 0,45-0,6 x 0,65-1,4 µm với vi khuẩn lấy từ mô cấy.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
7

Trên môi trường nhân tạo, khuẩn lạc của Xoo có màu vàng sáp, có dạng hình tròn,

mô, bìa nguyên, bề mặt khuẩn lạc ướt. Vi khuẩn Xoo háo khí, không làm hóa lỏng getalin,
không tiêu thụ nitrat, không sản sinh amoniac, sản sinh khí H
2
S nhẹ. Vi khuẩn Xoo không
sản sinh Indol, men của Xoo không làm đông sữa, không sản sinh khí và acid từ đường
saccharose (Ou, 1972).
Môi trường nuôi cấy thường dùng là Wakimoto cải tiến (Karganilla et al., 1973).
Nhiệt độ tối thích cho Xoo phát triển là 25-30
o
C và pH là 6-6,5 (Fang et al., 1957). Theo
Ou (1972), Xoo không sống lâu trong nước cất vô trùng, nhưng sống khá lâu trong buffer
phosphate pH = 7 và trong nước có pha peptone. Tốt nhất là giữ trong huyền phù đất sét
hạt mịn, sau hơn 12 tháng tỉ lệ sống của vi khuẩn Xoo vẫn rất cao. Vi khuẩn Xoo tiết độc
tố phenylacetic acid trong môi trường nuôi cấy và trong lá bệnh, Xoo còn tổng hợp
enzyme phân giải protein và cellulose. Vi khuẩn Xoo rất dễ kháng streptomycin, đối với
các kháng sinh khác thì kháng ít hơn.
Theo Ou (1972) các vết thương trên lá là những đường xâm nhập phổ biến và thuận
lợi. Vi khuẩn xâm nhập vào thủy khổng và nhân lên trong biểu mô, một số vi khuẩn xâm
nhập vào hệ thống mạch dẫn, một số khác thoát ra ngoài qua thủy khổng (Tabei và Muko,
1960). Ngoài ra, vi khuẩn còn xâm nhập vào rễ qua các chỗ đứt, đây cũng là con đường
gây bệnh quan trọng (Mizukami, 1957).
2.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của bệnh
Bệnh phát triển mạnh nhất vào giai đoạn lúa làm đòng, trổ và chín sữa (Lê Lương
Tề, 2000). Ở Nhật Bản, bệnh thường xuất hiện vào giai đoạn cây lúa đẻ nhánh rộ hoặc
cuối giai đoạn mạ (Ou, 1972).
Sự phát sinh phát triển và mức độ tác hại của bệnh cháy bìa lá phụ thuộc vào thời
tiết (nhiệt độ, ẩm độ), đặc điểm của giống lúa và giai đoạn sinh trưởng, chế độ dinh dưỡng
phân bón, nước… (Lê Lương Tề, 2000).
Theo Vũ Triệu Mân (2003), trong điều kiện bình thường, bệnh lan truyền qua hạt
giống, lây qua vết thương cơ giới và qua đất trồng trọt nếu đất không được luân canh hay

xử lý bằng các biện pháp canh tác. Ngoài ra, các kỹ thuật canh tác như xén bớt lá mạ khi
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
8

