Bài giảng công nghệ sinh học đại cương full đại học nông nghiệp hà nội

CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG
(SH3014)

Giảng viên: Ninh Thị Thảo

1/19/2013

BM CNSH TV – Khoa CNSH

1


CHƯƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI
(10 TIẾT)

 Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn
 Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng
gen
 Các phương pháp lai phân tử
 Phương pháp PCR, ứng dụng
 Kỹ thuật xác định trình tự DNA
 Kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA

1/19/2013

BM CNSH TV – Khoa CNSH

2


Kiến thức ơn tập

• Cấu trúc phân tử DNA

1/19/2013

3


Thành phần cấu tạo của DNA- các bazơ
Purines

1/19/2013

Pyrimidines

4


Nucleoside

[structure of deoxyadenosine]

Nucleotide
1/19/2013

5


ii). Structure
the
Structure

of theofDNA
DNA double chain
helix
polynucleotide

5’

3’
• polynucleotide chain
•1/19/2013
3’,5’-phosphodiester bond

6


1/19/2013

7


Học thuyết trung tâm:The Central Dogma

DNA  RNA  Protein  Function
Replication

Translation

Work

Transcription

1/19/2013

8


Phân loại Gene
coding genes
Chromosome

intergenic
non-coding
region
genes

Messenger RNA

Structural RNA

Proteins
transfer
RNA
Structural proteins
1/19/2013

ribosomal
RNA

other
RNA

Enzymes
9


2.1 ENZYME GIỚI HẠN (RESTRICTION ENZYME - RE)

 Khái niệm: là các enzyme có
khả năng nhận dạng và cắt DNA
ở những vị trí đặc hiệu.
– Restriction
enzymes
=
Restriction
endonuclease
Endo (bên trong), nuclease (cắt nucleic
acid)
– Trình tự nhận biết của RE được gọi là trình
tự giới hạn

Ví dụ: trình tự nhận biết của EcoRI

1/19/2013

BM CNSH TV – Khoa CNSH

10


Lịch sử phát hiện

• 1950s: một số dịng vi khuẩn có khả năng chống lại sự
xâm nhiễm của một số bacteriophages.
• 1962: phát hiện các vi khuẩn này có chứa hệ thống
enzyme có khả năng nhận biết và phá huỷ DNA của
phage, đồng thời có khả năng tự biến đổi DNA của bản
thân để tránh bị phá huỷ
• 1970: Haminton Smith at Johns Hopkins University, Phát
hiện được enzyme HindII từ Haemophilus influenzae: có
khả năng cắt đặc hiệu đồng thời tự methyl hoá DNA của
tế bào chủ để tự bảo vệ.

1/19/2013

BM CNSH TV – Khoa CNSH

11


Restriction Endonucleases

Why don’t bacteria destroy their own
DNA with their restriction enzymes?

1/19/2013

12


Methylation

1/19/2013

13


Phân loại các RE

• Loại I: Cắt tại điểm cách vị trí giới hạn
khoảng 1000-5000 nucleotide
• Loại II: cắt ngay tại vị trí giới hạn.

• Loại III: cắt ở vị trí cách vị trí giới hạn đó
khoảng 20 nucleotide.

1/19/2013

BM CNSH TV – Khoa CNSH

14


Cách gọi tên

Genus (Tên chi)

Ví dụ: EcoRI
Escherichia

Species (Tên lồi)

coli

Strain (Chủng)

R

Thứ tự tìm ra enzyme

I

(số La Mã)
1/19/2013

BM CNSH TV – Khoa CNSH

15


Đặc điểm của trình tự nhận biết của RE loại II

Trục đối xứng

Trình tự nhận biết là các
palindrome. Đây là đoạn DNA
mạch kép, 2 mạch bổ sung có
trình tự giống nhau khi đọc theo
cùng chiều 5’3’ hoặc ngược lại

1/19/2013

Don't nod
Dogma: I am God
Never odd or even
Too bad – I hid a boot
Rats live on no evil star
No trace; not one carton
Was it Eliot's toilet I saw?
Murder for a jar of red rum
Some men interpret nine memos
Campus Motto: Bottoms up, Mac
Go deliver a dare, vile dog!
Madam, in Eden I'm Adam
Oozy rat in a sanitary zoo
Ah, Satan sees Natasha
Lisa Bonet ate no basil
Do geese see God?
God saw I was dog
Dennis sinned

