Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng chuyển hóa dầu thầu dầu thành chất thơm

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.08 MB, 43 trang )

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược
------------ 0SẼQ183-

----------------------------- -

NGUYỄN THỊ NGỌC HOA

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM MEN CÓ KHẢ
NĂNG CHUYỂN HOÁ DẦU THẦU DẦU THÀNH CHẤT THƠM

(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ ĐẠI HỌC KHOÁ 1998-2003)

Người hướng dẫn

: TS. Vũ Nguyên Thành
GVC. Nguyễn Lệ Phi

Nơi thực hiện

: Viện Công Nghiệp Thực Phẩm

Thời gian thực hiện

: 03 - 05/2003

— BOGS—

Hà Nội, tháng 5, năm 2003

í4 -

N.

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới
GVC NGUYỄN LỆ PHI
TS v ữ NGUYÊN THÀNH
là những thầy, cô đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong
việc hoàn thành khoá luận này.
Tôi xỉn chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trường Đại học
Dược và bộ môn Vi Sinh đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá
trình học tập tại trường.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các anh chị phòng 401 và cán
bộ nhân viên của Viện Công Nghiệp Thực Phẩm đã tạo điều kiện cho
tôi trong quá trình thực hiện đê tài tại Viện.
Cuối cùng tôi xỉn cảm ơn tất cả những người thân và bạn bè đã
động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
Hà N ộ i. Tháng 5 . năm 2003.
Sinh viên
Nguyễn Thị Ngọc Hoa.

M ỤC LỤC
Trang
Đặt vấn đề
Phần I: Tổng quan
1.1. Đại cương về nấm m en......................................................................2
1.2. Dầu thầu dầu .....................................................................................3
1.2.1. Cây thầu dầu ...........................................................................3

1.2.2. Dầu thầu dầu.......................................................................... 4
1.3. [R]-y-Decalactone tính chất hoá lý nguồn gốc và ứng dụng..............5
1.4. Tổng hợp y-Decalactone nhờ vi sinh v ậ t...........................................6
1.4.1. Con đường tổng hợp sinh học................................................6
1.4.2. Con đường biến đổi sinh h ọ c ................................................ 7
1.4.3. Cơ chế chuyển hoá acid Ricinoleic thành y-Decalactone ở
vi sinh vật........................................................................................ 9
Phần II: Thực nghiệm và kết quả
2.1. Nguyên liệu và phương pháp thực nghiệm......................................11
2.1.1. Nguyên vật liệu hoá chất và thiết b ị................................... 11
2.1.2. Một số môi trường sử dụng cho nghiên c ứ u ......................12
2.1.3. Phương pháp thực nghiệm..................................................14
2.2. Kết quả thực nghiệm.......................................................................18
2.2.1. Phân lập các chủng nấm men chuyển hoá dầu thầu dầu thành
chất thơm...................................................................................... 18
2.2.2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh trưởng và khả
năng tạo mùi thơm của 5 chủng phân lập..................................... 18
2.2.3. Tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng chuyển hoá
acid ricinoleic từ bộ sưu tập giống của Viện................................ 19

2.2.4. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh trưởng và khả
năng tạo mùi thơm của 7 chủng tuyển chọn................................. 19
2.2.5. Quan sát hình thái tế bào của một số chủng phân lập và
tuyển chọn.................................................................................... 20
2.2.6. Lên men và tách chiết chất thơm tạo thành từ môi trường
nuôi cấy các chủng tạo hương.................................................... 24
2.2.7. Định tính và định lượng chất thơm tạo thành trong các dịch
chiết n-hecxan bằng sắc ký k h í................................................... 25
2.2.8. So sánh lượng y-Decalactone tạo thành của chủng KFP-346

khi nuôi cấy và tách chiết theo các cách khác nhau bằng sắc ký
khí..................................................................................................29
2.3. Bàn luận ...........................................................................................31
Phần III: Kết luận và đề xuất

