Nghiên cứu đặc tính của mycocin từ một số chủng vi nấm

BỘ YTẼ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
TRẦN THỊ MINH ĐỨC
NGHỈÊN CỨU ĐẶC TÍNH CỦA MYCOCIN
■
TỪ MỘT SỐ CHỦNG VI NẤM
■
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHOÁ 1997-2002)
Người hướng dẫn: TS. Vũ Nguyên Thành
GVC. Nguyễn Lệ Phi
Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh
Viện Công nghiệp Thực phẩm
Thời gian thực hiện: 04/03 - 25/05/2002
Hà Nội, 6 - 2002
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành biết ơn Ban giám hiệu, các thầy giáo cô giáo, các cán bộ
trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình giảng dạy trong 5 năm tôi học tập tại
nhà trường.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với TS. Vũ Nguyên Thành,
GVC. Nguyễn Lệ Phi - những thày cô đã trực tiếp hướng dẫn tôi làm khoá
luận này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các cán bộ, kỹ thuật viên bộ
môn Vi sinh - Viện Công nghiệp Thực phẩm và bộ môn Vi sinh - Sinh học
Trưòíng Đại học Dược Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực
hiện đề tài này.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Từ Minh Koóng về những lời khuyên
quý báu cho khoá luận.
Tôi xin cảm ơn CN. Đào Anh Hải, sv. Dương Anh Tuấn đã hỗ trợ và giúp
đỡ tôi hoàn thành khoá luận này.
Tôi xin cảm ơn tất cả người thân, bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong quá
trình học tập và nghiên cứu.

Hà Nội, tháng 5 năm 2002
Sinh viên
Trần Thị Minh Đức
MỤC LỤC
Đặt Vấn Đề

1
Phần 1- Tổng quan

2
1.1. Đại cương về nấm men 2
1.2. Mycocin 4
1.2.1. Vài nét khái quát 4
1.2.2. Cấu tạo của mycocin 5
1.2.3 Cơ chế tác động của mycocin lên tế bào chủng mẫn cảm

6
1.2.4. Ý nghĩa của việc nghiên cứu Mycocin
6
1.3. Vài nét về các chủng sinh mycocin nghiên cứu

7
Phần 2- Thực nghiệm và kết quả 8
2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm

8
2.Ỉ.L Nguyên vật liệu 8
2.1.2. Phương pháp nghiên cứu 9
2.2. Kết quả thực nghiệm và nhận xét

13
2.2.1. Quan sát hình thái tế bào các chủng sinh mycocin 13
2.2.2. Kết quả nghiên cứu các đặc tính sinh hoá của SS4.2 13
2.2.3. Phổ chống nấm của các mycocin
2.2.4. Kết quả thử độc tính cấp các mycocin nghiên cứu

21
2.2.5. Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến hoạt tính của mycocin

21
2.2.6. Kết quả nghiên cứu đặc tính hoá học của các mycocin

25
Phần 3 - Kết luận và đê xuất
28
3.1. Kết luận 28
3.2. Đề xuất 28
Tài liệu tham khảo 29
ĐẶT VÂN ĐỂ
Mycocin là chất do vi nấm tiết ra nhằm ức chế hoặc tiêu diệt các chủng
khác cùng loài và các chủng có họ hàng gần. Nhiều nghiên cứu về mycocin
trong thời gian gần đây tập trung theo hướng ứng dụng mycocin như những
thuốc chống nấm đặc hiệu hoặc làm chất bảo quản thực phẩm chống lại sự
xâm nhập và phá huỷ của nấm men.
Cho tới nay trên dưới 80 loài nấm men có khả năng sinh mycocin đã được
biết tới. Trong số này hiện chỉ có một vài mycocin thực sự có tiềm năng ứng
dụng. Một trong những hướng phát triển đang nhận được nhiều quan tâm của
các nhà khoa học là tìm kiếm và xác định đặc tính của những loài có khả năng
sinh mycocin mới. Đa dạng sinh học tiềm ẩn của thế giới nấm men là một
thách thức đầy hứa hẹn.

Tại Việt Nam, Viện Công nghiệp Thực phẩm - Bộ Công nghiệp trong nỗ
lực tìm kiếm các mycocin mới có khả năng ứng dụng đã phát hiện một số
chủng nấm men có khả năng sinh mycocin. Đặc tính mycocin do các chủng
trên tiết ra vẫn chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ và chi tiết. Vì vậy,
chúng tôi tiến hành đề tài '"Nghiên cứu đặc tính của mycocin từ một số
chủng vi nám'' với các mục tiêu sau:
1. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá của các chủng vi nấm sinh
mycocin SS4.2, IFO-0895, N14.1.
2. Tách chiết mycocin, xác định đặc điểm hoá học, kích thước phân tử.
3. Khảo sát một số đặc tính sinh học của mycocin (phổ tác dụng, ảnh
hưởng của thời gian nuôi cấy lên hoạt tính của mycocin).
4. Thử độc tính cấp của mycocin.
PHẦN 1- TỔNG QUAN
1.1. Đại cương về nấm men
Nấm men gồm những loại nấm đoỉn bào thuộc giới Eucaryotes. Tuỳ từng
loại nấm men mà chúng có hình thái và kích thước khác nhau. Chúng có thể
có hình cầu, hình bầu dục, hình trứng, hình quả chanh, hình ống Kích thước
tế bào thay đổi tuỳ loài, tuỳ giống, tuỳ điều kiện sinh trưởng và có thể thay đổi
trong khoảng 1 - 5 X 5 - 30 I^m hay có khi dài hơn nữa nhưng thường kích
thước tế bào của các loại nấm men vào khoảng 4 - 5 ịim. Nấm men phân bố
rất rộng rãi trong tự nhiên (trên hoa, quả, trên thực phẩm, lương thực, trong đất
v.v ).
Nấm men sinh sản bằng cách nảy chồi hay phân đôi. Khi tế bào nấm men
bắt đầu trưởng thành sẽ nảy ra một chồi nhỏ. Chồi lớn dần lên, một phần nhân
của tế bào mẹ được chuyển sang chồi, sau đó tách hẳn ra thành một nhân mới.
Đến một lúc nào đó, tế bào mới sinh ra sẽ hình thành nên vách ngăn ngăn cách
với tế bào mẹ hoặc vẫn đính trên tế bào mẹ và tiếp tục nảy ra các chồi mới. ở
một vài loài nấm men, thay thế cho hình thức sinh sản nảy chồi là hình thức
phân cắt tế bào mẹ thành hai tế bào con giống hệt nhau như ở
Schizosacharomyces.

