Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ strepomyces 27 271

BỘ Y TÊ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC

Dược HÀ NỘI

.......... A- Q •&............

ĐÀO THỊ THANH HƯỜNG

GÓP PHẦN NGHIÊN c ứ u SINH TổNG HỢP KHÁNG SINH
TỪ STREPTOMYCES 27.271
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ KHOÁ 2000- 2005)

L

'u

* « r' ' \

V lc L h

7

NOI THỰC HIỆN

PGS. TS. CAO VĂN THU
BỘ MÔN VI SINH VÀ SINH HỌC
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

THÒI GIAN THỰC HIỆN:

2/2005 - 5/2005

NGƯÒI HƯỚNG DẪN

Hà Nội, tháng 5 nấm 2005


M

ò ỉ

c ả m

ỔVL

Với lòng biết ơn sâu sắc tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến
thầy giáo PGS. TS. Cao Văn Thu, người đã trực tiếp hướng dẫn ân cần chỉ
bảo, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô trong ban giám hiệu,
các thầy cô giáo, cán bộ kỹ thuật viên bộ môn Vi sinh và Sinh học, bộ môn
công nghiệp dược và các bộ môn khác đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá
trình thực nghiệm.
Xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bè bạn đã quan tâm, động viên tôi
trong thời gian qua.
Do trình độ bản thân và thời gian có hạn, khóa luận không tránh khỏi
những thiếu sót. Rất mong được sự chỉ bảo của các thầy cô và sự đóng góp ý
kiến của các bạn.
Tôi xin chân thành cảm ơn./

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2005.

Sinh viên
Đào Thị Thanh Hường


MỤC LỤC
Đặt vấn đề........................................................................................................... 1
Phần 1: Tổng Q uan............................................................................................3
1.1 Kháng sinh................................................................................................... 3
1.1.1 Lịch sử......................................................................................................... 3
1.1.2 Định nghĩa kháng sinh................................................................................ 3
1.1.3 Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh.........................................................4
1.2 Đại cương về xạ khuẩn Streptomyces........................................................ 5
1.2.1. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces.............................5
1.2.2. Phân loại Streptomyces............................................................................... 6
1.3. Các phương pháp cải tạo giống................................................................. 6
1.3.1. Đột biến ngẫu nhiên.................................................................................... 6
1.3.2. Đột biến nhân tạo........................................................................................ 7
1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh.... ...................................................... 8
1.4.1 Lên men bề mặt............................................................................................ 8
1.4.2 Lên men chìm .............................................................................................. 8
1.5 Tách và tinh chế sản phẩm......................................................................... 10
1.5.1 Đại cương về các phương pháp tách.......................................................... 10
1.5.2 Chiết xuất kháng sinh................................................................................10
1.5.3 Phương pháp sắc k ý ................................................................................... 10
1.6. Một số kết quả nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh.............................12
1.6.1. Aureoverticillactam- Kháng sinh Macrocyclic Lactam mới từ
Streptomyces aureoverticillatus....................................................................... 12
1.6.2. Phương pháp tổng hợp các kháng sinh aminocoumarin mới từ
coumermycin A I ............................................................................................... 13

1.6.3. Nghiên cứu phát hiện kháng sinh caprolacton mới từ xạ khuẩn
Streptomyces ở b iể n .............................................................................................13
1.6.4. Gen điều khiển sao chép sinh tổng hợp nikkomycin của Streptomyces
ansochromogenes................................................................................................. 15
Phần 2: Thực nghiệm và kết quả......................................................................... 15
2.1 Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm ............................................ 15
2.1.1 Nguyên vật liệu...........................................................................................15
2.1.2 Phương pháp nghiên cứu........................................................................... 19
2.2 Kết quả thực nghiệm................................................................................... 27
2.2.1 Kết quả phân loại theo ISP của xạ khuẩn Streptomyces 27.271............. 27
2.2.2 Kết quả lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp ................................... 28
2.2.3 Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên.................................................................... 30
2.2.4 Kết quả đột biến hoạt tính sinh kháng sinh của Streptomyces 27.271 ánh
sáng u v .................................................................................................................31
2.2.5 Kết quả tối ưu hoá các thành phần trong môi trường (M T4)..................33
2.2.6 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng sinh trong dịch lên men.................... 36
2.2.7. Đánh giá ảnh hưởng của pH đến độ bền vững của kháng sinh trong dịch
lên men (phương pháp giếng thạch)....................................................................3 7
2.2.8 Kết quả chiết kháng sinh bằng các dung môi khác nhau........................38
2.2.9 Kết quả tách kháng sinh trong dịch lên men bằng sắc ký lớp mỏng......39
Phần 3: Kết luận và đề x u ất................................................................................ 41


