phân lập vi khuẩn nội sinh trên cây diệp hạ châu (phyllanthus urinaria l.) mọc hoang ở thành phố cần thơ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
∗∗∗∗∗∗∗∗
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC
PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY DIỆP HẠ
CHÂU (PHYLLANTHUS URINARIA L.) MỌC HOANG
Ở THÀNH PHỐ CẦN THƠ
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: SINH VIÊN THỰC HIỆN:
PGS.TS NGUYỄN HỮU HIỆP HỒ PHƯƠNG PHẠM BẢO TRÂN
MSSV: 3103996
LỚP: VSV K36
Cần Thơ, tháng 12 / 2013
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
∗∗∗∗∗∗∗∗
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC
PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY DIỆP HẠ
CHÂU (PHYLLANTHUS URINARIA L.) MỌC HOANG
Ở THÀNH PHỐ CẦN THƠ
Cần Thơ, tháng 12 / 2013
PHẦN KÝ DUYỆT
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
(ký tên) (ký tên)
PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp Hồ Phương Phạm Bảo Trân
XÉT DUYỆT CỦA BỘ MÔN
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………
Cần Thơ, ngày tháng năm 2013
TRƯỞNG BỘ MÔN
(ký tên)
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT
LỜI CẢM TẠ
Sau 4 năm học tập và nghiên cứu, đến nay tôi đã hoàn thành Luận văn tốt nghiệp
chuyên ngành Vi sinh vật học. Trong thời gian này, luôn có sự hỗ trợ và động viên của
gia đình, quý Thầy Cô và bạn bè giúp tôi vượt qua những khó khăn, hoàn thành tốt
luận văn tốt nghiệp.
Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:
Quý Thầy Cô Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại
học Cần Thơ đã truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực
hiện luận văn.
Phó Giáo sư - Tiến sĩ Nguyễn Hữu Hiệp, Phó Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh
học Vi sinh vật, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học
Cần Thơ, thầy hướng dẫn đề tài, đã tận tình truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm học tập
và nghiên cứu khoa học.
Cán bộ các phòng thí nghiệm và đặc biệt là anh chị ở phòng thí nghiệm Vi sinh
vật thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã luôn giúp đỡ tôi hoàn
thành đề tài.
Gia đình, người thân và các bạn lớp Vi Sinh Vật Học K36 đã giúp đỡ, động viên
và chia sẻ những khó khăn giúp tôi hoàn thành tốt luận văn này.
Kính chúc quý vị nhiều sức khỏe, hạnh phúc và thành đạt.
Xin trân trọng cảm ơn!
Cần Thơ, ngày 25 tháng 11 năm 2013

Hồ Phương Phạm Bảo Trân

Chuyên ngành Vi Sinh Vật học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT
TÓM LƯỢC
Mười bốn dòng vi khuẩn nội sinh được phân lập từ rễ, thân, lá và trái của Diệp
hạ châu. Tất cả các dòng vi khuẩn đều có tế bào hình que, mười hai dòng có khả năng
chuyển động và hai dòng không có khả năng chuyển động. Có ba dòng vi khuẩn thuộc
nhóm Gram dương, mười một dòng vi khuẩn thuộc nhóm Gram âm. Các dòng vi
khuẩn này có khả năng tổng hợp NH
4
+
và Indole-3-Acetic Acid (IAA) nhất định sau
hai ngày chủng. Lượng NH
4
+
tăng cao nhất vào ngày 6 và giảm dần sau 8 ngày chủng.
Lượng IAA tăng cao nhất vào ngày 4 và giảm dần sau 6 ngày chủng, riêng chỉ dòng
P3 là có lượng IAA giảm cả ở ngày 4 và ngày 6. Trong đó, dòng P11 có khả năng tổng
hợp lượng NH
4
+
cao nhất (0.7µg/ml). Lượng IAA sinh ra nhiều nhất là 13.33µg/ml do
dòng P7 tổng hợp. Có hai dòng P10, P14 có khả năng hòa tan lân khó tan. Dòng P14
có hiệu suất hòa tan lân cao nhất là 250 sau 4 ngày chủng. Bốn dòng có khả năng
kháng lại với Escherichia coli và ba dòng kháng lại với Aeromonas hydrophila. Dòng
P2 kháng lại với Escherichia coli tốt nhất với vòng vô khuẩn đạt 3.5mm sau 2 ngày
chủng và dòng P7 kháng lại với Aeromonas hydrophila tốt nhất với vòng vô khuẩn đạt
2.25mm sau 3 ngày chủng. Ba dòng vi khuẩn P2, P7, P9 được nhận diện bằng phương
pháp giải trình tự đoạn gen 16S rDNA. Dòng P2 tương đồng với Bacillus tequilensis
với mức độ đồng hình 99%; dòng P7 tương đồng với dòng Bacillus amyloliquefaciens
với mức độ đồng hình 99% và dòng P9 tương đồng với Bacillus subtilis với mức độ

