Nghiên cứu saponin và một số tác dụng của saponin trong thân cây hoàng liên ô rô mọc tại đèo gió tỉnh cao bằng

BễYTẫ
TRITễNG DAI HOC DUOC H NễI

NGUYấN VN TON

NGHIấN CU SAPONIN V MễT Sễ TC DUNG CĩA
SAPONIN TRONG THN CY HONG LIấN ễ Rễ
MOC TAIDẩO GIễ - TẻNH CAO BANG
(KHO LUN TOT NGHIấP DUĩC Sẻ KHO 1998 - 2003)

Ngucri hirụng dõn : TS. Phựng Ho Binh
Nai thuc hiờn : - Bụ mụn Dirỗrc hoc co truyờn
- Tộ mụn vi sinh bụ mụn cụng nghiờp duac
- Phụng duac l - Sinh Hoõ - Viờn Duac liờu
Thụi gian thuc hiờn: tự 0312003 den 05/2003

H NễI, THNG 5,2003


J( Mi carn, (Pn

c

Dờ hon thnh khoõ luõn tụt nghiờp, tụi dõ nhõn dirỗfc su" giup dd tõn
tinh cỹa cõc thõy giõo, cụ giõo, cõc ban cựnglụp vgia dợnh.
Nhõn dip ny, tụi xin dtfỗfc gỷi ldi cõm ctn chõn thnh tụi:
TS. Phựng Ho Bợnh
ngiùụd d tnfc tiờ'p hirụng dõn tụi thỹc hiờn dờ ti ny.
Tụi cỹng xin diùỗfc trõn trong cõm cm cõc thõy giõo, cụ giõo bụ mon
Duỗfc hoc cS truyờn, thõy TS. Cao Võn Thu - Tộ vi sinh - Bụ mon cụng nghiờp
diùỗfc, Phụng diroc l - Sinh hoõ - Viờn diùỗfc lieu v cõc Phụng ban trong nh

tnrdợig, ban bố v ngirụi thõn d cS vu, dụng viờn, tao diờ'u kiờn, giup dd tụi rat
nhiờu trong thdi gian thiic hiờn dờ ti ny.
H Nụi, ngy 20 Thõng 5 nam 2003.
Sinh viờn
Nguyờn Võn Toõn.


MUC LUC

DAT VAN DÊ
PHÂN 1: TÔNG QUAN
1.1. Cây Hoàng liên Ô rô
1.1.1. Dac âiem thuc vât
1.1.2. Phân ho
1.1.3. Thành phân hoâ hoc
1.1.4. Tac dung sinh hoc
1.1.5. Công dung
1.2. Câc phirong phâp xâc dinh Saponin
1.2.1. Dinh ünh
1.2.2. Dinh luomg
PHÂN 2: THlTC NGHIÊM VÀ KET QUÂ
2.1. Nguyên vât lieu và phirong phâp nghiên ctiru
2.1.1. Nguyên vât lieu
2.1.2. Phucmg phâp nghiên cûu
2.2. Ket quâ thuc nghiêm và thâo luân
2.2.1. Hinh thâi thuc vât cüa mâu nghiên cûu
2.2.2. Hoâ hoc
2.2.3. Tac dung sinh hoc

Trang

1
2
2
2
2
4
4
5
6
6
10
11
11
11
12
14
14
15
29


2.3. Bàn luân
2.3.1. Hoâ hoc
2.3.2. Tac dung sinh hoc
PHAN 3: KÊT LUÂN VÀ DE XUAT
3.1. Ket luân
3.1.1. Hoâ hoc
3.1.2. Tac dung sinh hoc
3.2. De xuât
TÀI LIEU THAM KHÂO

34
34
37
38
38
38
38
39
40


CHÜ VIÉT TÂT
CSTB
CSPH
DD
g/kg TT
HPLC
M.
MNC
NXB
SKG
SKLM

: Chï so tao bot
: Chî so phâ huyét
: Dung dich
: g/kg thé trong
: Sâc kÿ long hiêu nâng cao
: Mahonia

: Mâu nghiên cuu
: Nhà xuâ't bân
: Sâc kÿ giây
: Sâc lÿ lorp mông


DAT VAN DE
Mahonia sp. Berberidaceae (ho Hong liờn gai) l tờn khoa hoc cỹa
nhiờu loi Hong liờn ụ rụ. Dõy l mot loai cõy cụ ụ nhiờu noi trờn thộ giụi
nhir Lo, Trung Quục, Thõi Lan, Canada [1,6,12,14,16,17].... ễ Viờt Nam
chỹng thtfcmg moc hoang trờn cõc vựng nui cao nhir : Cao Bõng, H Giang,
Lai chõu, Lõm dụng, Lo Cai... [1,6,11,12,14,16,17]
Thộo kinh nghiờm dõn gian, Hong liờn ụ rụ thirụfng diroc dựng dộ chỹa
cõc bờnh vờ diùcfng tiờu hoõ nhir kiờt ly, viờm ruụt, tiờu chõy, viờm gan vng
da [1,6,14,16,17]. Nuục sõc dõm dõc dựng ngoi con dở tri cõc chiùng viờm da,
di ỷng, ngỷa lụ [6,14,16]. Mot so loi thuục chi ny dõc biờt l M. aquifolium
dõ diroc nghiờn cỹu cho thõy cụ tõc dung tụt vụi cõc bờnh: võy nờn, eczema,
da khụ v nõm ngoi da. [18,19, 20,22,23].
Mot so tõc giõ birục du xõc dinh thõn cõy Hong liờn ụ rụ cụ chỷa
Alcaloid chỹ yờu l nhụm Protoberberin, ngoi Alcaloid trong thnh phõn cỹa
cõy cụn chỷa Saponin [9]. \ /
Vi võy, de ti ny tiộp tue nghiờn cỹu Saponin vụi cõc nụi dung sau:
+ Dinh tmh, dinh lirỗmg Saponin ton phõn trong cõy
+ Thỹ tõc dung khõng nõm, tõc dung chụng viờm cỹa Saponin ton
phõn.

