phân lập và nhận diện nấm mốc gây bệnh thối đỏ trên cây mía ở tỉnh hậu giang

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN NẤM MỐC GÂY BỆNH THỐI
ĐỎ TRÊN CÂY MÍA Ở TỈNH HẬU GIANG

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN:

SINH VIÊN THỰC HIỆN:

NGUYỄN THỊ LIÊN

DƯƠNG ANH THƯ
MSSV: 3103991
LỚP : VSVH K36

Cần Thơ, Tháng 12/2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP NẤM MỐC GÂY BỆNH THỐI ĐỎ TRÊN CÂY MÍA

Ở TỈNH HẬU GIANG

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN:

SINH VIÊN THỰC HIỆN:

NGUYỄN THỊ LIÊN

DƯƠNG ANH THƯ
MSSV: 3103991
LỚP : VSVH K36

Cần Thơ, Tháng 12/2013


PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

SINH VIÊN THỰC HIỆN

Dương Anh Thư

Nguyễn Thị Liên

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………

Cần Thơ, ngày

tháng

năm 2013

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG


LỜI CẢM TẠ
Trong suốt quá trình nghiên cứu để hoàn thành luận văn tốt nghiệp đại học đã
nhận được rất nhiều sự đóng góp quý báu từ phía cán bộ hướng dẫn, Ban Giám Đốc
viện, bạn bè và sự quan tâm ủng hộ của gia đình.
Trước tiên tôi chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển
Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện cho tôi học tập, nghiên
cứu nâng cao trình độ trong những năm qua.
Xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Liên đã hết lòng dìu dắt, dạy dỗ và nâng
đỡ trong suốt thời gian học đại học. Cảm ơn cô đã chỉ dẫn và đồng hành từ đầu quá
trình thực hiện đến khi luận văn được hoàn thành một cách tốt đẹp.
Xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện NC & PT Công nghệ sinh học đã tạo
mọi điều kiện về trang thiết bị, máy móc, dụng cụ và hỗ trợ đắc lực trong quá trình
thực hiện luận văn, cảm ơn cô Trần Thị Xuân Mai và cô Nguyễn Thị Pha phòng Công
Nghệ Gen Thực Vật đã nhiệt tình chỉ bảo trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu
tại phòng thí nghiệm.
Tất cả các bạn lớp Vi sinh vật học khóa 36 và người bạn thân nhất của tôi đã luôn
bên cạnh động viên, cổ vũ và giúp tôi trong suốt quá trình học và nhất là khoảng thời
gian làm luận văn.

Bên cạnh đó, gián tiếp tạo nên thành công của luận văn là sự động viên, cổ vũ
của gia đình. Xin cảm ơn cha, mẹ và em gái đã chia sẻ và tiếp thêm sức mạnh cho tôi
trong những lúc khó khăn và mệt mỏi nhất.
Một lần nữa xin gửi lời tri ân đến tất cả mọi người, những người đã yêu thương,
quan tâm và hết lòng giúp đỡ tôi trong hơn ba năm tôi học tập tại trường.


TÓM LƯỢC

Bệnh thối đỏ trên mía do nấm Colletotrichum falcatum gây ra. Trong phạm vi
nghiên cứu này: Từ 120 mẫu lá mía bị bệnh thối đỏ được thu tại bốn địa điểm khác
nhau thuộc huyện Phụng Hiệp, Thị xã Ngã Bảy, huyện Long Mỹ và Thành phố Vị
Thanh của tỉnh Hậu Giang; đã phân lập được 25 dòng nấm thuần chủng. Đa số khuẩn
lạc có màu trắng đục ở ngoài và vàng nhạt từ tâm ra, dạng nhung mượt hoặc len xốp,
độ nổi mô hoặc lài, bìa nguyên hoặc gợn sóng (chiếm 40%) và trắng xen tím nhạt,
dạng len xốp, độ nổi phẳng hoặc lài, bìa nguyên hoặc chia thùy (chiếm 48%). Các
dòng còn lại khuẩn lạc có màu trắng, dạng bột mịn hoặc len xốp, độ nổi phẳng, bìa
nguyên (chiếm 4%); vàng nâu, dạng bột mịn, độ nổi phẳng, bìa nguyên (chiếm 8%).
Từ khóa: Bệnh thối đỏ,Colletotrichum falcatum, Hậu Giang.

i


MỤC LỤC

PHẦN KÝ DUYỆT ..........................................................................................................
LỜI CẢM TẠ ...................................................................................................................
TÓM LƯỢC ................................................................................................................... i
MỤC LỤC ..................................................................................................................... ii
DANH MỤC BẢNG .................................................................................................... iv