cấy, trong điều kiện đất chua, úng ngập, mực nước sâu, đất nhiều mùn,… làm cho bệnh
xuất hiện sớm và phát triển mạnh (Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân, 1999; Ou, 1972).
Theo Ou (1972), nhiệt độ cao 25-30
o
C thích hợp hơn cho bệnh phát triển, ở nhiệt độ
17
o
C bệnh hầu như không phát triển.
2.2. Biện pháp phòng trừ bệnh
Để giảm thiệt hại do bệnh cháy bìa lá, việc phòng và trừ bệnh đúng lúc có ý nghĩa
quan trọng. Có 4 phương pháp phòng trừ bệnh chính:
2.2.1. Biện pháp canh tác
Biện pháp canh tác gồm thời vụ, làm đất, vệ sinh đồng ruộng, điều chỉnh mực nước
thích hợp, bón phân cân đối, chăm sóc, luân canh, xen canh (Vũ Triệu Mân et al., 2007).
Theo Lê Lương Tề (2000), để phòng trừ bệnh cháy bìa lá bằng biện pháp canh tác cần
làm tốt khâu xử lý hạt giống, vệ sinh tàn dư sau thu hoạch, diệt cỏ dại là ký chủ phụ (cỏ
môi, cỏ lồng vực, cỏ gừng bò ), không bón thừa phân đạm nhất là khi bón nuôi đòng,
điều chỉnh mực nước thích hợp (để nước sâu 5-10 cm). Khi bệnh mới xuất hiện cần tháo
nước cho khô ruộng trong 2-3 ngày. Biện pháp canh tác hạn chế được sự phát triển của
bệnh, phòng bệnh ngay từ đầu, chi phí thấp, dễ áp dụng trong sản xuất, không gây ảnh
hưởng đến môi trường. Tuy nhiên, biện pháp này tốn nhiều công sức, có tác động chậm
và có hiệu quả thấp khi bệnh đã phát triển mạnh, cần sử dụng kết hợp với biện pháp khác.
2.2.2. Biện pháp sử dụng giống kháng
Sử dụng giống lúa có khả năng kháng bệnh cháy bìa lá đã được các nhà khoa học
trên thế giới và Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế (IRRI) quan tâm và nghiên cứu từ rất lâu,

do đây là biện pháp thuận tiện nhất khi ứng dụng vào sản xuất. Mặc dù đã có hơn 30 gen
kháng bệnh cháy bìa lá được tìm thấy (Verdier et al., 2012) nhưng mỗi gen chỉ có khả
năng kháng với một hoặc một vài nòi vi khuẩn Xoo (theo thuyết Gen-đối-gen của Flor).
Trong khi đó, vi khuẩn này có rất nhiều nòi khác nhau. Cho đến nay, Viện Nghiên cứu
Lúa Quốc tế đã liệt kê được 14 nòi Xoo chuẩn, đặt tên từ 1 đến 10; trong đó nòi 3 gồm 3B
và 3C và nòi 9 gồm 9a, 9b, 9c, và 9d (Khoa, 2005). Bên cạnh đó, trong quá trình tiến hóa
được xem là rất nhanh của mầm bệnh, vẫn còn khả năng các nòi Xoo khác sẽ được tìm
thấy. Như vậy, để có thể phòng trừ bệnh cháy bìa lá hiệu quả bằng giống kháng, chúng ta
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
9

cần phải biết hiện tại trên ruộng lúa có những nòi Xoo nào để triển khai đúng giống kháng
tương thích. Việc này không đơn giản do phải ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử tốn
kém để xác định nòi Xoo; hơn nữa, trong khi việc lai tạo giống kháng rất tốn thời gian thì
quần thể vi khuẩn Xoo luôn có khả năng biến đổi về mặt di truyền rất nhanh (thay đổi cấu
trúc nòi trong quần thể) để phá vỡ tính kháng của cây lúa. Vì vậy, biện pháp phòng trừ
bệnh cháy bìa lá bằng giống kháng thường không cho hiệu quả lâu dài và vì thế khó triển
khai ứng dụng.
2.2.3. Biện pháp hóa học
Để phòng trừ bệnh cháy bìa lá có thể rắc 56-83 kg vôi trên một ha hoặc phun
Kasuran 0,1-0,2%. Ngoài ra, còn có thể phun Kasumin 21, Xanthomix 20 WP, Cuproxat
345 SC, Staner 20WP, Sasa 20WP hoặc Asusu 20WP (Lê Lương Tề, 2000). Phòng trừ
bệnh cháy bìa lá bằng biện pháp hóa học có thể trừ bệnh nhanh chóng và hiệu quả. Tuy
nhiên, nếu sử dụng thuốc không hợp lý, sai phương pháp sẽ mang đến hiệu quả thấp, gây
ô nhiễm môi trường đất, nguồn nước, trực tiếp gây độc cho người, sinh vật có ích hoặc để
lại dư lượng chất hóa học trong nông sản vượt mức cho phép, gây ngộ độc thực phẩm cho
người và gia súc. Nếu sử dụng liên tục một loại thuốc trừ bệnh ở một vùng sẽ dẫn đến kết
quả làm vi sinh vật quen thuốc và kháng thuốc (Vũ Triệu Mân et al., 2007).
2.2.4. Biện pháp sinh học