1


PHÀN 1

TÔNG QUAN

1.1. Cây Hoàng liên ô rô (Mahonia sp. Jterberidaceae).
1.1.1. Dâc âiém thuc vât.
Cây bui hay cây gô nhô, cao tù 2 - 6m [6, 11, 14]. Thân cây cô ruôt
màu vàng, cành không cô gai. La kép hînh long chim le, moc so le, cô hai gai
nhô phia cuông la, gôm tir 3 - 21 la chét tuÿ tîïng loài. La chét thircmg cô hînh
trùng dàu sàc nhon, phia cuông trôn, môi bên cô tù 3 - 8 rang cüa sàc, ngân
[1.6.14.16.17],
Mùa hoa cô thé tù thâng 9-11 hoâc vào mùa xuân (thâng 1-3), mùa
quâ chm vào thâng 11-2 hoâc 4 - 5 tuÿ tîmg loài [1,16]. Cum hoa hînh bông,
phân nhânh à gôc, hoa màu vàng nhat [1,6,14,16,17]. Quâ mong hînh trùng
màu xanh thâm, khi chm quâ cô màu tfm, bên trong chùa tù 2-5 hat
[1.6.14.17].
1.1.2. Phân bd:
Hoàng liên ô rô phân bô à nhiêu noi trên thé giôi nhir Lào, Trung Quôc,
Thâi Lan, Mï, Canada, Viêt Nam... [1,4,12,16,17]. Cây thtfông moc hoang
trên câc vùng nui cao, lanh, nui dâ vôi, à dô cao trên 1000m [16]. Mot sô loài
nhu M.aquifolium Push.; M.repens (Lindl.) G.Don. cô nhiêu à vùng Tây bâc
Mÿ, Canada [20]. M. Bealei (Fort.) Carr.; M. nepalensis D.C.; M. fortunei
(Fort) Carr. cô nhiêu à Trung Quôc, Lào, Thâi lan, An Dô [6,14,16].
Ô Viêt nam, Hoàng liên ô rô côn duoc goi là Hoàng bâ gai, Thich
Hoàng liên, Thfch hoàng bâ, Tông pênh (H’Mông), Mâ hô hay Thâp dai công
lao [16,12,17,1]. Hiên nay, câc nhà khoa hoc dâ phât hiên duoc 3 loài
Mahonia à nuôc ta. Viên duoc lieu (Bô Ytê) dâ lây và liru mâu 3 loài
Mahonia này gôm:
Mahonia bealei (Fort.) Carr. (N°1541C) à Hà Giang trên dînh nui cao
1400m (ành 1.1.a)
2

- Mahonia nepalensis D.C. (N°2709) à LangBiang - Lac Dirong - Lâm
Dông. (ânh 1.1.b)
- Mahonia japonica (Thunb.) D.C. (N°2021A) à Sïn H6 - Lai Châu.
(ânh 1.1.c)
Anh 1.1. Tiêu ban 3 loài Mahonia luu tai Viên Dixoc lieu và MNC
9

Ânh 1.1.a: Mau N°1541C

Ânh 1.1.c: Mâu N°2021A

Anh 1.1.d: mâu~ nghiên cûu
?


So sõnh vụi cõc mõu liru tai Viờn diroc lieu, mõu Hong liờn ụ rụ moc
Dốo Giụ - Tợnh Cao Bng (õnh 1.1.d) giụng vụi mõu N2021A (õnh 1.1. c).
1.1.3. Thnh phõn hoõ hoc.
Rờ v thõn Hong liờn ụ rụ thuụng chỹa cõc Alcaloid chu yộu l nhụm
Protoberberin nhu Berberin, Palmatin v Rotundin, ngoi ra cụn cụ
oxycanthin, jatrorrhizin, neprotin [1,11,16,17]
Trong rờ, thõn v la cỹa MNC cụ chỹfa Alcaloid, saponin, duụng khỹ,
acid amin, sterol, riờng lõ cụ chỹa tanin. Trong dụ, ngoi thnh phõn chmh l
Alcaloid cụn cụ mot luỗfng dõng kở Saponin [9].
1.1.4. Tõc dung sinh hoc.
- Tõc dung khõng khuõn:
Hong liờn ụ rụ chỹa mot luong lụn Berberine v Palmatin nờn cụ tõc
dung khõng khuõn khõ manh [1,2,3,16], ỷc chộ duoc su phõt triởn cỹa nhiờu
loi vi khuõn nhu: Staphylococcus aureus, Shigella dysenteriae, Shigella