Đăt
vấn đề
•
Con người từ lâu đã khao khát tìm ra những nguồn hương liệu để phục vụ
cho nhu cầu ngày càng tăng của các ngành công nghiệp dược phẩm, thực
phẩm, mỹ phẩm. Những năm qua, nhiều loại chất thom đã được xác định rõ
về cấu tạo cũng như tính chất hoá học, trong số đó các hợp chất Ỵ-lactone là
những hợp chất tạo ra mùi thơm rất dễ chịu. Các hợp chất này được tìm thấy
trong tự nhiên ở một số loại hoa quả, thảo mộc và một số sản phẩm lên men
tự nhiên. Với giá trị tạo hương thơm, các lactone này đã được sử dụng để
tạo ra các loại nước hoa, hay làm tăng mùi vị thơm ngon của thực
phẩm.. .Tuy nhiên việc tách chiết chúng từ nguồn tự nhiên là một công việc
khó khăn và ít có hiệu quả kinh tế, vì vậy nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu
điều chế các hợp chất lactone này từ nguồn nguyên liệu dầu thực vật nhờ vào
quá trình chuyển hoá của vi sinh vật. Trong các loại dầu thực vật, dầu thầu
dầu là loại nguyên liệu lý tưởng để làm việc trên do thành phần chính của
nó là acid ricinoleic, một acid có cấu trúc đặc biệt thuận lợi cho việc tổng
hợp các lactone.
Nguồn nguyên liệu dầu thầu dầu ở nước ta có rất sẵn và rẻ nhưng sử
dụng nó cho sinh tổng họp chất thơm nhờ vi sinh vật còn chưa được nghiên
cứu. Vì vậy chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Phân lập và tuyển chọn các
chủng nấm men có khả năng chuyển hoá dầu thầu dầu thành chất
thơm” với các mục tiêu sau:
- Phân lập từ tự nhiên và tuyển chọn trong bộ sưu tập giống các chủng

nấm men có khả năng chuyển hoá dầu thầu dầu thành chất thơm Ỵdecalactone.
- Tách chiết y-decalactone từ môi trường nuôi cấy nấm men và sơ bộ
định tính, định lượng bằng sắc ký khí.

1

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.
1.1. Đại Cương về nấm men
Nấm men (yeast, Levure) là tên gọi thông thường của một nhóm nấm
có vị trí phân loại không thống nhất nhưng có những đặc điểm chung sau[3]:
nói chung chúng thường ở trạng thái đơn bào, đa số sinh sản theo cách nảy
chồi, cũng có khi sinh sản theo lối phân cắt tế bào, nhiều loại có khả năng
lên men đường, thành tế bào có chứa mannan, thích nghi với môi trường có
nồng độ đường cao và có tính acid.
Nấm men phân bố rộng rãi trong tự nhiên, nhất là trong môi trường có
chứa đường, có pH thấp, chẳng hạn như trong hoa quả, rau dưa, mật mía, rỉ
đường, trong đất vườn trồng cây ăn quả, trong đất có nhiễm dầu mỡ. Là vi
sinh vật thuộc nhóm nhân thật, nấm men có cấu tạo tế bào hoàn chỉnh gồm
có: thành tế bào, màng tế bào, tế bào chất, nhân... Kích thước tế bào nấm
men lớn gấp 10 lần so với vi khuẩn, và vào khoảng 2-15 |j.m do đó có thể
thấy rõ dưới kính hiển vi quang học. Hình thái tế bào nấm men rất đa dạng
và phong phú: hình cầu, hình trứng, hình ô van, hình elip, hình cong, hình
thoi, hình tam giác, hình thận, hình lưỡi liềm, hình mũ.. .Nấm men có cả hai
hình thức sinh sản hữu tính và vô tính. Sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi,
phân cắt và bằng bào tử: bào tử đốt ở chi Geotrỉchum, bào tử bắn ở chi
Sporobolomyces, bào tử áo ở chi Candida. Sinh sản hữu tính bằng bào tử túi
ở các chi Saccharomyces, Zygosaccharomyces, và nhiều chi nấm men thuộc
bộ Endomycetales.
Nấm men thuộc loại dinh dưỡng hoá năng hữu cơ. Chúng chỉ có khả

năng thu nhận năng lượng nhờ quá trình oxy hoá hiếu khí hoặc lên men kỵ khí
các họp chất hữu cơ ngoại bào [4]. Trong quá trình sinh trưởng và phát triển
nấm men cần những nguồn dinh dưỡng như: nguồn cacbon thường là các loại