DANH MỤC HÌNH .......................................................................................................v
TỪ VIẾT TẮT ............................................................................................................. vi
CHƯƠNG I. GIỚI THIỆU ...........................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề ...........................................................................................................1
1.2. Mục tiêu đề tài ....................................................................................................2
1.3. Mục đích đề tài ...................................................................................................2
CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .....................................................................3
2.1. Sơ lược về cây mía (Saccharum) .......................................................................3
2.1.1. Nguồn gốc phân loại .....................................................................................3
2.1.2. Đặc điểm hình thái và sinh học của cây mía.................................................3
2.2. Tỉnh Hậu Giang-vùng trồng mía trọng điểm ..................................................4
2.2.1. Giới thiệu chung về Hậu Giang ....................................................................4
2.2.2. Tình hình trồng mía ở Hậu Giang .................................................................5
2.3. Bệnh thối đỏ trên cây mía ..................................................................................5
2.3.1. Triệu chứng bệnh ..........................................................................................6
2.3.2. Đặc điểm phát sinh bệnh ...............................................................................6
2.3.3. Tác nhân gây bệnh ........................................................................................6
2.4. Nấm mốc Colletotrichum falcatum ....................................................................7
2.4.1. Vị trí phân loại ..............................................................................................7
ii


2.4.2. Đặc điểm hình thái – sinh lý .........................................................................7
2.5. Phương pháp phân lập nấm mốc ......................................................................8
2.5.1. Các dụng cụ cấy ............................................................................................8
2.5.2. Các thao tác vô trùng ....................................................................................8
2.5.3. Phương pháp dùng kim nhọn ........................................................................9
2.5.4. Phương pháp cấy đơn bào tử ........................................................................9
CHƯƠNG III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................11
3.1. Thời gian ...........................................................................................................11

3.2. Địa điểm ............................................................................................................11
3.3. Phương tiện .......................................................................................................11
3.3.1. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm nuôi cấy .........................................................11
3.3.2. Vật liệu thí nghiệm......................................................................................12
3.3.3. Hóa chất ......................................................................................................12
3.4. Phương pháp .....................................................................................................12
3.4.1. Thu mẫu và xử lý mẫu ................................................................................12
3.4.2. Phân lập nấm mốc ......................................................................................13
3.4.3. Nhận diện nấm bằng phương pháp truyền thống ........................................13
CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...........................................................17
4.1. Kết quả phân lập nấm mốc từ các mẫu lá mía bị thối đỏ ở tỉnh Hậu Gian
...................................................................................................................................17
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................28
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................29
PHỤ LỤC

Phụ lục 1 . Thành phần và nồng độ các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
Phụ lục 2. Môi trường nuôi cấy

iii


DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1. Thuốc nhuộm Cotton blue........................................................................... 21
Bảng 2. Thuốc nhuộm Lacto-Fuchsine .................................................................... 22
Bảng 3. Dung dịch cố định mẫu Acid lactic ............................................................. 22
Bảng 4. Đặc điểm khuẩn lạc của 25 dòng nấm mốc được phân lập........................ 19
Bảng 5. Đặc điểm khuẩn ty và bào tử của 25 dòng nấm mốc được phân lập .......... 24

iv


DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1. Ruộng mía.................................................................................................... 3
Hình 2. Bản đồ hành chính tỉnh Hậu Giang .............................................................. 4
Hình 3. Bệnh thối đỏ trên lá mía ............................................................................... 5
Hình 4. Nấm Colletotrichum falcatum ...................................................................... 7
Hình 5. Đặc điểm của một số khuẩn lạc nấm mốc phân lập được. .......................... 18
Hình 6. Một số hình dạng bào tử của nấm mốc dưới độ phóng đại 1000 lần ......... 23
Hình 7. Hình dạng bào tử của nấm Colletotrichum sp. đối chứng chụp dưới độ phóng
đại 1000 lần .............................................................................................................. 27

v


TỪ VIẾT TẮT

Bi-H2O

Nước cất 2 lần

ĐBSCL

Đồng bằng sông Cửu Long

EB

Extraction buffer

H2 O2

Hydrogen peroxide

H2 S

Hydrogen sulfide

Ha

Hecta

PDA

Potato Dextrose Agar

pH

hydrogen power

UV

Ultra Violet

V

Voltaire

vi

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

CHƯƠNG I. GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Hiện nay, mía được biết đến là cây trồng đóng vai trò rất quan trọng trong đời
sống xã hội.
Trong công nghiệp mía được sử dụng để lấy đường. Đường là một loại thực
phẩm cần có trong cơ cấu bữa ăn hàng ngày của nhiều quốc gia trên thế giới, cũng như
là loại nguyên liệu quan trọng của nhiều ngành sản xuất công nghiệp nhẹ và hàng tiêu
dùng như bánh kẹo... Ngoài sản phẩm chính là đường những phụ phẩm của cây mía
cũng mang đến nhiều lợi ích như: Ngọn lá mía phơi khô có bổ sung urê được dùng làm
thức ăn cho gia súc, bã mía có thể dùng làm nguyên liệu đốt lò hoặc làm bột giấy, ép
thành ván dùng trong kiến trúc, cao hơn là làm ra Furfural là nguyên liệu cho ngành
sợi tổng hợp, mật rỉ dùng làm để sản xuất cồn 96o, sản xuất nhựa xêrin làm sơn, xi
đánh giầy, phân bón. Thêm vào đó, mía còn là loại cây có tác dụng bảo vệ đất rất tốt
bởi vì mía đến mùa mưa, bộ lá mía giao nhau thành thảm lá xanh dày, diện tích lá gấp
4-5 lần diện tích đất làm cho mưa không thể rơi trực tiếp xuống mặt đất có tác dụng
tránh xói mòn đất cho các vùng đồi trung du. Hơn nữa mía là cây rễ chum và phát triển
mạnh trong tầng đất từ 0-60cm. Một ha mía tốt có thể có 13-15 tấn rễ, sau khi thu
hoạch bộ rễ để lại trong đất cùng với bộ lá là chất hữu cơ quý làm tăng độ phì của đất.
Tuy nhiên, bên cạnh sự phát triển mạnh của ngành trồng mía thì tình hình dịch bệnh
trên mía cũng bắt đầu xuất hiện nhiều và ngày một gia tăng gây ảnh hưởng nghiêm
trọng đến năng suất và chất lượng của cây mía. Trong đó phổ biến nhất là bệnh thối đỏ
trên mía do nấm Colletotrichum falcatum gây ra gây hại trên thân, phiến lá, bẹ lá, mầm
non và cả rễ cây. Đây là một trong những loại bệnh hại nguy hiểm trên cây mía, đặc
biệt là ở những chân ruộng đất trũng, ẩm thấp, khó thoát nước, không khí nóng ẩm,