CHÚ GIẢI CHỮVIẾT TẮT

ADN

: Acid deoxyribonucleic

AIDS

: Aciquired Immunodeíiciency Syndrome

B
D[mm\

: Blue
: Đường kính trung bình các vòng vô khuẩn

Gr

: Green

Gy

: Grey

Ha

: Hair

HIV

: Human immunodeíiciency Virus

ISP

: International Streptomyces Project

MS

: Mass spectrium

MT

: Môi trường

MTdd

: Môi trường dung dịch

RA

: Retinaculiaperti

RF

: RectiAexibiles

s

: Spirales

s

: Sai số chuẩn đã hiệu chỉnh

sm

: Smooth

sp

: Spiny

V

: Violet

vsv

: Vi sinh vật

VK

: Vi khuẩn

Wa

: Warty

w

: White

Y

: Yellow

CĐ<Ậ® (V c ế n fì) é

háng kháng sinh đang là vấn đề được quan tâm hiện nay trên toàn thế
v»giới. Các nghiên cứu cho thấy ngày càng xuất hiện nhiều chủng đề
kháng lại kháng sinh, nhiều kháng sinh kinh điển không còn tác dụng trên
một số chủng vi khuẩn. Như vậy việc tìm ra các kháng sinh mới để mở rộng
phổ tác dụng, tăng tác dụng trong điều trị các bệnh nhiễm trùng là rất cần
thiết.
Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học, kỹ thuật và công nghệ hiện
đại, kháng

sinh mới thường được nghiên cứu phát hiện tổng hợp theo

3

hướng: tổng hợp hoá học, bán tổng hợp và sinh tổng hợp. Do có nhiều ưu điểm
mà phương pháp tổng hợp kháng sinh nhờ các vi sinh vật vẫn là cách thức
chủ yếu trên con đường đi tìm kháng sinh mới, ưu việt hơn về phổ tác dụng và
tác dụng điều trị và quan trọng hơn là chưa bị kháng bởi các chủng vi khuẩn
gây bệnh hiện nay.
Vi sinh vật sinh tổng hợp kháng sinh có thể là xạ khuẩn, nấm, vi khuẩn,
trong đó các loài xạ khuẩn sinh tổng hợp ra nhiều kháng sinh nhất. Chi
Streptomyces bao gồm một số lượng lớn các xạ khuẩn có khả năng tạo ra
những kháng sinh quan trọng có cấu trúc phức tạp và đa dạng về đặc điểm
kháng khuẩn. Một số xạ khuẩn trong chi này còn tạo ra các chất chữa ung thư
và điều trị HIV/AIDS.
Phòng thí nghiệm bộ môn Vi sinh và Sinh học trường đại học Dược Hà Nội
đã tiến hành phân lập các chủng Streptomyces từ đất, bùn...ở Việt Nam và tiến
hành nghiên cứu khởi phát về hoạt tính sinh của các chủng này. Trong các

chủng phân lập được, chủng Streptomyces 27.271 có hoạt tính sinh kháng sinh
tốt và ổn định. Là cơ sở để chúng tôi lựa chọn khoá luận: " Góp phần nghiên

1


cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ xạ khuẩn Streptomyces 27.271" với các mục
tiêu sau:
•ộ’

Cải tạo giống, nghiên cứu các điều kiện lên men nhằm nâng cao hiệu
suất sinh kháng sinh của chủng.

^

Bước đầu nghiên cứu chiết tách kháng sinh từ dịch lên men.

-ộ-

Cơ bản phân loại Streptomyces 27.271 theo khoá phân loại ISP.

2


TỐNG QUfiN
1.1. Kháng sinh
1.1.1. Lịch sử [6], [11]
Năm 1928, Alexander Fleming một nhà bác học người Anh đã tình cờ phát
hiện thấy mốc xanh nhiễm vào môi trường nuôi cấy tụ cầu vàng và ức chế sự
phát triển của vi khuẩn này. Fleming đã phân lập mốc đó là Penicillium

notatum. Đến năm 1939 hai nhà khoa học là Florey và Oxfor đã chiết được
hoạt chất từ môi trường nuôi cấy Penicillium notatum và hoạt chất được đặt
tên là penicillin. Sau đó do nhu cầu sử dụng kháng sinh để điều trị cho các
thương binh trong chiến tranh đã phát triển thành công phương pháp thích hợp
để sản xuất penicillin G. Số lượng các kháng sinh được tìm thấy không ngừng
tăng lên và nhanh chóng được sử dụng vào điều trị cho các bệnh nhiễm trùng.
Đến nay đã có khoảng hơn 10000 kháng sinh được tìm thấy có nguồn gốc từ
vi sinh vật.
Ngày nay việc sử dụng kháng sinh không chỉ giới hạn trong lĩnh vực y học mà
còn được áp dụng rộng rãi trong: chăn nuôi, trồng trọt, công nghiệp thực
phẩm.
1.1.2. Định nghĩa kháng sinh [6]
Kháng sinh là những hợp chất hoá học do vi sinh vật tiết ra, có tác dụng ức
chế sự phát triển hay tiêu diệt một cách có chọn lọc một nhóm vi sinh vật xác
định (vi khuẩn, nấm, protozoa,virrus) hay cả tế bào ung thư ở nồng độ thấp.
1.1.3. Sơ đồ chung sản xuất kháng sinh

3


Sơ đồ tổng quát sản xuất kháng sinh.

4


1.2. Đại cương về xạ khuẩn Streptomyces
Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm các vi khuẩn thật (Eubacterria)
phân bố rộng rãi trong tự nhiên (bùn, đất, nước).
Phần lớn các xạ khuẩn là các tế bào gram dương, hiếu khí hoại sinh, có cấu
tạo dạng sợi (khuẩn ty) phân nhánh.

