hiệu quả đường gluocse, acid acetic đến khả năng tăng sinh của vi khuẩn pseudomonas stutzeri d3b, bacillus subtilis tgt.013l và ứng dụng vi khuẩn trong xử lý nước rỉ rác và nước thải chăn nuôi heo

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
o0o



LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HIỆU QUẢ ĐƯỜNG GLUOCSE, ACID ACETIC ĐẾN
KHẢ NĂNG TĂNG SINH CỦA VI KHUẨN
Pseudomonas stutzeri D3b, Bacillus subtilis TGT.013L
VÀ ỨNG DỤNG VI KHUẨN TRONG XỬ LÝ
NƯỚC RỈ RÁC VÀ NƯỚC THẢI CHĂN NUÔI HEO


CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
Gs.Ts. CAO NGỌC ĐIỆP NGUYỄN VĂN LƯỢNG
MSSV: 3096833
LỚP: CNSH TT 35




Cần Thơ, Tháng 11/2013
Luận văn tốt nghiệp tốt nghiệp khóa 35 (2009-2013) Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
ii
PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN




Gs.Ts. Cao Ngọc Điệp Nguyễn Văn Lượng



DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG



PGs.Ts. Trương Trọng Ngôn

Luận văn tốt nghiệp tốt nghiệp khóa 35 (2009-2013) Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
iii
LỜI CẢM TẠ
  
Sau thời gian học tập tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học,

Trường Đại học Cần Thơ, tôi xin chân thành gởi lời cảm ơn đến Quý thầy cô trong viện
đã chỉ dạy cho tôi những kiến thức chuyên môn bổ ích và cần thiết cho công việc tương
lai sau này của tôi được thuận lợi.
Đặc biệt, tôi xin dành lời cảm ơn chân thành đến thầy Gs.Ts. Cao Ngọc Điệp đã
đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất, chỉ dạy tôi nhiều kiến thức
khoa học trong quá trình học tập, cung cấp cho tôi những tài liệu cập nhật và chính xác
để tôi nhìn nhận, phát hiện những nội dung mà đồ án tốt nghiệp của tôi đề cập dưới sự
hướng dẫn của Thầy.
Tôi xin cám ơn chị Trần Thị Giang và chị Nguyễn Thị Xuân Mỵ - cán bộ phòng
thí nghiệm Vi sinh vật Môi trường và Vi sinh vật Đất cùng quý thầy cô, anh chị cán bộ
các phòng thí nghiệm của Viện NC&PT CNSH đã hỗ trợ, đóng góp ý kiến và tạo điều
kiện thuận lợi để tôi thực hiện tốt đề tài này.
Xin chân thành cám ơn các anh chị học viên cao học, các bạn học viên của phòng
thí nghiệm đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình và người thân đã động
viên, khích lệ và luôn ủng hộ tôi về mặt vật chất cũng như tinh thần trong suốt thời gian
qua để tôi vững tin thực hiện đề tài.
Tôi xin kính chúc quý Thầy Cô cùng các bạn sinh viên luôn dồi dào sức khỏe, công
tác tốt.
Xin chân trọng cám ơn!
Cần Thơ, ngày…… tháng… năm 2013



Nguyễn Văn Lượng


Luận văn tốt nghiệp tốt nghiệp khóa 35 (2009-2013) Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
iv

TÓM LƯỢC
Nước rỉ rác và nước thải chăn nuôi heo chứa hàm lượng chất ô nhiễm rất cao đặc
biệt là hàm lượng ammonium và lân hòa tan (orthophosphate) góp phần gây ô nhiễm
môi trường. Vì vậy việc xử lí ammonium và orthophosphate trong nước rỉ rác và nước
thải chăn nuôi trước khi thải ra môi trường là điều rất cần thiết. Đề tài “Hiệu quả
đường glucose, acid acetic đến khả năng tăng sinh của vi khuẩn Pseudomonas
stutzeri B3b, Bacillus subtilis TGT.013L và ứng dụng vi khuẩn trong xử lý nước rỉ
rác và nước thải chăn nuôi heo” được thực hiện.
Thí nghiệm sử dụng vi khuẩn khử đạm Pseudomonas stutzeri dòng D
3
b và vi
khuẩn tích lũy phosphate Bacillus subtilis dòng TGT.013L với nguồn carbon là glucose
(5 g/L) và acid acetic (1 mL/L) với tỉ lệ khác nhau được tiến hành. Kết quả chỉ ra rằng
mật số vi khuẩn chuyển hoá nitơ và vi khuẩn tích luỹ phosphate đều đạt mật số cao nhất
với các nghiệm thức: NT4 (50% glucose – 50% acid acetic); NT5 (75% glucose – 25%
acid acid acetic) và NT6 (100% glucose). Khi áp dụng ba nghiệm thức này vào xử lý
nước rỉ rác và nước thải chăn nuôi heo trên mô hình 1 lít; kết quả sau 48 giờ xử lý hiệu
suất khử đạm nước rỉ rác và nước thải chăn nuôi heo lần lượt ở các nghiệm thức là
NT4: 91,25% và 77,31%; NT5: 98,73% và 63,14%; NT6: 99,58% và 98,00%. Hiệu suất
khử lân nước rỉ rác và nước thải chăn nuôi heo lần lượt là NT4: 100% và 99,49%; NT5:
100% và 100%; NT6: 100% và 100%. Khi chuyển sang thể tích lớn hơn với mô hình 8
lít thì kết quả thu được sau 48 giờ xử lý như sau: hiệu suất khử đạm nước rỉ rác và nước
thải chăn nuôi lần lượt là: NT4: 71,90% và 92,14%; NT5: 80,92% và 93,34%; NT6:
96,81% và 93,42%. Hiệu suất khử lân nước rỉ rác và nước thải chăn nuôi heo lần lượt
là NT4: 85,36% và 61,29%; NT5: 99,10% và 96,25%; NT6: 99,13% và 88,32%. Tuy
nhiên sau 3 lần thay 50% nước thì hiệu suất xử lý ở 3 nghiệm thức sau 48 giờ là khác
biệt không nhiều.
Từ khoá: acid acetic, ammonium, Bacillus subtilis glucose, nước rỉ rác, nước thải
chăn nuôi heo, phosphate, Pseudomonas stutzeri.