mưa nhiều tạo ẩm độ không khí cao… Cây bị bệnh lá ngọn thường chuyển mầu vàng
héo, nếu bị hại nặng, toàn cây có thể bị khô chết, mía gốc sẽ tái sinh kém. Bệnh không
những làm giảm năng suất mía cây mà còn làm giảm hàm lượng đường của cây mía
nguyên liệu rất nhiều, do đường đã chuyển hóa thành rượu. Ngoài ra, mía nguyên liệu
bị bệnh làm cho nước ép dơ, gây khó khăn cho quá trình lắng lọc, chế biến. Nguồn
bệnh tồn tại trong thân, lá, hom giống… của cây mía bị bệnh, trong đất ruộng. Hiện
nay, vẫn chưa có các biện pháp phòng trừ đặc hiệu loại nấm này, các biện pháp phòng
Chuyên ngành Vi sinh vật học

1

Viện NC&PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

trừ chủ yếu là sử dụng thuốc hóa học. Song, việc sử dụng các chất hóa học lại gây ô
nhiễm môi trường, ảnh hưởng đến sức khỏe con người và làm hao tốn nhiều chi phí.
Vì vậy, vấn đề đặt ra là phải tìm ra phương pháp phòng trị bệnh hiệu quả, thân
thiện với môi trường và ít tốn kém nhằm nâng cao năng suất mía, từ đó cải thiện kinh
tế cho người dân. Do đó, đề tài: “Phân lập, nhận diện nấm mốc gây bệnh thối đỏ
trên cây mía ở tỉnh Hậu Giang” được đề ra nhằm tạo ra nguồn vật liệu phục vụ cho
những nghiên cứu sâu hơn về nấm mốc gây bệnh thối đỏ trên cây mía góp phần đáp
ứng những yêu cầu nêu trên.
1.2. Mục tiêu đề tài
Phân lập các dòng nấm mốc gây bệnh thối đỏ trên cây mía.
1.3. Mục đích đề tài
Làm nguồn vật liệu phục vụ cho những nghiên cứu sâu hơn về nấm mốc gây

bệnh thối đỏ trên cây mía.

Chuyên ngành Vi sinh vật học

2

Viện NC&PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Sơ lược về cây mía (Saccharum)
2.1.1. Nguồn gốc phân loại
Theo phân loại khoa học hiện nay. Mía được xếp vào:
Giới

:

Plantae

Bộ

:

Poales

Họ

:

Poaceae

Phân họ

:

Panicoideae

Tông

:

Andropogoneae

Chi

:

Saccharum L.

(*Nguồn: 12/07/2013)

2.1.2. Đặc điểm hình thái và sinh học của cây mía

Hình 1. Ruộng mía
(*Nguồn: 12/07/2013)

Mía có thân to mập, chia đốt, chứa nhiều đường, cao từ 2-6 m, Trên cây mía,
thông thường phần ngọn sẽ nhạt hơn phần gốc (trong chiết nước mía). Đó là đặc điểm
chung của thực vật: chất dinh dưỡng (ở đây là hàm lượng đường) được tập trung nhiều
Chuyên ngành Vi sinh vật học

3

Viện NC&PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

ở phần gốc (vừa để nuôi dưỡng cây vừa để dự trữ). Đồng thời, do sự bốc hơi nước của
lá mía, nên phần ngọn cây lúc nào cũng phải được cung cấp nước đầy đủ để cung cấp
cho lá, gây ra hàm lượng nước trong tỉ lệ đường/nước phần ngọn sẽ nhiều hơn phần
gốc, làm cho ngọn cây mía nhạt hơn.
2.2. Tỉnh Hậu Giang-vùng trồng mía trọng điểm
2.2.1. Giới thiệu chung về Hậu Giang
Hậu Giang là một tỉnh ở ĐBSCL. Hậu Giang là tỉnh ở trung tâm châu thổ sông
MêKông, thành phố Vị Thanh là trung tâm hành chính của tỉnh cách Thành phố Hồ
Chí Minh 240 km về phía tây nam, cách thành phố Cần Thơ 60 km theo Quốc lộ 61 và
chỉ cách 40 km theo đường nối Vị Thanh – thành phố Cần Thơ. Hậu Giang là tỉnh
thuộc khu vực nội địa của ĐBSCL. Trước năm 1945, Hậu Giang là tên gọi của sông
Hậu. Vùng đất thuộc tỉnh Hậu Giang ngày nay nằm rải rác ở nhiều tỉnh khác nhau.
Sau 30 tháng 04 năm 1975, tỉnh Hậu Giang được thành lập trên cơ sở sáp nhập hai
tỉnh Phong Dinh và Ba Xuyên thời Việt Nam Cộng Hoà. Cuối năm 1991 tỉnh Hậu
Giang được chia thành Cần Thơ và Sóc Trăng. Ngày 26 tháng 11 năm 2003, tỉnh Cần
Thơ được chia thành thành phố Cần Thơ trực thuộc Trung ương và tỉnh Hậu