Xạ khuẩn có thể sản sinh ra nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng
(kháng sinh, vitamin, acid hữu cơ).
1.2.1. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces [3], [6 ]
Các loài xạ khuẩn chi Streptomyces có khả năng tạo ra nhiều kháng sinh
nhất và có cấu trúc phức tạp nhất. Gần đây các nhà khoa học đã chú ý hơn đến
các họ khác: Micromonosporaceae, Nocardiaceae, .v.v..Tổng hợp các loài xạ
khuẩn tạo ra đến 60% các kháng sinh đã được tìm thấy.
Bảng 1: Một số kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces.

1

STT

Kháng sinh

Nguồn gốc

Tác dụng

1

Lincomycin

Streptomyces linconensis

Kháng khuẩn

2

Oxytetracyclin

Streptomyces rimosus

Kháng khuẩn

3

Streptomycin

Streptomyces griseus

Kháng khuẩn

4

Vancomycin

Streptomyces orientalỉs

Kháng khuẩn

5

Kanamycin

6

Tetracyclin

Streptomyces aureoỷaciens

Kháng khuẩn

7

Cloramphenicol

Streptomyces venezuela

Kháng khuẩn

8

Candicidin

Streptomyces grỉseus

Kháng nấm

9

Nistatin

Streptomyces noursei

Kháng nấm

10

Pymarycin

Streptomyces nalanensis

Kháng nấm

Paromomycin

Streptomyces rimosus

Kháng đơn bào

Streptomyceskanamyceticus

1 1

5

Kháng khuẩn


Kháng nấm

Trichomycin

Streptomyces hachifaensis

13

Bleomycin

Streptomyces vertỉcillum

Kháng ung thư

14

Actinomycin D

Streptomyces antibioticus

Kháng ung thư

15

Daunorubicin

Streptomyces peucetius

Kháng ung thư

12

và đơn bào

1.2.2. Phân loại Streptomyces [12]
Về phân loại Streptomyces, có nhiều khoá phân loại khác nhau. Trong hội
nghị vi sinh vật lần thứ X (1970) đã thống nhất chọn khoá phân loại của
E.B.Shirling và D. Gottlieb làm khoá phân loại chính để phần loại
Streptomyces. Khoá phân loại này được đặt tên là International Streptomyces
Project (ISP).

Khoá phân loại dựa vào các đặc điểm sau để phân loại:
- Đặc điểm hình thái:
❖

Màu sắc khuẩn ty cơ chất, khuẩn ty khí sinh.

-

Hình dạng chuỗi bào tử.

<-

Đặc điểm bề mặt bào tử.

4

- Đặc điểm sinh thái:
❖

Khả năng tạo sắc tố melanoid.

❖

Khả năng tiêu thụ các nguồn đường.

❖

Sắc tố hoà tan trong môi trường.

1.3. Các phương pháp cải tạo giống vi sinh yật

Vi sinh vật sinh kháng sinh phân lập từ cơ chất tự nhiên thường có hoạt
tính thấp. Vì vậy muốn có được chủng có hoạt tính cao đưa vào sản xuất công
nghiệp cần phải ứng dụng một cách khéo léo các phương pháp cải tạo giống.
1.3.1. Đột biến ngẫu nhiên [4], [11]
Trong quần thể vi sinh vật luôn xuất hiện những đột biến mà không cần có
sự can thiệp của thực nghiệm. Đó là các đột biến tự phát.

6


Đối với xạ khuẩn: các cá thể đột biến tự phát theo các tần số khác nhau. Có
cá thể hoạt tính sinh tổng hợp kháng sinh tăng hơn

-

10 2 0

% so với các cá thể

khác.
Như vậy, nhiệm vụ của cải tạo giống là tuyển chọn lấy các cá thể có hoạt tính
sinh tổng hợp kháng sinh cao để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
1.3.2. Đột biến nhân tạo [2] [4], [7], [11]
- Tác nhân gây đột biến:
Tác nhân lý học: TiaX, tia u v .
❖

Tác nhân hoá học: H N 02, 2 aminopurin, bromouracil, dimetyl sulíat,
nitrosoguanidin.

- Cơ chế gây đột biến: Chủ yếu gây ra những biến đổi trên ADN.
^

Lắp chất tương tự base

*>■

Thay đổi tính chất hoá họccủa base.

❖

Lắp vào hoặc loại đi một cặp base.

<-

Dimer hoá các pirimidin.

- Các yếu tố ảnh hưởng đến sự xuất hiện các chủng dẫn đến thay đổi tính
trạng.
A

Điều kiện môi trường xử lý đột biến.

->

pH môi trường, hệ đệm.

❖

Nồng độ, cường độ tác nhân.

❖

Thời gian xử lý.

❖

Các nhân tố thuộc về chủng đột biến (trạng thái phát triển của vi sinh
vật, mật độ vi sinh vật, đặc điểm hoạt chất).

