phân lập, khảo sát đặc tính và nhận diện vi khuẩn nội sinh ở cây lúa nương trồng tại huyện tuy an, tỉnh phú yên

B GIÁO DO
I HC C
VIN NGHIÊN CU VÀ PHÁT TRIN CÔNG NGH SINH HC



LUT NGHII HC
NGÀNH CÔNG NGH SINH HC


PHÂN LP, KHC TÍNH VÀ
NHN DIN VI KHUN NI SINH  
TRNG TI HUYN TUY AN, TNH PHÚ YÊN





CÁN B NG DN SINH VIÊN THC HIN
Gs. Ts. CAO NGP HU
MSSV: 3092432
LP: CNSHTT K35


C11/2013
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến Viện NC&PT Công nghệ Sinh học



CÁN B NG DN SINH VIÊN THC HIN
(ký tên) (ký tên)



Gs. Ts. Cao Ngp Hu


DUYT CA HNG BO V LU






Cần Thơ, ngày tháng năm 2013
CH TCH HNG
(ký tên)
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến Viện NC&PT Công nghệ Sinh học



u tiên xin gi ln cha m và mi trong gia
ng và dy d con cho n hôm nay!
t c các quý thy cô thuc Vin Nghiên Cu và Phát
Trin Công Ngh Sinh Ht cho tôi nhiu kin thc b ích trong quá trình

hc tp tng!
Xin bày t lòng sâu sc bin thng dn Gs. Ts. Cao Ng
tn tâm dìu dt, tn tình ch dn tôi trong sut thi gian hc tp và thc hin lu
này!
y Hunh Xuân Phong - c vn hc tp lp Công Ngh Sinh Hc tiên
ting viên và tu kin tt cho tôi trong sut thi gian
hc tc hin lut nghip!
   Nguyn Th Xuân M, ch Trn Th Giang - cán b phòng thí
nghim, ch   em trong phòng thí nghim Vi Sinh
Vt - Vin Nghiên Cu và Phát Trin Công Ngh Sinh Hc cùng tt c các bn
lp Công Ngh Sinh Hc tiên ti và cho tôi nhiu li
khuyên b ích trong lúc hc tp và thc hin lu!
Cui li, xin kính chúc cha m, quý thy cô và các anh ch em luôn vui v, mnh
khe và thành công. Chúc các bn lp Công Ngh Sinh Hc tiên tin khóa 35 báo cáo
lup.

C



Hu

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn sống trong mô thực vật, có khả năng cố định đạm,
hòa tan lân khó tan và tổng hợp IAA. Từ 25 mẫu rễ và thân cây lúa gạo đỏ giống Tàu
Cúc thu được ở huyện Tuy An tỉnh Phú Yên phân lập được hai mươi dòng vi khuẩn
trên môi trường Nfb và RMR tỉ lệ 10:10. Qua các phép thử sinh hóa thì tất cả các