Giang ngày nay.

Hình 2. Bản đồ hành chính tỉnh Hậu Giang
(*Nguồn: 12/07/2013)

Chuyên ngành Vi sinh vật học

4

Viện NC&PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

2.2.2. Tình hình trồng mía ở Hậu Giang
Hậu Giang là tỉnh có diện tích trồng mía lớn nhất ĐBSCL hiện nay. Ở Hậu Giang
mía là cây trồng đã được nông dân canh tác từ lâu đời. Tuy nhiên, trước đây diện tích
và năng suất mía không ổn định do chưa được đầu tư đúng mức và đầu ra bấp bênh.
Từ năm 2003 đến nay, được sự quan tâm đầu tư cơ sở hạ tầng, chuyển giao khoa học
kỹ thuật, đầu tư lao động, thâm canh của nông dân, cùng với sự phối hợp của các
doanh nghiệp mía đường nên diện tích mía của tỉnh đã tăng mạnh, lên đến 13.00015.000 ha/năm.
Năng suất và chất lượng mía cũng được nâng cao (có nhiều hộ đạt năng suất 200
tấn/ha), duy trì sản lượng hàng năm trên 1 triệu tấn mía cây. Trong niên vụ mía 20102011, diện tích mía của tỉnh là 13.063 ha, năng suất bình quân 82,6 tấn/ha, sản lượng
gần 1,1 triệu tấn. Trong đó, tập trung nhiều nhất là ở huyện Phụng Hiệp và thị xã Ngã
Bảy với tổng diện tích lên đến 9.600 ha, chiếm trên 73% diện tích trồng mía của tỉnh.
Còn lại trồng rải rác ở huyện Long Mỹ, Vị Thủy và thành phố Vị Thanh.
Theo tính toán của các hộ trồng mía, chi phí bình quân sản xuất mía niên vụ
2010-2011 ở mức từ 600-700 đồng/kg. Niên vụ 2011-2012, diện tích mía của Hậu

Giang tăng thêm 650 ha, nâng tổng diện tích toàn tỉnh lên 13.747 ha, dự kiến năng suất
đạt từ 85-95 tấn/ha, sản lượng 1,2-1,3 triệu tấn. Các giống mía được nông dân trồng
chủ yếu trong niên vụ này là ROC 16, ROC 18, ROC 13, ROC 11, ROC 22, QĐ 13,
QĐ 11, QĐ 16, Suphanburi 7, K94- 2483, QĐ 11, QĐ 13, DLM 24, VD 86 - 368…
(*Nguồn: 30/07/2013)

2.3. Bệnh thối đỏ trên cây mía

Hình 3. Bệnh thối đỏ trên lá mía
(*Nguồn: 13/07/2013)
Chuyên ngành Vi sinh vật học

5

Viện NC&PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

2.3.1. Triệu chứng bệnh
Bệnh thối đỏ có thể gây hại ở nhiều bộ phận của cây mía, từ thân lóng, phiến lá,
bẹ lá cho đến mầm non và cả rễ của cây. Tuy nhiên, bệnh thường gây hại nhiều nhất là
trong thân cây, phiến lá và bẹ lá của cây mía vào giai đoạn cây mía đã vươn lóng cao
Cây bị bệnh lá ngọn thường vàng héo, nếu bị nặng toàn cây chết khô. Trên phiến
lá: Bệnh thường xuất hiện ở gân chính trong lòng máng sống lá. Lúc đầu vết bệnh chỉ
là những chấm nhỏ màu hồng. Sau đó phát triển dần lên phía trên và xuống phía dưới
của sống lá thành những vệt dài hình bầu dục (đôi khi chỉ là những vệt dài khoảng 57cm) có màu đỏ huyết, giữa vết bệnh có màu nhạt hơn, quanh rìa có màu đỏ nâu. Trên
vết bệnh cũng có những hạt đen nhỏ, đó là các ổ bào tử của nấm. Mô bị bệnh dễ bị nứt