2

đường, nguồn nitơ, các nguyên tố khoáng và các chất sinh trưởng. Đồng thời
trong quá trình sinh trưởng và phát triển nấm men cũng tổng hợp nên các chất
hữu cơ, tạo ra các sản phẩm trao đổi chất mà con người đã và đang sử dụng
chúng để phục vụ cho đời sống của mình. Rất nhiều loại nấm men được ứng
dụng trong sản xuất như: công nghiệp sản xuất rượu, bia, nước giải khát, sinh
khối phục vụ chăn nuôi, cao nấm men, lipid nấm men, các enzym như
amilase, invertase, lactase, sản xuất ergosterol, acid ribonucleic, riboflavin,
các acid amin như lyzin, cystein, methionin...Cũng có rất nhiều loài nấm men
đã được biết là có khả năng chuyển hoá dầu thầu dầu thành Ỵ-decalactone và
đã được sử dụng để sản xuất Ỵ-decalactone như: Candida guỉlliermondỉỉ,
Yarrowia ỉipolytỉca, Geotrỉchum klebahni [13], Sporobolomyces odorus,
Rhodotorula glutỉnus [10]...
1.2. Dầu thầu dầu
1.2.1. Cây thầu dầu [1]
Cây thầu dầu có tên khoa học là Ricinus communis L, thuộc họ thầu dầu
Euphorbỉaceae, bộ ba mảnh vỏ Euphorbiaỉes, còn có tên gọi khác là: đu đủ
tía, tỳ ma, cây dầu ve, cây hương thét.
Hình thải'. Cây sống lâu năm, thân yếu, nhưng có thể cao tới 10-12m.
Lá mọc so le có cuống, lá kép hai bên họp thành một túi màng, sớm rụng,
phiến lá hình chân vịt từ 5-9 có khi tới 11 thuỳ cắt sâu, mép có răng cưa
không đều. Hoa mọc thành chùm sim, quả 3 mảnh vỏ trên mặt có nhiều gai
mềm. Hạt hình trứng hơi dẹt. Mặt hạt nhẵn bóng.
Phân bổ thu hái, chế biến: Mọc hoang ở nhiều vùng nhiệt đới: Việt

Nam, Ấn Độ, Brazin...Người ta thu hoạch hạt thầu dầu vào tháng 4-5, với
mục đích chủ yếu là dùng để ép dầu trong công nghiệp. Ngày nay, cây thầu
dầu được trồng ở nhiều nơi trên thế giới.

3

1.2.2. Dầu thầu dầu
Dầu thầu dầu có tên thương phẩm là Castor oil được tách ra từ hạt thầu
dầu bằng phương pháp ép lạnh, ép nóng hoặc trích ly.
Dầu thầu dầu là một chất lỏng sền sệt, không màu hoặc hơi vàng, mùi
vị nhạt. Thành phần hoá học của dầu thầu dầu Việt Nam chưa được xác định
rõ ràng. Theo tác giả Đỗ Tất Lợi dầu thầu dầu Việt Nam ngoài các glycerid
chung như stearin, palmitin còn có một một glycerid đặc biệt là ricinolein là
thành phần chính của dầu thầu dầu (xà phòng hoá sẽ cho acid ricinoleic).
Ricinoleic là một acid rượu béo có công thức như sau:
OH

0

Acid rỉcỉnoleỉc (12-hydroxy-9-octadecenoỉc)
Trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu thành phần hoá học
của dầu thầu dầu và đã được công bố. Theo các tác giả C.Borch-Jensen và
G.Lakshininarayana dầu thầu dầu có thành phần hoá học như bảngl.
Bảng 1: Thành phần hoá học của dầu thầu dầu[9,14]
Acid

Dầu Brazin (%)

Dầu ấn độ (%)

Ricinoleic acid

83-90,00

87,4-90,4

Linoleic

3,19-5,98

2,9-4,0

Oleic

2,96-5,64

2,5-4,0

Stearic

0,68-1,84

0,9-1,3

Palmitic

0,87-2,35

0,8-1,3

Dihydrostearic

-

0,5-0,8

Encozenic

-

0,6-1,6

0,34-0,91

0,1-1,1

Linoleic

4

Theo bảng 1 thì thành phần hoá học của dầu thầu dầu có sự khác biệt
theo nguồn gốc tuy nhiên thành phần chính vẫn là acid ricinoleic (chiếm 8390,4 %).
1.3. [R]- Ỵ-decalactone tính chất hoá lý nguồn gốc và ứng dụng
Các Ỵ-lactone được tìm thấy nhiều trong tự nhiên trong số đó
y-decalactone là lactone có giá trị nhất và cũng đựoc quan tâm nghiên cứu
nhiều nhất. y-Decalactone là một lactone được tìm thấy lần đầu tiên trong
quả đào và một số loại hoa quả khác. Ỵ-Decalactone là một ester nội phân tử
của acid 4-hydroxy-decanoic, acid này trong điều kiện pH từ 1-5 và nhiệt độ

70-100 0 c sẽ đóng vòng để tạo y-decalactone [7].