dòng vi khuẩn này đều thỏa mãn những đặc tính của vi khuẩn nội sinh, phù hợp với
nhiều công trình nghiên cứu trước đây. Kết quả cho thấy các dòng AN6, AN9, AN15
và AN17 có khả năng cố định đạm, hòa tan lân khó tan và tổng hợp IAA tốt nhất. Các
dòng vi khuẩn đã phân lập đều được xác định là vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật PCR
16S rRNA. Trong đó kết quả giải trình tự cho thấy đoạn DNA của các dòng AN6, AN9,
AN15 và AN17 có tỉ lệ đồng hình 99% lần lượt với trình tự DNA của các dòng
Pseudomonas hibiscicola, Enterobacter cloacae, Acinetobacter radioresistens,
Bacillus sp
Từ khóa: đặc tính, gen 16S rRNA, lúa nương, nhận diện, vi khuẩn nội sinh
ABSTRACT
Plant-associated bacteria that live inside plant tissues without causing any harm
to plants are defined as endophytic bacteria. Twenty bacterial isolates were isolated
from root and stem of the samples taken in Tuy An, Phu Yen province. Ten isolates
(AN1-AN10) were cultured on Nfb medium and ten isolates (AN1-AN10) were cultured
on RMR medium. All of them were tested about the ability of nitrogen-fixation,
phosphate-solubilization and IAA production. Twenty isolates were identified as
endophytes by PCR 16S rRNA technique. Four of twenty isolates (AN6, AN9, AN15,
AN17) were chosen to sequence, DNA sequencing was compared with Genbank
database of NCBI by BLASTN software. The result showed that AN6 isolate was
similarity of 99% with JQ659719 Pseudomonas hibiscicola strain R4-790; AN9 isolate
was a 99% similarity with JX495602 Enterobacter cloacae strain Bio103; AN15
isolate was 97% of the identity with AB859674 Acinetobacter radioresistens strain
MTCC 9821, AN17 isolate was 99% identity with KF417540 Bacillus flexus strain
PHCDB8.
Key words: characteristics, endophytic bacteria, identification, upland rice, 16S
rRNA gene
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Trang
PHN KÝ DUYT
LI CM T
C
MC LC i
DANH SÁCH BNG iv
DANH SÁCH HÌNH v
CÁC T VIT TT vii
I THIU 1
t v 1
1.2. M tài 1
C KHO TÀI LIU 2
2.1. V a lý huyn Tuy An 2
c v 2
2.3. Vi khun ni sinh 3
2.3.1. Vai trò 4
2.3.2. Ngun gc và cách xâm nhp 4
ng sinh hc 5
2.4. Mt s c tính ca vi khun ni sinh 7
2.4.1. Kh  m 7
2.4.2. Kh  7
2.4.3. Kh ng hp indole-3-acetic acid (IAA) 8
i kháng sinh hc 9
2.4.5. Sn phm thiên nhiên t vi khun ni sinh 10
2.4.6. Kh y sinh hc 10

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
2.5. K thut PCR (Polymerase Chain Reaction) 11

2.5.1. Ly trích hay tách chit DNA 11
2.5.2. Phn ng PCR 12
2.5.3. K thun di 13
U 16
n nghiên cu 16
3.1.1. Dng c, thit b 16
3.1.2. Nguyên vt liu 16
3.1.3. Hóa cht 16
u 17
3.2.1. Thu thp và x lý mu 17
3.2.2. Phân lp vi khun 17
3.3.3. Quan sác khun lc 18
3.3.4. Quan sát hình dng và kh ng ca vi khun 18
3.3.5. Nhum Gram t bào vi khun 18
3.3.6. Kho sát kh  m 19
3.3.7. Kho sát kh  20
3.3.8. Kho sát kh ng hp Indole-3-acetic acid (IAA) 21
3.3.9. Nhn din vi khun ni sinh bng k thut PCR 22
T QU VÀ THO LUN 26
4.1. Kt qu phân lp 26
m khun lc ca vi khun 27
m ca t bào vi khun 28
4.4. Kh  m 29
4.5. Kh  32
4.6. Kh ng hp IAA 34
4.7. Nhn din các dòng vi khun ni sinh bng k thut PCR 38
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
T LU NGH 44

5.1. Kt lun 44
 ngh 44
TÀI LIU THAM KHO 45
PH LC


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


ng chun NH
4
+
20
ng chun P
2
O
5
21
ng chun IAA 22
Thành phn mt phn ng PCR 23
. Ngun gc các dòng vi khun phân lng Nfb và RMR 26
m khun lc ca vi khun phân lng Nfb và
RMR 27
m t bào ca 20 dòng vi khuc 28
 ng ca lúa go tính theo t l pht khô so vi mt
s cây ly ht khác 51
ng NFb 51
Thành phng RMR 52

ng Burk 52
 12. Công thng NBRIP lng 53
ng LB 53
t qu thng kê kh  m, hòa tan lân, tng hp IAA ca
các dòng vi khun phân lng Nfb 53
t qu thng kê kh  m, hòa tan lân, tng hp IAA ca
các dòng vi khun phân lp trên mông RMR 58
Kt qu so sánh gia các nghim thc thông qua giá tr LSD ca các dòng
vi khun phân lng Nfb và RMR 63
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
DANH SÁCH HÌNH