đồng hình 99%.
Từ khóa: Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus tequilensis, Diệp hạ
châu, IAA, kháng sinh, PCR, vi khuẩn cố định đạm, vi khuẩn hòa tan lân
Chuyên ngành Vi Sinh Vật học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT
MỤC LỤC
LỜI CẢM TẠ i
TÓM LƯỢC ii
MỤC LỤC iii
DANH SÁCH BẢNG vii
DANH SÁCH HÌNH viii
TỪ VIẾT TẮT ix
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1
Đặt vấn đề 1
Mục tiêu đề tài 2
CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
Vị trí địa lý và điều kiện tự nhiên của thành phố Cần Thơ 3
Sơ lược về Diệp hạ châu 5
Diệp hạ châu đắng (diệp hạ châu thân xanh) 6
Diệp hạ châu ngọt (diệp hạ châu thân tím) 7
Tìm hiểu về vi khuẩn nội sinh 8
Vi khuẩn Azospirillum 9
Vi khuẩn Bacillus 11
Vi khuẩn Pseudomonas 17
Vi khuẩn Klebsiella 19
Vi khuẩn Burkholderia 20
Vi khuẩn Azotobacter 21
Vi khuẩn Enterobacter 21
Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh 22
Chuyên ngành Vi Sinh Vật học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT
Khả năng cố định đạm 22
Khả năng hòa tan lân khó tan 22
Khả năng tổng hợp Indole-3-Acetic Acid (IAA) 24
Đối kháng sinh học 25
Tìm hiều về một số vi khuẩn gây bệnh 26
Vi khuẩn Echerichia coli 26
Vi khuẩn Aeromonas hydrophyla 28
Tình hình nghiên cứu Diệp hạ châu trong và ngoài nước 30
Tình hình nghiên cứu trong nước 30
Tình hình nghiên cứu ngoài nước 32
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36
Phương tiện nghiên cứu 36
Thời gian – Địa điểm thực hiện 36
Dụng cụ - thiết bị 36
Vật liệu 36
Hóa chất 37
Phương pháp nghiên cứu 41
Phương pháp phân lập vi khuẩn nội sinh 41
Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn 42
Nhuộm Gram vi khuẩn nội sinh 44
Xác định khả năng tổng hợp NH4+ 45
Xác định khả năng hòa tan lân 47
Xác định khả năng tổng hợp IAA 47
Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn 48
Tinh sạch DNA của các dòng vi khuẩn tiêu biểu đã phân lập 49
Chuyên ngành Vi Sinh Vật học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT
Nhận diện các dòng vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật PCR 50
Phương pháp xử lý số liệu 51

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52
Kết quả phân lập vi khuẩn 52
Phân lập vi khuẩn 52
Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn 53
4.1Đặc tính của vi khuẩn 56
Khả năng hòa tan lân của các dòng vi khuẩn 57
Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp NH4+của các dòng vi khuẩn 59
So sánh khả năng tổng hợp NH4+của các dòng vi khuẩn phân lập từ rễ 60
So sánh khả năng tổng hợp NH4+của các dòng vi khuẩn phân lập từ thân 61
So sánh khả năng tổng hợp NH4+của các dòng vi khuẩn phân lập từ lá 61
So sánh khả năng tổng hợp NH4+của các dòng vi khuẩn phân lập từ trái 62
Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn 63
So sánh khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập từ rễ 64
So sánh khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập từ thân 65
So sánh khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập từ lá 65
So sánh khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập từ trái 66
Kết quả khảo sát khả năng tạo vòng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn 67
Khả năng tạo vòng kháng khuẩn đối với vi khuẩn E.coli 67
Khả năng tạo vòng kháng khuẩn đối với vi khuẩn A.hydrophila 69
Kết quả nhận diện một số dòng vi khuẩn 72
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 77
Kết luận 77
Đề nghị 77
Chuyên ngành Vi Sinh Vật học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT
TÀI LIỆU THAM KHẢO 78
PHỤ LỤC 1
Phụ lục 1: Một số hình ảnh thí nghiệm
Phụ lục 2: Phụ lục số liệu
Phụ lục 3: Đường chuẩn đo đạm - IAA

Phụ lục 4: Một số kết quả thống kê
Chuyên ngành Vi Sinh Vật học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT
DANH SÁCH BẢNG
LỜI CẢM TẠ i
TÓM LƯỢC ii
MỤC LỤC iii
DANH SÁCH BẢNG vii
DANH SÁCH HÌNH viii
TỪ VIẾT TẮT ix
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1
CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 77
TÀI LIỆU THAM KHẢO 78
PHỤ LỤC 1
Chuyên ngành Vi Sinh Vật học vii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT
DANH SÁCH HÌNH
LỜI CẢM TẠ i
TÓM LƯỢC ii
MỤC LỤC iii
DANH SÁCH BẢNG vii
DANH SÁCH HÌNH viii
TỪ VIẾT TẮT ix
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1
CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52

CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 77
TÀI LIỆU THAM KHẢO 78
PHỤ LỤC 1
Chuyên ngành Vi Sinh Vật học viii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT
TỪ VIẾT TẮT
A. hydrophila Aeromonas hydrophila
DNA Deoxiribonucleic Acid
DMSO Dimethyl sulfoxide
ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long
E. coli Escherichia coli
IAA Indole-3 Acetic Acid
LB Luria – Bertani
NBRIP National Botanical Research Institute’s photphaste
OD Optical Density
PCR Polymerase Chain Reaction
PDA Potato Dextrose Agar
16S rDNA 16S ribosomal DNA
Chuyên ngành Vi Sinh Vật học ix Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
Đặt vấn đề
Diệp hạ châu là một trong những loại cây dược liệu quan trọng trong ngành y học.
Theo các nghiên cứu hiện đại, cây Diệp hạ châu chứa một số enzyme và hoạt chất có tác
dụng chữa viêm gan như phyllanthine, hypophyllanthine, alkaloids và flavonoids Một
nghiên cứu cho thấy, 50% yếu tố lây truyền của virus viêm gan B trong máu đã mất đi sau
30 ngày sử dụng loại cây này (với liều 900 mg/ngày). Trong thời gian nghiên cứu, không
có bất kỳ sự tương tác nào giữa Diệp hạ châu với các thuốc khác.
(Nguồn: />chau-dang-2275734.html)
Trong y học hiện nay, kháng sinh tân dược được sử dụng rộng rãi và hiện phổ biến ở

các nước trên thế giới nhằm điều trị các bệnh lý nhiễm trùng. Tuy nhiên, bên cạnh hiệu
quả điều trị, hầu hết kháng sinh cũng đều có nguy cơ gây ra các phản ứng không mong
muốn cho người bệnh. Nguyên nhân là do phản ứng miễn dịch của cơ thể đối với thuốc
hoặc các sản phẩm chuyển hóa thuốc. Ngoài ra, một số phản ứng khó có thể dự đoán
trước như phản ứng dị ứng hoặc tình trạng không dung nạp thuốc thường xảy ra do không
phụ thuộc vào liều dùng và đường dùng của thuốc. Loại phản ứng này thường ảnh hưởng
đến một số hệ thống cơ quan của cơ thể như da, niêm mạc, gan và tế bào máu. Đấy là
chưa kể những tai biến nguy hiểm do nhiều loại kháng sinh gây ra, có khi dẫn đến tử
vong. Chính vì vậy, hiện nay, người ta có xu hướng quay về với thiên nhiên, sử dụng cây
cỏ để làm thuốc chữa bệnh.
Việc sử dụng kháng sinh thực vật đang được nhiều người hướng đến vì có đặc điểm
nổi bật là rất ít độc nên không gây ra những tai biến nguy hiểm và hiện chưa thấy tài liệu
nào nói đến. Mặc dù hiệu lực kháng khuẩn của các cây thuốc kháng sinh không mạnh
bằng kháng sinh tân dược nhưng cũng đủ để chữa khỏi nhiều bệnh nhiễm khuẩn. Bên
cạnh đó, phần lớn các kháng sinh thực vật lại rất bền vững và dễ hoà tan trong nước, dễ
tìm mà hiệu quả lại cao, sử dụng đơn giản. Ngoài ra, người ta vẫn chưa thấy hiện tượng
kháng thuốc khi sử dụng các loại cây thuốc thực vật này.
Chuyên ngành Vi Sinh Vật học 1 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT
(Nguồn: />cua-khang-sinh-thuc-vat.html)
Nhiều nghiên cứu sản xuất cây dược liệu có tính kháng khuẩn như cây Sài đất
(Wedelia calendulacea L.), cây Giấp Cá (Houttuynia cordata T.), cây Diệp hạ châu
(Phyllanthus urinaria L.)… đã được nghiên cứu chứng tỏ chúng có hoạt tính kháng khuẩn
nhờ chúng có chứa tinh dầu là các nhóm aldehyde và các dẫn xuất ceton như methyl
n-nonyl ceton, L-decanal, L-dodecanal. Nhóm terpen bao gồm các chất α-pinen,
camphen có tác dụng diệt các vi khuẩn Streptococcus pneumonia, Staphylococcus
aureus, Shigella, Salmonella, E. coli (Đỗ Tất Lợi, 2006; Shu-Chen et al., 2008).
Nhiều nghiên cứu cho thấy trong các cây trồng không thuộc họ đậu cũng có các
nhóm vi sinh vật có ích sống trong cây hoặc ở vùng rễ cây đã kích thích cây trồng phát
triển tốt nhờ chúng có khả năng cố định nitơ, phân giải lân, tổng hợp các hormone tăng

trưởng và các hợp chất có khả năng trực tiếp ức chế một số bệnh cho cây trồng hoặc kích
thích cây trồng sản xuất các hợp chất biến dưỡng thứ cấp giúp cây chống lại các tác nhân
gây bệnh cây. Đặc biệt là có những chủng vi sinh vật nội sinh với cây dược liệu có thể sản
xuất các hợp chất kháng khuẩn khi chúng sống bên trong cây dược liệu. Các nhóm vi sinh
vật có khả năng này bao gồm các loài thuộc chi Azosprillum, Herbaspirillum,
Gluconacetobacter, Klebsiella… Vì vậy, việc phân lập và nhận diện các dòng vi khuẩn
sống nội sinh trong cây Diệp hạ châu góp phần vào việc sản xuất thuốc nhằm hỗ trợ cho
nền y học hiện nay là rất cần thiết.
Mục tiêu đề tài
Phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây Diệp hạ châu ở thành
phố Cần Thơ có khả năng tổng hợp amonium, IAA, hòa tan lân và có khả năng kháng
khuẩn.
Chuyên ngành Vi Sinh Vật học 2 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT
CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
Vị trí địa lý và điều kiện tự nhiên của thành phố Cần Thơ
Thành phố Cần Thơ nằm ở vùng hạ lưu của Sông Mê Kông và ở vị trí trung tâm
đồng bằng châu thổ Sông Cửu Long, nằm cách thành phố Hồ Chí Minh 169 km, cách
thành phố Cà Mau 178 km, cách thành phố Rạch Giá 128 km, cách biển khoảng 100 km
theo đường sông Hậu.
Hình 1. Thành phố Cần Thơ
(Nguồn: />Cần Thơ có tọa độ địa lý 105
o
13’38” – 105
o
50’35” kinh độ Đông và 9
o
55’08” –
10
o