Nấm men là một trong những nhóm vi sinh vật quan trọng được ứng dụng
trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Trong nông nghiệp thực phẩm,
Saccharomyces cerevisiae được sử dụng để sản xuất rượu vang, sản xuất bia,
Kluyveromyces marxianus trong sản xuất sữa chua Trong y học,
Saccharomyces cerevisỉae còn được ứng dụng trong điều trị một số bệnh
đưòfng tiêu hoá và có thể phối hợp với kháng sinh mà không bị mất tác dụng
[4]. Bên cạnh đó, nấm men cũng gây bệnh cho con người và làm hỏng thực
phẩm. Ngày nay, các vi nấm có nhiều cơ hội gây bệnh hofn trước do sự cấy
ghép mô phổ biến, bệnh ung thư, các bệnh suy giảm miễn dịch, đặc biệt là sự
lan tràn rộng khắp của đại dịch AIDS. Đây là những yếu tố thuận lợi làm tăng
khả năng xâm nhập vào cơ thể và gây bệnh của vi nấm. Điển hình trong số các
nấm men gây bệnh là Candida albicans (và một số loài Candida khác) gây
tưa miệng và viêm âm đạo, Cryptococcus neoformans gây viêm não - màng
não, Malasseizia furfur gây bệnh lang ben [5]. Điều trị các bệnh do vi nấm
gặp tương đối nhiều khó khăn do tính không ổn định với kháng sinh và hay tái
phát. Hiện nay đã có nhiều loại thuốc chống nấm, tuy nhiên việc tìm ra các
thuốc kháng nấm mới vẫn đang được tiếp tục [9].
Trên thực phẩm, Zygosaccharomyces bailii phát triển trên nồng độ đường
cao, làm hư hỏng mật xirô, làm lên men một số rượu vang và nước đậu tương.
Geotrichum candidum làm tăng pH các sản phẩm đồ uống, tạo điều kiện cho
vi khuẩn tạp nhiễm phát triển và còn mọc tốt trên sản phẩm thức ăn và mỡ, có
khả năng phân huỷ lipid mạnh. Debaryomyces sp. và Pichia sp. tạo màng trên
bề mặt của sản phẩm như dưa chuột ướp chua [3].
Để bảo quản thực phẩm chống sự xâm nhiễm của các vi nấm và vi khuẩn,
có các phương pháp bảo quản như: bảo quản ở nhiệt độ thấp, ướp đường ướp
muối, bảo quản bằng cách thay đổi thành phần không khí quanh sản phẩm
và bảo quản bằng hoá chất. Các hoá chất dùng để bảo quản thực phẩm bao
gồm: các chất chống oxy hoá (acid acetic, acid citric, acid ascorbic, acid
sorbic, acid benzoic và muối benzoat natri), các chất sát khuẩn (anhydric
sulíurơ SO2, natri sunfit NajSOj, natri nitrat NaNOg) và các chất kháng sinh.

Các chất kháng sinh được dùng nhiều nhất là biomixin, teramixin có tác
dụng kéo dài thời gian bảo quản. Việc dùng chất kháng sinh vào thực phẩm tới
nay ít được phổ biến rộng rãi, bởi lẽ có thể tạo ra các dòng vi khuẩn nhờn với
thuốc làm giảm tác dụng của thuốc, dẫn tới điều trị một số bệnh nhiễm khuẩn
bằng kháng sinh kém hiệu quả [3]. Ngày nay, người ta thường sử dụng các
chất kháng sinh không dùng cho y học do vi khuẩn sinh ra, đặc biệt là các vi
khuẩn lactic (gọi chung là bacteriocin). Hai chế phẩm từng được biết đến là
diplocoxin và nizin. Nizin được dùng trong chế biến phomát để diệt vi khuẩn
kỵ khí Clostridium, trong nước ép đóng hộp, đồ hộp, rau quả tươi
Mycocin (zymocin, killer toxin) cũng đang được các nhà khoa học tích cực
nghiên cứu để có thể trở thành kháng sinh bảo quản thực phẩm và xa hơn nữa
là trở thành thuốc điều trị nấm gây bệnh [7, 6, 14, 10, 15].
1.2. Mycocin
1.2.1. Vài nét khái quát
Gần 40 năm trước, Makower và Be van (Mỹ) phát hiện một số chủng của
Saccharomyces cerevisiae có khả năng sinh tổng hợp protein (killer toxin) diệt
các chủng khác cùng loài. Những chủng này kháng được killer toxin do bản
thân chúng sinh ra. Một số chủng khác không sinh killer toxin và cũng không
mẫn cảm với killer toxin. Những nghiên cứu tiếp theo đã phát hiện ra các
chủng killer của s. cerevisiae sinh ra killer toxin bởi dsARN mạch thẳng. Một
dsARN khác thì mã hoá protein vỏ bao bọc cả hai dsARN trên trong những
thể hạt virus (VLP). Những thể hạt virus này không lây nhiễm mà lan truyền
thông qua quá trình phân chia tế bào hoặc tiếp hợp hữu tính [14].
Hiện tượng killer đã trở thành đối tượng lý tưởng cho các nghiên cứu về
tương tác giữa tế bào nhân thật (Eucaryotes) với virus cũng như các khảo sát
về quá trình bài tiết protein. Để hiểu đúng về hiện tượng killer cần nhấn mạnh
rằng hiện tượng này không đặc thù cho nấm men. Quá trình tổng hợp những
protein mang đặc tính đặc hiệu đối với cá thể thuộc họ hàng gần và khả năng
đề kháng tương ứng cũng được biết ở nấm than (smut fungi), trùng đế giày
(paramecium), nấm nhày (slime mold) và vi khuẩn. Các protein có tính chất