 2
Hình 2. Azospirillum brasilense i kính hin t, x15000 6
Hình 3. Herbaspirillum seropedica 6
Hình 4. Azotobacter spp. 6
 l trình tng hp IAA  Enterobacter cloacae 9
Hình 6. Máy gia nhit (máy PCR) và b n di 15
Hình 7. Thang chun 15
Hình 8. Chu trình PCR 16S rRNA 24
Hình 9. Vi khun sau 36 gi nuôi cc Nfb (trái) và RMR
(phi) to màng mng trên b mng 27
Hình 10. Khun lc ca vi khun ni sinh cng Nfb và RMR 27
Hình 11. Kh ng hp NH
4
+
(mg/l) trung bình ca 10 dòng vi khun c
phân lp t ng Nfb 30

Hình 12. Kh ng hp NH
4
+
(mg/l) ca 10 dòng vi khun c phân lp t
ng Nfb theo thi gian 30
Hình 13. Kh ng hp NH
4
+
(mg/l) trung bình ca 10 dòng vi khun c
phân lp t ng RMR 31
Hình 14. Kh ng hp NH
4
+
(mg/l) ca 10 dòng vi khun c phân lp t
ng RMR theo thi gian 31
Hình 15. Kh 
2
O
5
/l) trung bình ca 10 dòng vi khun
c phân lp t ng Nfb 33
Hình 16. Kh 
2
O
5
/l) ca 10 dòng vi khun c phân
lp t ng Nfb theo thi gian 33
Hình 17. Kh  tan (mg P
2
O

5
/l) trung bình ca 10 dòng vi khun
c phân lp t ng RMR 34
Hình 18. Kh P
2
O
5
/l) ca 10 dòng vi khun c phân lp t
ng RMR theo thi gian 34
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Hình 19. Kh ng hp IAA (mg/l) trung bình ca 10 dòng vi khun c
phân lp t ng Nfb 35
Hình 20. Kh tng hp IAA (mg/l) ca 10 dòng vi khun c phân lp t
ng Nfb theo thi gian 35
Hình 21. Kh ng hp IAA (mg/l) trung bình ca 10 dòng vi khun c
phân lp t ng RMR 36
Hình 22. Kh ng hp IAA (mg/l) ca 10 dòng vi khun c phân lp t
ng RMR theo thi gian 36
Hình 23. Kh ng c m, hòa tan lân và tng hp IAA trung bình ca 10
dòng vi khun trên ng Nfb 37
Hình 24. Kh  m, hòa tan lân và tng hp IAA trung bình ca 10
dòng vi khun trên ng RMR 37
Hình 25. Ph n di ca sn phc nhân lên t n 16S rRNA ca 20
dòng vi khun 38
Hình 26. Kt qu so sánh trình t AN6 vi trình t các dòng vi khun trên ngân
hàng d liu NCBI 39
Hình 27. Kt qu so sánh trình t AN9 vi trình t các dòng vi khun trên ngân
hàng d liu NCBI 40

Hình 28. Kt qu so sánh trình t AN15 vi trình t các dòng vi khun trên ngân
hàng d liu NCBI 41
Hình 29. Kt qu so sánh trình t AN17 vi trình t các dòng vi khun trên ngân
hàng d liu NCBI 42
Hình 30. Cây ph h (phylogenetic tree) trình bày mi quan h gia bn dòng vi
khun ni sinh thc hi    imum-Likelihood vi
1500 ln lp li (Bootstrap) da theo trình t gen 16S rRNA 43


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến vii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


BLAST The Basic Local Alignment Search Tool
BLASTN Nucleotide Blast
CTAB Cetyl trimethylammonium bromide
DMSO Dimethyl sulfoxide
DNA Deoxyribonucleic acid
EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid
GDP Gross Domestic Product
IAA Indole-3-acetic acid
LB Luria broth
LSD Least Significant Difference
NBRIP National Botanical Research Institute's phosphate growth medium
NCBI National Center for Biotechnology Information
Nfb medium Nitrgen fixing bactria medium
PCR Polymerase chain reaction
RMR medium Rennie medium supplemented with rice extract and malate
RNA Ribonucleic acid

SDS Sodium dodecyl sulfate
Taq Thermus aquaticus
TBE Tris/Borate/EDTA
TE buffer Tris-EDTA buffer

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 1 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
 