paradysenteriae, Bacillus tuberculosis, Streptococcus hemolytycus,
Diplococcus pneumoniae, Bacillus subtilis, Bacillus proteus.....
Hong liờn ụ rụ moc tai Dốo Giụ - Tợnh Cao Bng cỹng dõ duoc nghiờn
cỹfu tõc dung khõng khuõn vụi ket quõ nhir sau:
Hụn hop Alcaloid ton phõn nụng dụ 5mg/ml cụ tõc dung tụt vụi 5/8
vi khuõn duoc thỹ dụ l cõc chỹng: Sarcina. Lutea, Staphylococcus aureus,
Staphylococcus aureus Y1? Salmonela typhi, Shigella flexneri. Nuục hõm v
dich chiột ton phõn cỹa thõn v rờ nụng dụ 1: 2 cụn cho tõc dung manh
hỹn cõc chỹng trờn [9].
- Tõc dung khõng nõm gõy bờnh:
Dich chiột loi Mahonia aquifolium cụ tõc dung ỷc chộ su phõt triởn cỹa
mot sụ nõm gõy bờnh ngoi da [22]. MNC cỹng duoc thỹ tõc dung khõng nõm
cho thõy cụ tõc dung tirong dụi tụt vụi hai chỹng Candida Albicans,
Saccharomyces cerevisea.[9].

4


I

- Tõc dung chụng viờm:
MNC dõ duoc thỷ tõc dung chụng viờm cõp trờn chuụt cụng trõng [9]
cho kột quõ: niùục sc lieu 6g/kg thộ trong cụ tõc dung chụng viờm cõp trờn
chuụt gõy viờm bõng Carragenin. So vụi Aspirin, thụi gian tõc dung cỹa MNC
tuy chõm hon (Aspirin cụ tõc dung ngay ụ liờu thỷ nhõ't, MNC cụ tõc dung tự
gid thỷ hai) nhung lai kộo di hcfn (tõc dung cỹa Aspirin chợ kộo di dờh gi
thỷ ba cụn MNC kộo di nhiờu gi sau dụ).
- Tõc dung lỗfi mõt v bõo vờ tờ'bo gan:
Berberin cụ tõc dung loi mõt, dựng tụt cho bờnh viờm tỹi mõt [2], liờu
6g/kg thở trong, dich chiột cụn cỷa thõn MNC cụ tõc dung loi mõt tụi 65,5 %

[9]. Cỹng dich chiờt cụn liờu 6g/kg cụn cụ tõc dung bõo vờ tộ bo gan chuụt
thf nghiờm khi gõy dục bõng CCL4[9].
Ngoi cõc tõc dung trờn, Hong liờn ụ rụ cụn nhiờu tõc dung khõc nhu
tõc dung ha huyột õp, ha nhiờt, hung phõn tự cung, da dy, ruụt, tõc dung
chụng ụxy hoõ, tõc dung chụng ung thu... [1,2,11,12, 21,23].
1.1.5. Cụng dung:
Thộo Y hoc cụ truyờn, Hong liờn ụ rụ cụ vi dng, trnh hn, quy vo
cõc kinh tõm, t, vi, can, thõn cụ tõc dung thanh nhiờt giõi dục, tiờu viờm, lm
se [1,16].
Thộo kinh nghiờm dõn gian, nuục sc cỹa Hong liờn ụ rụ cụ tõc dung
chỹa ly, tiờu chõy, õn uụng khụng tiờu, viờm gan, vng da. [14,16]. Quõ cụ tõc
dung loi tiởu [6]. Dich nuục nõu dõc rỷa bờn ngoi dở tri viờm da, di ựng, lụ
ngỷa [6,11,16]. Ngoi ra, cụn duoc dựng dở chỹa dau mõt, cõm lanh, dau hong
v dau rng [11,16].
Trong sụ nhỹng loi thuục chi Mahonia, cụ mot loi duoc cõc nh khoa
hoc trờn thộ giụi hột sỷc quan tõm dụ l M. aquifolium. Nhõn dõn vựng Bc
M thudng dựng loi ny dở chỹa cõc bờnh nhu sot, n khụng tiờu, tiờu chõy,
viờm khụp, cõc bờnh gan, thõn. Dc biờt cụn dựng dở tri cõc bờnh vờ da nhu

5


võy nộn, eczema, bờnh da khụ [18,19,20,21,23]. Do võy, cõc nh khoa hoc dõ
di sõu nghiờn cuu vờ M. aquifolium v dua ra nhiờu kột quõ khõ quan nhõt l
trờn bờnh võy nộn. Trong mot cụng bụ' khoa hoc (1995), Gieler cho biột: khi
tiộn hnh diờu tri thỹ nghiờm trờn 433 bờnh nhõn bi bờnh vay nộn 89 khoa
da liờu tai Duc bang M.aquifolium thõy rang: sau 12 tuõn diờu tri, triờu chỷng
cỹa bờnh dõ giõm hoõc khụng cụn xuõ't hiờn trờn 81,1% so bờnh nhõn thự
nghiờm [19], ban du vụi 31,1% bờnh nhõn cụ triờu chiợng xõ'u thù sau 12 tuõn
giõm xuụ'ng cụn 5,6%. Thộo mot bõo cao khõc, Augustin (1996) cụng bụ:

80% bờnh nhõn sir dung M.aquifolium khụng cụ tac dung phu. [18]. Diờu ny
cho thõy, M.aquifolium vựa cụ tac dung tụt trờn bờnh võy nộn lai vựa cụ dụ an
ton tuofng dụi cao.
1.2. Cõc phmmg phõp xõc dinh Saponin.
1.2.1. Dinh ỹnh.
1.2.1.1. Dira trờn tfnh chõ't tao bot.[3,5, 15]
Dõy l tfnh chõ't dõc tnrng nhõt cỹa Saponin. Dua vo tfnh chõ't ny cụ
thở:
- So bụ xõc dinh sir cụ mõt cỹa Saponin trong duỗfc liờu:
Cho vo ong nghiờm mot liùỗfng nhụ bot duoc liờu (hoõc dich chiờ't duỗfc
liờu), thờm nuục, lc manh 5phut. De yờn, quan sõt hiờn tiùỗmg tao bot, nộu cụt
bot bờn vỹng sau 15 phỹt thợ so bụ nhõn dinh cụ Saponin trong duoc liờu.
^ - So bụ nhõn dinh Saponin triterpenoid hay Saponin steroid:
Dich chiờ't Saponin cho vo hai ụ'ng nghiờm, ụ'ng 1 thờm acid HC1, ụ'ng
2 thờm NaOH. Lc manh, nờ'u cụt bot ụ'ng 1 cao hon hoõc bõng ụ'ng 2 thù so
bụ nhõn dinh l Saponin triterpenoid, nộu cụt bot ụ'ng 2 cao hon l Saponin
steroid.
- Xõc dinh chợ so tao bot cỹa diùỗfc liờu:
Chợ sụ tao bot l sụ ml nuục dở ho tan saponin trong lg nguyờn liờu
cho mot cụt bot cao 1cm sau khi lc v doc (tien hnh trong diờu kiờn quy
dinh) [15].
6


1.2.1.2. Dua trờn tợnh chõt phõ huyờt: [3,5,15]
Dõy cỹng l mụt tợnh chõt dõc trung cỹa hõu hột saponin, tuy nhiờn
cỹng cụ mot vi saponin khụng thộ hiờn rụ tợnh chõt ny. Dira trờn tmh chõt
ny cụ thộ:
- So bụ xõc dinh sif cụ mõt cỹa Saponin trong duỗfc lieu:
Cụ thộ kiộm tra tợnh chõt phõ huyột cỹa Saponin trờn lam kợnh, trờn

thach, hay ụng nghiờm.
+ Trờn lam kợnh: nhụ 1 giot dich chiột duoc liờu lờn mot lam kfnh cụ
chỹa mõu, quan sõt trờn kợnh hiởn vi nờu cụ Saponin sờ thõy hiờn tuỗrng hụng
cõu bi phõ vụ.
+ Trờn thach mõu: nhụ dich chiột vo cõc lụ dõ duc sõn trờn dùa thach
mõu, nộu dich chiột cụ Saponin, sau vi giụ sờ thõy vụng phõ huyột.
+ Trờn ong nghiờm: cho dich chiột duoc liờu vo mot ụng nghiờm cụ
chỹa mõu, lc dờu, de lõng. Nờu dich chiột cụ saponin v saponin dỹ manh dộ
phõ vụ hụng cõu, sau vi giụ sờ quan sõt thõy dung dich trong ụng nghiờm cụ
mu hụng dụ. Nộu saponin chua dỹ manh dộ phõ vụ hụng cõu, so sõnh vụi ụng
chỹng cụ chỹa mõu v nuục muụi sinh l sờ thõy liùỗmg hụng cõu ụng thỹ
tỹa ợt hon.
- Xõc dinh chợ so phõ huyờt:
Dua vo tmh chõt phõ huyột nguụi ta cụ thộ xõc dinh CSPH cỷa
saponin. Chợ sụ phõ huyột l sụ ml dung dich dờm cõn thiột dộ ho tan saponin
cụ trong lg duoc liờu gõy ra su phõ huyột dõu tiờn v hon ton dụi vụi mot
thỹ mõu dõ chon (tien hnh trong dieu kiờn quy dinh) [3,15].
1.2.1.3. Cõc phõn ỷng mu:[3,8,15]
Phõn ỷng chung:
- Phõn ỷng Liebermann - Burchardat:
Chõt thỹ trong Chloroform thờm hụn hop anhydrid acetic, chloroform
(dộ ụ 0C) v acid Sulfuric dõc, xuõt hiờn cõc mu xanh da trụi, lue, hụng,
cam, dụ bờn vỹng trong 1 thụi gian (phõn ỷng dõ edi tiờn).
Hoõc chõt thỹ ho tan nụng trong anhydrid acetic, thờm acid sulfuric
dõc theo thnh ụng nghiờm thõy xuõt hiờn mụt vụng mu tim dụ, mõu nõu hay
nõu dụ bờ mõt phõn cõch (phõn ỷng co diờn).
7


- Phân üng Salkowski:

Hoà tan chat thü trong acid sulfuric dâm dàc së cô màu thay doi tùf vàng
sang dô lof, xanh là hay xanh tim.
- Phân üng Molish:
Chat thü tâc dung vôi dung dich a-naphtol trong Ethanol. Thêm acid
Sulfuric dâc theo thành ông nghiêm thây xuât hiên môt vông màu tim.
- Phân üng Lifschutz:
Chat thü hoà tan trong acid acetic, thêm Benzoylhydroperoxyd, dun sôi
môt vài làn. Làm nguôi, thêm acid Sulfuric dàc (cho xuong tân âây) cô mâu
tfm - xanh hay xanh la à dây.
• Câc phân üng phân biêt Saponin steroiâ và Saponin triterpenoid:
- Phân üng Resenhein:
Saponin triterpenoid tâc dung vôi acid trichloacetic 20% trong
Chloroform sê cho mâu tim chuyën sang xanh la sau tù 10-20 phüt.
- Phân üng Rosenthaler.
Saponin triterpenoid tâc dung vôi vanilin 1% trong Ethanol thêm acid
HC1, ha nông së cô màu tim hoa cà.
- Phân üng Carr-Price.
Saponin steroid tâc dung vôi Antimon Trichorid trong Chloroform së
cho màu hông hoâc dô.
Ngoài câc phân üng trên côn nhiêu phân üng khâc dë phât hiên Saponin
và phân biêt 2 loai Saponin.
1.2.1A. Khâ nâng tao phüc vôi Cholesterol:
Dây cüng là môt tinh chat rat dàc tnmg cüa Saponin [3,15]. Do dô, cô
thë dinh tinh Saponin bang câch cho tâc dung vôi Cholesterol, phüc hop giüa
Saponin và Cholesterol së kêt tüa xuông dây ông nghiêm. Thông thircmg, câc
Saponin steroid tao phüc tôt han Saponin triterpenoid.
8


1.2.1.5. Sâc kÿ:

• Sâc kÿ lôp mông
- Chat hâp phu: Silicagen GF254 365.
- Hê dung môi:
+ Vôi Saponin, cô thé dùng câc hê:
n - Butanol bâo hoà nuôc
n - Butanol : Acid Acetic : Nuôc (4:1:1)
n - Butanol: Ethanol: Nuôc (4:1:4)
Xyclohenxan : Ethylacetat (4: 6)
Chloroform : Methanol : Nuôc (65:35:10)
+ Vôi Sapogenin, cô thé dùng câc hê:
Chloroform : Methanol (19:1)
Chloroform : Aceton (9:1)
Chloroform : Ethylacetat (4:1)
Chloroform : Ether ethylic (1:1)
n - Hexan : Aceton (4:1)
- Thuôc thür hiên màu:
Cô thé hiên màu bang câc thuôc thû : Carr - Price,
Liebermann-Burchardat, Salkowski, Vanilin 1%/côn.
Sau khi phun thuôc thur, sây bân mông ô nhiêt dô 110°C tù 5-10 phüt.
• Sâc kÿ giây:
Mot sô Saponin trung tfnh và acid cô thé dinh tfnh bàng sàc kÿ giây cho
két quâ tâch rat tôt.
- Giây sàc kÿ : Whatman sô 1 cô hoâc không cô tam Formamid.
- Hê dung môi : Cô thé sur dung câc hê dung môi sau:
n - Butanol: Ethanol: amoniac 25% (10:2:5)
Chloroform: Tetrahydrofuran: pyridin (5:5:1)
n - Butanol : acid acetic bàng: nuôc (4:1:5)
Chloroform: Benzen (1:1)
9

Thudc thỹ hiờn mu: Sc k giõy dờ bi phõ hu bai acid H2S04nờn
thuụng hay su dung cõc thudc thu: acid phosphotungstic, acid
phosphomolypdic, acid trichloracetic.
Ngoi SKLM, SKG, Saponin cụn cụ thở duoc xõc dinh bng cõc phuong
phõp khõc nhu: Sc k khi (GC), HPLC, ph6 hụng ngoai, pho tir ngoai, pho
khoi... [15].
1.2.2. Dinh luong.
Saponin thuụng duoc dinh luong theo cõc phuong phõp sau:
1.2.2.1. Phuong phõp cõn. [3]
Saponin ton phõn duoc chiột kiờt bng mot so dung mụi hựu co: bot
duoc liờu chiột loai bộo bng Ether du, sõy khụ, chiột kiờt hoat chõt bng
Methanol 80%, cõt thu hụi dung mụi, lụp nuục cụn lai duoc lc vụi
n - Butanol, cụ n - Butanol dộn cn, ho tan trong mot luong toi thiởu
Methanol, ket tỷa saponin bng cõch thờm tự tự Aceton. Rua tua bng Aceton.
Luong tua thu duoc dem sõy khụ dộn khoi luong khụng doi. Cõn, xõc dinh
hm luỗmg Saponin ton phõn theo duoc liờu khụ tuyờt doi.
1.2.2.2. Phiùcfng phõp do quang: [3]
Mot vi saponin, cụ thở dinh luong bng phuong phõp do quang.
Vụi Saponin triterpenoid cụ thở dựng thudc thỹ vanilin - sulfuric dở lờn
mu roi dinh luong.
Vụi Saponin steroid nhụm spirostan dựng mot Aldehyd cụ nhõn thom
v acid Phosphoric dở dinh luong.
Cõc dõn chõt 5lờn mu bng thudc thỹ FeCl3- H3P04 dở dinh luong.
Nhợn chung, phuong phõp ny hay dựng dở dinh luong riờng biờt cõc
sapogenin sau khi tõch bng sc k giõy hoc sc k lụp mụng.
Ngoi hai phuong phõp trờn, saponin cụn cụ thở dinh luong bng
phuong phõp HPLC [15].
10