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 35 (2009-2013) Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
MỤC LỤC
PHẦN KÝ DUYỆT ii
LỜI CẢM TẠ iii
TÓM LƯỢC iv
DANH SÁCH HÌNH ix
DANH SÁCH BẢNG xi
CÁC TỪ VIẾT TẮT xii
CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu đề tài 2
CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
2.1. Tổng quan về nước rỉ rác và nước thải chăn nuôi heo 3
2.1.1. Cơ chế phát sinh nước rỉ rác 3
2.1.2. Phân loại nước rác 4
2.1.3. Đặc tính nước rác 4
2.1.4. Sơ lược về nước thải chăn nuôi 6
2.2. Quá trình cố định nitơ phân tử 7
2.2.1. Sự đồng hóa nitrogen 7
2.2.2. Quá trình nitrate hóa 8
2.2.3. Quá trình phản nitrate hóa 9
2.3. Sơ lược về vi khuẩn chuyển hóa nitơ Pseudomonas stutzeri 10
2.4. Sơ lược về quá trình loại bỏ phospho sinh học 12
2.4.1. Quá trình loại bỏ phospho sinh học 13
2.4.2. Poly-P 14
2.5. Vi khuẩn tích lũy phosphate (PAOs) 15
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 35 (2009-2013) Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
2.6. Chuyển hóa và điều hòa sự trao đổi chất trong PAOs 17

2.6.1. Trao đổi chất với nguồn carbon là acetate 17
2.6.2. Trao đổi chất với nguồn carbon khác 18
2.6.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ giữa hàm lượng carbon và phosphate trên khả năng
đồng hóa và dị hóa poly-P 18
2.6.4. Ảnh hưởng pH đến quá trình đồng hóa và dị hóa poly-P và acetate 20
2.7. Các nghiền cứu liên quan 21
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
3.1. Thời gian và địa điểm 22
3.1.1. Thời gian nghiền cứu 22
3.1.2. Địa điểm nghiền cứu 22
3.2. Phương tiện thí nghiệm 22
3.2.1. Vật liệu 22
3.2.2. Dụng cụ, trang thiết bị 22
3.2.3. Hóa chất 22
3.3. Phương pháp nghiền cứu 23
3.3.1. Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn 23
3.3.2. Tiến hành thí nghiệm 25
3.3.3. Phương pháp phân tích các chỉ tiêu hóa lý 29
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36
4.1. Thí nghiệm 1: Hiệu quả đường glucose, acid acetic đến khả năng tăng
sinh của vi khuẩn Pseudomonas stutzeri dòng D3b và vi khuẩn tích lũy
phosphate Bacillus subtilis dòng TGT.013L trong nước rỉ rác và nước thải
chăn nuôi heo trên mô hình bình tam giác 0,5 lít/đơn vị thí nghiệm 36
4.1.1. Hiệu quả nguồn carbon đến khả năng tăng sinh của vi khuẩn chuyển
hóa nitơ Pseudomonas stutzeri dòng D3b và vi khuẩn tích lũy
phosphate Bacillus subtilis dòng TGT.013L trong nước rỉ rác 36
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 35 (2009-2013) Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vii Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
4.1.2. Hiệu quả nguồn carbon đến khả năng tăng sinh của vi khuẩn chuyển
hóa nitơ Pseudomonas stutzeri dòng D3b và vi khuẩn tích lũy

phosphate Bacillus subtilis dòng TGT.013L trong nước thải chăn nuôi
heo 41
4.2. Thí nghiệm 2: Hiệu quả xử lý nitơ, phospho trong nước rỉ rác và nước
thải chăn nuôi heo với vi khuẩn chuyển hóa nitơ Pseudomonas stutzeri
dòng D3b, vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus subtilis dòng TGT.013L,
nguồn carbon và giá thể trên mô hình bình 1 lít 44
4.2.1. Hiệu quả xử lý nitơ, phospho trong nước rỉ rác với vi khuẩn chuyển
hóa nitơ Pseudomonas stutzeri dòng D3b, vi khuẩn tích lũy phosphate
Bacillus subtilis dòng TGT.013L, nguồn carbon và giá thể trên mô
hình bình 1 lít 45
4.2.2. Hiệu quả xử lý nitơ, phospho trong nước nước thải chăn nuôi heo với
vi khuẩn chuyển hóa nitơ Pseudomonas stutzeri dòng D3b, vi khuẩn
tích lũy phosphate Bacillus subtilis dòng TGT.013L, nguồn carbon và
giá thể trên mô hình bình 1 lít 48
4.3. Thí nghiệm 3: Hiệu quả xử lý nitơ, phospho trong nước rỉ rác và nước
thải chăn nuôi heo với vi khuẩn chuyển hóa nitơ Pseudomonas stutzeri
dòng D3b, vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus subtilis dòng TGT.013L,
nguồn carbon và giá thể trên mô hình bình 8 lít 51
4.3.1. Hiệu quả xử lý nitơ, phospho trong nước rỉ rác với vi khuẩn chuyển
hóa nitơ Pseudomonas stutzeri dòng D3b, vi khuẩn tích lũy phosphate
Bacillus subtilis dòng TGT.013L, nguồn carbon và giá thể trên mô
hình bình 8 lít 51
4.3.2. Hiệu quả xử lý nitơ, phospho trong nước thải chăn nuôi heo với vi
khuẩn chuyển hóa nitơ Pseudomonas stutzeri dòng D3b, vi khuẩn tích
lũy phosphate Bacillus subtilis dòng TGT.013L, nguồn carbon và giá
thể trên mô hình bình 8 lít 54
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58
5.1. Kết luận 58
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 35 (2009-2013) Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học viii Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

5.2. Đề nghị 58
TÀI LIỆU THAM KHẢO 59
PHỤ LỤC I
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 35 (2009-2013) Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ix Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
DANH SÁCH HÌNH
Hình 1. Một số dạng khuẩn lạc của Pseudomonas stutzeri 12
Hình 2. Cấu trúc chuỗi poly-P 14
Hình 3. Ảnh chụp dưới kính hiển vi điện tử Burkholderia cepacia, các chấm
đen là hạt poly-P 14
Hình 4. Mô tả các đặc điểm sinh hóa chính trong quá trình EBPR. Sự chuyển
đổi kiểu trao đổi chất xảy ra dưới điều kiện kỵ khí và hiếu khí. 17
Hình 5. Mối tương quan giữa tốc độ hấp thu phosphate và hàm lượng COD
ngoại bào. 19
Hình 6. Phương pháp đếm sống 30
Hình 7. Ảnh hưởng nguồn carbon đến mật số vi khuẩn chuyển hóa nitơ
Pseudomonas stutzeri (D3b) trong nước rỉ rác. 36
Hình 8. Ảnh hưởng nguồn carbon đến mật số vi khuẩn tích lũy phosphate
Bacillus subtilis (TGT.013L) trong nước rỉ rác. 38
Hình 9. Ảnh hưởng nguồn carbon với vi khuẩn chuyển hóa nitơ Pseudomonas
stutzeri (D3b) và vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus subtilis
(TGT.013L) lên giá trị pH nước rỉ rác. 40
Hình 10. Ảnh hưởng nguồn carbon đến mật số vi khuẩn chuyển hóa nitơ
Pseudomonas stutzeri (D3b) trong nước thải chăn nuôi heo. 42
Hình 12. Ảnh hưởng nguồn carbon với vi khuẩn chuyển hóa nitơ
Pseudomonas stutzeri (D3b) và vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus
subtilis (TGT.013L) lên giá trị pH nước thải chăn nuôi heo. 44
Hình 13. Ảnh hưởng nguồn carbon với vi khuẩn chuyển hóa nitơ
Pseudomonas stutzeri (D3b), vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus
subtilis (TGT.013L) và giá thể lên hàm lượng ammonium trong nước