1.1. 
Vi khun nc tìm thy trong hu ht tt c các loài thc vt c
nghiên cu, chúng sng trong các mô ca cây ch và hình thành các mi quan h khác
nhau, bao gm cng sinh, h sinh, hi sinh. Vi khun ni sinh có nhiu ging r
d  Enterobacter, Pseudomonas, Burkholderia, Azospirillum, Azotobacter
Hu ht các vi khun ni sinh có ngun gc t vùng r tuy nhiên mt s có th c
truyn qua ht ging. Vi khun ni sinh có th y s 
sut ca cây  có th hom soát sinh hc. Vi khun ni sinh
sn xut các sn phm t nhiên có th khai thác ti dng trong nông nghip,
y t hoc các ngành công nghic chng minh rng có tim
i b các cht gây ô nhing trong vic ci tt
thông qua kh  m.
Khai thác vi khun ni sinh dn viy sc khe thc vt
vai trò quan trng trong các ng dng nông nghip bn vng cho c thc phm và cây
trng. S hiu bit v c tính ca vi khun ni sinh cùng v
cu và ng dng chúng s là u cn thi  tiu qu
cho các ng dng thc ti

Phân lp, khc tính và nhn din vi khun ni sinh  ng
ti huyn Tuy An, tnh Phú Yên nhm chn ra mt s dòng vi khuc tính tt

ng dng trong sn xut nông nghip.

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 2 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
 

2.1. V a lý huyn Tuy An
Huyn Tuy An thua phn hành chính tnh Phú Yên, vùng Duyên hi Nam
Trung B. V trí huyn nm ven bin tnh Phú Yên, phía bc giáp vi th xã Sông Cu
ng Xuân, phía nam là thành ph Tuy Hòa, phía Tây giáp vi huy và
. a hình  ng gng bng và
bin.
Tuy An nm  a ng
n. Huya hình thp t m cao nht là núi Hòn
Chuông, cao 500 m. Nhiu xã núi non him tr
. Huyn có din tích 435 km
2
, 
 và tng 
.
2.2. 

Hình 1
(*Nguồn: 2-xanh-2-vang 48.html, ngày
23/07/2013)
Chi Lúa (danh pháp khoa hc: Oryza) là mt chi ca 15-20 loài thuc h Hòa
tho (Poaceae) và nm trong phân h Oryzoideae, có ngun gc  các khu vc nhit
i và cn nhii ca châu Á và châu Phi. Chi này bao gm c nhng loài sng lâu


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 3 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
c gi là m. Sau khi ngâm 
ng lúa c cày, ba k
t khong thi gian thì nh m
cy trong ru cao t 1-2 m vi các lá mng,
hp b-2,5 cm và dài 50- t th phn mc thành
các cm hoa phân nhánh cong hay r xung, dài 30-50 cm.
Sn phc t-12 -3
mm. Sau khi xát b lp v c sn phm chính là go và các ph phm là
cám và tru. Go là nguc ch yu ct na dân s th gii (ch
yu  châu Á và châu M (Oryza sativa
s c trên th gic có tm quan trng toàn cu.
t loi lúa mc trên các tring
bào các dân tc min núi gieo trng  i cao hon núi, nhc.
Các ging lúa g a bàn huyn Tuy An có kh u hn tt, phù
hp vng ci núi Phú Yên. Ngoài yu t phù hp vi
u kin t nhiên không thun li  i núi Phú Yên thì theo báo cáo kt
qu kim tra do Công ty c phnh và Kh trùng FCC (TP H Chí Minh) tin
hành: các ging lúa g Tuy An có chng các cht Protein, Canxi, Kali,
i ging lúa cn LC93 (ging lúa cc Vin
Bo v thc vt - B NN-PTNT cung c làm gii chc xem là
ging lúa có cha ngun gen quý, cc bo v.
Hong sn xut lúa hin ti tp trung ch yu  hai xã An Hòa, An Hip
huyn Tuy An vi các ging lúa: Tàu cúc, Bát qung lúa Tàu
c nhii dân la chn vì có thng phù hp t
khá; 2 ging Bát qu h dân sn
xut các ging này không còn nhiu.
2.3. 