PHAN 2

THlTC NGHIấM V KấT QU
2.1. Nguyờn võt liờu v phuong phõp nghiờn curu.
2.1.1. Nguyờn võt liờu.
- Ditỗfc liờu:
Thõn Hong liờn ụ rụ duỗfc lõy tai Dốo Giụ - Tùnh Cao Bang vo khoõng
thõng 10; sau dụ duoc phoi khụ v nghiờn nhụ dở lm nguyờn liờu dựng cho
nghiờn cựu.
- Hoõ chõ't dat tiờu chuõn phõn tich:
+ Methanol, Ethanol, Ether dõu hoõ, Chloroform, Butanol, Nuục cõt....
do phụng võt tu truụng Dai hoc Duoc cung cõp.
+ Solasonin chuõn, Diosgenin chuan do Phụng phõn tich,
tiờu chuõn - Viờn duỗfc liờu (Bụ Y Tờ) cung cõp.
+ Bõn sc k lụp mụng Silicagen GF254 (MERCK).
- Phirong tiờn:
+ May cõt quay BĩCHI waterbath B480 (Dỷc).
+ May xõc dinh dụ õm Presica PH - HA60 (Thuy Si)
+Tu sõy Memmert.
+ May do bien dội thở tich 7140 PLETHYSMOMETTER - UGO BASILE
(Dỷc).
+ Cõc dung eu thuy tinh: Shoxlet 150ml, 500ml; cục cụ mụ ....
- Vi nõm : Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae, Aspegilus
niger do T6 Vi sinh - Bụ mụn Cụng nghiờp Duoc cung cõp (lõy tự Viờn da liờu
trung irong).
- Chuụt cụng trõng: Cõ hai giụng, khoờ manh, thun chỹng, trong ltfỗfng
100 - 120g do Hoc viờn Quõn y 103 cung cõp.

11

2.1.2. Phuong phõp nghiờn cỷu:
2.1.2.1. Sa bụ xõc dinh mõu cõy nghiờn cỷu.
MNC duoc Nguyờn thi Hang sa bụ xõc dinh tờn khoa hoc bng cõch so
vụi mõu hru tai Viờn duoc liờu [9].
2.1.2.2. Nghiờn cỷu hoõ hoc.
- Dinh tfnh Saponin bang cõc phõn ỷng chung v phõn ỷng dõc hiờu
[3,8,15].
- Dinh tfnh Saponin v Sapogenin bng phuong phõp SKLM.
- Dinh luong Saponin ton phõn bng phuong phõp cõn. [3]
Duoc liờu duoc chiột kiờt h^ôô.
bng Methanol 80%, thu hụi
Methanol, dich nirục cụn lai lc vụi n - Butanol dộn khi lụp n - Butanol trong.
Dich n-Butanol cụ dộn cn, ho tan cn trong mot luong tụi thiởu Methanol,
tua Saponin bng cõch cho tir tuf mot luong Aceton (gõp 10 ln). Rua tua
Saponin bng Aceton, sõy dộn khụi luong khụng doi, cõn, tfnh hm luong theo
duoc liờu khụ tuyờt dụi.
* Kờ't quõ:
Hm luong Saponin ton phõn duoc tfnh theo cụng thỹc:
a
x 100 (1)
A=
m x (1- b)
Vụi:
A: Hm luong hoat chat trnh theo duoc liờu khụ tuyờt dụi. (%)
a
: Khụithuduoc (g)
m : Khụi luong duoc liờu dem chiột (g)
b

: Hm m cỹa duoc liờu (%)
Kột quõ dinh luong duỗfc xỹ l thụng kờ theo mue2.1.2.4.

12


2.1.2.3. Nghiờn cỷu tõc dung sinh hoc.
Thỹ tõc dung khõng nõm [7,13]
Thỹ tõc dung khõng nõm theo phuong phõp khuyộch tõn trờn thach, khõ
nõng ỹc chộ nain duoc dõnh giõ bng duụng kmh vụng vụ nõm cỹa cõc dung
dich thỹ.
Thỹ tõc dung chong viờm : theo phuong phõp cỹa Winter [24].
Thỹ thuục trờn chuụt cụng trõng theo ducfng uụng. Gõy viờm chõn chuụt
bng Carrageenin. Mỷc dụ viờm biởu hiờn bng dụ phự. Do thở iùch chõn
chuụt tai thụi diởm 3 giụ sau khi gõy viờm. Tmh t le phự chõn chuụt tai thụi
diởm trờn. Thuục cụ tõc dung chong viờm khi lm giõm t le phự chõn chuụt
lụ thỹ so vụi lụ trng tai thụi diởm nghiờn cỹu vụi dụ tin cõy 95% (P<0,05).
Cụng thỷc tmh t le phự chõn chuụt X%, v t le giõm phự G%:
V-V
Vt VO
X = -------------- x 100 (%) (2)
V0
Xo-Xt

G = -------------- x 100 (%) (3)
X0

Trong dụ:
X : T le phự chõn chuụt (%)
V0, Vt: Thở tfch chõn chuụt thụi diởm 3h sau gõy viờm cỹa

lụ trng v lụ thỹ
X0,Xt : T le phự chõn chuụtcỹa lụ trõng v lụ thỹ
G : T le giõm phự (%)
2.1.2.4. Xỹlkởtquõ thirc nghiờm:
Cõc ket quõ duoc xỹ l theo phuong phõp thụng kờ toõn hoc [10], kờt
hop vụi su hụ trỗf cỹa EXCEL 97.
13