vỡ, nát ra, làm cho lá dễ bị gẫy gập xuống tại vị trí bị nứt vỡ (Vũ Triệu Mân, 2007).
2.3.2. Đặc điểm phát sinh bệnh
Bệnh thối đỏ mía phát triển mạnh trong điều kiện độ ẩm cao, mưa nhiều, trời
nóng ẩm. Tuy nhiên, trong điều kiện nhiệt độ thấp 15-20°C mía sinh trưởng chậm, sức
chống bệnh yếu thì nấm vẫn gây hại.
Loại nấm gây bệnh thối đỏ sinh trưởng phát triển tốt ở nhiệt độ 27-32°C, pH 5-6.
Khi nhiệt độ quá thấp (dưới 10°C) hoặc quá cao (trên 37°C) nấm sinh trưởng kém.
Nấm xâm nhiễm dễ dàng qua vết thương xây xát, do đó mức độ bệnh còn liên
quan tới mức độ sâu đục thân mía phá hại. Nếu sâu đục thân hại mía càng nhiều thì
bệnh càng nặng. Mặt khác, mưa gió nhiều, nơi cất trữ mía không thoát nước cũng thúc
đẩy sự phát sinh phát triển của bệnh.
Mức độ phát sinh gây hại của nấm bệnh có liên quan chặt chẽ với cấu tạo hình
thái, sinh lý của từng giống mía. Các giống mía vỏ xanh thường bị bệnh nhiều hơn
giống mía vỏ vàng. Thực tế sản xuất cho thấy, Giống Roc.10 và 2714 POJ bị bệnh
nặng. Giống 2883 POJ, 2678 POJ, F 103 bị bệnh nhẹ hơn. Các giống mía có hàm
lượng phenol cao cũng có khả năng chống chịu bệnh cao hơn (Vũ Triệu Mân, 2007).
2.3.3. Tác nhân gây bệnh
Bệnh thối đỏ, do nấm Colletotrichum falcatum gây ra. Nấm được phân lập vào
năm 1892 trên một ruộng mía ở Tjomal, Java, Indonesia bởi Went. Sau đó von Arx và
Chuyên ngành Vi sinh vật học

6

Viện NC&PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

Müller (1954) phát hiện ra giai đoạn sinh sản hữu tính của Colletotrichum falcatum và
đặt tên là Glomerella tucumanensis (Hyde et al., 2009).
2.4. Nấm mốc Colletotrichum falcatum
2.4.1. Vị trí phân loại
Ngành

:

Deuteromycotina

Lớp

:

Hypomycetes

Bộ

:

Moniliales

Họ

:

Tuberculariaceae

Chi

:

Colletotrichum

(Cao Ngọc Điệp, 2010)

2.4.2. Đặc điểm hình thái – sinh lý

Hình 4. Nấm Colletotrichum falcatum
(*Nguồn:( (13/07/2013)

Nấm Colletotrichum có hệ khuẩn ty thật, gồm có sợi nấm mảnh, phân nhánh,
không màu, có vách ngăn, sợi nấm có nội bào và gian bào. Nhiều hạt dầu được sản
xuất trong mỗi tế bào của hệ sợi nấm. Khi già sợi nấm trở nên sậm màu và bện xoắn
lại thành dạng chất nền nhỏ dưới lớp ngoài cùng.
Chuyên ngành Vi sinh vật học

7

Viện NC&PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

Colletotrichum nội sinh chỉ sinh sản vô tính bằng bào tử đính, bào tử đính phát
triển trên cuống bào tử trong dạng thể quả là cụm cuống bào tử. Cụm cuống bào tử có
dạng đĩa phẳng, mặt sau có cấu trúc phấn mịn, mỗi cụm cuống bào tử gồm nhiều lớp
chất nền. Bề mặt sản sinh cuống bào tử trong suốt. Cuống bào tử không có vách ngăn

kéo dài đơn bào. Bào tử có dạng liềm, cong, bào tử trong suốt có vách ngăn. Cùng với
bào tử và cuống bào tử là các lông cứng trên mỗi cụm cuống bào tử, lông dài cứng,
thuôn nhọn, không phân nhánh và đa bào cấu trúc như tơ cứng (Cao Ngọc Điệp,
2010).
2.5. Phương pháp phân lập nấm mốc
Kỹ thuật phân lập để tìm ra loài nấm mới hay nấm hữu ích là rất quan trọng trong
quá trình nghiên cứu. Không có một quy luật chung nào dùng cho phân lập vi sinh vật.
Phương pháp phân lập tốt nhất sẽ là phương pháp mà ta lựa chọn để phân lập vi sinh
vật mà ta cần. Suy nghĩ một cách sáng tạo cho công việc và thành thạo với các kỹ
thuật phân lập mới là yêu cầu chung của bất kỳ một nhà vi sinh vật nào.
Các nhà nấm học Nhật Bản thường dùng các phương pháp sau để phân lập nấm
sợi: Sử dụng kim nhọn nhặt bào tử; Phân lập bào tử đơn độc;...
2.5.1. Các dụng cụ cấy
 Que cấy móc: que cấy có đầu vuông góc, thường dùng để cấy khuẩn ty nấm
 Kim mũi mác: có đầu nhọn như mũi giáo dùng để cắt miếng khuẩn lạc nấm
2.5.2. Các thao tác vô trùng
Thao tác cấy được thực hiện trong một không gian vô trùng tạo bởi ngọn lửa đèn
cồn hoặc đèn Bunsen. Ngọn lửa đèn cồn, đèn Bunsen có tác dụng oxy hóa không khí
tạo không gian vô trùng, đồng thời còn được dùng để đốt khử trùng que cấy, miệng
chai lọ, ống nghiệm khi mở, đóng, nút bông, nắp nhựa,…
Để tránh việc gây nhiễm thông qua tiếp xúc, trong các thao tác, nhân viên cần
mang găng tay hoặc tiến hành sát trùng tay bằng cồn 70% hoặc các dung dịch diệt
khuẩn. Tương tự như vậy tiến hành sát trùng mặt bàn thao tác trước khi bắt đầu thao
tác vô trùng. Sau khi hoàn tất việc cấy chủng, tiến hành sát trùng tay, mặt bàn làm việc
tương tự như trên trước khi rời phòng kiểm nghiệm.