Vi khun ni sinh là vi khung ca cây ch mà không
làm tn hn cây (Misaghi et al., 1990).
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 4 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Vi khun nc phát hin trong hu ht các loài thc vt. Không nhng
vy chúng còn rt phong phú v chng loi, vi hu ht thuc chi vi khu
Enterobacter, Pseudomonas, Burkholderia, Azospirillum.
2.3.1. Vai trò
Vi khun ni sinh có mt s  giúp ích cho s ng và khe mnh
ca cây. Nh này có vai trò quan tru cho vic s dng cây trng
làm nguyên liu cho nhiên liu sinh hc và hp th carbon thông qua sn xut sinh
khi.
n vùng r, vi khun nc chng minh là có kh 
y thc vng nh vào vic sn xut các phytohormones, các enzyme tham
     i ch       -
aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) deaminase, auxin, indole-3-acetic acid
(IAA), acetoin, 2,3- ci
thin s ng thc vt thông qua s c m (diazotrophy) (Triplett, 1996)
và cung cp các khoáng chte.
Nhng nghiên cu gy vi khun ni sinh có kh p
cht kháng mm bn, nm,. Bên c 
phân hy các hóa chc hi dùng trong nông nghip.
2.3.2. 
Ngun gc ca vi khun nc khnh. Tuy nhiên, nhiu kt
qu nghiên cu cho rng vi khun ni sinh xut phát t t.
Vi khun ni sinh xâm nhp vào mô thc vt theo nhi b
mt r và tìm cách chui vào r chính hay r bên, thông qua lông hút, di chuyn gia
các t bào nhu mô r hay biu bì r  sng n   Azotobacter, Bacillus,
Beijerinckia, Derxia, Enterobacteriaeae (Klebsiella, Enterobacter, Pantonae),

Pseudomonas, Alcaligenes, Azoarcus, Burkholderia, Campylobacter, Herbaspirillum
Gluconacetobacter, và Paenibacillus        
xâm nhp vào mô thc vt thông qua khí khng hay các v trí b ta lá
(Roos và Hattingh, 1983).
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 5 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Vi khun Azospirillum
Azospirillum thuc nhóm vi khun Gram âm, có th chuyng, dng hình que
ngc bin thiên trong khong 0,8- chiu rng và 1,4-u
dài. Các loài Azospirillum biu hin s phân b sinh thái vô cùng rng lc gn
lin vi s ng to ln ca cây trng (van Berkum và Bohlool, 1980).
Mt s loài ph bi ng xut hin  r và thân lúa và   
Azospirillum brasilense, Azospirillum lipoferum, Azospirillum amazonense,
Azospirillum irakens.
Vi khun Herbaspirillum
Vi khun Herbaspirillum thuc nhóm   Proteobacteria, là vi khun c nh
m sng trong r ca nhiu cây không phi là h u, bao gm các loi cây h lúa có
giá tr kinh t.
Các loài Herbaspirillum seropedicae và Herbaspirillum rubrisubalbicans 
c tìm thy  cây b  ng, lúa hoang và lúa trng (Baldani et al., 1986;
Olivares et al., 1996). Vi khuc tìm thy  c 
trng nhii (Cruz et al., 2001).
Hu ht các loài ca Herbaspirillum thuc nhóm vi khun ni sinh bt buc
trong các mô thc vt. Trong vùng r chúng có kh    m mnh m
(Baldani et al., n c nhng vùng  thân và lá
(Barraquio et al., 1997).
Vi khun Azotobacter

Chi Azotobacter ng có kh ng, hình bu dc hoc hình cu, có th
sn xut mng ln cht nhn nang. Chúng thuc loi vi khun hiu khí. Khi sng
t  nhiên, c
n, và gii dng i diu tiên
ca chi, Azotobacter chroococcumc phát hin và mô t i nhà vi sinh
hc và thc vt hi Hà Lan Martinus Beijerinck. Azotobacter là vi khun Gram
c tìm tht trung tính và kic và sng ni sinh
trong thc vt.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 6 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Nhng loài thuc chi Azotobacter có th tng hp mt s loi enzyme
nitrogenase, enzyme quan trng nhn s c m.