Những thay đổi trên AND không chỉ làm xuất hiện đột biến mà còn mang
lại nhiều cái chết cho vi sinh vật. Các chủng đột biến được tìm trong số các vi
sinh vật sống sót sau một đợt xử lý đột biến với các tác nhân mạnh (gây chêt
trên 99%).

7


1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh [6 ], [10], [11]
Ngày nay lên men được áp dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau
như: dược phẩm, hóa học, năng lượng, thực phẩm, nông nghiệp... để sản xuất
ra nhiều sản phẩm hữu ích.
Kỹ thuật lên men: là quá trình nuôi cấy vi sinh vật trong các điều kiện tối
ưu để sản xuất ra các sản phẩm trao đổi chất nhờ chính các sinh vật đấy hoặc
thành phần tế bào của chúng.
Có 2 kiểu lên men vi sinh vật: Lên men chìm và lên men bề mặt.
1.4.1 Lên men bê mặt.
Là quá trình nuôi cấy vi sinh vật trên bề mặt môi trường rắn, đặc hay lỏng.
Vi sinh vật hấp thụ chất dinh dưỡng của môi trường và oxy của không khí để
hô hấp trên bề mặt môi trường dinh dưỡng.

❖

Ưu điểm của phương phap: đơn giản, dễ thực hiện, đầu tư ban đầu
thấp.

❖

Nhược điểm: Hiệu suất thấp, tốn diện tích, khó cơ giới hoá tự động
hoá.

Do phương pháp lên men bề mặt có nhiều hạn chế mà chỉ khi công nghệ
lên men chìm ra đời thì kỹ thuật lên men mới phát triển, đưa vào sản xuất trên
qui mô công nghiệp làm hạ giá thành sản phẩm.
1.4.2 Lên men chìm .
Trong phương pháp này: vi sinh vật được nuôi cấy trên môi trường lỏng,
phát triển cả 3 chiều, trong điều kiện sinh lý tối ưu để phát triển và tổng hợp
sản phẩm.
- Ưu điểm của phương pháp:
❖

Sử dụng được môi trường dinh dưỡng tối ưu, đáp ứng được nhu cầu
sinh lý của vi sinh vật.

•0*

Hiệu suất sử dụng không gian cao (3 chiều), lượng hoạt chất được tổng
hợp trong một thể tích môi trường cao, hiệu suất lên men cao.

8

4

-

Các thiết bị dễ cơ giới hoá, tự động hoá, tiết kiệm mặt bằng nhân công.

- Nhược điểm:
❖

Đầu tư trang thiết bị kỹ thuật ban đầu lớn.

- Các kiểu lên men chìm:
Ỷ-

Lên men gián đoạn (lên men chu kì): trong suôt thời gian lên men

không bổ sung gì thêm vào hệ thống trừ oxi, các chất điều chỉnh PH, chất
phá bọt. Vi sinh vật trong bình lên men phát triển qua các pha: Pha tiềm
tàng, pha log, pha ổn định và pha suy tàn.
Trong công nghiệp, quá trình lên men kết thúc phụ thuộc vào việc
sinh tổng hợp hoạt chất dừng lại ở pha nào trong chu kỳ sinh trưởng của vi
sinh vật, hoặc việc sinh tổng hợp hoạt chất đã chậm lại, nếu tiếp tục lên
men sẽ không mang lại hiệu quả kinh t ế .
❖

Lên men có bổ sung: sản phẩm trao đổi chất thứ cấp bị nồng độ

glucose, các chất dinh dưỡng nitơ kiềm chế. Bởi vậy các chất này trong
quá trình lên men được bổ sung liên tiếp vào môi trường lên men thành

những phần nhỏ.
❖

Lên men bán liên tục: khi vi sinh vật phát triển trong bình đạt đến một

nồng độ sinh khối cần thiết thì lấy bớt dịch lên men rồi bổ sung thêm
lượng môi trường mới bằng chính thể tích dịch lên men đã lấy đi. Việc rút
bớt dịch lên men và bổ sung thêm môi trường dinh dưỡng không xảy ra
liên tục mà chỉ định kỳ trong một số thời điểm nhất định.
❖

Lên men liên tục: vi sinh vật được nuôi trong một thiết bị đặc biệt để

sao cho khi vi sinh vật phát triển đến một giai đoạn nhất định, khi đó lấy
đi một thể tích môi trường lên men cùng các tế bào và sản phẩm trao đổi
chất của chúng đồng thời bổ sung đúng một thể tích môi trường dinh
dưỡng vào bình nuôi cấy. Quá trình rút dịch lên men và bổ sung môi
trường dinh dưỡng diễn ra liên tục.

9


1.5. Tách và tinh chế sản phẩm [ 1 ], [5], [ 1 1 ]
Sau khi lên men các kháng sinh thường có mặt trong dung dịch phức hợp
có nhiều chất khác nhau với nồng độ khá thâp. Kháng sinh có thể tan trong
môi trường dinh dưỡng hoặc nằm trong tế bào chất của vi sinh vật. Để thu
được sản phẩm mong muốn cần có phương pháp tách, tinh chế thích hợp.
1.5.1 Đại cương vê các phương pháp tách
Trong công nghiệp sản xuất kháng sinh thường sử dụng các phương pháp
tách sau:

Phương pháp: Lọc, li tâm (với hỗn dịch).
4

-

Phương pháp chuyển pha: chiết, sắc ký, thẩm thấu...