rỉ rác. 45
Hình 14. Ảnh hưởng nguồn carbon với vi khuẩn chuyển hóa nitơ
Pseudomonas stutzeri (D3b), vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus
subtilis (TGT.013L) và giá thể lên hàm lượng orthophosphate trong
nước rỉ rác. 46
Hình 15. Ảnh hưởng nguồn carbon với vi khuẩn chuyển hóa nitơ
Pseudomonas stutzeri (D3b), vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 35 (2009-2013) Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học x Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
subtilis (TGT.013L) và giá thể lên giá trị pH trong nước rỉ rác Sự
biến động giá trị pH nước rỉ rác theo thời gian. 48
Hình 16. Ảnh hưởng nguồn carbon với vi khuẩn chuyển hóa nitơ
Pseudomonas stutzeri (D3b), vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus
subtilis (TGT.013L) và giá thể lên hàm lượng ammonium trong nước
thải chăn nuôi heo. 49
Hình 17. Ảnh hưởng nguồn carbon với vi khuẩn chuyển hóa nitơ
Pseudomonas stutzeri (D3b), vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus
subtilis (TGT.013L) và giá thể lên hàm lượng orthophosphate trong
nước thải chăn nuôi heo. 50
Hình 18. Ảnh hưởng nguồn carbon với vi khuẩn chuyển hóa nitơ
Pseudomonas stutzeri (D3b), vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus
subtilis (TGT.013L) và giá thể lên giá trị pH trong nước thải chăn
nuôi heo. 51
Hình 19. Ảnh hưởng nguồn carbon với vi khuẩn chuyển hóa nitơ
Pseudomonas stutzeri (D3b), vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus
subtilis (TGT.013L) và giá thể lên hàm lượng ammonium trong nước
rỉ rác. 52
Hình 20. Ảnh hưởng nguồn carbon với vi khuẩn chuyển hóa nitơ
Pseudomonas stutzeri (D3b), vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus
subtilis (TGT.013L) và giá thể lên hàm lượng orthophosphate trong

nước rỉ rác. 53
Hình 21. Ảnh hưởng nguồn carbon với vi khuẩn chuyển hóa nitơ
Pseudomonas stutzeri (D3b), vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus
subtilis (TGT.013L) và giá thể lên giá trị pH trong nước rỉ rác. 54
Hình 22. Ảnh hưởng nguồn carbon với vi khuẩn chuyển hóa nitơ
Pseudomonas stutzeri (D3b), vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus
subtilis (TGT.013L) và giá thể lên hàm lượng ammonium trong nước
thải chăn nuôi heo. 55
Hình 23. Ảnh hưởng nguồn carbon với vi khuẩn chuyển hóa nitơ
Pseudomonas stutzeri (D3b), vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 35 (2009-2013) Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học xi Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
subtilis (TGT.013L) và giá thể lên hàm lượng orthophosphate trong
nước thải chăn nuôi heo. 56
Hình 24. Ảnh hưởng nguồn carbon với vi khuẩn chuyển hóa nitơ
Pseudomonas stutzeri (D3b), vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus
subtilis (TGT.013L) và giá thể lên giá trị pH trong nước thải chăn
nuôi heo. 57

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 35 (2009-2013) Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học xii Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm trên mô hình 0,5 lít với nguồn carbon là glucose
và acetate với hàm lượng vi khuẩn là 5% 25
Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm trên mô hình 0,5 lít với nguồn carbon là glucose
và acetate với hàm lượng vi khuẩn là 5% 26
Bảng 3.3: Thành phần hóa chất trong dãy đường chuẩn đo đạm NH4+ 31
Bảng 3.4: Phương trình đường chuẩn NH4+ 32
Bảng 3.5: Thành phần hóa chất trong dãy đường chuẩn đo lân PO43- 33
Bảng 3.6: Giá trị giới hạn các thông số và nồng độ chất ô nhiễm theo QCVN

40:2011/BTNMT 34
Bảng 3.7: Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về chất lượng nước mặt. Quyết định
số16/2008/QĐ-BTNMT do Bộ trưởng Bộ Tài nguyên và Môi
trường ban hành ngày 31 tháng 12 năm 2008. 35

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 35 (2009-2013) Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học xiii Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
CÁC TỪ VIẾT TẮT
ANAMOX: Anaerobic ammonium oxidation-oxy
BOD: Biological oxygen demand
COD: Chemical oxygen demand
CCCP: carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone
ĐBSCL: Đồng Bằng Sông Cửu Long
DPAOs: Denitrifying polyphosphate accumulating organisms
EBPR: Enhanced biological phosphorus removal
GAOs: glycogen accumulating organisms
N: Nitơ
P: Phospho
PAOs: Polyphosphate accumulating organisms
PHAs: Polyhydroxyalkanoates
Poly-P: Polyphosphate
SEM: Scanning electron microscopy
TEM: Transmission electron microscopy
VFAs: Volatile fatty acids

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 35 (2009-2013) Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 1 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1. Đặt vấn đề
Theo số liệu tại Hội thảo "Công nghệ xử lý và quản lý chất thải rắn" tại Cần Thơ