19’38” vĩ độ Bắc, trải dài trên 55 km dọc bờ Tây sông Hậu. Phía bắc giáp tỉnh An
Giang, phía đông giáp tỉnh Đồng Tháp và tỉnh Vĩnh Long, phía tây giáp tỉnh Kiên Giang,
phía nam giáp tỉnh Hậu Giang. Diện tích nội thành là 53 km². Thành phố Cần Thơ có tổng
diện tích tự nhiên là 1.409,0 km², chiếm 3,49% diện tích toàn vùng và dân số vào khoảng
1.200.300 người, mật độ dân số tính đến 2011 là 852 người/km². Cần Thơ cũng là thành
phố hiện đại và lớn nhất của cả vùng hạ lưu sông Mê Kông.
Thành phố Cần Thơ nằm toàn bộ trên đất có nguồn gốc phù sa sông Mê Kông bồi
đắp và được bồi lắng thường xuyên qua nguồn nước có phù sa của dòng sông Hậu. Địa
chất trong thành phố được hình thành chủ yếu qua quá trình bồi lắng trầm tích biển và phù
Chuyên ngành Vi Sinh Vật học 3 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT
sa của sông Cửu Long, trên bề mặt ở độ sâu 50 mét có hai loại trầm tích là Holocen (phù
sa mới) và Pleistocene (phù sa cổ).
Địa hình nhìn chung tương đối bằng phẳng, phù hợp cho sản xuất nông, ngư nghiệp,
với độ cao trung bình khoảng 1–2 m dốc từ đất giồng ven sông Hậu, và sông Cần Thơ
thấp dần về phía nội đồng tức là từ phía đông bắc sang phía tây nam. Bên cạnh đó, thành
phố còn có các cồn và cù lao trên sông Hậu như Cồn Ấu, Cồn Khương, Cồn Sơn, Cù lao
Tân Lập. Thành phố Cần Thơ có 3 dạng địa hình chính là địa hình ven sông Hậu hình
thành dải đất cao là đê tự nhiên và các cù lao ven sông Hậu.
Ngoài ra do nằm cạnh sông lớn, nên Cần Thơ có mạng lưới sông, kênh, rạch khá
chằng chịt. Vùng tứ giác Long Xuyên, thấp trũng, chịu ảnh hưởng lũ trực tiếp hàng năm.
Đồng bằng châu thổ chịu ảnh hưởng triều cùng lũ cuối vụ.
Cần Thơ nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, ít bão, quanh năm nóng ẩm,
không có mùa lạnh. Mùa mưa kéo dài từ tháng 5 đến tháng 11, mùa khô từ tháng 12 tới
tháng 4 năm sau. Nhiệt độ trung bình năm khoảng 28°C, số giờ nắng trung bình cả năm
khoảng 2.249,2h, lượng mưa trung bình năm đạt 1600 mm. Độ ẩm trung bình năm dao
động từ 82% - 87%. Do chịu ảnh hưởng khí hậu nhiệt đới gió mùa, có lợi thế về nền nhiệt
độ, chế độ bức xạ nhiệt, chế độ nắng cao và ổn định theo hai mùa trong năm.
Các lợi thế này rất thuận lợi cho sinh trưởng và phát triển của sinh vật, có thể tạo ra
một hệ thống nông nghiệp nhiệt đới có năng suất cao, với nhiều chủng loại cây con, tạo

nên sự đa dạng trong sản xuất và trong chuyển dịch cơ cấu sản xuất. Tuy nhiên, mùa mưa
thường đi kèm với ngập lũ ảnh hưởng tới khoảng 50% diện tích toàn thành phố, mùa khô
thường đi kèm với việc thiếu nước tưới, gây khó khăn cho sản xuất và sinh hoạt, nhất là
khu vực bị ảnh hưởng của mặn, phèn làm tăng thêm tính thời vụ cũng như nhu cầu dùng
nước không đều giữa các mùa của sản xuất nông nghiệp.
Thành phố Cần Thơ có Sông Hậu chảy qua với tổng chiều dài là 65 km, trong đó
đoạn qua Cần Thơ có chiều rộng khoảng 1,6 km. Tổng lượng phù sa của sông Hậu là
35 triệu m
3
/năm. Tại Cần Thơ, lưu lượng cực đại đạt mức 40.000 m
3
/s. Mùa cạn từ
tháng 1 đến tháng 6, thấp nhất là vào tháng 3 và tháng 4. Lưu lượng nước trên sông tại
Chuyên ngành Vi Sinh Vật học 4 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT
Cần Thơ chỉ còn 2.000 m
3
/s. Mực nước sông lúc này chỉ cao hơn 48 cm so với mực nước
biển.
Sông Cần Thơ bắt nguồn từ khu vực nội đồng tây sông Hậu, đi qua các quận
Ô Môn, huyện Phong Điền, quận Cái Răng, quận Ninh Kiều và đổ ra sông Hậu tại bến
Ninh Kiều. Sông Cần Thơ có nước ngọt quanh năm, vừa có tác dụng tưới nước trong mùa
cạn, vừa có tác dụng tiêu úng trong mùa lũ và có ý nghĩa lớn về giao thông. Sông Cái Lớn
dài 20 km, chiều rộng cửa sông 600–700 m, độ sâu 10–12 m nên có khả năng tiêu, thoát
nước rất tốt.
Bên cạnh đó, thành phố Cần Thơ còn có hệ thống kênh rạch dày đặc, với hơn
158 sông, rạch lớn nhỏ là phụ lưu của 2 sông lớn là sông Hậu và sông Cần Thơ đi qua
thành phố nối thành mạng đường thủy. Các sông rạch lớn khác là rạch Bình Thủy,
Trà Nóc, Ô Môn, Thốt Nốt, kênh Tham Rôn và nhiều kênh lớn khác tại các huyện ngoại
thành là Thốt Nốt, Vĩnh Thạnh, Cờ Đỏ và Phong Điền, cho nước ngọt suốt hai mùa mưa