kháng sinh của vi khuẩn được gọi là bacteriocin và do vậy để nhấn mạnh bản
chất chung của những tương tác đối kháng kiểu này, tốt hơn hết là gọi các
killer toxin của nấm men là mycocin.
Các kiểu killer dựa trên dsARN như ở Saccharomyces cerevisiae còn gặp
thấy ở Hanseniaspora uvarum, Sporỉdiobolus johnsonii (S. salmonicolor) và
Cystofilobasidium bisporidii. Mycocin sinh ra bởi Kluyveromyces lactis,
Pichỉa acaciae và p. inositovora gắn liền với các plasmid dsADN mạch thẳng.
Đặc tính killer của Candida glabrata và một số chủng của s. cerevisiae được
mã hoá bởi gen trong chromosom. Trong nhiều trường hợp đặc tính killer tuy
chưa đánh giá cụ thể về mặt di truyền nhưng được tạm cho là có nguồn gốc
trong chromosom [7, 14, 12],
Bảng 1. Những loài nấm men mà hoạt tính mycocin đã được công bố.
Giống Loài
Candida
C. dattila, C. glabrata, C. guilliermondii, C. holmii, C. krusei, C.
maltosa, C. neodendra, C. parapsilosis, C. pseudotropicalis, C.
sonorensis, C. sphaerica, C. valida, C. versatilis.
Cryptococcus
Cr. albidus, Cr. laurentii, Cr. podzolicus
Cystofîlobasidium
Cys. bisporidii
Debaryomyces
D. hansenii, D. polymorphus, D. vanrijiae
Filobasidium
F. capsuligenum
Hanseniaspora
H. uvarum
Kloeckera
K. apiculata, K. japónica
Kluyveromyces

Kl. aestuarii, Kl. dobzhanskii. Kl. lactis. Kl. lodderae. Kl.
marxianus. Kl. phaffii. Kl. wickerhamii, Kl. wikenii
Metschnikowia
M. pulcherrima
Pichia
P. acaciae, P. amethionina, P. anómala, P. antillensis, P.
bimundalis, P. cactophila, P. canadensis, P. ciferrii, P.fabianii, P.
farinosa, P. guilliermondii, P. holstii, P. inositovora, P. jadinii, P.
kluyverii, P. membranifaciens, P. mexicana, P. minuta var.
nonfermentans, P. ohmeri, P. opuntiae, P. petersonii, P. pini, P.
quercuum, P. spartinae, P. subpelliculosa, P. thermotolerans
Rhodotorula
R. fujisanensis, R. glutinis, R. mucilaginosa, R. pallida
Saccharomyces
S. cerevisiae, S. paradoxus, S. unisporus
Sporỉdiobolus
Sp. johnsonii, Sp. pararoseus
Trichosporon
T. capitatum
Williopsis
W. californica, W. pratensis, W. saturnus, W. saturnus (W.
beijerinckii), W. saturnus var. mrakii, W. saturnus var.
sargentensis, W. saturnus var. subsujficiens
1.2.2. Cấu tạo của mycocỉn
Tất cả các mycocin đã được biết đến đều có bản chất protein. Chúng có thể
là protein hoặc glycoprotein chứa từ hai tới ba cấu tử (Subunit). Đối với hầu
hết các nấm men, trọng lượng phân tử của mycocin có kích thước trong
khoảng từ 10 đến 20 KDa (kilo dalton). Trọng lượng phân tử mycocin của
Kluyveromyces lactis và Pichia anómala lại lớn hơn nhiều (100 KDa và hơn
nữa). Mycocin KI (20548 Da) do s. cerevisiae tiết ra được cấu tạo từ a và (3-

polypeptid liên kết bởi cầu sulfit đôi và có chứa nhiều acid amin kỵ nước cũng
như acid amin mang điện tích. Tiền chất của KI được tổng hợp trong tế bào là
một phân tử polypeptid mạch đơn kích thước lớn với hai cấu tử a và p tách
riêng bởi vùng Y có độ glycoside hoá cao [14].
1.2.3 Cơ chế tác động của mycocỉn lên tế bào chủng mẫn cảm
Mycocin gây giảm pH nội bào và thất thoát K^, ATP cũng như một số chất
trung gian của nội bào. Chúng ức chế vận chuyển acid amin và ra ngoại
bào. Các quá trình trên thể hiện sự gia tăng của độ dẫn proton qua màng ở
những tế bào mẫn cảm. Như vậy, mycocin tương tác với màng tế bào chủng
mẫn cảm, tạo nên những kênh cho các ion lọt qua. Những lỗ thủng này sẽ phá
huỷ hiệu thế điện hoá của màng và dẫn tới tiêu diệt tế bào. Một số trường hợp
đặc biệt như mycocin của Kluyveromyces lactis ngăn chặn chu trình phân chia
tế bào ở pha Gl. Mycocin của Williopsis saturnus var. mrakii (IFO 0895) ức
chế quá trình tổng hợp P-l,3-glucan, còn toxin KT 28 của s. cerevisiae ức chế
quá trình tổng hợp ADN [14],
1.2.4. Ý nghĩa của việc nghiên cứu Mycocỉn
Những nghiên cứu ban đầu về hiện tượng killer của nấm men tập trung vào
s. cerevisiae và chủ yếu liên quan tới đặc tính di truyền, sinh hoá và sinh học
phân tử của hiện tượng. Đến nay, hiện tượng killer được biết tới đối với
khoảng 80 loài nấm men đại diện cho gần 20 họ thuộc cả
Ascomycetes và
Basidỉomycetes. Ngoài ý nghĩa để tìm hiểu thế giới tự nhiên đa dạng, việc
nghiên cứu mycocin còn mang nhiều ý nghĩa thực tiễn. Các mycocin không
thích hợp để dùng làm kháng sinh chống nấm trong y học (dùng đường uống
hoặc tiêm) do chúng có bản chất protein và thường kém bền với nhiệt độ và
pH. Chúng chỉ có thể dùng cho các nhiễm trùng nấm ở ngoài da, miệng và âm
đạo. Một số nấm men sinh các độc tố bền hơn và một số độc tố có tác dụng
chống nấm men gây bệnh. Do vậy, trong tương lai, hy vọng mycocin có thể có
ứng dụng trong y học. Các mycocin cũng có thể dùng trong điều trị bệnh nhân
AIDS bị các nhiễm trùng nấm cơ hội [14]. Mycocin còn hứa hẹn nhiều triển