tháng 3-2013 cho thấy, hằng năm, tại đồng bằng sông Cửu Long (ÐBSCL) phát sinh
hơn 600 nghìn tấn chất thải rắn thông thường và khoảng 47 triệu m
3
chất thải rắn công
nghiệp, hầu hết đều chưa được quản lý và xử lý triệt để trước khi đưa ra môi trường. Dự
báo đến năm 2015, tổng khối lượng chất thải rắn phát sinh tại các tỉnh, thành phố thuộc
ÐBSCL là khoảng 5.000 tấn/ngày và sẽ tăng lên đến gần 8.000 tấn/ngày vào năm 2020.
Riêng thành phố Cần Thơ, hiện toàn bộ chất thải rắn sinh hoạt thu gom được xử lý bằng
cách chôn lấp tại bãi rác Tân Long (20 ha, Hậu Giang) và bãi rác Ô Môn (4ha ở Q. Ô
Môn, TP Cần Thơ). Trong khi theo Công ty Công trình đô thị Cần Thơ, bãi rác tại Q. Ô
Môn hiện đã lấp đầy khoảng 95% và đang quá tải. Hiện lượng rác đã đổ tại bãi rác Tân
Long khoảng 700.000 tấn và phải tiếp nhận 450-500 tấn rác/ngày đêm của cả TP Cần
Thơ và tỉnh Hậu Giang (hầu hết rác là của TP. Cần Thơ). Với lượng rác khổng lồ như
thế, bãi chôn lấp rác trở thành nơi bị ô nhiễm nghiêm trọng bởi một lượng nước rỉ rác
khổng lồ có hàm lượng ô nhiễm hữu cơ cao do đó vùng đất này trở thành vùng đất chết.
Nước thải từ rác ở các khu xử lý rác chứa hàm lượng chất hữu cơ, nitơ, phospho cao đã
và đang gây nguy hại đối với môi trường và sức khỏe con người (Nguyễn Thành Nhân,
2008). Vì thế, việc xử lý lượng nước rỉ rác là một trong những vấn đề quan trọng và cấp
thiết hiện nay.
Trong thời gian qua, các nghiên cứu về vấn đề xử lý nước rỉ rác mang tính hiệu
quả đã và đang được thực hiện ở trong và ngoài nước. Để có thể xử lý đồng thời các loại
chất hữu cơ, phospho và nitơ có trong nước rác, cần phải kết hợp đúng đắn giữa công
đoạn xử lý sinh vật với công đoạn xử lý hóa lý. Hiện nay, việc ứng dụng vi khuẩn tích
lũy phosphate (Polyphosphate accumulating organisms – PAOs) thông qua quá trình
EPBR, vi khuẩn nitrate hóa và khử nitrate hóa để xử lý đồng thời các chất hữu cơ,
phospho, nitơ có trong nước rác hiện nay được áp dụng rộng rãi trong các biện pháp sinh
học. Tuy nhiên quá trình xử lý đã gặp nhiều gián đoạn và đi đến thất bại. Hàng loạt các
nghiên cứu đã được thực hiện để tìm ra nguyên nhân. Trong số rất nhiều các nguyên
nhân được đưa ra thì nguồn carbon bổ sung là yếu tố đang được chú ý nhất. Các nghiên
cứu cho thấy rằng khi nguồn carbon bổ sung chủ yếu là acetate hoặc propionate thì quá

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 35 (2009-2013) Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 2 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
trình xử lý hoạt động rất hiệu quả, tuy nhiên với nguồn carbon chủ yếu là glucose thì
quá trình bị gián đoạn và đi đến thất bại. Ngược lại, một số báo cáo khác cũng cho thấy
ảnh hưởng tăng cường của glucose đến quá trình xử lý. Để giải quyết tốt vấn đề trên thì
cần phải hiểu rõ cơ chế hoạt động của EPBR và khả năng khử đạm của vi khuẩn bằng
biện pháp sinh học. Vì thế đề tài “Hiệu quả đường glucose, acid acetic đến khả năng
tăng sinh của vi khuẩn Pseudomonas stutzeri dòng B3b, Bacillus subtilis dòng
TGT.013L và ứng dụng vi khuẩn trong xử lý nước rỉ rác và nước thải chăn nuôi
heo” được tiến hành nhằm khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn carbon đến sự phát triển
của vi khuẩn và tìm ra phương pháp tối ưu trong việc sử dụng hiệu quả nguồn carbon
để tăng hiệu quả xử lý nước thải.
1.2. Mục tiêu đề tài
- Xác định được tỷ lệ đường glucose và acid acetic thích hợp nhất cho sự sinh
trưởng của vi khuẩn chuyển hóa nitơ Pseudomonas stutzeri dòng D3b và vi khuẩn tích
lũy phosphate Bacillus subtilis dòng TGT.013L trong nước rỉ rác và nước thải chăn nuôi
heo.
- Xác định được tỷ lệ đường carbon và acid acetic mang lại hiệu quả xử lý đạm,
lân tối ưu nhất trong nước rỉ rác và nước thải chăn nuôi heo của vi khuẩn chuyển hóa
nitơ Pseudomonas stutzeri dòng D3b và vi khuẩn tích lũy phosphate Bacillus subtilis
dòng TGT.013L.
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 35 (2009-2013) Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 3 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về nước rỉ rác và nước thải chăn nuôi heo
2.1.1. Cơ chế phát sinh nước rỉ rác
Nước rỉ rác từ các bãi chôn lấp có thể được định nghĩa là chất lỏng thấm qua các
lớp chất thải rắn mang theo các chất hòa tan hoặc các chất lơ lửng. Trong hầu hết các
bãi chôn lấp nước rỉ rác bao gồm chất lỏng đi vào bãi chôn lấp từ các nguồn bên ngoài,
như nước mặt, nước mưa, nước ngầm và chất lỏng tạo thành trong quá trình phân hủy

các chất thải. Đặc tính của chất thải phụ thuộc vào nhiều hệ số.
Nước rác được hình thành từ 5 nguồn chính sau đây:
 Nước mặt chảy tràn
 Thấm từ nguồn nước ngầm
 Thấm từ nước mưa
 Độ ẩm trong rác
 Nước hình thành từ các phản ứng trong đống rác
Khả năng giữ nước của nguyên liệu lấp đất có nước mưa thấm vào khu chôn rác
và hàm lượng nước có trong rác thải vượt quá mức cho phép sẽ đi qua tầng rác thải dị
tính (inhomogeneous) sinh ra các vật chất gây ô nhiễm; đồng thời do rác thải bên trong
khu chôn lấp bị phân huỷ nên hiện tượng này xảy ra liên tục hơn và làm xuất hiện nước
rác. Nước rác được sinh ra có trạng thái khác nhau tuỳ theo thành phần rác thải chôn,
hàm lượng nước của tầng rác thải, số năm sau khi chôn, lượng nước mưa, điều kiện thiết
kế bãi chôn lấp.
Một số đặc điểm của nước rác: sau khi chôn rác được khoảng 2-3 năm, nước rác
có nồng độ đạt chỉ số tối đa, sau đó có khuynh hướng giảm dần - nghĩa là: khoảng 233
năm sau khi chôn, nồng độ chất hữu cơ có trong nước rác tăng cao, nhu cầu oxy hóa học
(COD) là khoảng 10.000~30.000 mg/l, tỷ lệ nhu cầu oxy sinh hóa/ nhu cầu oxy hóa học
(BOD/COD) cũng ở mức khoảng 0,4-0,8. Quá trình tự phân huỷ khá đơn giản. Thời
gian chôn càng lâu, điều kiện trong bãi chôn lấp sẽ ở tình trạng kị khí bắt buộc (không
sinh trưởng được trong môi trường có O
2
), COD giảm xuống còn 1.000-3.000mg/l,
BOD/COD cũng ở dưới mức 0,4. Lúc này quá trình tự phân huỷ diễn ra phức tạp, đặc
biệt thành phần nitơ trong nước rác cao dần, làm một số công đoạn chưa được xử lý phát
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 35 (2009-2013) Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 4 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
sinh. Do đó, qua một thời gian dài sau khi chôn lấp rác thải, chúng đều mang đặc tính
của loại nước rác không chứa thành phần có thể xử lý bằng phương pháp sinh học.
2.1.2. Phân loại nước rác