Biện pháp sinh học là biện pháp sử dụng các sinh vật, chất kháng sinh hoặc dịch
trích có nguồn gốc từ cơ thể sống để tiêu diệt hay hạn chế sự phát triển của vi sinh vật gây
bệnh (Vũ Triệu Mân et al., 2007). Trong đó, phòng trừ sinh học bằng vi sinh vật đối
kháng là hướng nghiên cứu còn rất nhiều tiềm năng để khai thác (Lê Gia Hy, 1994). Ở
Việt Nam, việc nghiên cứu sử dụng vi sinh vật đối kháng để phòng trừ bệnh cây trồng bắt
đầu phát triển từ những năm 1990, trong đó, nhóm nghiên cứu do Phạm Văn Kim đứng
đầu là một trong những nhóm tiên phong và đạt được một số thành tựu khả quan. Nhóm
đã nghiên cứu sử dụng vi khuẩn đối kháng phòng trừ bệnh đốm vằn trên lúa từ năm 1998
(Phạm Văn Kim et al., 1999; Mew et al., 2004), cho ra đời sản phảm sinh học BIOBAC-1
ĐHCT có khả năng phòng trừ một cách bền vững bệnh đốm vằn trên ruộng lúa và triển
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
10

khai đến nông dân (Nguyễn Đắc Khoa et al., 2010). Ngoài ra, biện pháp sinh học đã được
sử dụng để phòng trừ sâu bệnh trên nhiều loại cây và đạt được nhiều thành tựu.
Đối với bệnh cháy bìa lá lúa, từ năm 1994, Thind và Ahrmad đã phân lập và so sánh
hiệu quả ức chế mầm bệnh Xoo của một số loài vi khuẩn như Bacillus subtilis, Erwinia
herbicola, Enterobacter aerogens, Micrococcus sp., Pseudomonas fluorescens,
Aspergillus flavus, Cladosporium cladosporioides, Penicillium oxalicum và Trichoderma
eharzianum; kết quả cho thấy Bacillus subtilis có hiệu quả cao nhất. Những nghiên cứu
tiếp theo cũng chứng minh các chủng vi khuẩn Bacillus sp. có khả năng ức chế sự phát
triển của vi khuẩn Xoo (Weiliang et al., 1997; Lin et al., 2001; Beríc et al., 2012). Ngoài
ra, vi khuẩn Delftia tsuruhatensis HR4 do Han et al. (2005) phân lập từ vùng trồng lúa ở
phía Bắc Trung Quốc cũng có khả năng ức chế Xoo và các mầm bệnh khác như R. solani
và Pyricularia oryzae. Trong một nghiên cứu gần đây, Gesheva và Vasileva-Tonkova
(2012) đã phân lập được chủng vi khuẩn Nocardioides sp. từ vùng đất Nam cực có khả
năng sinh ra các enzyme thủy phân và các hợp chất đặc biệt có khả năng ức chế sự phát
triển không những của vi khuẩn Xoo mà cả Staphylococcus aureus. Bên cạnh đó,
Mageshwaran et al. (2012) đã ly trích được hợp chất lipopeptide từ vi khuẩn

Paenibacillus polymyxa HKA-15 phân lập từ cây đậu nành có khả năng ức chế mầm bệnh
cháy bìa lá Xoo trên lúa. Bên cạnh vi khuẩn, xạ khuẩn Streptomyces cũng được thử
nghiệm khả năng đối kháng với vi khuẩn Xoo nhưng không mang lại kết quả khả quan
(Ndonde và Semu, 2000). Biện pháp phòng trừ bệnh cháy bìa lá bằng vi sinh vật đối
kháng hiện đang bắt đầu được tập trung nghiên cứu trở lại.
Tại Việt Nam, việc nghiên cứu về vi khuẩn đối kháng có khả năng phòng trừ bệnh
cháy bìa lá vẫn còn rất hạn chế, chỉ tìm được thông tin của Nguyễn Hồng Anh (2011) và
Nguyễn Đình Hải (2012) về chủ đề này, trong đó Nguyễn Hồng Anh chọn lọc được chủng
xạ khuẩn VN10-A44 có khả năng đối kháng với mầm bệnh Xoo và Nguyễn Đình Hải đã
xác định được chủng xạ khuẩn VN08A12 có tiềm năng đối kháng với Xoo là
Streptomyces toxytricini, cải tiến môi trường sinh kháng sinh và khẳng định VN08A12
không gây hại cho các sinh vật có ích trong môi trường sống.
Phòng trừ bệnh cháy bìa là bằng vi khuẩn đối kháng tuy hiệu quả chậm hơn thuốc
hóa học nhưng hiệu quả lâu dài, thường không độc với con người và môi trường, bảo vệ
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
11