vọng là những kháng sinh an toàn trong việc bảo quản thực phẩm chống sự
phá huỷ của nấm men, đặc biệt là các loại nước hoa quả. Những sản phẩm này
thường có hàm lượng đường cao, pH thấp, do đó là điều kiện rất thuận lợi cho
sự sinh trưcmg và phát triển của nấm men. Sự xâm nhập không kiểm soát của
nấm men từ môi trường sẽ làm hỏng hương vị và chất lượng của nước hoa quả.
Trong một số điều kiện, quá trình lên men không lưòỉng trước có thể làm nổ
bao gói, bình chứa gây thất thoát và ảnh hưởng tới an toàn sản xuất. Người ta
cũng đã thành công trong việc chuyển gen mang đặc tính killer vào các chủng
công nghiệp phục vụ lên men. Điều này không làm thay đổi hương vị của sản
phẩm, độc tố do chúng sinh ra chỉ tác dụng đặc hiệu lên chủng mẫn cảm mà
không gây độc cho người [1].
1.3. Vài nét về các chủng sinh mycocin nghiên cứu
Trong số các chủng có khả năng sinh mycocin được phát hiện và lưu giữ tại
Sưu tập giống Vi sinh vật công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm, chúng
tôi chọn ra 3 chủng nấm có khả năng sinh mycocin mạnh nhất để nghiên cứu.
Đó là các chủng:
Nấm men Williopsis sartunus yãĩ.mrakii IFO-0895. Mycocin do IF0-0895
sinh ra có phổ tác dụng khá rộng. Bản chất của nó là một polypeptid gồm
88 acid amin, Kích thước phân tử khoảng 10,7 kDa. Đặc biệt, nó có độ ổn
định cao, vẫn giữ được hoạt tính trong khoảng pH rộng (pH từ 2-11) và ở
100 trong 10 phút [10]. Cơ chế tác dụng lên các chủng mẫn cảm là ức
chế tổng hợp l,3-í3-glucan thành tế bào. Những ưu điểm này đã khiến
mycocin của IPO-0895 trở thành một chất khá lý tưởng trong bảo quản
thực phẩm [10, 13]. Chủng IPO-0895 được đề cập nhiều nhất trong các
nghiên cứu ứng dụng của mycocin.
SS4.2 (nấm men) và NI4.1 (nấm mốc) là hai chủng nấm sinh mycocin
phân lập được tại Việt Nam. SS4.2 được phân lập từ tương còn N14.1 từ lá
cây. Hai chủng này đại diện cho hai loài chưa được biết tới. Sau khi được
giải trình tự gen 26S rRNA miền D1/D2, gen của SS4.2 khác biệt trên 100
nucleotid trên tổng số 535 nucleotid được đọc so với loài đã biết gần nhất.

Chủng N14.1 tương tự như vậy, có 19 nucleotid khác biệt trên tổng số 538
nucleotid so với loài gần nhất là Microstroma juglandis. Theo lý thuyết,
chỉ cần sự khác biệt từ 5-7 nucleotid trong miền D1/D2 thì đã được coi là
khác loài. Chính vì vậy, SS4.2 và N14.1 được coi là những loài mới'*\
- Kết quả chưa công bố của Viện Công nghiệp Thực phẩm.
PHẦN 2- THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm
2.1.1. Nguyên vật liệu
a. Chủng giống
Đối tượng nghiên cứu của chúng tôi là 3 chủng vi nấm: nấm men IFO-
0895 (Williopsis sartunus ysiĩ.mrakiỉ), nấm men SS4.2 và nấm mốc N14.1.
Các chủng này được lấy từ Sưu tập giống Vi sinh vật Công nghiệp, Viện
Công nghiệp Thực phẩm.
Để phục vụ nghiên cứu tương tác đối kháng, chúng tôi sử dụng 44 chủng
nấm men từ Sưu tập giống Vi sinh vật Công nghiệp, Viện Công nghiệp
Thực phẩm. Ngoài ra còn có 3 chủng vi khuẩn và 1 chủng nấm mốc từ Bộ
môn Vi sinh, Trường Đại học Dược Hà Nội được dùng cho khảo cứu. Danh
sách các chủng cũng như tên loài được liệt kê cùng kết quả.
b. Các môi trường
- Môi trường YEPD
Cao nấm men 1% (Difco), Pepton 2% (Difco), D-glucose 2% (Trung
Quốc), Nước cất 1000 ml. Hấp ở 121°c/ 30 phút.
- Môi trường thử hoạt tính của mycocin
Môi trường Malt-Glucose 2° Bx (Malt l°Bx, Glucose l°Bx) có bổ sung agar
1,8% hấp ở 121°c/ 30 phút. Sau khi hấp, bổ sung 1/10 thể tích đệm phosphate-
citrate 0,5M, pH=3 [6, 7 ].
- Môi trường giữ giống
Môi trường malt glucose 2°Bx (Malt l^Bx, Glucose l°Bx) có bổ sung agar
2%. Hấp ở 121 °c/ 30 phút [1].
- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn [2];

Pepton bột 5g, Cao thịt 2,5g, NaCl 2,5g, Thạch 9g, Nước 500ml. pH=7,
hấp 121 °c/ 30phut.
c. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm:
- Máy đông khô Christ BETA 2-16
- Máy điện di Hoefer (Amersham Pharmacia Biotech)
- Máy lắc IKA KS-130 basic
- Máy ly tâm Universal 16 (Hettich)
- Máy so mầu Jenway 6300 Spectrophotometer
- Kính hiển vi Eclipse E600 - Nikon (Nhật)
- Nồi hấp áp lực Himayama Toko (Nhật)
- Tủ cấy Bioblock Scientific (Pháp)
- Lò vi sóng LG (Hàn Quốc)
- Tủ lạnh LG (Hàn Quôc)
- Tủ ấm 25°c Velp - Scientifica
- Màng lọc Protein MWCO 3500 (Fisherbrand)
- Kính sắc ký bản mỏng silica gel 60 (Merck)
- Đĩa petri, pipet, que cấy, bình đựng môi trường, ống ependorf, ống Falcon,
các loại đầu côn 1000 |Lil và 200 1^1.
2.1.2. Phương pháp nghiên cứu
a. Quan sát hình thái, đặc tính sinh hoá của chủng sinh mycocin
- Quan sát hình thái tế bào
Sử dụng kính hiển vi để quan sát hình thái tế bào nấm với độ phóng đại 400
lần và 1000 lần.
- Khảo sát đặc tính sinh hoá của tế bào SS4.2
Môi trường gốc nitơ (Difco) được khử trùng bằng phương pháp lọc. Các hoá
chất thử test sinh hoá (Sigma) được hấp thanh trùng ở 0,9 atm trong 15 phút.
Các hoá chất thử được trộn với môi trường gốc nitơ và bổ sung nước cất thanh
trùng sao cho nồng độ của môi trường gốc đạt 6.7 g/1, còn các chất thử đạt
0.5% (riêng raffinose - 1%). Test thử khả năng mọc trên môi trưcmg chứa 1%
acid acetic được chuẩn bị từ môi trường YM (glucose 1%, malt 0.3%, cao nấm