o

ACID

GAMMA-DECALACTON

4-HYDROXY-DECANOIC

Ở điều kiện thường Ỵ-decalactone là một chất lỏng trong suốt không
màu, hoặc có màu vàng rom rất nhạt, rất dễ bay hơi tạo mùi thơm dễ chịu.
Nó hầu như không tan trong nước nhưng tan rất tốt trong rượu, dầu, ete, etyl
acetat, hexane.. .Nó có các đặc tính hoá lý sau [6,20]:
+ Công thức phân tử: Ciot
+ Công thức cấu tạo:

H3C

+ nhiệt độ sôi: 281 0 c
+ Tỷ trọng : 0,952
+ Mùi: Hoa quả và bơ sữa.
y-Decalactone không có độc tính và có thể sử dụng trực tiếp trong thực
phẩm. Năm 1974, Uỷ ban họp tác Châu Âu đã đưa chất này vào danh sách
những hợp chất thơm tổng hợp được sử dụng trong thực phẩm ở mức độ cao

5

nhất từ 5 -20 ppm. Tuy nhiên trong thực tế, nồng độ lactone này sử dụng

trong thực phẩm cũng không quá 3 ppm và trong nước hoa từ 20-400
ppm[17]. Trên thế giới Ỵ-decalactone được sử dụng trong nhiều ngành công
nghiệp khác nhau như thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm chính vì sự an
toàn và mùi thơm hấp dẫn đối với người sử dụng. Nó được dùng làm chất
tạo hương thom cho thực phẩm, singum, kem đánh răng, đồ uống, nước hoa,
sản phẩm làm mềm vải, các chế phẩm dùng cho tóc [13]...
Trong tự nhiên, y-decalactone có mặt trong một số loại hoa quả như:
mận 1230 mg/kg, mơ 490 mg/kg, xoài 450 mg/kg, đào 125 mg/kg, dứa 20
mg/kg...một số loại thảo mộc và một số sản phẩm lên men. Trong phân tử
y-decalactone có chứa một trung tâm hoạt động quang học vì vậy trong tự
nhiên người ta tìm thấy cả hai loại đồng phân quang học của nó là
[R]-y-decalactone và [S]-y-decalactone. Tuy nhiên dạng đồng phân quang
học R được tìm thấy nhiều hơn. Người ta đã nghiên cứu rất kỹ về sự vượt
trội này trong nhiều loại quả từ các nước khác nhau trên thế giới[5].

1.4. Tổng hợp Ỵ-decalactone nhờ vi sinh vật [15].
y-Decalactone được tạo thành bằng hai con đường: tổng hợp sinh học
(biosynthetic) và biến đổi sinh học (biotransformation). Con đường biến đổi
sinh học là con đường chính trong công nghiệp để tổng hợp
y-decalactone vì con đường này cho năng suất cao hơn con đường tổng hợp
sinh học.
1.4.1. Con đường tổng hợp sinh học(biosynthetic).
Là con đường tổng hợp Ỵ-decalactone nhờ vi sinh vật trong đó không
sử dụng chất béo hay dầu mỡ. Một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp
Ỵ-decalactone từ những hợp chất đơn giản. Berger là người đầu tiên đã phát
hiện ra sự có mặt của Ỵ-decalactone trong môi trường nước thịt lên men bởi

6

các chủng Basỉdomycetes (nấm đảm). Có rất nhiều báo cáo khoa học về việc
tổng hợp Ỵ-decalactone nhờ

nấm mốc nhưng nói chung sản lượng

y-decalactone thu được rất thấp. Jourdant và cộng sự đã dùng chủng
Sporobolomyces odorus để tổng hợp Ỵ-decalactone nhưng chỉ thu được
lmg/1 liter môi trường...Tressel và Albrecht đã đưa ra ý kiến về việc sản
xuất y-decalactone nhờ sự hoá đặc acyl-ACP cùng succinyl CoA. Tuy nhiên
có rất ít tài liệu nói về khả năng có thể của việc kết hợp giữa hoá sinh hoặc
sinh lý học với tổng hợp y-decalactone.
1.4.2. Con đường biến đổi sinh học (biotransformation)
y-Decalactone và những lactone khác được sản xuất trong công nghiệp
bằng cách chuyển hoá acid ricinoleic, acid béo cơ bản của dầu thầu dầu nhờ
vi sinh vật. Đầu tiên acid ricinoleic bị biến đổi thành acid 4-hydroxydecanoic sau đó đóng vòng để tạo ra y-decalactone .

o
Acid 4-hydroxy decanoic

Gamma-decalactone

Con đường biến đổi acid ricỉnoleỉc tạo Ỵ-decalactone ở vi sinh vật.
Phản ứng đóng vòng lactone xảy ra do sự tác động của enzym hay
không cần sự xúc tác của enzym là điều chưa rõ ràng. Tổng hợp
Ỵ-decalactone từ nguồn nguyên liệu dầu thầu dầu và acid ricinoleic theo quy
mô công nghiệp là mục đích của nhiều công trình nghiên cứu [7, 8, 10, 11,
12, 13, 16, 18, 19]. Những vi sinh vật đã được biết là có khả năng chuyển
hoá acid ricinoleic thành Ỵ-decalactone rất đa dạng và phong phú bao gồm
cả vi khuẩn, nấm men và nấm mốc.