được sự cân bằng sinh học trong tự nhiên, hạn chế tình trạng bùng phát bệnh, tránh được
dư lượng chất hóa học độc hại trên nông sản, không gây ô nhiễm môi trường và góp phần
quan trọng trong việc phát triển nền nông nghiệp bền vững và hiệu quả.
2.3. Phương pháp định danh vi khuẩn
Hiện nay, do sự phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử, nhiều loài vi khuẩn đã
được định danh bằng kỹ thuật giải trình tự gen 16S rRNA. Các trình tự nucleotide của vi
khuẩn được lưu trữ trên các cơ sở dữ liệu lớn và việc tìm kiếm thông tin về trình tự
nucleotide cũng rất đơn giản nên việc định danh vi khuẩn chủ yếu dựa vào kỹ thuật giải
trình tự gen 16S rRNA. Tuy nhiên, kết quả định danh vi khuẩn bằng kỹ thuật giải trình tự
còn gây nhiều tranh cãi, nên ở đề tài này vi khuẩn được định danh bằng cách kết hợp kỹ
thuật giải trình tự gen 16S rRNA và phương pháp truyền thống sử dụng hệ thống phân
loại của Bergey (John et al., 1994) để tăng độ tin cậy.

2.3.1. Phương pháp truyền thống - Hệ thống phân loại Bergey
2.3.1.1. Khảo sát hình thái và cấu tạo của vi khuẩn
a) Nhuộm Gram
Theo John (1994) và Benson (1997), bước thứ nhất là nhuộm Gram mẫu vi khuẩn.
Nhuộm Gram là phương pháp dùng để chia các loài vi khuẩn thành 2 nhóm là Gram
dương (Gram positive) và Gram âm (Gram negative) dựa trên các đặc tính hóa lý của
vách tế bào. Phương pháp này được đặt tên theo người phát minh ra nó, nhà khoa học
người Đan Mạch Hans Christian Gram (1853-1938). Ông phát triển kỹ thuật này vào năm
1884, về sau được Hucker và nhiều nhà khoa học khác cải tiến.
Theo Nguyễn Lân Dũng et al. (2007), phương pháp nhuộm Gram dựa vào khả năng
lưu giữ crystal violet của vách tế bào vi khuẩn sau khi bị tẩy bằng cồn. Xác định thời gian
tẩy màu là yếu tố quan trọng trong việc phân biệt vi khuẩn Gram dương và Gram âm. Nếu
kéo dài thời gian tẩy màu, ngay cả vi khuẩn Gram dương cũng không giữ được màu
nhuộm ban đầu. Ngoài ra, một số loài vi khuẩn Gram dương cũng có thể bị tẩy màu dễ
dàng và vì thế chúng được coi là các chủng vi khuẩn có tính chất bắt màu Gram thay đổi
(có thể âm lẫn dương). Chất nhuộm fuchsin (hoặc có thể thay bằng safranin) tạo cho vi
khuẩn Gram âm có màu hồng đỏ. Fuchsin nhuộm màu mạnh hơn và có màu dễ nhìn hơn
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
12

safranin. Vi khuẩn Haemophilus spp. và một vài chủng vi khuẩn kỵ khí không ăn màu
safranin.
Theo McClelland (2001), có một số nguyên nhân làm sai lệch kết quả nhuộm Gram
như sau:
- Nguyên nhân làm cho vi khuẩn Gram dương lại cho kết quả Gram âm:
+ Nhiệt độ cố định mẫu quá nóng làm cho các tế bào dễ dàng bị mất màu.
+ Rửa nước hơn 5 giây sau khi nhuộm vi khuẩn đã được cố định với crystal
violet, crystal violet rất dễ bị rửa trôi bằng nước. Thời gian rửa tốt nhất là 2 giây.
+ Lứa cấy quá già: vi khuẩn trong quá trình biến dưỡng sinh ra một số chất có