Hình 2. Azospirillum brasilense i kính hin vn t, x15000
(*Nguồn: , ngày 20/02/2013)

Hình 3. Herbaspirillum seropedica
(*Nguồn: :8088/funpar/index.php?option=com_content&view=article&id=73 , ngày
21/02/2013)


Hình 4. Azotobacter spp.
(*Nguồn: , ngày 20/02/2013)


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 7 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Mt s nhóm vi khun ni sinh khác

Ngoài nhng loài trên, còn có mt s nhóm vi khun va mc phát hin gn
  Gluconacetobacter diazotrophicus, Klebsiella, Enterobacter, Azoarcus,
Pseudomonas, Burkholderi, Cellulomonas, Clavibacter, Curtobacterium,
Microbacterium, Gammaproteobacteria, Acinetobacter, Bacillus và Firmicutes 
có trin vng nghiên cu sâu.

2.4.1
t cht cn thit cho nhiu quá trình; và là cht ch yu ca bt k dng
s   t. Nó là thành phn chính trong tt c amino acid, và có mt
trong các chn cu thành nên các axit nucleic, n DNA và RNA. Trong thc
vt, hu hc dùng trong các phân t chlorophyll, là cht cn thit cho quá
trình quang hp và s phát trin v sau c thành phn chính ca khí
quyn (khong 78%) , có th  t b chn nh
trong khí quyng tn ti dng phân t nên có giá tr s dng rt hn ch i
vi sinh vt.
ng cht chính gii hn s phát trin ca lúa, lúa c sn
xut ra 15-20 kg lúa ht (Ladha và Reddy, 2003). C m sinh hc là mt quá
 c thc hin bi vi khu      c bi i thành dng
nguyên t amonia, tin s bii
tip mt phn thành dng h s dng cho bn thân vi khun.  m
bo an toàn thc phm thông qua nn nông nghip bn vng, nhu cu c m
sinh h dc c dnh bng
công nghip.
Vi sinh vt c ng trong chu trình chuy
t c bit nh quá trình c  m sinh hc mà nhu cu v a cây
trt mng 170 t
c chuyp cht nh  cung cp cho cây trng.
2.4.2
t, lc phân thành 3 loi chính là 
hKucey et al., 1989). Cây ch có th c lân t i dng

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 8 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
hoà tan trong dung dt (dng d tiêu), ch yu  dng orthophosphate bc mt
hoc bc hai. Nhiu lo  t khá
     c vì lân  i dng khó hoà tan  
hydroxyapatite, và oxyapatite.
ng tn ti mt nhóm vi sinh vt có kh 
sinh vc các nhà khoa ht tên là nhóm vi sinh vt hoà tan lân (phosphate
solubilizing microorganisms).
Nhóm vi sinh vt này d dàng nuôi c   ng nhân to. Nhi 
i ta trn sinh khi hoc bào t các loi vi sinh vt hoà tan lân sau khi nuôi cy và
nhân lên trong phòng thí nghim vi bt phosphorit hoc apatit ri bón cho cây. Các
ch phm sinh hi hiu qu cao  nht cây b thiu lân.
2.4.3-3-acetic acid (IAA)
Indole-3-acetic acid (IAA) hay còn gi là auxin, là chu hòa ch yu ca s
ng thc vt. IAA chi phi s phân chia t bào, s giãn dài t bào, phân hóa
sinh mô, phát trin trái và ht, chi ph   u s phát trin ca cây trng
 ng ca auxin ph thuc vào dng t bào,  các n 
ng thi s giãn dài trc lá mn s ng ca r
chính, kích thích s khu ca r bên và s thành lp lông r (Theologis và Ray,
1982; Gray et al., 2001).
Có nhiu l trình tng hp IAA trong thc vn
ch tng h cp nhiu nht. Theo Koga et al. (1991), các l trình
sinh tng hp IAA gm có:
- L trình indole-3-pyruvic acid
Tryptophan => indole-3-pyruvic acid =>indole-3-acetaldehyde => IAA
- L trình tryptamine
Tryptophan => tryptamine => indole-3-acetaldehyde => IAA
- L trình indole-3-acetamine