Theo đặc điểm và tính chất, nước rác được phân ra làm 4 loại:
- Nước rác tươi – nước rỉ rác khi không có mưa;
- Nước rác khi có nước mưa: nước mưa thấm qua bãi rác và hoà lẫn nước rác; Theo đặc
điểm hoạt động của bãi chôn lấp:
- Nước rác phát sinh từ các bãi chôn lấp cũ, đã đóng cửa hoặc ngừng hoạt động; thành
phần và tính chất loại nước rác này phụ thuộc vào thời gian đã đóng bãi, mức độ phân
huỷ các thành phần hữu cơ trong bãi rác.
- Nước rác phát sinh từ các bãi chôn lấp đang hoạt động và vận hành;
2.1.3. Đặc tính của nước rác
 2.1.3.1. Đặc trưng pH
Giá trị pH nằm trong khoảng 7,0 – 9,5; giá trị thường gặp nằm trong vùng 7,6 –
8,6 thiên về tính kiềm. Nước rác tuổi cao có giá trị pH lớn, về mùa khô giá trị pH cao
hơn so với mùa mưa. pH cao của nước rác là do các nguyên nhân: độ kiềm cao, quá trình
phân hủy yếm khí sâu và do hoạt động của tảo ở các hồ trữ nước rác.
 2.1.3.2. Đặc trưng của độ kiềm
Độ kiềm của nước rác gây ra chủ yếu bởi muối bicarbonate (pH < 8,2), một phần
do CO
3
2-
và OH
-
khi pH > 8,2. Sự biến động độ kiềm không theo quy luật nhất định. Độ
kiềm có khuynh hướng giảm vào mùa khô, rất có thể do quá trình thoát khí CO
2
từ nước
thải.
 2.1.3.3. Cặn không tan
Nhìn chung lượng cặn không tan trong nước rác không lớn, thường nằm trong
khoảng 100 – 200 mg/l. Thành phần cặn không tan chủ yếu là chất hữu cơ: xác vi sinh
vật và tảo. Tuy hàm lượng cặn không cao (khối lượng riêng của chất hữu cơ thấp) nhưng

nó gây độ đục lớn vì chúng thường có màu sẫm
 2.1.3.4. Acid hữu cơ dễ bay hơi (VFAs)
Acid hữu cơ dễ bay hơi là sản phẩm trung gian của quá trình phân hủy yếm khí.
Chúng là acid béo có phân tử lượng thấp (C1 – C6) nên dễ bay hơi. Acid hữu cơ dễ bay
hơi hình thành trong quá trình acid hóa, do loại vi sinh vật yếm khí acidogens, từ các
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 35 (2009-2013) Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 5 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
sản phẩm của giai đoạn thủy phân trước đó. Giai đoạn tiếp theo là sự hình thành khí
metan từ các loại acid trên với khí hydro.
 2.1.3.5. Nhu cầu oxy hóa học, độ oxy hóa
Nhu cầu oxy hóa học là đại lượng thể hiện nồng độ chất hữu cơ có thể oxy hóa
được trong điều kiện phản ứng cụ thể.
 2.1.3.6. Hợp chất nitơ
Trong nước rác, hợp chất nitơ có thể tồn tại ở các dạng khác nhau, là thành phần
trong hợp chất hữu cơ (protein, acid amin), dạng amoniac/amoni, nitrite, nitrate. Ngoài
các dạng chính nêu trên, một số dạng khác có thể tồn tại trong nước rác như: NO, N
2
O,
N
2
.
Chu trình biến đổi các hợp chất nitơ trong nước rác bao gồm: thủy phân các phân
tử hữu cơ lớn (protein) thành các acid amin và tiếp tục thành amoni. Một phần amoni
được vi sinh vật sử dụng để tổng hợp tế bào. Trong các ao hồ có chứa đầy dủ các điều
kiện thì xảy ra quá trình oxy hóa amoni thành nitrite, nitrate và khử nitrite, nitrate về khí
N
2
(khử với chất hữu cơ hoặc với amoni). Trong quá trình thủy phân, xác vi sinh vật
hoặc tảo lắng xuống đáy hồ và quá trình tiếp diễn cũng như trên.
Khác với chu trình carbon, một phần lớn chất hữu cơ được tách loại khỏi môi

trường nước rác trong quá trình chôn lấp và thu gom, hợp chất nitơ trong nước rác ít có
điều kiện để thoát ra khỏi môi trường nước rác do sự hình thành khí N
2
trong chu trình
không thuận lợi.
Do sự biến đổi nồng độ amoniac trong nước rác phụ thuộc vào các điều kiện: mức
độ pha loãng do mưa, mức độ phân hủy (tuổi của nước rác, điều kiện phân hủy) càng
cao thì hàm lượng amoniac càng lớn và tỷ lệ giữa amoniac và nitơ tổng càng cao. Nồng
độ nitrite, nitrate trong nước rác thấp (< 0,1 mg/l) do quá trình oxy hóa không có điều
kiện thuận lợi để xảy ra.
 2.1.3.7. Hợp chất phospho
Hàm lượng phosphate trong nước rác không cao, ngang với mức độ của nước thải
sinh hoạt. Nồng độ phosphate tính theo P của các mẫu khảo sát nằm trong khoảng 0,5 –
31,6 mg/l.
 2.1.3.8. Thành phần vô cơ
Trong quá trình ủ rác hình thành một loạt các thành phần vô cơ cũng như chiết tách
một số các chất vô cơ bám dính trên rác thải. Các chất vô cơ có ảnh hưởng đáng kể đến
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 35 (2009-2013) Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 6 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
công nghệ xử lý nước rác bao gồm: Ca, Mg, Cl
-
, SO
4
2-
, HCO
3
-
. Các thành phần vô cơ
tan tạo ra tổng chất tan (chủ yếu) của nước rác, quyết định độ dẫn điện và độ muối của
nước rác.