men 0.3%, peptone 0.5%) với lượng acid acetic tương ứng. Với test
cycloheximide, môi trường gốc nitơ chứa 1% glucose và 0.01%
cycloheximide được sử dụng [8].
Chủng SS4.2 được hoà vào nước cất vô trùng tới nồng độ xấp xỉ 10^ tế
bào/ml. Trong mỗi ống nghiệm, cho 50 1^1 chủng vào 1 ml môi trường. Tiến
hành nuôi cấy ở 25
°c và theo dõi khả năng phát triển của SS4.2 sau 7 ngày, 14
ngày và 21 ngày. Các ống có sự phát triển rõ rệt của SS4.2 được đánh giá là
dương tính (+), ngược lại, những ống SS4.2 không phát triển được đánh giá là
âm tính (-), Trong trường hợp sự phát triển chỉ xảy ra sau 21 ngày thì gọi là
chậm (D) (delay).
b ^ á c ề chiết mycocỉn
Các chủng sinh mycocin được nuôi cấy trên môi trường YEDP, lắc 240
vòng/phút ở 25-27°C trong vòng 48 giờ. Dịch tế bào sau nuôi cấy được ly tâm
với tốc độ 4000 vòng/ phút trong 7 phút. Phần dịch đã loại tế bào chính là dịch
mycocin được sử dụng cho các thí nghiệm về sau (nồng độ ban đầu).
Cô đặc các dịch sau ly tâm
Sử dụng máy đông khô để cô đặc các canh trường của SS4.2, IPO-0895 sau
ly tâm. Dịch chiết sau đông khô được loại các thành phần phân tử lượng thấp
(đường, muối, rượu ) bằng màng lọc bán thấm có kích thước thẩm tích tối đa
3500 Da. Riêng với NI4.1 canh trường được chỉnh pH tới 3.0 bằng dung dịch
đệm phosphate-citrate. Sau đó mycocin NI4.1 được tách chiết bằng
ethylacetat. Ethylacetat được loại bỏ bằng phương pháp cô quay. Cặn còn lại
được hoà tan trong 10 ml nước, ta thu được dịch mycocin đậm đặc của N14.1.
Các dịch đậm đặc này được dùng để thử độc tính cấp trên chuột. Với những
phương thức trên, dịch mycocin có độ đậm đặc từ 75-100 lần so với ban đầu
được thu nhận.
c. Tìm hiểu đặc điểm của các mycocin
- Khảo sát phổ hoạt động chống nấm của các mycocin
Để khảo sát các tương tác đối kháng, phương pháp khuếch tán trên thạch

được sử dụng. Các chủng mẫn cảm được pha loãng bằng nước cất với nồng độ
khoảng 10^ TB/ml và cho vào mỗi đĩa petri 500 |il dịch chứa chủng mẫn cảm.
Sau đó dùng pipet hút 20 ml môi trường thử hoạt tính mycocin (đã để nguội
đến 45°C) đổ vào đĩa, láng đều. Dùng khoan tiệt trùng đục lỗ thạch, đường
kính lỗ đục 0,7 cm. Dùng pipet nhỏ lần lượt 50 ịil từng dịch: SS4.2, IFO 0895,
NI4.1 vào các lỗ. Các đĩa petri được để trong tủ ấm 25°c. Kết quả được quan
sát sau 48 giờ, đo đường kính vòng ức chế.
Tìm hiểu kiểu tác dụng của mycocin.
Khả năng mycocin làm chết tế bào hoặc chỉ ức chế tạm thời được xem xét.
Để thực hiện thí nghiệm tế bào chủng mẫn cảm SBY-2576 được hoà tan trong
đệm phosphate-citrat 0,05M pH = 3, nồng độ 10^ TB/ml. Dịch mycocin thô
được trộn vào dịch chứa tê bào SBY-2576 theo tỷ lệ 1:1. Để ở nhiệt độ 25°c
trong 3 giờ. Sau 3 giờ, ly tâm, loại bỏ dịch, rửa lại tế bào 2 lần bằng phosphat-
citrate 0,05M pH = 3. Pha loãng nồng độ tế bào SBY-2576 tới các nồng độ 1,
1/10, 1/100. Các dịch chứa SBY-2576 được cấy lên các đĩa petri chứa môi
trường Malt-glucose 2°Bx. Sau 48 giờ, theo dõi kết quả. Nếu chủng mẫn cảm
vẫn mọc, suy ra mycocin chỉ có tác dụng ức chế. Nếu SBY-2576 không mọc
có nghĩa mycocin có tác dụng tiêu diệt chủng mẫn cảm.
- Điện di (SDS PAGE) [W]
Gel điện di cũng như điều kiện chạy được thực hiện theo phương pháp
chuẩn với các thành phần cơ bản như sau:
- Đệm nạp mẫu (sample bufer): 0.125 M Tris-HCl pH = 6.8, 4 % SDS, 20
% glycerol
- Đệm chạy (tank buffer): 0.025 M Tris pH = 8.3, 0.192 M glycine, 0.1
%SDS
- Gel phân tách (seperating gel):
Đêm (1,5M Tris - HCl pH = 8,8)
2,5ml
H2O
0,68ml