7

Bảng 2: Một số vi sinh vật đã được sử dụng cho sản xuất ỵ-decalactone
và một sổ lactone khác[8, 10, 12, 16, 19].
Nguyên liệu

Năm Chủng vi sinh vật
1980 Pityrosporum canis

Sản phâm
Ỵ-decalactone

Pit. achydermatis
Acid oleic

Pỉt.orbiculare

Ỵ-hexa
Ỵ-hepta..

Pỉt.ovale
1982 Aspergillus oryzae
Geotrichum klebahnỉi
Yarrowia lipolytỉca
Candida guỉỉlỉermondỉỉ
Candida albicans
Candida krusei

Dầu thầu dầu

Dầu thầu dầu thuỷ
phân

Candida parakrusei

Y-decalactone

Acid ricinoleic

Candida pseudotropicals
Candida stellatoidea
Candida tropicalis
Candida rugosa
Hansenula saturnus
1989 Aspergillus niger
Cladosporium suaveolens
Phanerochaetechrysosporium

Dầu thầu dầu

Ỵ-decalactone

Dầu hướng dương

Ỵ-octanolied

Dầu dừa

Ỵ-decanolied

Pichia etchellsii
1990 Sporobolomyces odorus

Dầu thầu dầu

Rhodotorula glutinus

Ỵ-decalactone
y-hydroxydecanoic acid

Dâu thâu dâu

2001 Yarrowia lipolytica
HR 145 (DSM 12397)

8

y-decalactone

1.4.3. Cơ chế chuyển hoả acid ricinoleic thành y-decalactone ở vi sinh vật.
Quá trình chuyển hoá acid ricinoleic xảy ra ở vi sinh vật thực chất là
qúa trình P-oxy hoá nhờ vào hoạt động của các Acyl Coenzym A oxidase
(Aox). Acid ricinoleic bị cắt dần thành từng mẩu 2 cacbon tạo ra AcetylCoA, chất này sau đó sẽ biến đổi qua chu trình citric acid và chuỗi hô hấp tế
bào tạo năng lượng ATP cung cấp cho hoạt động sống của vi sinh vật [2].
Quá trình này tạo ra sản phẩm trung gian acid 4-hydroxy decanoic, như đã
biết ở trên acid này có thể đóng vòng để tạo ra y-decalactone. Yves Wache
[21, 22] và cộng sự đã chứng minh hoạt động của các Aox (Aoxl đến Aox5)
được mã hoá bởi các gen Poxl->Pox5 ở nấm men Yarrowia lipolytica có
liên quan đến sự tích tụ và tiêu huỷ lactone. Trong đó gen Pox3 mã hoá

enzym Aox3

(chuỗi ngắn-short chain) có ảnh hưởng lớn nhất đến sự tổng

hợp y-decalactone. Ở những chủng đột biến cắt đứt gen Pox3 lượng
y-decalactone tạo thành tăng lên đáng kể so với chủng hoang dã (Từ 50mg/l
lên đến 220mg/l sau 24 h). Ở các chủng hoang dã sự tạo thành 3-hydroxy-ydecalactone chiếm phần lớn trong sản phẩm thu được đã gợi ra suy nghĩ rằng
ở chủng hoang dã quá trình |3-oxy hoá chịu sự tác động của 3-hydroxy-AcylCoenzym A Hydrogenase.

9

Con đường /3-oxy hoá biến đổi methyl rỉcỉnoleate ở nấm men Yarrowia
ỉipolytỉca theo Yves Wache và cộng sự [22]:

Sản phẩm ị3-oxy hoá khác

+Hệ enzym:

+ Sản phẩm tạo thành:
1: Dec-3-en-4-01ide

Aox: Acyl CoezymA oxidase

2: y-Decalactone

Ahy: Acyl Co A Hydratase

3: Dec-2-en-4-01ide

Hdh: 3-hydroxy-y-Decalactone

4: 3-hydroxy-Ỵ-Decalactone

T h i: 3keto acyl Co A thiolase.