2.1.4. Sơ lược về nước thải chăn nuôi
Nước thải chăn nuôi là một loại nước thải rất đặc trưng và có khả năng gây ô nhiễm
môi trường cao do có chứa hàm lượng cao các chất hữu cơ, cặn lơ lửng, N, P và vi sinh
vật gây bệnh. Theo kết quả điều tra đánh giá hiện trạng môi trường của Viện chăn nuôi
(2006) cho thấy đặc điểm của nước thải chăn nuôi (Cao Đức Phát, 2010):
 Các chất hữu cơ: hợp chất hữu cơ chiếm 70–80% bao gồm cellulose, protit, acid
amin, chất béo, hidrat carbon và các dẫn xuất của chúng, thức ăn thừa. Các chất vô cơ
chiếm 20–30% gồm cát, đất, muối, ure, ammonium, muối chlorua, SO
4
2-
…
 N và P: khả năng hấp thụ N và P của các loài gia súc, gia cầm rất kém, nên khi
ăn thức ăn có chứa N và P thì chúng sẽ bài tiết ra ngoài theo phân và nước tiểu. Trong
nước thải chăn nuôi heo thường chứa hàm lượng N và P rất cao. Hàm lượng N-tổng
khoảng 200 – 350mg/l trong đó N-NH
4
chiếm khoảng 80-90%; P-tổng = 60-100mg/l.
 Sinh vật gây bệnh: Nước thải chăn nuôi chứa nhiều loại vi trùng, virus và trứng
ấu trùng giun sán gây bệnh.
Trong những năm gần đây, ngành chăn nuôi lợn phát triển với tốc độ rất nhanh
nhưng chủ yếu là tự phát và chưa đáp ứng được các tiêu chuẩn kỹ thuật về chuồng trại
và kỹ thuật chăn nuôi. Do đó năng suất chăn nuôi thấp và gây ô nhiễm môi trường một
cách trầm trọng. Ô nhiễm môi trường không những ảnh hưởng đến sức khỏe vật nuôi,
năng suất chăn nuôi mà còn ảnh hưởng rất lớn đến sức khỏe con người và môi trường
sống xung quanh. Mỗi năm ngành chăn nuôi gia súc gia cầm thải ra khoảng 75-85 triệu
tấn phân, với phương thức sử dụng phân chuồng không qua xử lý ổn định và nước thải
không qua xử lý xả trực tiếp ra môi trường gây ô nhiễm nghiêm trọng.
Chất thải chăn nuôi tác động đến môi trường và sức khỏe con người trên nhiều
khía cạnh: gây ô nhiễm nguồn nước mặt, nước ngầm, môi trường khí, môi trường đất và
các sản phẩm nông nghiệp. Đây chính là nguyên nhân gây ra nhiều căn bệnh về hô hấp,

tiêu hoá, do trong chất thải chứa nhiều vi sinh vật gây bệnh, trứng giun. tổ chức y tế thế
giới (WHO) đã cảnh báo: nếu không có biện pháp thu gom và xử lý chất thải chăn nuôi
một cách thỏa đáng sẽ ảnh hưởng rất lớn đến sức khỏe con người, vật nuôi và gây ô
nhiễm môi trường nghiêm trọng. Đặc biệt là các virus biến thể từ các dịch bệnh như lở
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 35 (2009-2013) Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 7 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
mồm long móng, dịch bệnh tai xanh ở lợn có thể lây lan nhanh chóng và có thể cướp đi
sinh mạng của rất nhiều người.
Cho đến nay, chưa có một báo cáo nào đánh giá chi tiết và đầy đủ về ô nhiễm môi
trường do ngành chăn nuôi gây ra. Theo báo cáo tổng kết của viện chăn nuôi, hầu hết
các hộ chăn nuôi đều để nước thải chảy tự do ra môi trường xung quanh gây mùi hôi
thối nồng nặc, đặc biệt là vào những ngày oi bức. Nồng độ khí H
2
S và NH
3
cao hơn mức
cho phép khoảng 30-40 lần (Bùi Xuân An, 2007). Tổng số vi sinh vật và bào tử nấm
cũng cao hơn mức cho phép rất nhiều lần. Ngoài ra nước thải chăn nuôi còn có chứa
Coliform, E.coli, COD , và trứng giun sán cao hơn rất nhiều lần so với tiêu chuẩn cho
phép.
Ô nhiễm môi trường khu vực trại chăn nuôi do sự phân huỷ các chất hữu cơ có mặt
trong phân và nước thải của lợn. Sau khi chất thải ra khỏi cơ thể của lợn thì các chất khí
đã lập tức bay lên, khí thải chăn nuôi bao gồm hỗn hợp nhiều loại khí trong đó có trên
40 loại gây mùi, chủ yếu là H
2
S và NH
3
. Trong điều kiện kỵ khí cộng với sự có mặt của
vi khuẩn trong phân và nước thải xảy ra quá trình khử các ion sunphát (SO
4

2-
) thành
sunphua (S
2-
). Trong điều kiện bình thường thì H
2
S là một trong những nguyên nhân
gây ra các vấn đề về màu và mùi. Nồng độ S
2-
tại hố thu nước thải chăn nuôi lợn có thể
lên đến 330 mg/l cao hơn rất nhiều so với tiêu chuẩn (theo TCVN 5945-2005 cột C nồng
độ sunfua là 1,0mg/l) (Bùi Xuân An, 2007).
Việc kiểm soát chất thải chăn nuôi là một nội dung cấp bách cần được các cấp
quản lý, các nhà sản xuất và cộng đồng dân cư bắt buộc quan tâm để: hạn chế ô nhiễm
môi trường, bảo vệ sức khỏe của con người, cảnh quan khu dân cư cũng như không kìm
hãm sự phát triển của ngành.
2.2. Quá trình cố định nitơ phân tử
2.2.1. Sự đồng hóa nitrogen
Những sinh vật tự dưỡng và dị dưỡng hấp thu và đồng hóa NH
4
+
, NO
3
-
. Tế bào của
thực vật và tảo hấp thu nitrogen tốt nhất ở hình thức NH
4
+
. Sau khi hấp thụ, những tế
bào này sẽ biến đổi NH

4
+
, NO
3
-
thành protein. Để đồng hóa được 100 ĐVC, tế bào cần
10 đơn vị nitrogen (tỷ lệ C/N = 10) (Bitton, 2005).
Quá trình amon hóa protein là quá trình phân hủy các hợp chất hữu cơ chứa nitơ,
giải phóng NH
3
do nhiều vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí gây ra như vi khuẩn, nấm mốc
và xạ khuẩn (Bitton, 2005).
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 35 (2009-2013) Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 8 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
Tất cả các loài vi sinh vật amon hóa điều tiết ra enzym thủy phân protein ra ngoài
môi trường làm cho protein bị phân cắt thành pepton, polypeptid, dipeptid và acid amin.
Các acid amin được đối tượng biến đổi trong tế bào thông qua con đường trao đổi năng
lượng và trao đổi xây dựng, sản phẩm cuối cùng chủ yếu của quá trình vô cơ hóa hiếu
khí protein là amonia, carbonic, các muối của acid sulfuric và acid phosphoric. Trong
điều kiện kỵ khí, các acid amin không được vô cơ hóa hoàn toàn, bên cạnh NH
3
và CO
2

còn tích lũy nhiều hợp chất hữu cơ khác như acid hữu cơ, rượu, H
2
S và những dẫn xuất
của nó như mecaptan, các chất độc như diammine và tomain (độc tố thịt thối) các sản
phẩm bốc mùi rất khó chịu như indol và scatol (Bitton, 2005).
Quá trình amon hóa protein giữ vai trò quan trọng trong việc khép kín vòng tuần

hoàn nitơ vì quá trình này mà nitơ chuyển từ dạng khó hấp thu sang dạng muối amon dễ
dàng được thực vật hấp thu.
2.2.2. Quá trình nitrate hóa
Nitrate hóa là quá trình oxy hóa amonia và muối amonium hình thành acid nitrous
(HNO
2
) và acid nitric (HNO
3
). Qua đó, vi sinh vật thu năng lượng cần thiết cho hoạt
động sống của mình. Vi sinh vật thực hiện quá trình oxy hóa này kèm theo sự đồng hóa
CO
2
xây dựng các hợp chất hữu cơ của cơ thể chúng, chúng là vi khuẩn hóa tự dưỡng
và là những cơ thể hiếu khí bắt buộc.
Quá trình này gồm 2 giai đoạn:
 Sự biến đổi amonia thành nitrite