BM CNSH TV – Khoa CNSH

16


Tần suất cắt
Nếu giả thiết trình tự sắp xếp của các loại base là ngẫu
nhiên thì xác suất để một đoạn trình tự được nhận biết sẽ
là 1/4n (n là chiều dài (bp) của chuỗi được nhận biết).
Số nucleotide của đoạn
nhận biết

1/19/2013

Xác suất xảy ra sự kiện
phân cắt bởi RE

4

1/ 44= 1/256

5

1/ 45= 1/ 1024

6

1/ 46= 1/ 4096

8

1/ 48= 1/ 65.536

n

1/ 4n
BM CNSH TV – Khoa CNSH

17

Các kiểu cắt

3’ overhangs

blunt ends

1/19/2013

BM CNSH TV – Khoa CNSH

Tạo đầu sole Tạo đầu bằng

5’ overhangs

18


Ví dụ một số RE loại II

1/19/2013

BM CNSH TV – Khoa CNSH

19


Ứng dụng của RE loại II trong cơng nghệ gen

• Tạo DNA tái tổ hợp
• Lập bản đồ giới hạn

1/19/2013

BM CNSH TV – Khoa CNSH

20


Tạo DNA tái tổ hợp
•

DNA tái tổ hợp là các DNA được tạo thành
từ ít nhất hai đoạn DNA có nguồn gốc khác
nhau thông qua vi thao tác của con người

•

Nếu như 2 (hay nhiều) DNA đều được cắt
bởi cùng một loại enzyme thì các đầu cắt
của các đoạn DNA được tạo ra hoàn toàn
khớp nhau (tương ứng theo quy tắc bổ
sung) gọi là các đầu dính và chúng rất dễ
dàng gắn lại với nhau khi có mặt enzym
ligase. Từ đây xuất hiện khả năng ghép nối
các DNA có nguồn gốc khác nhau để tạo
nên DNA tái tổ hợp

1/19/2013

BM CNSH TV – Khoa CNSH

21


Bản đồ giới hạn
• Là bản đồ thể hiện loại enzyme giới hạn, số lượng
và kích thước các đoạn DNA bị cắt bằng enzyme
giới hạn.
• Một phân tử khi sử dụng các loại enzyme khác
nhau có thể cho nhiều đoạn cắt khác nhau hình
thành nên các bản đồ giới hạn khác nhau.
• Được sử dụng trong xác định nguồn gốc hoặc sự
khác nhau giữa các cá thể trong loài.

1/19/2013

BM CNSH TV – Khoa CNSH

22


Phương pháp lập bản đồ giới hạn
• Tách chiết DNA mẫu nghiên cứu và thực hiện PCR
tạo ra một lượng DNA cần thiết.
• Lựa chọn các enzym giới hạn thích hợp, xử lý
enzym giới hạn các mẫu trong điều kiện thích hợp.
• Điện di kết quả trên gel agarose cùng với thang
DNA chuẩn, tính tốn kết quả và lập bản đồ.

1/19/2013

BM CNSH TV – Khoa CNSH

23


VÍ DỤ VỀ LẬP BẢN ĐỒ GIỚI HẠN
Sử dụng enzym 1 để cắt đoạn
ADN nghiên cứu (kích thước
17kb). Kết quả cho 3 đoạn ADN
(6kb, 3kb, 8kb). Điều này chứng
tỏ enzym 1 có 2 vị trí cắt trên
đoạn ADN nhưng chưa rõ đoạn
3kb nằm ở giữa hay ở cuối sợi.
Khi cắt sợi ADN nghiên cứu
bằng enzym 2, kết quả cho 2
đoạn cắt (7kb, 10kb) chứng tỏ
enzym này chỉ có một điểm cắt
trên sợi 17kb. Khi cắt bằng tổ
hợp hai enzym 1 và 2 cho thấy
có sự xuất hiện lại đoạn 6kb và
8kb, hai đoạn này là sản phẩm
của sự hoạt động của enzym 1.
Như vậy đoạn 3kb sẽ bị cắt bởi
enzym 2 (vỡ kết quả cắt phối
hợp cho 4 đoạn (6kb, 8kb, 2kb,
1 kb). Từ đây suy ra đoạn 3kb
phải nằm ở giữa sợi.
1/19/2013

24


Restriction enzyme animation

/>
1/19/2013

25