tryptophan => indole-3-acetamine => IAA
Vi khun Enterobacter cloacae có kh  ng hp IAA t tin cht L-
tryptophan (Koga et al.,1991).
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 9 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Hình 5.  l trình tng hp IAA  Enterobacter cloacae
(*Nguồn: Kaga et al., 1991)
Vi khun ni sinh có kh ng hp IAA là do chúng cha nhng enzyme
c hiu thuc nhóm dehydrogenase.
2.4.4
i kháng sinh hc là bin pháp s dng các sinh vt, vi sinh vi kháng hay
sn phm ca chúng trong kim soát sinh hc, nhn, dit tr các sinh vt,
vi sinh vt gây bnh. Nó không nhng phòng, tr sâu bnh hi có hiu qu mà còn
khc phc nhm ca bin pháp s dng các cht hoá hc bo v
thc vt.
Bin pháp sinh hc không hoc rt ít gây ô nhing, góp phn vào vic
gi cân bc hi vi s dng, các nông phm to ra có cht
ng cao, sch an toàn vi sc kho i và vt nuôi. Vì vy bin pháp sinh hc
c s dng khá ph bin  nhic phát trin và hic m
rng, khuyn khích s dng  hu hc trên th gii và có nhiu trin vng
phát trin m
Mt s vi khun ni sinh kích hot hing gi là h th kháng cm ng
(induced systemic resistance-     th  kháng mc phi
(systemic-acquired resistance-SAR). SAR phát trin khi thc vt thành công kích hot
 bo v c ng vi s nhim trùng do mt tác nhân gây bnh.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 10 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

ISR chng li các tác nhân gây bnh có hiu qu i SAR vì vi khun
gây không gây ra các triu chng có th nhìn thy trên cây ch (van Loon et al, 1998).
Nhiu thí nghing minh vi khun ni sinh có kh 
n tác hi ca sinh vt gây bnh. Tùy ng gây hi khác nhau mà
có nhu khác nhau.
2.4.5. Sn phm thiên nhiên t vi khun ni sinh
Nhng chi vi khun n   Pseudomonas, Burkholderia và Bacillus
c bin vi kh ng hp các sn phm th cp
p cht hm, kháng virus,
c ch min dch.
Trong khi hu ht các nghiên cp trung vào sn xut ch phm vi sinh có
trng phân t nh, hong  n thp chng li vi khun gây bnh cho
ng vi và thc vt.
Mt thành viên ca chi Pseudomonas là Pseudomonas viridiflava, phân lp trong
các mô ca nhiu loài c c tìm th sn xut hai hp
cht kháng khun mc gi ca các lipopeptides
mc to thành t mt s ng bao gm homoserine và
-hydroxy aspartic acid. Nhng hp chc cho rng có kh c ch các
mm bnh  i Cryptococcus neoformans và Candida albicans (Miller et al,
1998.).
Các sn phm th c c trích ly t s lên men ca nhng loài vi
khuPseudomonas, Burkholderia, Bacillus (Lodewyckx et al., 2002)










Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 11 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học



2
.
Ví d n ni sinh trong cây trng phát trin tt  t b nhim
c có cha gene có kh   y các hp ch c h    
2001).

n th
         h        
hoc
2.5.  PCR (Polymerase Chain Reaction)
2.5.1. Ly trích DNA
K thut tinh chit DNA là mt trong nhng k thut sinh hc phân t u tiên
vô cùng quan trng, góp phn cho s thành công trong nhc tip theo. Hin nay
có rt nhiu cách làm n, thi gian thc hin rút ngn tùy theo m dng
 làm gì, hoc chit xut DNA t long gì.
 c DNA tinh sch cn loi b nhng thành phn tp nhim mà quan
trng nht là protein. Tách chit DNA giúp ta thc hi
Theo Neumann (1992), quy trình chung chit xu
1. Chun b mu
2. Phá v t bào
3. Hòa tan DNA
4. Loi b các thành phn không phi là DNA
5. Ta DNA

6. Ra DNA
7. Làm khô
8. Kim tra chng DNA
- Ly trích DNA da trên nguyên tc:
Ly tâm dch vi khu phá v màng t bào, ging.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 12 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Dung dch TE pH8 có tác dng hòa tan t bào và giúp DNA không b bin tính. Dung
d phá v màng nhân làm cho DNA phóng thích vào dung dch
Proteinase K là mc bic s d chit sut và
tinh sch DNA có trng phân t c dù
chit sut RNAse và làm bt ho hong có hiu
qu c duy trì trong s hin din ca SDS, EDTA và urea.
Proteinase K có tác dng phân hy protein.
10% CTAB/0,7M NaCl to phc tan v   o phc dng ta vi