4

-

Phương pháp chia cắt pha.

1.5.2. Chiết xuất kháng sinh
Chiết là quá trình chuyển chất tan từ pha này sang pha khác. Thường dùng
dung môi hữu cơ để tách lấy một chất hay một nhóm chất từ hỗn hợp cần
nghiên cứu.
Chiết thực ra là phương pháp tách dựa vào sự phân bố của chất tan giữa 2 pha
không hoà tan lẫn vào nhau và luôn tiếp xúc với nhau.
Tuỳ theo chất cần chiết ở pha lỏng hay pha rắn có thể phân biệt: chiết lỏng -lỏng hay chiết lỏng- rắn.
Các phương pháp chiết lỏng- lỏng:
■

Chiết đơn.

■

Chiết lặp.

■

Chiết ngược dòng.
Các chất có thể chiết được bằng dung môi hữu cơ: Các hợp chất hữu cơ,

các ion kim loại ở dạng phức Chelat và các cặp ion của nhiều ion hữu cơ.
1.5.3. Phương pháp sắc ký: sắc ký là một nhóm các phương pháp hóa lý
dùng để tách các thành phần của một hỗn hợp . Sự tách sắc ký dựa trên sự

10


phân chia khác nhau của các chất khác nhau vào

2

pha luôn tiếp xúc và không

hoà lẫn vào nhau: một pha tĩnh và một pha động.
- Phân loại sắc ký:
Theo hệ pha :
❖

Sắc ký khí: sắc ký khí rắn, sắcký khí lỏng.

❖

Sắc

4

-

kí lỏng

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Sắc ký phẳng: sắc ký lớp mỏng, sắc ký giấy.

Theo cơ chế:
❖

Sắc ký hấp phụ
Sắc ký phân bố

4

-

❖

Sắc ký trao đổi ion
Sắc

ký rây phân tử

Săc ký lớp mỏng:
Pha tĩnh trong bản mỏng rất đa dạng: chất hấp phụ, trao đổi ion, chất rây
phân tử, và các dung môi khác nhau trên chất mang rắn. Do đó sắc ký lớp
mỏng có đầy đủ 4 cơ chế tách tuỳ thuộc vào pha tĩnh sử dụng.
Đại lượng đánh giá sự di chuyển của chất phân tích: hệ số Rf
Rí =

Khoảng cách của chất phân tích di chuyển được.
---------------------------------------------------------- ’—
Khoảng cách của dung môi di chuyển được

Rf phụ thuộc vào nhiều yếu tố như cách tiến hành, tính chất hoạt độ của
chất hấp phụ, tính chất của dung môi, chiều dày của lớp mỏng, quãng đường
chạy sắc ký, lượng chất chấm, nên người ta sắc ký song với một chất đã biêt
để đối chứng trên cùng một bản mỏng và tính Rf.
- Phát hiện các chất phân tích trên bản mỏng:
4

" Tận dụng tính chất của các chất có khả năng phat huỳnh quang, xác
định trực tiếp chất khi dùng ánh sáng kích thích.

11


❖ Đưa thêm các chất chỉ thị huỳnh quang và dùng ánh sáng u v chiếu
vào để ghi nhận mẫu.
4

- Phun chất ôxy hoá mạnh như HNO3 , KM n04, H2 S 0 4 đặc vào sẽ có
các điểm bị ôxy hoá và chuyển sang màu đậm là chất phân tích.

❖ Đưa các thuốc thử đặc biệt như ninhydrin để hiện - NH2. sử dụng các
chất tạo phức màu làm cho kim loại có thể nhìn thấy.
-Úng dụng của sắc ký lớp mỏng:
4

- Thí nghiệm thăm dò cho sắc ký cột.

^

Thử độ tinh khiết.

❖ Sắc ký chế hoá.
1.6. Một số kết quả nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh
1.6.1. Aureoxertỉciỉỉactam- Kháng sinh mới Macrocyclic Lactam vòng 22
nguyên tử từ Streptomyces aureoverticillatus [8 ], [9], [17]
Dịch chiết từ môi trường nuôi xạ khuẩn Streptomyces aureoverticillatus cho
thấy có chất chống lại HT 29 (tế bào ung thư trực tràng ở người) ở nồng độ 2,5
|ig/ml. Tiến hành sắc ký trên cột C18, phân đoạn kèm theo thử nghiệm sinh
học cho thấy tác dụng ức chế đó có thể do streptoburin (trước đó người ta đã
biết Streptomyces aureoverticillatus tạo ta hợp chất này) và một hợp chất khác
(hợp chất 1). Tinh chế hợp chất 1 trong dịch chiết thô bằng cách chuyển
streptoburin sang hexan. Tiếp tục tinh chế hợp chất

1

trong dịch chiết còn lại

bằng sắc ký chế hóa HPLC cột C18 sử dụng hỗn hợp dung môi Me0H/H20
gradient (75/25) thu được hợp chất

1

tinh khiết 95%. Tiến hành các phương

pháp đo phổ u v , phổ MS, phổ NMR để xác định cấu trúc của hợp chất 1. Kết

quả cho thấy hợp chất

1

(aureoverticillactam) là một macrocyclic lactam vòng

22 nguyên tử, có công thức phân tử là C28 H 39N 0 4.
Đánh giá hoạt tính ức chế phát triển của aureoverticillactam trên nhiều
dòng tế bào ung thư khác nhau cho thấy hợp chất có tác dụng chống lại các tế
bào ung thư: trực tràng, bạch huyết và sắc tố.