nắng, tạo điều kiện cho nhà nông làm thủy lợi và cải tạo đất.
(Nguồn: />Sơ lược về Diệp hạ châu
Cây Diệp hạ châu có tên khoa học là Phyllanthus urinaria L., họ thầu dầu
Euphorbiaceae, cây này còn có tên là chó đẻ răng cưa, diệp hạ châu đắng, diệp hòe thái,
lão nha châu, diệp hạ châu ngọt, cam kiềm, kiềm vườn, trân châu thảo Cây mọc hằng
năm ở khu vực nhiệt đới, là loại cỏ mọc hoang có thể tìm thấy nhiều nơi khắp nước ta.
Cây có hạt tròn xếp thành hàng dưới lá nên gọi là diệp hạ châu (diệp: lá, hạ: dưới, châu:
ngọc tròn).
Có hai loại: Diệp hạ châu ngọt (Phyllanthus urinaria L.) và Diệp hạ châu đắng
(Phyllanthus amarus schum et thonn), cùng họ thầu dầu (Euphorbiaceae). Cả 2 loại đều
giàu dược tính nên ngay từ xa xưa, 2 loại này đã được dùng làm thuốc. Bộ phận dùng làm
thuốc là toàn cây (được cắt phần trên mặt đất của cây).
Diệp hạ châu vị đắng, hơi ngọt, tính mát, có tác dụng thanh can lương huyết, lợi
tiểu, sát trùng, giải độc. Kích thích tiết dịch mật, tăng cường chức năng gan và dùng nó để
Chuyên ngành Vi Sinh Vật học 5 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT
điều trị sỏi mật, sỏi thận, viêm bàng quang, vàng da phù, rối loạn tiêu hóa, đau bụng kinh.
(Nguồn: />Cây Diệp hạ châu sử dụng rộng rãi để trị viêm gan B, viêm túi mật, thận, thống
phong, sốt rét, thương hàn, cúm, cảm lạnh, kiết lỵ, đau dạ dày, mụn nhọt, lở loét, ung độc.
Nó còn được sử dụng như một thuốc giảm đau, kích thích ngon miệng, kích thích trung
tiện, tẩy giun, lợi tiểu, điều hòa kinh nguyệt phụ nữ Tại nhiều nước châu Á (như Ấn
Độ, Malaysia…), người dân cũng dùng Diệp hạ châu để chữa viêm gan, vàng da, hen, lao,
kiết lỵ, lậu, viêm phế quản, viêm da, viêm đường tiết niệu.
(Nguồn: />Đặc biệt, nghiên cứu của các nhà khoa học Nhật bản và Ấn độ cho biết họ đã phân
lập được những hợp chất trong cây Diệp hạ châu có khả năng chữa bệnh viêm gan, giải
độc gan và chữa viêm gan siêu vi B như phyllanthine, hypophyllan-thine, alkaloids và
flavonoids. Nhiều thầy thuốc Đông y cho rằng cây Diệp hạ châu là một trong những thảo
dược hàng đầu có thể đáp ứng được yêu cầu trong điều trị bệnh.
(Nguồn: />Diệp hạ châu đắng (diệp hạ châu thân xanh)
Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum & Thonn tên đồng danh