Acrylamide (1:29) 30%
6,66ml
SDS 10%
0,1ml
Ammonium persulphate 10%
50|al
IJbMED
10^1
dẫn (stacking gel):
Đêm (0,5M Tris - HCl pH = 6,8)
1,25 ml
H2O
3 ml
Acrylamide (1:29) 30%
0,675 ml
SDS 10%
50
Ammonium persulphate 10%
30 1^1
IHMED
5,5 ịiì
y
Mẫu mycocin của SS4.2, N14.1 được trộn với đệm tra mẫu theo tỉ lệ 1:1 sau
đó được tra vào các giếng, mỗi giếng lO^il. Tiến hành chạy ở 150V, 24mA
trong vòng 3 tiếng. Sau khi chạy, bản gel được nhuộm bằng dung dịch nhuộm
gel gồm 0,125% Coomassiae Blue R-250, 50% Methanol, 10% Acetic acid
qua đêm sau đó được rửa trong dung dịch chứa 30% Methanol và 10% Acetic
acid.
- Sắc ký bản mỏng mycocin N 14.1
Với mục đích tách mycocin của N14.1 ra khỏi các chất khác, chúng tôi thực

hiện phương pháp sắc ký bản mỏng với pha tĩnh là silicagel. Pha động là các
dung môi nhaiLTitwr F.thylar^at - Methanol - Acetic acid (7,5 : 2 : 0,5);
Methanol; ( ^ thanol sác kv đảo Ethanol; Àceton - Acetonitrile (Ijl);
Ethylacetat vã^'€hiorofgmtr Satt-jdĩi tuỳến dung moi đạt gan vị trí đỉnh của
bản sắc ký, để khô các miếng kính sắc ký và đặt lên đĩa petri có môi trường
thử mycocin chứa nấm men SBY-2576. Sau 48h ở nhiệt độ 25°c, quan sát
vòng ức chế do phân đoạn mycocin của NI4.1 tạo ra.
d. Thử độc tính cấp trên chuột
Chuột nhắt trắng chủng Swiss thể trọng 20g được cho uống mycocin ở nồng
độ đậm đặc nhất có thể thu nhận được (đặc 75 - 100 lần). Mỗi lô chuột thử
gồm 6 con (3 chuột đực, 3 chuột cái). Cho chuột nhịn ăn trước và sau khi uống
thuốc 2 tiếng. Mỗi con chuột được uống 0,5 ml dịch đậm đặc. Sau khi chuột
uống thuốc, chúng tôi theo dõi chuột trong suốt 72 giờ về tình trạng sức khoẻ
và hoạt động của chúng.
e. Khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến hoạt tính của mycocỉn
Môi trường nuôi cấy SS4.2, IFO 0895 là môi trưòỉng YEPD. Môi trưòíng
nuôi cấy N14.1 là Malt 3”Bx (Malt l,5°Bx, Glucose l,5°Bx). Nuôi cấy lắc các
chủng nấm trong vòng 1 tuần. Cứ sau 24h, tiến hành lấy 5ml mẫu một lần.
Sinh khối được xác định bằng phương pháp đo độ đục ở bước sóng 620 nm
sau khi đã ly tâm và thu hồi tế bào. Phần canh trường được bảo quản ở - 20°c.
Sau khi hết thời gian khảo sát, đem thử hoạt tính mycocin của tất cả các mẫu
lấy tại các thời điểm khác nhau. Chủng mẫn cảm sử dụng là SBY-2576
(Saccharomyces cerevisiae).
2.2. Kết quả thực nghiệm và nhận xét
2.2.1. Quan sát hình thái tế bào các chủng sình mycocin
IFO 0895: tế bào hình elip. Sinh sản bằng cách nảy chồi. Trong pha
sinh sản hữu tính tạo bào tử túi. Bào tử hình cầu, có vành hình sao Thổ
(Satum) (Hình la, b). Mỗi túi chứa 1-2 bào tử. Khi đã già bào tử được
giải phóng ra khỏi túi. Khuẩn lạc màu trắng, dẹt, tròn đều, không bóng.
N14.1: tế bào dạng sợi. Sinh sản bằng cách phân chia và nảy chồi trên

cuống tạo bào tử sinh dưỡng, Bào tử mọc thành chùm và hình thành tại
các điểm riêng biệt trên cuống sinh bào tử (Hình 1 c, d). Khuẩn lạc
trắng, dày và xù xì, Trên một số môi trường (như môi trường Malt-
Glucose 2°Bx) NI4.1 sinh sắc tố. sắc tố này tự chuyển mầu theo pH
môi trường. Khi đưa vào môi trường axit, sắc tố có mầu đỏ và chuyển
thành xanh lam khi’thay đổi môi trường thành bazơ. Pha sinh sản hữu
tính chưa phát hiện được.
SS4.2: tế bào hình trứng, sinh sản bằng cách nảy chồi và phân cắt (Hình
2). Khuẩn lạc khi còn "non" có màu trắng nhưng khi về "già" lại chuyển
sang màu vàng, lục và sau đó là nâu đen. Khuẩn lạc khô, gồ ghề phát
triển chậm trong thời gian đầu. Pha sinh sản hữu tính chưa phát hiện
được.
2.2.2. Kết quả nghiên cứu các đặc tinh sình hoá của SS4.2
Trong tổng số 41 môi trường chứa các nguồn carbon đem thử, SS4.2 sử
dụng được 10 nguồn carbon, đó là D-Glucose, D-Ribose, Sucrose,
Maltose, Cellobiose, Arbutin, Glycerol, Erythritol, D- Mannitol và
Ethanol. SS4.2 không sử dụng được 31 nguồn Carbon còn lại (Bảng 2).
Trên môi trường chứa các chất độc hại thì SS4.2 mọc được trên môi
trường chứa 0,01% cycloheximid nhưng mọc chậm, không mọc được
trên môi trưòỉng chứa 1% acid acetic (Bảng 3).
h:*
V ' ‘1 .«■-■o."'"' ‘
s ^ "#J ‘
Ọ C/ |: ^
t.» \
tT^
' J lA . i#'
Ci
r:i
a ^ ■ * b

.
‘
.

.
.
.

.

.