khả năng làm tăng tính acid của môi trường nuôi cấy gây sai lệch kết quả. Tốt nhất nên
nhuộm Gram với lứa cấy từ 18-24 giờ.
+ Dung dịch Lugol bị hỏng: phải bảo quản dung dịch lugol trong chai nâu,
tránh ánh sáng và cần loại bỏ ngay khi thấy dung dịch chuyển màu từ nâu sang vàng.
+ Tẩy màu quá mức: nhỏ quá nhiều cồn hoặc không rửa nước ngay. Nếu nhỏ từ
từ cồn 95% cho đến khi vùng phiến kính bạc màu đi, thông thường từ 10-15 giây. Rửa
ngay với nước để chấm dứt công đoạn tẩy màu.
- Nguyên nhân làm cho vi khuẩn Gram âm lại cho kết quả Gram dương:
+ Cố định tiêu bản khi còn ướt, các hợp chất protein có trong môi trường hoặc
trong mẫu vi khuẩn làm tiêu bản khó tẩy màu.
+ Tẩy màu chưa đạt.
+ Vết bôi vi khuẩn quá dày.
b) Khảo sát hình thái kích thước và sự liên kết tế bào
Sau bước nhuộm Gram, vi khuẩn được quan sát qua tiêu bản sống dưới kính hiển vi
quang học với độ phóng đại 1000 lần để xác định hình dạng, kích thước và sự liên kết của
tế bào.
Theo Phạm Văn Kim (2007), vi khuẩn có ba hình dạng chính là cầu khuẩn (coccus),
trực khuẩn (bacille, monas) và xoắn khuẩn (spira). Giữa ba loại này thường có những
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36-2013 Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
13

dạng trung gian. Thí dụ như dạng cầu trực khuẩn (coccobacille) hoặc dạng phẩy khuẩn
(vibrie).
* Cầu khuẩn: là loại vi khuẩn có hình cầu, hình hạt cà phê nhưng cũng có thể là hình
bầu dục hoặc ngọn nến, có đường kính trung bình khoảng 0,5-1 µm. Cầu khuẩn được chia
thành một số loại sau:
- Đơn cầu (Micrococcus): vi khuẩn hình cầu, sống riêng lẻ, sống hoại sinh trong đất,
nước, không khí.
- Song cầu (Diplococci) là những cầu khuẩn liên kết với nhau thành từng đôi (do

phân cắt theo mặt phẳng xích đạo) như phế cầu (Streptococcus pneunoniae), lậu cầu
(Neisseria gonorrhoeae) và não mô cầu (Neisseria meningitidis).
- Liên cầu (Streptococci) là những cầu khuẩn liên kết với nhau tạo thành chuỗi.
- Tụ cầu (Staphylococci) là những cầu khuẩn phân cắt theo các mặt phẳng bất kỳ và
liên kết với nhau thành từng đám như chùm nho, hoại sinh hoặc ký sinh gây bệnh cho
người và gia súc.
- Sarcina phân cắt theo ba mặt phẳng trực giao với nhau và tạo thành khối gồm 8, 16
tế bào hoặc nhiều hơn. Hoại sinh trong không khí. Sarcina urea có khả năng phân giải urê
khá mạnh.
* Trực khuẩn: là những vi khuẩn hình que, đầu tròn hay đầu vuông, kích thước
thường gặp có chiều rộng khoảng 0,5-1 µm, chiều dài khoảng 1-4 µm (các trực khuẩn
không gây bệnh thường có kích thước lớn hơn), bao gồm:
- Bacillus: là những trực khuẩn Gram dương, có nội bào tử, không thay đổi hình
dạng khi sinh nội bào tử.
- Các trực khuẩn Gram âm, không sinh nội bào tử, có roi gồm các chi Pseudomonas
có 1-7 roi, Xanthomonas có 1 roi, Erwinia có nhiều roi mọc chung quanh
- Corynebacterium có hình chùy, không có nội bào tử, hình dạng và kích thước có
thay đổi nhiều khi nhuộm màu, tế bào thường tạo thành các đoạn nhỏ bắt màu khác nhau.
- Clostridium: là những trực khuẩn Gram dương, 0,4-1 x 3-8 µm, có sinh nội bào tử,
nội bào tử to hơn chiều ngang tế bào nên khi có nội bào tử tế bào thường phình ra ở giữa