khác Phyllanthus niruri auct., non L) hay còn gọi diệp hạ châu thân xanh.
Gọi là diệp hạ châu, vì có các hạt tròn nằm dưới lá. Diệp hạ châu trong dân gian
thường gọi là cây chó đẻ, cây mang tên này vì người ta thấy những con chó sau khi đẻ
thường đi ăn cây này. Ngoài ra còn có nhiều tên khác: trân châu thảo, diệp hạ châu đắng,
diệp hòe thái, lão nha châu…
a. Đặc điểm nhận dạng
- Lá và toàn thân có màu xanh, khi cây già gốc và cành ngả sang màu nâu vàng
- Cây phân cành cách gốc 5-8 cm tùy điều kiện sinh trường, tán cây hình chóp nón
- Chiều cao cây trung bình 30-40 cm, tuy nhiên có cây cao tới 60-70 cm
Chuyên ngành Vi Sinh Vật học 6 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT
b. Thành phần hóa học Diệp hạ châu đắng
Trong Diệp hạ châu đắng có các thành phần flavonoid, alcaloid phyllanthin và các
hợp chất hypophyllanthin, niranthin, phylteralin. Thành phần hóa học chính phyllanthin.
c. Tác dụng dược lý
Cây Diệp hạ châu đắng có vị hơi đắng, tính mát, có tác dụng tiêu độc, sát trùng, tán
ứ, thông huyết, điều kinh, lợi tiểu, thông sữa.
Hình 2. Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum)
(Nguồn: />Diệp hạ châu ngọt (diệp hạ châu thân tím)
Diệp hạ châu thân tím, chó đẻ thân tím (Phyllanthus urinaria L)
a. Đặc điểm nhận dạng
- Lá có màu xanh thẫm, thân cành có màu tím (nên gọi là diệp hạ châu thân tím)
- Cây phân nhánh từ gốc, tán cây xòe dạng bò lan
- Chiều cao trung bình 10-12 cm
b. Thành phần hóa học
Trong loài P. urinaria L. có mặt các acid, triterpen, một vài alkaloid và các dẫn xuất
phenol, acid ellagic, acid gallic, acid phenolic và một flavonoid, phyllanthin.
Có tài liệu ghi nhận thành phần phyllanthin trong diệp hạ châu đắng (thân xanh) cao
gấp cao gấp 27 lần hàm lượng phyllanthin trong diệp hạ châu ngọt (thân tím).
Chuyên ngành Vi Sinh Vật học 7 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT
Hình 3. Diệp hạ châu thân tím (Phyllanthus urinaria L)
(Nguồn: />c. Tác dụng dược lý
Diệp hạ châu thân tím (Phyllanthus urinaria L.) với vị ngọt, hơi đắng, tính mát có
tác dụng lợi tiểu, tiêu độc, sát trùng, tán ứ, thông huyết, điều kinh, thanh can, sáng mắt,
làm se và hạ nhiệt. Người ta cũng nhận thấy tác dụng diệt khuẩn và diệt nấm rõ rệt của
acid phenolic và flavonoid trong chó đẻ răng cưa. Coderacin phân lập được từ cây dùng
chế thuốc nhỏ mắt và thuốc mỡ tra mắt, do khả năng tiêu diệt một số vi khuẩn, nấm gây
bệnh ở mắt. (Nguồn: />dang/)
Tìm hiểu về vi khuẩn nội sinh
Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn trải qua phần lớn vòng đời trong cây trồng (Quispel,
1992). Từ vùng rễ, chúng xâm nhập vào mô thực vật xuyên qua vùng rễ theo 3 cách là:
bám ở bề mặt rễ và tìm cách chui vào rễ chính hay rễ bên (lateral roots), thông qua lông
hút, giữa các tế bào nhu mô rễ hay biểu bì rễ để sống nội sinh như Azotobacter, Bacillus,
Beijerinckia, Derxia, Enterobacteriaeae (Klebsiella, Enterobacter, Pantonae),
Pseudomonas, Alcaligenes, Azoarcus, Burkholderia, Campylobacter, Herbaspirillum
Gluconacetobacter, và Paenibacillus (Elmerich, 2007). Tuy nhiên nó cũng có thể xâm
nhập vào các mô xuyên qua khí khổng hay các vị trí bị tổn thương của lá (Roos và
Chuyên ngành Vi Sinh Vật học 8 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT
Hattingh, 1983). Sau khi xâm nhập vào cây chủ, các vi khuẩn nội sinh có thể tập trung tại
vị trí xâm nhập hay phát tán khắp nơi trong cây đến các tế bào bên trong, đi vào các
khoảng trống gian bào hay vào trong hệ mạch (Zinniel et al., 2002). Mật số của quần thể
vi khuẩn nội sinh rất biến thiên, phụ thuộc chủ yếu vào loài vi khuẩn và kiểu di truyền của
cây chủ; nhưng cũng phụ thuộc vào giai đoạn phát triển của cây chủ và các điều kiện môi
trường (Pillay và Nowak, 1997; Tan et al., 2003).
Một số nhóm vi khuẩn nội sinh không gây hại hay gây bệnh cho cây chủ, mà trái lại
chúng có thể thúc đẩy sự phát triển của cây trồng bằng cách sản xuất các chất kích thích
sự sinh trưởng thực vật và sự cố định đạm từ không khí (Sturz et al., 2000). Hơn nữa, một
số dòng vi khuẩn nội sinh có thể cải thiện sự phát triển bệnh (Benhamou et al., 1996) và