2.2. Kờt quõ thuc nghiờm v thõo luõn
2.2.1. Hợnh thõi thuc võt cỹa MNC:
Hong liờn ụ rụ moc tai Dốo Giụ - Cao Bang (õnh 2.2) l cõy bui cao tir
1,5 - 5m. Thõn gụ mu vng tircfi, vi rõ't dng. Bờn ngoi cụ lụp bn mu xõm
dy tự 2- 3mm, cụ nhiờu võn doc khụng thng hng.
L kộp hợnh long chim lố, moc so le, la gục mang 3 - 5 l chột, l ngon
mang 11 - 13 l chột khụng long, cỷng. Mụi bờn mộp l cụ 3 - 6 rng cua
ngn, du sc nhon. Mụi l di 5 - 13cm, rụng 2- 4 cm.
Do chua lõy duỗfc mõu hoa, quõ nờn chua thở phõn tich duỗfc cõc dc
diởm vờ hoa v quõ. Tuy nhiờn, so vụi mõu luu tai Viờn Duỗfc liờu, scf bụ nhõn
dinh tờn khoa hoc cỹa cõy l Mahonia japonica (Thunb.) D.C.
Berberidaceae.
Anh 2.2: Cõy Hong liờn ụ rụ - Dốo Giụ - Cao Bõng
9

y

14


2.2.2. Hoõ hoc.

2.2.2.1. Dinh tỷih:
Cõn khoõng 10g duỗfc liờu, cho vo bợnh non dung tfch 250ml, thờm
50ml cụn 80 dun hụi luu cõch thu trong 30 phỹt. Loc lõ'y dich (dich A) de
lm cõc phõn Ung.
Di/a vo tfnh chõ't tao bot.
> (Phõn ỷng tao bot:
Cho 1ml dich A vo mot ụng nghiờm lụn cụ chUa sn 5ml nuục cõt.
Lc manh theo chiộu doc ụ'ng nghiờm trong 1 phỹt. Quan sõt thõ'y cụt bot ben
hon 15 phỹt.
> Sa bụ xõc dinh Saponin steroid v Saponin triterpenoid.
Thi nghiờm duoc bụ' tri theo bng 2.1 sau:
Bõng 2.1. Thi nghiờm phõn biờt Saponin triterpenoid v Saponin steroid

Dich chiờ't (ml)
Dung dich NaOH 0,1N
Dung dich HC1 0,1N
'

Ong 1
5ml
5ml

Ong 2
5ml

5ml
Lc doc theo ụng nghiờm trong 1 phỹt

Kờt qua : Ong 1 cụ cụt bot cao hon ụng 2
* Nhõn xột: So bụ nhõn dinh l Saponin steroid.

Dira vo tfnh chõ'tphõ huyờ't.
Lõ'y lg bụt thach, dun vụi 80 ml NaCl 0,9 %, dở nguụi khoõng
40 - 45C, cho 5ml mõu thụ vo trụn dờu, dụ ra mot dợa Pộtri, dở nguụi.
Duc cõc lụ trờn mõt thach, duụng kmh 0,7 cm. Nhụ dung dich
NaCl 0,9% v dich chiột duỗfc liờu (chiờ't trong 30 phỹt) vụi cõc nụng dụ 1%,
2%, 5%, 10%, 20% vo cõc lụ tuong ỹng vụi cõc vi tri 6, 5, 4, 3, 2, 1 trờn
Anh 2.3. Sau 6 tiờ'ng, quan sõt vụng phõ huyờ't.
15


nh 2.3: Hiờn tuang phõ huyờt cỹa Saponin trờn thach mõu

* Kờ't quõ:
Quan sõt thõy vụng phõ huyột (õnh 2.3), duụng kmh vụng phõ huyột (d)
duỗfc ghi trong bõng 2.2 (vụi - : khụng cụ vụng phõ huyột).
Bdng 2.2. Kờ't quõ phõn ỷng phõ huyờt trờji thach ^
20
1
2
5
10
Dung dich thỹ (%) NaCl
8,6 12,8 18,4
d (mm)
-

-

-

Phõn ỷng mu.
> Phõn ỷng Liebermann - Burchardat.
Cho 1ml dich A vo mot ong nghiờm, cụ cõch thu dộn cõn, ho tan
trong 1ml anhydrid acetic, dun nụng. Thờm tự tir 1ml H2S04 theo chiờu doc
cỹa ụng nghiờm, thõy xuõt hiờn mụt vụng mu nõu dụ giỷa bờ mõt phõn cõch.
> Phõn ỷng Salkowski:
Cho 1ml dich A vo mot ụng nghiờm, cụ dộn cõn. Thờm vo ụng
nghiờm 1ml Chloroform, dun nụng, thờm 1ml acid Sulfuric dõc (d=l, 76) theo
chiởu doc cỹa ụng nghiờm thõy xuõt hiờn mot vụng mu hụng dụ ụ bờ mõt
phõn cõch.