12


1.6.2. Phương pháp tổng hợp các kháng sinh Aminocoumarin mới từ
Coumermycỉn A I [2], [13], [14], [15]
Novobiocin,

clorobiocin,

coumermycin

AI

là

các

kháng

sinh

aminocoumarin được tổng hợp từ các loài xạ khuẩn Streptomyces khác nhau
(Streptomyces

spheroides,

Streptomyces

rishiriensis,

Streptomyces

roseochromogenes). Các kháng sinh này đều là tác nhân ức chế enzym
topoisomerase typ II của vi khuẩn trong đó novobiocin là một trong số ít các
kháng sinh có hiệu lực với MRSA (chủng tụ cầu vàng kháng methicillin) đang
được sử dụng rộng rãi. Không giống như novobiocin và

clorobiocin,

coumermycin AI là một dimer của khung carboxypyrrol và gắn thêm 2 phân
tử đường- là mục tiêu để gắn với các ADN - gyrase.
Bắt đầu với khung này đầu tiên sử dụng enzym CouL Ligase để gắn 1 hoặc
2 nhóm amino và tạo ra cơ chất cho enzym CouM glycolyltransferase. Enzym
này xúc tác gắn

1

(hoặc 2 ) nhóm noviosyl vào khung và tạo ra cơ chất cho

enzym CouP methyltransíerase hoạt động. Enzym NovN có nguồn gốc từ
novobiocin operon, sẽ gắn carbamoyl vào

1

hoặc

2

đầu của cơ chất.

Sự hoạt động theo dây truyền của 4 enzym CouL, CouM, CouP và NovN
như vậy có thể tạo ra nhiều kháng sinh aminocoumarin với nhiều đặc tính
khác nhau.
1.6.3 Nghiên cứu phát hiện kháng sinh caprolacton mới từ xạ khuẩn
Streptomyces ở biển [8 ], [9], [16]
Trong các nghiên cứu phát hiện các hợp chất mới có hoạt tính sinh học từ
vi sinh vật, các hợp chất thân dầu có độ phân cực yếu do các vi sinh vật tạo ra
thường bị bỏ qua. Dịch chiết từ môi trường nuôi vi sinh vật thường được lấy
hết mỡ khi chia cắt pha bởi methanol và hexan hay xyclohexan. Việc tìm ra
caprolacton này cho thấy sự phân tích pha dầu có thể thu được hợp chất mới
với nhiều đặc tính thích hợp.

13


Chiết toàn bộ môi trường nuôi chủng Streptomyces sp B6007 bằng
ethylacetat và phân pha bằng methanol và cyclohexan. Một phần cyclohexan
được methyl hoá bởi trimethyl sulfonium để chuyển các acid béo tự do hay có
liên kết este thành các methyl este tương ứng, sau đó phân tích các thành phần

trong dịch chiết bằng sắc ký khí và phổ MS. Các hợp chất bay hơi điển hình
của vi khuẩn như phenol, benzylacol phenylethanol...được xác định bởi sự so
sánh thời gian lưu (trên sắc ký khí) và phổ khối với chất chuẩn. Các acid béo
methyl hoá cũng được xác định bằng phương pháp trên.
Bên cạnh các hợp chất đó còn có 2 thành phần chưa biết 1 và 2 tồn tại
trong dịch chiết như nhân tố chính. Tiến hành các phương pháp phân tích phổ
khối và phổ NMR và khẳng định lại bằng phương pháp tổng hợp hoá học tìm
ra cấu trúc phân tử là (R) metyl-undecanolid và (6 R, 10S)- 10 metyl

6

-

dodecanonid.
Các thử nghiệm sinh học cho thấy các hợp chất trên có độc tính vừa phải
với tế bào thực vật, có tác dụng chống lại các tế bào ung thư đồng thời chỉ có
độc tính thấp với các tế bào thường.

14


ĩ^hẩn 2:

THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm
2.1.1 Nguyên vật liệu
<■Chủng xạ khuẩn
Chủng Streptomyces 27.271 do phòng thí nghiệm Bộ môn Vi sinh và Sinh
học, trường đại học Dược Hà Nội cung cấp.
❖ Giống vi sinh vật kiểm định.

Giống vi sinh vật kiểm định do phòng thí nghiệm bộ môn Vi sinh và
Sinh học trường đại học Dược Hà Nội cung cấp.
- Vi khuẩn Gram (-):
Escherichia coli ATCC 25922
Proteus mirabilis BV 108
Shigella fĩexneri DT 112
Salmonella typhi DT 220
Pseudomonas aeruginosa VM 201
- Vi khuẩn Gram (+):
Staphylococcus aureus ATCC 1128
Bacillus pumilus ATCC 10241
Bacillus subtilis ATCC 6633
Bacillus cereus ATCC 9946
Sarcina lutea ATTC 9341
Các môi trường sử dụng được giới thiệu ở bảng 2.