kích thích sự chống chịu của cây trồng đối với sự tác động của các nhân tố vô sinh và hữu
sinh (Hallmann et al., 1997).
Vùng rễ là nơi tiếp giáp giữa rễ thực vật và đất, là nơi lắng động các chất hữu cơ, và
là nơi xuất phát của các môi trường sống và nguồn sống khác nhau cho các vi sinh vật đất.
Thực vật có thể thay đổi vùng rễ của chúng nhờ sự hấp thu các chất dinh dưỡng, độ ẩm và
oxy từ vùng rễ; và các chất do rễ tiết ra (El-Shatnawi và Makhadmeh, 2001). Đặc tính
quan trọng của các dịch rễ là có tỉ lệ C/N cao nên có thể đẩy mạnh sự phong phú của các
vi khuẩn cố định đạm trong vùng rễ (Döbereiner, 1974). Ngược lại, vi sinh vật vùng rễ có
thể ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của cây do sự tác động của chúng đến giá trị của
các chất dinh dưỡng, sự phát triển và hình thái của rễ (Rovira et al., 1983; Harari et al.,
1988). Nhờ sự đa dạng của cây trồng và sự đa dạng của vùng rễ nên các nhà khoa học đã
khám phá được nhiều nhóm vi khuẩn nội sinh khác nhau từ các loại cây khác nhau.
(Nguồn: />Vi khuẩn Azospirillum
Azospirillum là vi khuẩn Gram âm, có khả năng chuyển động, có dạng hình que
ngắn, cong hoặc hình chữ S (như Azospirillum lipoferum), là vi khuẩn có khả năng tổng
hợp IAA, khả năng cố định đạm, hòa tan lân và một số chất dinh dưỡng khác.
Chuyên ngành Vi Sinh Vật học 9 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT
Hình 4. Vi khuẩn Azospirillum
(Nguồn: />Chúng sống tự do trong đất hay cộng sinh với rễ của các loại ngũ cốc, cỏ và cây có
củ. Vi khuẩn Azospirillum phát triển tốt trên môi trường có muối hữu cơ như malate,
succinate, lactate hay pyruvate. Vi khuẩn này không sử dụng đường đơn, fructose hay các
đường đôi khác là nguồn carbon của chúng. Một số dòng Azospirillum còn cần thêm
biotin.
Các loài Azospirillum biểu hiện sự phân bố sinh thái vô cùng rộng lớn và được gắn
liền với sự đa dạng to lớn của cây trồng (van Berkum và Bohlool, 1980).
Trong những năm 1984-85, người ta đã phát hiện nhiều loài của giống Azospirillum
trong vùng rễ của cỏ Kallar (Leptochloa fusca) (Reinhold et al., 1986); trong đó các vi
khuẩn xâm nhập vào bên trong nhu mô rễ có khả năng cố định đạm, hòa tan lân ở dạng
khoáng khó tan và các chất dinh dưỡng khác (Seshadri et al., 2000; Richardson, 2003),

sản xuất kích thích tố thực vật (Vande Broek et al., 1999), hay kiểm soát các vi sinh vật
gây bệnh cho cây trồng (Rangarajan et al., 2003). Khi Okon và Labandera-Gonzalez
(1994) phân tích tài liệu về các thử nghiệm ngoài đồng ở các cây trồng được chủng với
Azospirillum thì nhận thấy sản lượng cây trồng tăng 5 – 30%, cao hơn nhiều so với khi sử
dụng phân bón hóa học. Sản lượng tăng là do hệ thống rễ phát triển tốt hơn, tương quan
với việc tăng tỉ lệ nước và khoáng được rễ hấp thu.
Để phát hiện vi khuẩn Azospirillum có nhiễm vào rễ hay chưa, trước đây, người ta
thường sử dụng phương pháp đo lượng khí acetylen do rễ thải ra nhưng phương pháp này
Chuyên ngành Vi Sinh Vật học 10 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT
rất tốn kém và mất nhiều công sức. Ngày nay, người ta thường sử dụng phương pháp
miễn dịch học hoặc phương pháp sinh học phân tử hoặc kết hợp cả hai để phát hiện sự
hiện diện của vi khuẩn Azospirillum.
Azospirillum có thể tiết ra những kích thích tố tăng trưởng như: IAA
(Indole-3-Acetic Acid), IBA (Indole-3-butyric acid), ABA (abscisic acid) và cytokynins.
Những kích thích tố đó làm tăng chiều dài rễ, tăng thể tích rễ và số lượng rễ. Từ đó, chúng
làm tăng khả năng hấp thu khoáng chất và nước, nhờ đó, tăng khả năng sinh trưởng và
phát triển cũng như tăng năng suất của cây.
Vi khuẩn Bacillus
Vi khuẩn Bacillus là những vi khuẩn Gram dương, có nội bào tử hình ovan có
khuynh hướng phình ra ở một đầu. Bacillus được phân biệt với các loài vi khuẩn sinh nội
bào tử khác bằng hình dạng tế bào hình que, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí hoặc kỵ
khí không bắt buộc.
Hình 5. Vi khuẩn Bacillus
(Nguồn: />Tế bào Bacillus có thể đơn hoặc chuỗi và chuyển động bằng tiêm mao. Nhờ khả
năng sinh bào tử nên vi khuẩn Bacillus có thể tồn tại trong thời gian rất dài dưới các điều
kiện khác nhau và rất phổ biến trong tự nhiên nên có thể phân lập từ rất nhiều nguồn khác
nhau như đất, nước, trầm tích biển, thức ăn, sữa nhưng chủ yếu là từ đất nơi mà đóng
vai trò quan trọng trong chu kỳ C và N.
Chuyên ngành Vi Sinh Vật học 11 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT
Tất cả các loài thuộc chi Bacillus đều có khả năng dị dưỡng và hoại sinh nhờ sử
dụng các hợp chất hữu cơ đa dạng như đường, acid amin, acid hữu cơ Một vài loài có
thể lên men carbohydrat tạo thành glycerol và butanediol; một vài loài như Bacillus
megaterium thì không cần chất hữu cơ để sinh trưởng, một vài loài khác thì cần acid
amin, vitamin B. Hầu hết đều là loài ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ tối ưu là 30-45
o
C,
nhưng cũng có nhiều loài ưa nhiệt với nhiệt độ tối ưu là 65
o
C.
Đa số Bacillus sinh trưởng ở pH = 7, một số phù hợp với pH = 9 -10 như Bacillus
alcalophillus, hay có loại phù hợp với pH = 2 - 6 như Bacillus acidocaldrius.
Bacillus có khả năng sản sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase…), do
đó chúng được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp, trong bảo vệ môi trường…
Theo trích dẫn từ Genetics and Molecular Biology (2013), các chủng vi khuẩn
Agrobacterium, Aneurinibacillus, Bacillus, Enterobacter, Klebsiella, Lysinibacillus,
Micrococcus, Paenibacillus, Rhizobium và Sporolactobacillus và 15 loài khác thì các loài
này có thể tham gia trong việc thúc đẩy tăng trưởng, hòa tan phosphate, kiểm soát sinh
học và cố định đạm trong chuối.
Trong nghiên cứu, phân lập trực khuẩn cố định đạm từ rhizospheres được xác định
bằng thử nghiệm cắt giảm axetylen cho hoạt động nitrogenase để khuếch đại và giải trình
tự một phần của gen nifH. Báo cáo này cho thấy gen nifH tồn tại trong chi Bacillus và
Paenibacillus. (Journal of Applied Microbiology, 2005)
Sau đây là một số loài Bacillus thường gặp trong tự nhiên:
a. Bacillus amyloliquefaciens
Bacillus amyloliquefaciens là trực khuẩn Gram dương, hình que, di động, kích thước
0,7-0,9 x1,8-3µm, nội bào tử (0,6-0,8 x 1-1,4µm), là vi khuẩn hiếu khí hay kỵ khí, phát
triển tối ưu ở pH = 7, NaCl không cần thiết cho sự tăng trưởng. Nhiệt độ giới hạn
15-50