(enzyme amoni monoxygenase xúc tác quá trình)


Phản ứng bao gồm

 Sự biến đổi nitrite – nitrate: enzyme xúc tác là oxidoreductase


Sự nitrate hóa được kiểm soát bởi nhiều nhân tố: nồng độ amonia/nitrite, nồng độ
oxy, pH, nhiệt độ,…(Grady và Lim, 1980; Hawkes, 1983; Metcalf và Eddy, 1991). Sự
nitrate hóa tự dưỡng chiếm ưu thế trong tự nhiên, bên cạnh đó sự nitrate hóa cũng được
NH
3

+ O
2
+ 2H
+

NH
2
OH + H
2
O
NH
2
OH + H
2
O
NO
2
-
+ 5H
+

NH
3
+ 3/2O
2

NO
2
-
+ H

+
+ H
2
O
NO
2
+ 1/2O
2

NO
3
-

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 35 (2009-2013) Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 9 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
thực hiện bởi những vi khuẩn dị dưỡng (Arthrobacter) và nấm (Falih và Wainwright,
1995; Verstract và Alexander, 1972). Tuy nhiên sự nitrate hóa dị dưỡng cần năng lượng
kém hơn sự nitrate hóa tự dưỡng (Barraclough và Puri, 1995).
2.2.3. Quá trình phản nitrate hóa
Trong điều kiện có không khí, các dạng nitơ hợp chất (NO
3
-
, NO
2
-
) bị phân hủy để
tạo thành nitơ phân tử bởi các vi khuẩn khử nitrate (denitrifying bacteria), được gọi là
quá trình phản nitrate hóa (quá trình khử nitrate) làm giảm lượng nitrate, khép kín và
hoàn thiện vòng tuần hoàn nitơ.
Sự khử đạm là một quá trình dị hóa của vi khuẩn trong việc oxy hóa hợp chất nitơ.

Những khí và những sản phẩm như: NO, N
2
O, và N
2
được phóng thích kèm theo. Trong
môi trường, sự khử đạm phóng thích N
2
. Sự tích lũy của khí NO và NO
2
gây hiệu ứng
nhà kính dẫn đến sự hủy hoại tầng ozone. Như vậy, vi khuẩn chuyển hóa nitơ loại bỏ
hợp chất nitơ từ nước thải, nơi mà sự khử đạm được đi đôi với quá trình nitrate hóa. Khả
năng làm sạch môi trường ô nhiễm có thể đạt được dưới điều kiện khử đạm (Bracker et
al., 1998).
Quá trình khử đạm được coi như là một tiến trình then chốt trong chu trình nitơ
(Lee et al., 2002). Sự khử là một quá trình dị hóa làm giảm bớt nitrate và tạo ra sản phẩm
cuối cùng là phân tử nitrogen (Throback et al, 2004). Theo Nguyễn Đức Lượng và
Nguyễn Thị Thùy Dương (2003), Schloesing là người đầu tiên phát hiện ra hiện tượng
khử nitrate và nitrite thành nitơ phân tử vào năm 1868.
Quá trình này được xem như là sự tập hợp của sự hô hấp nitrate, nitrite kết hợp với
sự khử nitrite oxide và sự hô hấp nitrous oxide (Zumft, 1997):
Nitrate Nitrite Nitrite oxide Nitrous oxide Dinitrogen gas
(NO
3
-
) (NO
2
-
) (NO) ( N
2

O) (N
2
)
Dạng phản ứng oxy hóa- khử:
2NO
3
-
+ 10e
-
+ 12H
+
N
2
+ 6H
2
O
Quá trình này được thực hiện bởi các vi khuẩn dị dưỡng như Paracoccus denitrificans,
Thiobacillus denitrificans và những loài Pseudomonas, Clostridium (Smill, 2002).
Đặc biệt là quá trình ANAMMOX (Anaerobic Ammonium Oxidation-Oxy hóa
ammonium trong điều kiện kỵ khí), nitrite & amonium sẽ được chuyển đổi trực tiếp
thành nitơ phân tử dưới điều kiện thiếu oxy. Có thể ứng dụng tiến trình này vào trong
xử lý nguồn nước thải giàu nitơ. Toàn bộ phản ứng dị hóa này là:
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 35 (2009-2013) Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 10 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
NH
4
+
+ NO
2
-

N
2
+ 2H
2
O
3NH
4
+
+ 2NO
3
-
5/2 N
2
+ 6H
2
O
Sự khử nitrate được kiểm soát bởi các nhân tố: nồng độ nitrate, điều kiện thiếu
oxy, pH, nhiệt độ, (Bames và Biliss, 1983; Hawkes, 1983a). Trong nước thải, sự khử
nitrate hiệu quả nhất ở giá trị pH 7,0 – 8,5, tốt nhất ở pH = 7,0 và nhiệt độ 35 – 50
0
C
(Christensen và Harremoes, 1997; Metcalf và Eddy, 1991).
2.3. Sơ lược về vi khuẩn chuyển hóa nitơ Pseudomonas stutzeri
Pseudomonas stutzeri được phân lập lần đầu tiên bởi Burri và Stutzer (Burri và
Stutzer, 1895), có tên gọi là Bacillus denitrificans II, sau đó được van Neil và Allen đổi
tên thành Pseudomonas stutzeri (van Neil và Allen, 1952).
Theo hệ thống phân loại, Pseudomonas stutzeri thuộc:
Giới: Bacteria
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gama proteobacteria