15


Bảng 2:Thành phần các môi trường sử dụng (g/lOOml)
Thành phần
Tinh bôt
Lactose
Glucose
Cao ngô
Sacaroza
Bột đậu
từơng
Bột ngô
Pepton

Cao thit
KNO,
KC1
NaNO,
NH^NO,
CaCO,
FeSOd.7H.O
KHoPO.
M gS0 4 .7H ,0
NaCl
Cao nấm
men
Thach
Nước
pH

MT1
2

MTldd MT2 MT2dd MT3 MT3dd MT4 MT4dd MT5 MT5dd MT 6
2
2
2,4
2
3
3
0,5

0 ,1

0,5

2

2

0,5

0,5

1

1

1

2

2

MT6 dd MT7 MT7dd
2,4
1

0,3
0,3

0,3
0,3

0,4

0,4

2

2

0 ,1

0 ,1

0,3
0,5

0,3
0,5

0,5

0,5

0 ,1

0 ,0 0 1

0 ,0 0 1

0,05
0,05

0,05

0,05
0,05
0,05

0,05

0,05

0 ,2

0 ,2
0 ,2

0 ,2

0 ,2

0 ,2

0,3

0,3

0,4

0,4

0 ,1

0 ,1

0 ,1

0 ,1

0,05

0,05

0,25

0,25

0,05
0,15

0 ,2

0 ,2

0 ,1

0 ,1

0 ,1

0 ,1

0,05
0,15
0,5

0,5

1 ,8

0

2

0

2

0

2

0

2

0

2

0

1 ,8

0

1 00

100

100

100

100

1 00

100

100

100

100

1 0 0

100

100

100

7,0 - 7,2

, - 7 ,2

6 8

7 ,0 - 7 ,2

7 ,0 -7 ,2

16

7 ,0 -7 ,2

7 ,0 -7 ,2

7,4 - 7,6


- Môi trường canh thang nuôi cấy VK kiểm định:
NaCl 0,5% ; Pepton 0,5% ; cao thịt 0,3% ; nước vđ lOOml.
- Môi trường thạch thường :
NaCl 0,5% ; Pepton 0,5% ; cao thịt 0,3% ; thạch 1,8% ; nước vđ
lOOml.
- Môi trường phân loại theo ISP (ký hiệu từ môi trường ISP1 đến ISP 9)
+ Muối vi lượng: MnCl2 .4H20

0,lg; FeS0 4 .7H20

0,lg; ZnS0 4 .7H20

0,lg; nước cất vđ lOOml; pH=7,0 - 7,2.
+ ISP1: Trypton 5,0g; cao nẵin men 3,0g; nước cất vđ lOOOml; pH=7,0 -7,2.
+ ISP2: Cao nấm men 4,0g; dịch chiết Malt 10,Og; glucose 4,0g; thạch
20,Og; nước cất vđ l.OOOml; pH=7,3;
+ ISP3: Yến mạch 20,Og; dung dịch muối vi lượng l,0ml; thạch 18,0g; nước
cất vđ l.OOOml; pH=7,2.
+ ISP4: Tinh bột 10,Og; K2 HP0 4 l,Og; MgS0 4 .7H20 l,Og; NaCl l,Og;
(NH4 )2 S0 4 2,0g; CaC0 3 2,()g; dung dịch muối vi lượng l,Oml; thạch 20,Og; nước
cất vđ l.OOOml; pH=7,0 -7,4.
+ ISP5: L-asparagine l,Og; Glycerin 10,Og; K2 HP0 4 l,Og; dung dịch muối
vi lượng l,Oml; thạch 20,Og; nước cất vđ l.OOOml; pH=7,0 -7,4.
+ ISP 6 :
> Dung dịch A: Pepton 20g; acid citric 0,384g; FeS0 4 .7H20 0,556g; NH4OH
25% 0,264g; Na2 S2 0 3 lOml; K2 HP0 4 lg; nước cất vđ l.OOOml
> ISP 6 : Dung dịch A 36,Og; cao nấm men l,Og; thạch 15g; nước cất vđ 1000
ml; pH=7,0-7,2
+ ISP7: Glycerin 15,Og; L-tyrosine 0,5g; L-asparagine l,Og; K2 HP0 4 0,5g;
MgS0 4 .7H20 0,5g; NaCl 0,5g; FeS0 4 .7H20 0,0lg; dung dịch muối vi lượng


l,Oml; thạch dây 20,Og; nước cất vđ lOOOml; pH:7,2 -7,4.
+ ISP9:
>

Các nguồn đường khử trùng được sử dụng
1. D-Glucose
2. Saccaroza

5. Inositol
6

9. Raffinose

. D-mannitol

3. D-xylose

7. D-Fructose

4. L-arabinose

8

. Rramnose

> B. Dung dịch muối Pridham và Gottlieb:
CuS0 4 .5H20

0,64g; FeS0 4 .7H20

0,1 lg; MnCl2 .4H20

0,79g;