Chloroform: isoamyl alcohol (24/1) giúp phân tách và kéo các thành phn không
phi là DNA xung mi dung dch.
Ethanol 70% giúp gi ta DNA, loi b mu     ng
isopropanol còn li trong DNA.
Sy DNA trong máy s loi b ethanol.
2.5.2. Ph PCR
PCR là ch vit tt ca cm t Polymerase Chain Reaction hay phn ng khuch
i gen. PCR là mt k thut ph bin trong sinh hc phân t nhm khuyi mt
n DNA (to ra nhiu bn sao) mà không cn s dng các sinh vt s  E.
coli hay nc s dng trong các nghiên cu sinh hc và y hc phc v
nhiu m   n các bnh di truyn, nhn dng, ch 
nhng bnh nhim trùng, tách dòng gene, nh huyt thng, vân tay di truyn, gây
t bim, phân tích mu DNA cnh kiu gene ct bin và so sánh

m biu hin ca gene,
Chu k PCR gc:
n tách: t lên 94- tách hai sc này gi là
bin tính và nó giúp phá v cu ni hydrogen ni 2 sc chu k 1, DNA
c bin thi gian m chu m bo mu DNA và m c
phân tách hoàn toàn và ch còn dng si gian: 1-2 phút
n gn mi: sau khi 2 si DNA tách ra, nhi c h thp xu
mi có th gn vào sc này gi là gn mi. Nhi n này
ph thun mng th bin tính 50°C (45-60°C). Nu
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 13 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
s dng sai nhi n này s dn vin mi không gn hoàn
toàn vào DNA mu, hay gn mt cách tùy tin. Thi gian: 1-2 phút.
n tng hp: DNA polymerase gn tip vào si trng. Nó bu bám vào
và hong dc theo sc này gi là kéo dài. Nhi kéo dài ph thuc
DNA polymerase. Thi gian c c này ph thuc vào c DNA polymerase và
chiu dài mnh DNA cn khui.
c tin hành t 35-40 chu k.
Primer 16S rR nhn dng vi khun ni sinh có trình t sau:
p515FPL -GTGCCAGCAGCCGCGGTAA- 
p13B -AGGCCCGGGAACGTATTCAC- 
2.5.3. 
n di là hing dch chuyn ca các vt th ng
cng. S dch chuyn này do thành phn ln trong lc Lorentz.
   n di trên gel (electrophoresis hay gel electrophoresis) áp dng
trong sinh hc phân t là mt k thu  phân tích các phân t DNA, RNA hay
protein dm vt lý cc, hình dm
n tích (isoelectric point).
K thut này s dng mt dung d dn din và tng

u, mt b n
phân tách các phân t, và các cht nhum khác nhau (ethidium bromide, bc, xanh
c phát hin v trí các phân t n di.
K thun di hong nh vào lc kéo cng vào các
phân t c l ca th nn (gel). Gel cu to bi các chui cao
phân t c liên kt chéo vi nhau to thành mt h thng mi vi
 c các m i tùy thuc vào n  cht cao phân t (agarose,
polyacrylamide) và phn ng to liên kt chéo.
Các phân t c phân tách khi di chuyn trong gel vi vn tc khác nhau nh
vào s khác nhau ca:
- Lc cng lên chúng (nu các phân t n khác nhau).
- c ca phân t so vc l gel.
- Hình d cng knh ca phân t.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 35TT - 2013 Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 14 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
in di bng gel agarose bao gm vic nh mu sn phm PCR ca DNA vào
n di trên gel. Kt qu n DNA nh  di
chuyn ln qua gel t cn cc ca sn
phm PCR có th c nh bng vic so sánh vi thang chun DNA, thang này
có chm trong gel.
Loading buffer là buffer ti DNA cha glycerol, bromophenol blue và
xylencyanol và sucrose.      úp to màu,
glycerol và sucrose có t trng cao giúp kéo DNA nm trong ging không b trôi ra
ngoài trong khi load mu.
DNA ng 

           



cùng vi
       ng TE b  10 mM Tris-HCl
pH 7, mM EDTA trong 1l
trên gel.