:;,#;■ B'. t
.Ẹ- ị
% ;p\ I
,

ầ % II' "
■ i
t
■■ #■
*»
Hình 1. Hình thái tế bào chủng IFO - 0895 và NỈ4.Ỉ mọc trên môi trường
Malt-Glucose 2" Bx. (a): IFO-0895 ở độ phóng đại ỉ 000 lần. (h): IFO - 0895
ở độ phóng đại 400 lần. (c): NỈ4.I ở độ phòng đại 400 lần. (d): N14.Ỉ ở độ
phóng đại 1000 lần.
(
( / )
a
o

I i
Hình 2. Hình thái tế bào chủng SS4.2 nuôi cấy trên môi trường agar chứa
Malt-Glucose 2'’ Bx. (a, b): SS4.2 ở độ phóng đại 1000 lần. ịc, d): SS4.2 ở độ
phóng đại 400 lần.
Kí hiệu
Nguồn Cac bon
Kết quả
Kí hiệu Nguồn Cac bon
Kết quả
C1
D-Glucose
+
C22 Starch
-
C2
D-Galactose
-
C23
Glycerol
+
C3
L-Sorbose - C24 Erythritol +
C4
D-Glucosamine
-
C25
Ribitol
-
C5
D-Ribose

+ C26
Xylitol
-
C6
D-Xylose
-
C28
D- Glucitol
-
C7
L-Arabinose
-
C29 D- Mannitol
+
C8
D-Arabinose -
C30
Galactitol -
C9
L-Rhamnose - C31 myo- Inositol -
CIO
Sucrose
+
C32
D- Glucono-l,5-lactone -
CU
Maltose + C33 2-Keto-D-gluconate
-
C12 a- Trehalose - C34 5-Keto- D-gluconate
-

C13
Methyl a-D
glucopyranoside
-
C35
D-gluconate
-
C14
Cellobiose
+
C37 D-Galacturonate
-
C15
Salicin
-
C38 DL- Lactate
-
C16
Arbutin + C40
Citrate
-
C17
Melibiose -
C41 Methanol
-
C18
Lactose
-
C42
Ethanol H-

C19
Raffinose
-
C43
Propane 1,2 diol
-
C20
Melezitose
- 1
C44
Butane 2,3 diol
-
C21 Inulin -
Bảng 3. Khả năng mọc trên môi trường chứa một số chất độc hại của SS4.2
Kí hiệu
Khả năng mọc trên môi trường chứa
Kết quả
01
0,01%(w/v) cycloheximid
D
03
1 % Acetic acid
-
Ghi chú: - có mọc; - không mọc; "D" (Delay) - mọc chậm
2.2.3. Phổ chống nấm của các mycocin
Kết quả thử nghiệm về khả năng mycocin ức chế các chủng thử được trình
bày trong bảng 4. Trong tổng số 44 chủng nấm men đem thử, IPO-0895 chống
lại 20 chủng, SS4.2 chống lại 7 chủng và N14.1 chống lại 6 chủng. Trong
những chủng mẫn cảm, có cả những chủng sinh mycocin như Saccharomyces
cerevisiae K7, có cả các Debaryomyces - giống nấm men hình thành màng

trên sản phẩm dưa chuột ướp chua. Cả ba mycocin đều không tác dụng trên
các chủng Candỉda thử (trong đó có Candỉda albicans), trừ mycocin của IFO-
0895, SS4.2 tác dụng yếu lên Candida quercuum. Nhìn chung, IPO-0895 là
chủng sinh mycocin có phổ chống nấm mạnh hơn cả trong số 3 chủng nghiên
cứu.
Hình 3. Khả năng ức chế của các mycocin lên chủng mẫn cảm UWO 99.664.3
Việc thử nghiệm trên một số chủng vi khuẩn và nấm mốc như E.coli,
Staphylococcus aureus, Bacillus aureus, Fusarium oxysporum cũng đã được
thực hiện, nhưng kết quả cho thấy âm tính. Các mycocin không gây tác dụng
lên các chủng khuẩn và nấm mốc đem thử. Điều này cũng phù họfp với bản
chất của mycocin - chỉ tác dụng lên các chủng có họ hàng gần.
Qua tìm hiểu về tác dụng của các mycocin này, chúng tôi nhận thấy cả 3
mycocin đều có tác dụng ức chế chứ không làm chết các tế bào của chủng
mẫn cảm. Cụ thể là khi đưa tế bào chủng mẫn cảm (SBY-2576) vào dịch chứa
mycocin và ủ trong 3 giờ sau đó rửa sạch tế bào và nuôi cấy trên môi truờng
dinh dưỡng kết quả cho thấy không có sự thay đổi đáng kể tron^khljiäng
phát triển của tế bào. Riêng với trường hợp mycocin của Nlj
ệ
nhẹ (2 lần) số tế bào sống sót. Tuy nhiên so với những chất làm chết tế bào
thì sự thuyên giảm này là không đáng kể.
Bảng 4. Khả năng mycocin ức chế các chủng mẫn cảm.
s n
Chủng thử
ĐK ức chế chủng thử (mm)
SS4.2
IFO-0895
N14.1
1
Issatchenkia orientalis 505/3
2

Myxozyma sp. nov. gần nhất M. melibiosí UWO 91-124.5
18
3
Myxozyma sp. nov. gần nhất M. geophila UWO 99-664.3 16 21.5 15
4 Myxozyma melibiosi NRRL Y11781 18,75 15
5 Myxozyma melibiosi PEU 1 21,75
6
Myxozyma sp. (gần M. melibiosi) PSA 491
22
7
Myxozyma sp. (gần M. melibiosi) PVN 746
20
8 Candida quercuum CBS 6422 10 12,4
9 Candida tenuis CBS 7047
10
Candida vartiovaarai G164
11 Candida saitoana G237
12 Candida albicans
13
Candida util is JCM 9624
14
Candida glabrata G390
15
Saccharomyces cerevisiae K7
21,5
21,25 23,5
16
Saccharomyces cerevisiae CLIB 227
13,5 13.5
17

Saccharomyces cerevisiae VKM Y -1695
18
Saccharomyces carlsbergensis GLIB 176
19
Saccharomyces bayanus CLIB 181
. . .
20
Saccharomyces paradoxus CL IB 228
.
11,5
.
21 Saccharomycopsis fibuligera JCM 7609
_ _
STT
Chủng thử ĐK ức chế chủng thử (mm)
SS4.2
IFO-0895
N14.1
22 Saccharomycopsis fibuligera KHE 1
23
Saccharomyces uvarum CLIB 251 10
24
Schizoblastosporion starkeyi-henricii DSM 70569
25 Zygowilliopsis californicus G207 9
26
Debaryomyces hansenii G210
10
16
27 Debaryomyces hansenii G225 13
28 Debaryomyces hansenii G377 27,5 14 25,5