o
C, nhiệt độ tối ưu 30-40
o
C. B. amyloliquefaciens có thể phát triển trong NaCl nồng
độ 10%, sản xuất α-amylase, và khả năng lên men lactose tạo acid. Phản ứng catalase và
oxidase dương tính, khử nitrat.
Bacillus amyloliquefaciens là một vi sinh vật được biết đến với nhiều ứng dụng
trong sản xuất các sản phẩm thương mại như sản xuất enzyme công nghiệp.
Chuyên ngành Vi Sinh Vật học 12 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT
B.amyloliquefaciens có thể dùng như probiotics để bổ sung vào thức ăn hoặc nước uống
nhằm cân bằng hệ vi sinh đường ruột. Phytase của các chủng thuộc loài Bacillus
amyloliquefaciens là β propeller phytase với trung tâm hoạt động có vị trí ái lực cao với
Ca
2+
. Đây là loại phytase khá bền nhiệt, có tính đặc hiệu cơ chất rất cao với phytate nhưng
lại biểu hiện rất ít hoặc không có hoạt tính đối với các loại cơ chất esters phosphate khác.
Sự có mặt của Ca
2+
cũng làm tăng tính bền nhiệt của phytase loại này.
Bacillus amyloliquefaciens FZB42, khi phân tích bộ gen cho thấy 8,5% của tổng
3.918 Kb bộ gen được dành cho các gen mã hóa cho các kháng thể và siderophore khác
nhau (Chen et al., 2007). Khi phân tích thêm, Chen (2009) quan sát thấy bộ gen của
B.amyloliquefaciens FZB42 còn ẩn chứa sự sắp xếp của các gen tổng hợp các lipopeptide
và polyketide có khả năng kháng nấm, kháng khuẩn.
Theo R.A.Nastro et al. (2012) thì Bacillus subtilis, Bacillus polyfermenticus và
Bacillus amyloliquefaciens có khả năng sản xuất ra các phân tử kháng khuẩn. Gần đây,
một số nhà nghiên cứu mô tả một phân tử bacteriocin được sản sinh bởi
B.amyloliquefaciens và hoạt động chống lại sinh vật đơn bào gây bệnh ở người. Các phân
tử kháng sinh có tính chất hóa học và cơ chế khác nhau, nhưng trong một số trường hợp

thì không rõ. Trong quá trình theo dõi ở một số bệnh viện, cho thấy Bacillus
amyloliquefaciens HNA3 sản xuất thuốc kháng sinh chống lại cả vi khuẩn gram dương và
gram âm.
b. Bacillus cereus
Đây là loài có mối quan hệ gần gũi với Bacillus anthracis, Bacillus mycoides,
Bacillus thuringiensis. Bào tử của chúng phát tán khắp nơi, trong đất, không khí… Chúng
thường sinh sôi nảy nở trên thực phẩm như cơm và có thể sinh ra độc tố làm cho thực
phẩm hư hỏng. Chúng được áp dụng để sản xuất kháng sinh.
Chuyên ngành Vi Sinh Vật học 13 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học