5: 3-keto-y-Decalactone

10

1
1
n

H

"
Hoa thầu dầu mầu đỏ, nở
thành chùm

Sau khi thụ phấn hoa phát
triển thành quả có gai

j.x M .

0

W
Phần gai roi ra để lộ 3-4

mảnh vỏ bao hạt

Những mảnh vỏ có thê vỡ ra
do động vật

Quả khô vào giữa tháng Tám

$«fằ
Trong các mảnh vỏ là hạt thâu
dầu

Hình 1. Một Sổ hình ảnh về đậc điểm sinh trưởng và phát triên của cây thâu dâu.

PHẦN II: Thực nghiệm và kết quả

2.1. Nguyên yật liệu và phương pháp thực nghiệm
2.1.1. Nguyên vật liệu hoá chất và thiết bị
• Dầu thầu dầu: Được mua tại trung tâm Dầu mỡ, Viện hoá học Công
nghiệp. Dầu ở dạng thô, được khai thác từ thiết bị ép nóng tại ngay nơi trồng
ở Bắc Ninh.
• Acid rỉcỉnoleỉc: Do viện Công nghiệp Thực Phẩm cung cấp
• Chủng giống: 81 chủng nấm men KFP trong bộ sưu tập của viện
CNTP được sử dụng để tuyển chọn khả năng chuyển hoá dầu thầu dầu,
chủng giống JMC2320( Yarrowia lipolytica), chủng PDT7.
• Lá cây, đất và hoa: Gồm có 16 mẫu lá cây, 6 mẫu đất, và 6 mẫu hoa
được lấy ở viện CNTP, vườn thực vật trường Đại học Dược, công viên
Pasteur, Công viên Lê-nin, Hoài Đức Hà Tây...
• Hoá chất'.
+ Etyl acetat (Trung Quốc)

+ Agar
+ Môi trường khô Yeast nitrogen base (Difco)
+ Dịch chiết Malt-glu 20 0 Bx
+ (NH4)2s o 4
+ n-Hecxan ( Trung Quốc)
+ y-Decalactone chuẩn
+ HCL 37%
• Thiết bi và duns cu:
+ Box cấy vô trùng

Bioblock scientific ( Pháp )

+ Nồi hấp áp lực

Himayamatoko (Nhật)

+ Máy lắc ống nghiệm

IKA* KS 130 basic ( N hật)

11

+ Máy lắc bình tam giác

Lab-line ( Mỹ )

+ Máy ly tâm

Universal 16 Hettich

+ Lò vi sóng

LG ( Hàn Quốc )

+ Kính hiển vi quang học

E clipse E 600 Nikon ( N hật)

+ Máy sắc ký khí

Aligent 6890 A(USA)

+ Đĩa petri, ống eppendorf, ống nghiệm có nắp vặn, ống falcon, pipet,
bình tam giác...
2.1.2. Một số môi trường sử dụng cho nghiên cứu
• Môi trường lj
+ Chất khoáng (*)

:

100

ml

+ Nguyên tố vi lượng (**)

:

200

|il

+ Dịch chiết nấm men 5 %

:

2 ml

+ (NH4)2S04

:

5g

+ Thêm nước vừa đủ

:

1lit

KH2PO4

:

850 mg

K2HPO4

:

150 mg

MgS04.7.H20

:

500 mg

NaCl

:

100 mg

CaC1.6.H20

:

100 mg

(*) Thành phần chất khoáng (trong 1 lit)

(**) Thành phần nguyên tố vi lượng (trong 1 lit)
H 3BO3

:

500

C1 1 SO4 .5 .H2 O

:

400 ng

KI

:

100|Lig

12

ỊLig

FeCl3. 6 H20

:

200

M nS04.4H20

:

400 |j,g

Na2M o04.2H20

:

200 |ag

ZnS04.7H20

:

400 |ug

ỊLig

• Môi trườns 2: môi trường yeast-nitrogen 10%
+ Yeast nitrogen base w/o amino acid (Difco): 6,7g
+ Nước cất vừa đủ 100 ml
Yeast nitrogen base w/o amino acid: Là môi trường khô của hãng Difco
gồm có: các acid amin, các vitamin và các muối vô cơ cần thiết cho sự phát
triển của nấm men.
• Môi trườns 3:
+ Pepton

2g

+ Dầu thầu dầu

10g

+ Tween 80

20 ịú

+ Nước cất vừa đủ

100 ml
>

• Môi trường 4:môỉ trường làm sach lân môt:
+ Dịch Malt -gluco 20°Bx

:

100 ml

+ Agar

:

20g

+ Nước cất vừa đủ

:

llit

Hấp ở 120 °c/ 20 phút, sau khi để nguội tới 80 °c bổ xung 0,1 % acid
lactic và đổ thạch đĩa.
• Môi trường 5: môi trường làm sach lân 2
Thành phần như môi trường làm sạch lần 1 nhưng không bổ xung acid

lactic.