ZnS0 4 .7H20 0,15g; nước cất l.OOOml
> c. Môi trường thạch - muối khoáng: (NH4 )2S0 4 2,64g; KH2P0 4 2,38g;
K2HP0 4 .3H20 5,65g; MgS04 .7H20 l,0g;

dung dịch muối B l,0ml; thạch 15g; nước cất vđ l.OOOml; pH=6 ,8-7,0.
> Khử trùng môi trường c, để nguội đến 60°c rồi lần lượt cho các nguồn
đường đã tiệt trùng (bằng phương pháp Tyndal) sao cho nồng độ đường trong môi
trường là !%.• Bảng 3: Các dung môi đã sử dụng
Dung môi
Methanol
Ethylacetat
Ethanol
Dimethylíomamid
Dicloromethan
Cloroíorm
Butylacetat
n- Butanol
n- Propanol

Khối lượng riêng
0,791 - 0,793
0,902
0,789-0,791
0,95
1,32
1,470-1,480
0,880-0,885
0,81

0,803 - 0,805

• Vật liệu dùng trong sắc ký:

18

Nhiêt đô sôi

64,5°c
77°c

78,3°c

153°c
40°c
60 - 62°c
117 - 118°c
116 - 118°c
96 - 98°c


+ Bản mỏng sắc ký: silicagel 60 F254, Merck, các dung môi chạy sắc ký
( bảng trên), bình chạy sắc ký.
•

Máy móc, thiết bị
+ Ánh sáng u v (À, = 254nm) nguồn phát Toshiba 60W, điện thế 220V.
+ Máy lắc Taitec Bio - Shaker BR 300 Lf.
+Tủ ấm Trung Quốc, tủ sấy Shallab Model - 1350FX, tủ cấy aura VF48.
+ Kính hiển vi điện tử ( Viện vệ sinh dịch tễ TW).
+ Cân kỹ thuật Scaltec SPB 54, cân phân tích Sartorius BP 2105.

+Nồi hấp Nhật Hiclive HVE25.
2.1.2 Phương pháp nghiên cứu
A. Phương pháp giữ giống trên ống thạch nghiêng

Chuẩn bị môi trường thạch: cân pha MT2, đun sôi, chia đều ra các ống
nghiệm (mỗi ống 5 - 6 ml); Hấp tiệt trùng ở 0,9at/30 phút. Sau đó lấy ra đặt
thạch nghiêng.
Cấy bào tử: cấy zigzac bào tử Streptomyces 27.271 lên bề mặt thạch nghiêng
(trong điều kiện vô trùng).
ủ cho phát triển: ở nhiệt độ 30°c trong thời gian 7 -1 0 ngày.
Cất giữ : trong tủ lạnh (nhiệt độ 2-4°C).
B. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán
Nguyên tắc: Kháng sinh từ mẫu thử khuếch tán vào nuôi cấy vi sinh vật
kiểm định và ức chế sự phát triển của các vi sinh vật này tạo ra các vòng vô
khuẩn. Đo đường kính vòng vô khuẩn và đánh giá.
Vi sinh vật kiểm định có thể là vi khuẩn, nấm mốc, nấm men. Tuỳ theo loại
vi sinh vật kiểm định mà ta chọn môi trường, nhiệt độ, thời giannuôi cấy thích
hợp.

19


Bảng 4\ Vi sinh vật kiểm định
VSVkiểm

MT nuôi cấy tạo

định

nhũ dịch

MT nuôi cấy

Nhiệt độ

Thời gian

nuôi cấy

nuôi cấy

Vi khuẩn

Canh thang

Thạch thường

37°c

18-24 h

Nấm men

Sabouraud

Sabouruad đặc

30°c

48-72 h

Nấm mốc

Tween 80 0,5%

Sabouruad đặc

30°c

48-72 h

❖ Tiến hành:
■ Chuẩn bị môi trường và cấy vi sinh vật kiểm định.
Vi sinh vật kiểm định cấy vào môi trường nuôi cấy tạo nhũ dịch thích hợp đã vô
trùng và ủ ở nhiệt độ trong thời gian thích hợp để phát triển.
Đưa nhũ dịch vi sinh vật có nồng độ 106 -107Tế bào/lml vào môi trường nuôi cấy
đã tiệt trùng ở 0,9 at/ 30 phút, với tỉ lệ V nhũ dịch/ V môi trường= 5/200, khi
nhiệt độ môi trường nuôi cấy khoảng 45-50°C. Lắc tròn nhẹ để các vi sinh vật
phân tán đều trong môi trường rôi đổ ra các đĩa petri vô trùng

(2 0

ml môi

tnrờng/ 1 đĩa).
■ Đưa mẫu thử vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật kiểm định:
Có 3 cách:
- Đặt khối thạch: mẫu thử là khối thạch đặt trên bề mặt (cị) = 6 mm) môi
trường nuôi cấy vi sinh vật kiểm định.
- Tạo giếng thạch: trong trường hợp mẫu thử là dung dịch chứa hoạt chất.
Trên bề mặt môi trường nuôi cấy vi sinh vật kiểm định đục các giếng thạch ((ị) =
6

mm). Sau đó nhỏ 0,05 ml dung dịch thử vào các giếng thạch.

20