Bộ: Pseudomonadales
Họ: Psedomonadaceae
Giống: Pseudomonas
Loài: Pseudomonas stutzeri
(Nguồn: stutzeri)
Pseudomonas stutzeri là vi khuẩn không có sắc tố huỳnh quang, đây là đặc điểm
để phân biệt chúng với những thành viên khác của giống Pseudomonas (Rius et al.,
2001).
Pseudomonas stutzeri có phạm vi phân bố rất rộng: đất, ao nuôi, đầm lầy, biển
(Rossello – Mora et al., 1991; Rius et al., 2001; Sikorski et al., 2002), trong chất thải
chăn nuôi (Hubalek et al., 1998; Su et al., 2001), hóa chất làm giấy (Vaisanen et al.,
1998), trong các mẫu bệnh lý (Rossello - Mora et al., 1994).
Pseudomonas stutzeri là vi khuẩn Gram âm, tế bào có dạng hình que, kích thước
khoảng 1-3μm x 0,5μm, di chuyển bằng một chiên mao đỉnh; trong những điều kiện xác
định, một hoặc hai chiên mao ngắn hơn có thể được hình thành(Guasp et al., 2000).
Pseudomonas stutzeri có khả năng khử nitrate thành nitơ phân tử và được xem như vi
khuẩn đại diện cho những nghiên cứu về quá trình khử đạm (Zumft, 1997); có khả năng
tăng trưởng trong maltose và tinh bột (Bennasar et al., 1998; Sikorsky et al., 1999), cho
Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 35 (2009-2013) Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 11 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học
phản ứng dương tính với kiểm tra catalase và oxidase, phản ứng âm tính trong các kiểm
tra arginine dihydrolase và thủy phân glycogen (Lalucat et al., 2006). Pseudomonas
stutzeri là loài không tạo ra sắc tố do có sự tập trung cao hàm lượng cytochrom c trong
tế bào. Hàm lượng G + C trong DNA dao động từ 60 - 66 % mol (Palleroni et al., 1970;
Rossello – Mora et al., 1991; Lalucat et al., 2006). Phương pháp lai DNA - DNA cho
thấy có ít nhất 17 nhóm hệ gen (genomovar) đã được phân biệt (Lalucat et al., 2006).
Gần đây, vi khuẩn P. stutzeri được phân lập từ phân heo (Su et al, 2001). P. stutzeri có
khả năng khử nitơ theo nhiều con đường khác nhau khử nitrat thành N
2
mà không có sự

tích lũy nitrit, khử nitrat theo 2 bước ( khử NO
3
-
thành NO
2
-
và khử NO
2
-
thành N
2
),
khử nitrat với sự tích tụ nitrit ở nồng độ thấp (Su et al, 2001). Sự biến đổi nitrit là một
bước quan trọng trong chu trình nitrogen, trong đó NO
2
bị khử thành NO sau đó thành
N
2
. Hầu hết các enzyme khử nitơ của P. stutzeri được nghiên cứu bao quát (Coyle et al,
1985; Heiss et al, 1989; Körner và Zumft et al, 1989). Enzyme khử nitrat và nitrit thể
hiện khi nồng độ oxy hòa tan không vượt quá 5% và 2,5%, trong khi đó enzyme khử
nitrous oxide hiện diện khi nồng độ oxy không cao hơn 5% (Körner và Zumft, 1989). Ở
nồng độ oxy bảo hòa các chất nhận điện tử có nguồn gốc nitơ không bị ảnh hưởng trên
sự hiện diện enzyme khử nitơ của vi khuẩn P. stutzeri. Ở nồng độ oxy bão hòa 27%,
nitrat kích thích sự thể hiện hầu hết các enzyme khử nitrat và thể hiện đáng kể enzyme
khử nitrit, nitrous oxid (Körner và Zumft, 1989).
Các khuẩn lạc của Pseudomonas stutzeri có thể được phân biệt qua hình dạng
không bình thường và độ sệt của chúng (hình 3). Khuẩn lạc của Pseudomonas stutzeri
thường dính nhau dày đặc, bề mặt nhăn nheo, gấp nếp, khô, cứng, có màu nâu sáng,
không vàng (Rius et al., 2001). Có thể di chuyển dễ dàng khuẩn lạc ra khỏi bề mặt môi

trường. Khuẩn lạc của Pseudomonas stutzeri có hình dạng không đồng nhất và không
ổn định, thay đổi theo thời gian. Sau nhiều lần cấy chuyển trên môi trường phòng thí
nghiệm, bề mặt khuẩn lạc trở nên trơn, láng và màu tái đi. Sorokin et al. (1999) đã mô
tả chi tiết về hình thái khuẩn lạc, sự khác nhau giữa các khuẩn lạc có bề mặt trơn láng
(kiểu S) và sần sùi (kiểu R). Khuẩn lạc kiểu R thì ổn định, còn khuẩn lạc kiểu S dưới
những điều kiện thích hợp có khả năng tạo ra cả hai kiểu khuẩn lạc S và R. Khuẩn lạc
loại S tăng trưởng ở 30
0
C và được trữ ở 4
0
C trong 24 giờ thường phát triển đặc tính nhầy
(Cladera et al., 2004).

Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 35 (2009-2013) Trường ĐHCT
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 12 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

Hình 1. Một số dạng khuẩn lạc của Pseudomonas stutzeri
(Nguồn: Lalucat et al., 2006).
Pseudomonas stutzeri có thể phát triển trên môi trường minimal (Sikorski et al.,
2002); không chịu được điều kiện acid: chúng không thể phát triển ở pH 4,5.
Các loài Pseudomonas stutzeri phát triển tốt dưới điều kiện oxy khí quyển và sử
dụng oxy là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi hô hấp. Tuy nhiên, ở điều kiện vi
hiếu khí thì Pseudommonas stutzeri có khả năng sử dụng nitrate làm chất nhận điện tử
cuối cùng thay cho oxy và thực hiện quá trình khử nitrate (Stanier et al., 1996) nhờ có
các gen nar, nir, nor, nos (Sylvia et al., 2005; Lalucat et al., 2006). Ngoài ra, một số
dòng Psedomonas stutzeri còn có gen nifH có khả năng cố định đạm như dòng A1501
sống cộng sinh trong rễ lúa (Desnoues et al., 2003; Cladera et al., 2004).
2.4. Sơ lược về quá trình loại bỏ phospho sinh học
Phospho được xác định như là yếu tố dinh dưỡng thiết yếu cho sự sống. P là thành
phần cấu tạo nên các hợp chất quan trọng của sự sống như: các phân tử di truyền DNA,

RNA; các phân tử cấu trúc như protein, lipid; các phân tử dự trữ năng lượng cho tế bào
như ATP, poly-P…Tuy nhiên, mặc dù P vừa là một yếu tố kiểm soát sự tăng trưởng và
phát triển của sinh vật nhưng chúng cũng là nhân tố chủ yếu gây ra hiện tượng phú
dưỡng hóa. Ở hàm lượng vượt mức cho phép, P kích thích mạnh mẽ khả năng tăng sinh
khối của thủy sinh vật như tảo, tảo lam,…(Bowman et al., 2007), chỉ ra rằng, một lượng
nhỏ P trong nước 0,1 mg/l và duy trì thời gian dài sẽ gây sự phát triển mạnh mẽ của tảo.
Sự biểu hiện có thể nhận biết rõ của hiện tượng này là sự bùng nổ của tảo, sự giảm hàm