Chuyên ngành Vi sinh vật học

8

Viện NC&PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

Nhiều loài nấm hoại sinh và vi khuẩn thường phát triển thứ sinh trên mô cây bị
bệnh. Vì vậy, phải hết sức cẩn thận tránh phân lập các vi sinh vật thứ sinh bằng các
phương pháp khử trừng. Tiệt trùng bề mặt các mô cây bệnh có thể giúp loại trừ các vi
sinh vật hoại sinh thường phát triển trên bề mặt mô bệnh.
Chọn lá có vết bệnh mới phát triển vì nấm thường đang phát triển mạnh ở các mô
lá này. Cẩn thận dùng kéo hoặc dao cắt mẫu lá thành từng mẩu nhỏ tại phần tiếp giáp
giữa mô khỏe và mô bệnh. Khử trùng bề mặt bằng cách ngâm trong dung dịch natri
hypochlorite 10% khoảng 1 – 3 phút rồi rửa qua bằng nước vô trùng. Dùng kẹp đã khử
trùng đặt miếng mẫu lên môi trường agar.
2.5.3. Phương pháp dùng kim nhọn
Sử dụng phương pháp này để phân lập tất cả mọi loại nấm phát triển trên bất kỳ
một cơ chất nào.
Cách làm:
1) Đặt cơ chất cần phân lập (lá, cành cây mục,...) lên kính hiển vi vật kính X10 (độ
phóng đại 10 lần) hoặc lên kính lúp.
2) Chỉnh tiêu cự để quan sát được bào tử, cuống sinh bào tử từ cơ chất.
3) Khử trùng que nhọn bằng ngọn lửa đèn cồn.
4) Đưa que nhọn vào khoảng giữa vật kính và cơ chất, nhặt bào tử chuyển sang
môi trường phân lập.
5) Nuôi cấy bào tử ở nhiệt độ 25o C, quan sát sự nảy mầm của bào tử hàng ngày
đến khi hình thành khuẩn lạc thì chuyển sang môi trường thạch nghiêng.
2.5.4. Phương pháp cấy đơn bào tử
Cấy đơn bào tử là quá trình cấy truyền một bào tử đã nảy mầm để tạo một mẫu

nấm thuần. Phương pháp này thích hợp cho việc làm thuần những chi nấm tạo bào tử
trên môi trường nhân tạo, như Fusarium, Colletotrichum, Alternaria, Stemphylium,
Bipolaris, Verticillium và Phoma.

Chuyên ngành Vi sinh vật học

9

Viện NC&PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

Quy trình cấy đơn bào tử:
1. Khử trùng que cấy.
2. Tạo dung dịch bào tử bằng cách dùng que cấy lấy một lượng nhỏ sợi nấm trên
mặt thạch có lẫn bào tử hoặc lấy một chút bào tử từ khối bào tử lớn của nấm rồi cho
vào ống nghiệm chứa 10 ml nước vô trùng.
3. Lắc ống nghiệm để phân tán các bào tử và kiểm tra mật độ bào tử bằng cách
quan sát ống nghiệm trước ánh sáng hoặc kiểm tra một giọt dịch bào tử dưới kính lúp
soi nổi. Tránh tạo dịch bào tử với mật độ bào tử quá cao. Bằng kinh nghiệm, mật độ
bào tử có thể được đánh giá bằng mắt thường khi nhìn ống nghiệm.
4. Làm loãng với nước vô trùng nếu cần.
5. Đổ dịch bào tử vào một đĩa Petri có chứa một lớp mỏng môi trường thạch
nước cất.
6. Đổ dịch bào tử thừa từ đĩa Petri đi. Một số bào tử sẽ nằm lại trên mặt thạch.
7. Để đĩa Petri trong khoảng 18 giờ cho đến khi bào tử nảy mầm.
8. Kiểm tra đĩa Petri dưới kính lúp soi nổi với nguồn sáng phía dưới. (Điều chỉnh

nguồn sáng cẩn thận để có sự tương phản tốt giữa thạch, bào tử, và các ống mầm.)
9. Dùng kim mũi mác cắt lấy ra một bào tử nảy mầm và chuyển sang một đĩa môi
trường mới
(Nguồn: Cẩm nang chuẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam, 2009)