16


> Phõn ỷng Hirchshon:
Cho vo ong nghiờm 1ml dich A, thờm 1ml acid Trichloacetic, dun
cõch thuy khoõng 5 phỹt, thõy dung dich chuyởn tự mu vng sang mu dụ.
* Nhõn xột:
Qua cõc phõn ỷng dinh tinh trờn, sa bụ thõy rõng trong thõn cỹa Hong
liờn ụ rụ moc tai Dốo Giụ - Tinh Cao Bõng cụ chỷa Saponin v l
Saponin steroid.
Sõc k lụp mụng:
> Saponin.
+ Dich chõm sc k:
Tỹa Saponin ton phõn (tua S) thu duac tự quy trợnh chiột xuõt biởu diờn si
sa dụ 2.2 (mue 2.2.2) duỗfc ho tan trong MeOH lm dung dich chõm sõc
k.
+ Chõt hõp phu: Silicagel GF254 (MERCK), kfch thuục 3x10cm.
+ Hờ dung mụi/Saponin duac chay thõm dụ vụi cõc hờ dung mụi sau:
SI:

S2:
S3:
S4:
S5:
S6:
S7:
S8:
S9:
S10:
Sll:
S12:

Chloroform : Methanol: nuục
Chloroform : Methanol
Chloroform : Aceton
Chloroform : Ethanol : Amoniac 1%/H20
n - Butanol bõo ho nuục
CycloHexan : Ethylacetat
Ethyl acetat : Acid acetic : Nuục
n - Butanol : Ethanol
n - Butanol : Acid formic: Ethanol
n - Butanol : Ethanol : Nuục
n - Butanol : Ethanol
n - Butanol : Acid acetic : Ethanol

(65 : 35 : 1
(8:2)
(4:1)
(2 :2 :1 )
(4:6)

(8 :2 :1 )
(10 : 2)
(50 : 3 : 10
(4 :1 :4 )
(5:3)
(10 : 1 : 3)

% S J O . ựT-

l \ \V*.\ i

17

i< L y 0


Sau khi bay hoi dung môi à nhiêt dô phông, ban mông duçfc phun hiên
màu bàng câc thuôc thu:
Tl:
T2:
T3:

Vanilin 1% trong côn + 2ml H2S04
H2S0410% trong côn
Liebermann - Burchardat
(lm l H2S04, 20ml anhydrid acetic, 50ml Chloroform)
Sau khi phun thuôc thu, bân mông duoc sây cf nhiêt dô 110°C trong 10
phüt.
* Két quâ:

(ânh 2.4 A, B)

+ Thuôc thû Tl cho két quâ hiên màu tôt nhât.
+Màu sàc và Rf cüa câc vét duçfc ghi eu thé trong bâng 2.3.
Bang 2.3. Kët quâ SKLM cüa Saponin

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Xanh lue
Xanh lue
Xanh lue
Xanh lue
Xanh lue
Xanh lue
Xanh lue
Xanh lue
Xanh lue
Xanh lue

Rf
Hê S9

0,00
0,17
0,23
0,26
0,31
0,37
0,41
0,47
0,54
0,66
18

Hê S12
0,00
0,13
0,19
0,28
0,32
t—
H
O

TT

Màu

0,47
0,59
0,66
0,76

> Sapogenin.
- Dich sâc kÿ:
Tüa saponin toàn phân thuÿ phân bàng H2S04 7% trong 6 giô. Dich
thuÿ phân dë nguôi, pha loâng vôi nuôc, làc vôi Qiloroform dë chiét
Sapogenin. Cô dâc làm dung dich chay sâc kÿ.
- Chât hâp phu: Silicagel GF254 (MERCK)
- Hê dung môi:
Sapogenin duoc chay thàm dô vôi câc hê dung môi sau:
S’1
S’2
S’3
S’4
S’5
S’6
S’7
S’8

Chloroform: Aceton
Chloroform: Ethyl acetat
n - Hexan: Aceton
Ether: Chloroform
Benzen: Ethyl acetat
Benzen: Aceton
Xyclohexan : Ethyl acetat
Chloroform: MeOH

(4:1)
(4:1)

(4:1)
(1:1)
(1:4)
(4:1)
(7:3)
(19: 1)

Sau khi chay sàc kÿ, dë ban mông khô tu nhiên à nhiêt dô phông. Hiên
màu bàng thuôc thü Tl, sây à nhiêt dô 120°C trong 10 phüt.
* Kê't quâ:
+ Hê S’8 cho vét tâch tôt nhât vôi 9 vét (ânh 2.4 C)
+ Màu sàc và Rf cüa câc vét duoc ghi eu thë trong bàng 2.4.
+ Trên Sàc kÿ dô không thây cô vét nào trùng vÿfi So sânh vôi Solasonin
và Diosgenin chuân (ânh 2.4 D).
u

19


TT
1
2
3
4
5
6
7
8
9

Bâng 2.4. Kê't quâ SKLM cüa Sapogenin
Màu
Rf
Nâu dâm
0,00
Xanh da trôi
0,06
Nâu
0,13
Xanh là dâm
0,23
Tim nhat
0,32
Nâu nhat
0,51
Xanh la nhat
0,64
0,78
Hông
Tim than
0,99
9 2.4. Sâc' kÿ dô cua
? Saponin và Sapogenin
Anh

éA

l
1

B
A
Trong âô: A: Sàc kÿ dô Saponin hê SI2
B. Sâc kÿ dô Saponin hê S9
C: Sâc kÿ dô Sapogenin hê S’8
D: Sâc kÿ dô so sânh cüa Sapogenin (1) vôfv §olasoni
chuân (2) và Diosgenin chuân (3) hê S’8