29 Debaryomyces maramus CBS 1958 11 12
19,75
30 Pacchytiospora transvaalensis G286 17,25
31
Torulaspora delbrueckii G316
32
Torulaspora delbrueckii G361.7
33
Citeromyces matritensis G376
22 17
34
Pichia onychis G387
35 Pichia anómala G229
36
Pichia anómala (HAN ANOM)
37
Geotríchum canơidum G400
38 Yarrowia lipolytica JCM 2320
39 Lipomyces lipoferJCM 3769
40 Lipomyces tetrasporus JCM 6000
21,5
41 Arthroascus schoenii KBP 3099
15
42
Yarrowia lipolitica KBP 3364
. . .
43 Metschnikowia pulcherrima MPUE NEW
44
Hanseniaspora uvarum MW 28
. .

_
Sau khi cô đặc các mycocin, chúng tôi thu được các dịch đậm đặc mycocin
ở nồng độ xác định. Dịch đậm đặc mycocin SS4.2 đạt 75 lần. Dịch đậm đặc
mycocin IFO 0895 đạt 75 lần. Dịch đậm đặc mycocin N14.1 đạt 100 lần.
Chúng tôi đã tiến hành pha loãng các dịch đậm đặc này về nồng độ của dịch
mycocin ban đầu, với mục đích tìm hiểu mycocin sau đông khô và thẩm tách
có bị giảm hoạt tính hay không (sử dụng phương pháp đục lỗ thạch, chủng
mẫn cảm là SBY 2576). Kết quả cho thấy thật khả quan, mycocin của SS4.2,
IFO 0895 và N14.1 đều không bị giảm hoạt tính.
X 10 x5 x3 xl SS4.2thô(xl)
Hình 4. Đường kính vòng ức chế chủng mẫn cảm CBS-6422 (Candida
quercuum) của mycocin của SS4.2 ở các nồng độ pha loãng khác nhau.
Ghi chú:
X 10: nồng độ mycocin gấp 10 lần nồng độ ban đầu.
X 5; nồng độ mycocin gấp 5 lần nồng độ ban đầu.
X 3: nồng độ mycocin gấp 3 lần nồng độ ban đầu.
X 1: nồng độ mycocin bằng n ồn g độ ban đầu.
2.1.4. Kết quả thử độc tính cấp các mycocin nghiên cứu
Sau khi chuột uống thuốc, chúng tôi theo dõi chuột trong suốt 72 giờ. Kết
quả cho thấy không có chuột nào chết. Tất cả chuột ăn uống, hoạt động bình
thường. Như vậy,
à những liều thử cao gấp hàng chục lần liều có tác dụng
chống nấm (liều ban đầu), các mycocin đều không gây độc tính cấp (Bảng '5).
Bảng 5. Kết quả thử độc tính cấp trên chuột.
Mycocin
Lô thí nghiệm Sô chuột đem thử
Liều /lần Sô chuột chết
SS4.2 1
6
0,5 ml dịch đặc 75 lần

0
2
6
0,5 ml dịch đặc 65 lần
0
IFO 0895
1
6
0,5 ml dịch đặc 75 lần
0
2 6
0,5 ml dịch đặc 65 lần
0
N14.1
1
6
0,5 ml dịch đặc lOOlần
0
2
6
0,5 ml dịch đặc 90 lần 0
2.2.5. Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến hoạt tính của mycocỉn
Để khảo sát mối liên quan giữa thời gian nuôi cấy và hoạt tính mycocin
trong canh trường, các chủng sinh mycocin được nuôi cấy trên môi trường tối
thích (Malt-Glucose 3°Bx với N14.1 và YEPD với SS4.2 và IFO-0895). Canh
trường được lấy ra hàng ngày và kiểm tra đồng loạt sau khi kết thúc nuôi cấy
(sau 7 ngày). Kết quả thí nghiệm được trình bày trong bảng 6.
Bảng 6. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới sự sinh trưởng tế bào và hoạt
tính của mycocin trong canh trường của 3 chủng khảo cứu.
Ngày

IFO 0895
SS4.2 N14.1
OD BK OD
BK OD BK
1
11.4
0.0
0.9 0.0 1.7 0.0
2
21.1 1.0
10.8 5.5 12.0
5.5
3
22.4 1.0 11.9 6.0 17.9
6.0
4
24.4 1.0
15.7 8.0 21.6
8.0
5
22.8 ' 1.0
17.2 8.0 23.8
7.0
6
20.2 1.0
14.5 7.0
23.6 6.5
7
17.2 1.5
14.1 7.0 24.3 6.0

Ghi chú: OD - Mật độ tế bào biểu diễn thông qua mật độ quang (độ đục) tại
các thời điểm khác nhau; BK - bán kính ức chế (bán kính đường vành khuyên)
của canh trường lên chủng mẫn cảm.
Việc đánh giá kết quả đạt được dựa vào số liệu đo đạc thực tế như trình bày
trong bảng 6 tuy nhiên có nhiều điểm không phản ánh trực quan được thực
chất hiện tượng. Một điểm yếu trong phương pháp đánh giá hoạt lực mycocin
dựa trên bán kính ức chế liên quan đến bản chất của hiện tượng khuếch tán.
Về mặt lý thuyết, bán kính khuếch tán tỉ lệ logarit với nồng độ chất tan tại tâm
khuếch tán. Giá trị độ đục mặt khác lại tỉ lệ tuyến tính với mật độ tế bào. Do
vậy việc kết hợp hai giá trị đo đạc (OD và bán kính) gây nhiều khó khăn trong
đánh giá. Chúng tôi đề xuất việc dùng một giá trị ảo, tỉ lệ tuyến tính với nồng
độ thực của mycocin. Theo kết quả tính toán của chúng tôi rút ra từ những thí
nghiệm khác, giá trị này tỉ lệ thuận với luỹ thừa bậc hai của bán kính ức chế.
Vì vậy, trong các đồ thị trong hình 5, 6 và 7 chúng tôi sử dụng giá trị của OD
để so sánh với giá trị của luỹ thừa bậc hai của bán kính ức chế.