Chuyên ngành Vi sinh vật học

10

Viện NC&PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

CHƯƠNG III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian
Từ tháng 7 đến tháng 12 năm 2013.
3.2. Địa điểm
Phòng Công nghệ gen thực vật và phòng Sinh học phân tử, Viện Nghiên cứu và
Phát triển Công nghệ Sinh học trường Đại học Cần Thơ.
3.3. Phương tiện
3.3.1. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm nuôi cấy
 Eppendorf 1,5 ml; 2,2ml.
 Đĩa petri
 Kim cấy
 Kim mũi mác
 Dao mổ
 Lam

 Lamelle
 Bộ micropipet
 Đèn cồn
 Đầu col các loại
 Kéo
 Giấy lọc
 Bông gòn thấm nước
3.3.2. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm sinh học phân tử
 Kính hiển vi Olympus (Nhật)
 Kính lúp soi nổi
 Tủ cấy vô trùng Esco
 Nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi-international (Đức)
 Máy ly tâm Eppendorf
Chuyên ngành Vi sinh vật học

11

Viện NC&PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

 Máy ly tâm chân không Eppendorf
 Máy trộn mẫu (votex)
 Cân điện tử Satorius
 Máy đo pH Orion model 420A
 Máy khuấy từ HB50 BIBBY
 Lò vi sóng Panasonic (Thái Lan)

 Tủ lạnh trữ mẫu và hoá chất Alaska
 Tủ lạnh -20oC trữ hoá chất Akira
3.3.3. Vật liệu thí nghiệm
- Các mẫu lá mía bị bệnh thối đỏ được thu tại một số địa điểm tại tỉnh Hậu Giang:
Phụng Hiệp, Thị xã Ngã Bảy, huyện Long Mỹ, Thành phố Vị Thanh.
- Mẫu nấm đối chứng được cung cấp: Bộ môn Bảo vệ thực vật - Khoa Nông Nghiệp và
Sinh học ứng dụng.
3.3.4. Hóa chất
 Hóa chất dùng để quan sát hình dạng bào tử, khuẩn ty và nhuộm màu nấm mốc:
Nước cất khử trùng, thuốc nhuộm Lacto-Fuchsine, thuốc nhuộm Cotton Blue.
3.4. Phương pháp
3.4.1. Thu mẫu và xử lý mẫu
- Thu mẫu lá mía bị thối đỏ trên các ruộng mía tại một số địa điểm thuộc tỉnh Hậu
Giang: Phụng Hiệp, Thị xã Ngã Bảy, huyện Long Mỹ, Thành phố Vị Thanh.
- Để đảm bảo phân bố chuẩn các mẫu lá bệnh ta sử dụng phương pháp thu mẫu
ngẫu nhiên trên các ruộng mía. Mỗi một địa điểm thu 30 mẫu, cứ 1 liếp mía thu 5 mẫu
lá mía bị thối đỏ, mỗi liếp mía thu cách nhau 2 – 3m. Cho các mẫu lá đã thu thập vào
túi giữ ẩm và ghi ký hiệu mẫu.
- Túi mẫu được đặt trong thùng xốp có chứa nước đá để giữ cho các mẫu không bị
khô và vận chuyển mẫu về phòng thí nghiệm phân tích.
- Trường hợp mẫu bệnh không được phân tích ngay, có thể bảo quản mẫu trong túi
giữ ẩm và được trữ mát ở 4oC.
Chuyên ngành Vi sinh vật học

12

Viện NC&PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

3.4.2. Phân lập nấm mốc
Việc phân lập từ thân thường được cải thiện bằng cách gọt bỏ phần vỏ hoặc
các mô thân bên ngoài trước khi khử trùng bề mặt. Chọn mô mới bị bệnh để phân lập.
Không nên sử dụng các mô đã bị bệnh lâu bởi vì trên bề mặt các mô bệnh này thường
có rất nhiều nấm và vi khuẩn hoại sinh phát triển.
- Xử lý mẫu: Rửa mẫu lá trong nước để loại bỏ đất bụi và các tạp chất khác.
Khử trùng bề mặt mẫu lá bằng cách dùng gòn đã nhúng cồn 70% lau mặt lá, nhúng
mẫu lá vào dung dịch Javel (10-14% Clo) trong 1-3 phút sau đó rửa lại trong nước cất
vô trùng và để khô trên giấy thấm đã khử trùng.
- Cấy phân lập: Dùng dụng cụ đã khử trùng cắt những miếng cấy nhỏ
(khoảng 2 × 2 mm) từ phần ranh giới giữa mô khỏe và mô bệnh cấy lên môi trường
PDA, đặt miếng mẫu gần mép đĩa. Ủ đĩa cấy ở nhiệt độ khoảng 25oC.
- Cấy truyền và làm thuần mẫu nấm: Kiểm tra đĩa cấy hàng ngày, khi các tản
nấm phát triển từ những miếng cấy, cấy truyền chúng (chú ý cắt ở mép ngoài tản nấm)
sang môi trường PDA. Cấy truyền trên môi trường PDA cho đến khi khuẩn lạc xuất
hiện đồng nhất với hình dạng và màu sắc đặc trưng của nấm Colletotrichum.
- Làm tiêu bản quan sát mẫu: dưới kính hiển vi để khẳng định chính xác hình
dạng bào tử và khuẩn ty của nấm Colletotrichum (Roger Shivas và Dean Beasley,
2005)
- Phương pháp trữ mẫu: Theo Harris khi nấm đã ròng thì ta sẽ cấy lấy khuẩn
ty và bào tử nấm vào các lọ Wheaton 5 ml hoặc lọ McCartney 20 ml có chứa 3-5ml
nước cất đã được khử trùng để trữ giống. Nắp được vặn chặt và bọc nilon mỏng. Bảo
quản lọ mẫu ở nhiệt độ phòng, nơi không có bụi bẩn. Phương pháp này giúp bảo quản
mẫu nấm được vài năm và giúp tiết kiệm chi phí so với các phương pháp khác. Mỗi lọ
mẫu được xem như là một dòng (isolate).
3.4.3. Nhận diện nấm bằng phương pháp truyền thống
Khảo sát hình thái khuẩn lạc, khuẩn ty và bào tử nấm

- Quan sát và mô tả đặc điểm các khuẩn lạc:
Sau khi cấy chuyển phân lập nấm trên đĩa môi trường đặc, ta tiến hành quan sát
và mô tả đặc điểm của các khuẩn lạc bao gồm các chỉ tiêu sau: hình dạng, màu sắc, độ
nổi và hình dạng bìa bằng mắt thường (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2008).
Chuyên ngành Vi sinh vật học

13

Viện NC&PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

Tuy nhiên đối với khuẩn lạc có kích thước quá nhỏ ta có thể dùng kính lúp để quan sát.
Sử dụng thước kẻ có vạch chia cm để đo đường kính và chiều cao khuẩn lạc trên đĩa
petri.
- Quan sát khuẩn ty và bào tử nấm:
Sau khi phân lập và tách ròng nấm, tiến hành quan sát hình dạng bào tử và khuẩn
ty của nấm bẳng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400
lần.
Có rất nhiều dạng nấm Colletotrichum trong tự nhiên từ hoại sinh đến kí sinh
trên các kí chủ đặc hiệu. Các loài thường tồn tại thời gian dài trên các xác bã thực vật,
trong hoặc trên mặt đất với các đặc điểm chung như sau:


Sợi nấm: mảnh, phân nhánh, có vách ngăn, từ trong suốt đến nâu nhạt, bên

trong tế bào chất có các giọt dầu.



Đĩa cành: nằm trong biểu bì đến dưới biểu bì, có vách ngăn hoặc không, tạo

thành màu trong suốt hoặc nâu, có vách mỏng hoặc dày, có dạng giả nhu mô.


Lông cứng: có hoặc không có, hình thành không đồng đều, thẳng đứng hoặc

hơi thẳng, không phân nhánh, đỉnh nhọn hoặc tù, nâu, mịn, vách dày, có vách ngăn.


Cuống bào tử đính: có vách ngăn, phân nhánh, có màu từ trong suốt đến nâu

nhạt, mịn, được hình thành trên tế bào giả nhu mô của đĩa cành.


Bào tử đính: trong suốt, không có vách ngăn, có ít hoặc nhiều giọt dầu nhỏ,

hình trụ, hình chùy dài, hình liềm, hình thoi, khi nảy mầm chuyển sang màu nâu nhạt
có vách ngăn tạo thành dạng sợi áp (D.V. Singh et al., 2007).
- Cách làm tiêu bản giọt ép:


Nhỏ khoảng 20 µl nước cất vô trùng lên miếng lam sạch.



Khử trùng kim mũi mác hoặc que cấy vòng bằng cách đốt cho nóng đỏ trên

ngọn lửa đèn cồn.


Dùng kim mũi mác đã khử trùng lấy một ít sinh khối nấm từ một khuẩn lạc

đã được làm thuần rồi trải vào trong giọt nước trên lame. Sử dụng kim mũi mác đã
khử trùng khác để tách rời đám khuẩn ty thật mỏng để dễ quan sát.


Đậy lamelle lên giọt huyền phù nấm.

Chuyên ngành Vi sinh vật học

14

Viện NC&PT Công nghệ sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013

Trường ĐHCT

Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi để thấy được hình dạng bào tử và khuẩn ty của
nấm.
- Nhuộm màu nấm:
Hầu hết nấm và vi khuẩn có thể quan sát được dưới kính hiển vi phương pháp
làm tiêu bản giọt ép. Ngoài ra, có thể sử dụng acid lactic làm môi trường cố định nấm.
Việc nhuộm màu thường áp dụng đối với các cấu trúc nấm không màu sắc. Hai hóa
chất nhuộm màu thường dùng cho nấm là thuốc nhuộm bông xanh (cotton blue) và
lacto-fushin.

Bảng 1. Thuốc nhuộm Cotton blue
Cotton blue (hay trypan blue)
Cotton blue (Trypan blue)

0,1g

Acid lactic

25ml

Glycerol

50ml

Nước cất

25ml

(*Nguồn: />ollections_vietnamese.pdf, 24/07/2013)

Bảng 2. Thuốc nhuộm Lacto-Fuchsine
Lacto-Fuchsine
Acid Fuchsine

0,1g

Acid lactic

100ml

(*Nguồn: />ollections_vietnamese.pdf, 24/07/2013)

Chuyên ngành Vi sinh vật học

15

Viện NC&PT Công nghệ sinh học