• Môi trườns 6: môi trườns vhân lâp và giữ sỉổns
Thành phần như môi trường làm sạch lần 2.
2.1.3 Phương pháp thực nghiệm
• Phương pháp phân lập nấm men sử dụng Rìcìnoleỉc acid:
+ Nguyên tắc:
Để phân lập nấm men có khả năng chuyển hoá acid ricinoleic chúng tôi
sử dụng môi trường chứa nguồn cacbon duy nhất là acid ricinoleic. Nếu nấm
men mọc có nghĩa chúng phải oxy hoá được acid ricinoleic. Những chủng có
khả năng chuyển hoá acid ricinoleic được kiểm tra khả năng tạo mùi thông
qua đánh giá cảm quan.
+ Chuẩn bỉ môi trườns: Pha môi trường 1 đong vào các ống nghiệm
loại 10 ml có nắp vặn , mỗi ống 3ml. Bổ xung 30 |il acid ricinoleic / ống.
Hấp thanh trùng ở 120 °c / 20 phút.
+ Lấy mẫu:
- Mầu đất: Dùng dụng cụ vô trùng lấy đất trên bề mặt vào bình thuỷ
tinh vô trùng.
- Lá và hoa: Được lấy vào túi ni long sạch.
+ Xử lý mẫu:
- Dùng kéo đã thanh trùng cắt nhỏ khoảng 2 g lá cây (lcm) và cho vào
ống falcon chứa 20 ml nước cất vô trùng (Với mẫu đất cho khoảng 4 gam).
- Lắc nhẹ và ngâm khoảng 10 phút.
- Lắc mạnh trong 1-2 phút.
- Đe lắng trong vài chục giây, sau đó hút 1 ml dung dịch vào ống
eppendorf.
- Ly tâm ở 13000 vòng/phút trong thời gian 5 phút.

14

- Hút bỏ 900 \x\ phần dịch trong, trộn đều phần còn lại và nhỏ toàn bộ
vào ống chứa môi trường chọn lọc.
+ Nuôi cấy:
Nuôi cấy lắc trên giá ống nghiệm, chỉnh tốc độ lắc sao cho toàn bộ phần
dịch bị khuấy trộn. Sau 1-2 tuần, tuỳ theo mức độ phát triển có thể tiến hành
phân lập nấm men.
+ Phân lâp :
Môi trường sử dụng cho phân lập là môi trường 5
- Lắc đều dịch nuôi cấy
- Nhúng que cấy vào canh trường và cấy lên mặt thạch vài lần
- Di que cấy theo hướng từ vị trí ban đầu ra các phía để tách từng khuẩn
lạc riêng rẽ.
Sau 3- 5 ngày ta chọn các khuẩn lạc nấm men riêng rẽ và cấy lên đĩa
thạch chứa môi trường làm sạch lần 1. Khi v s v đã mọc ta chọn một khuẩn
lạc riêng rẽ cấy lên môi trường làm sạch lần 2. Qua 2 lần làm sạch ta có thể
chọn được các giống thuần chủng và các chủng này được giữ trong ống
eppendrof ở 5 0 c.
+ Thử hoat lưc của các chủng phân lâp đươc:
Chuẩn bị môi trường 1 và đong vào các ống nghiệm 10 ml có nắp
khoảng 3 ml/ống. Bổ xung 30jLil acid ricinoleic/ống. Hấp thanh trùng ở 1
atm/20 phút. Các chủng đã phân lập được cấy vào các ống nghiệm có chứa
môi trường trên. Nuôi cấy trong điều kiện hiếu khí nhiệt độ 25 °c, lắc 320
vòng /phút. Theo dõi mùi tạo ra hàng ngày trong thời gian 2 tuần để chọn
chủng có khả năng tạo hương thơm.
• Tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng chuyển hoá acid
ricinoleic từ bộ sưu tập giống của Viện:

15

Các chủng giống được giữ trong ống eppendorf trong tủ lạnh được cấy
truyền sang môi trường 6 trên thạch nghiêng đế hoạt hoá chủng.
Pha môi trường 2 đong vào các ống nghiệm 2ml/ống. Bổ xung 20|nl
acid ricinoleic /ống nuôi cấy ở điều kiện như trên V à theo dõi mùi tạo ra .
• Xác định thời gian tối ưu cho việc tạo hương ở một sổ chủng
phân lập và tuyển chọn
Từ các chủng tạo hương được phân lập và tuyển chọn chúng tôi tiến
hành nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến sinh trưởng và khả năng tạo
mùi thơm của các chủng.
•

Quan sát hình dạng tế bào của một số chủng nấm men phătt lập
và tuyển chọn.
Các chủng nấm men được cấy truyền từ ống giữ giống sang thạch

nghiêng, nuôi cấy ở 25 °c trong 3-5 ngày và quan sát hinh thái. Các hình
ảnh qua kính hiển vi quang học Eclipse 600 được truyền bằng camera JVC
và lưu giữ trên máy vi tính. Hình ảnh đã số hoá được sử lý bằng phần
mềm đồ hoạ Adobe Photoshop 5.0. Kết quả thu được sẽ được tham chiếu
với những khoá phân loại nấm men để sơ bộ định tên các chủng giống.
• Lên men và tách chiết chất thơm tạo thành từ môi trường nuôi cấy
các chủng tạo hương
+ Chuẩn bỉ chủns ziổnz: chủng giống được cấy truyền từ ống
eppendorf sang thạch nghiêng, sau 2-3 ngày có thể sử dụng cho lên men.
+Lên men và tách chiết: chuẩn bị bình tam giác chứa 100 ml môi
trường 2% pepton, 0.02 % Tween 80, 10 gam dầu thầu dầu. Tween 80 được
cho vào ở đây nhằm làm tăng khả năng nhũ hoá của dầu thầu dầu giúp cho vi
sinh vật có thể sử dụng tốt hơn. Môi trường được hấp thanh trùng ở 120 °c

/20 phút. Cấy khoảng một vòng que cấy chủng vào môi trường nuôi cấy, lắc

16

đều. Đặt các bình nuôi cấy chủng trong điều kiện rung lắc ở 200 vòng/phút,
nhiệt độ 25 °c, trong quá trình lên men theo dõi pH môi trường và giữ ở 6,57. Sau 7 ngày kết thúc quá trình lên men pH được chỉnh về 1,5 bằng dung
dịch acid HC1. Đun nóng ở 100 °c trong 10 phút để thực hiện phản ứng đóng
vòng lactone. Sau khi làm lạnh chiết bằng dung môi n- hecxan. Ly tâm dịch
chiết để loại bỏ cặn. Hút lấy dịch trong vào ống Falcon, dịch chiết được sử
dụng cho việc định tính và định lượng chất thơm tạo ra bằng sắc ký khí.
• Định tính và định lượng chất thơm tạo thành trong các dịch chiết
n-hecxan bằng sắc kỷ khỉ
Định tính chất thom trong dịch chiết bằng cách so sánh đối chiếu vị trí
của pic tương ứng trên sắc đồ trùng với pic của chất chuẩn đối chiếu.
Định lượng chất therm tạo thành bằng cách tính diện tích pic của chất
chuẩn đã biết chính xác hàm lượng từ đó suy ra lượng chất chuẩn có trong
mẫu th ử .
• So sảnh lượng ỵ-decalactone tạo thành của chủng KFP 346 khi
nuôi cấy và tách chiết theo các cách khác nhau(*):
Nuôi cấy chủng KFP 346 theo các cách sau:
+ Cách h Pha 100ml môi trường 1 trong bình tam giác. Hấp thanh
trùng ở latm/20 phút, cấy khoảng 1 vòng que cấy chủng. Sau thời gian nuôi
cấy 7 ngày ở điều kiện lắc 150 vòng/phút, 25°c. Sau cùng chiết bằng 50 ml
dung môi etylacetat. Ly tâm loại cặn.
+ Cách 2: khác cách 1 ở điểm: sau 7 ngày nuôi cấy thực hiện phản ứng
đóng vòng lacton bằng cách acid hoá môi trường bằng dung d ịch HC1 đến
pH 1,5. Đun nóng ở 100 0 c trong 10 phút. Làm lạnh và chiết bằng 25 ml
dung môi n-hecxan. Sau cùng ly tâm loại cặn.

17

+ Cách 3: chuẩn bị 100 ml môi trường 3 vào bình tam giác. Hấp thanh
trùng ở latm/20 phút, cấy khoảng một vòng que cấy chủng. Nuôi cấy trong
điều kiện rung lắc 150 vòng /phút, nhiệt độ 25 °c, pH môi trường được giữ
ở 6,5-7 trong thời gian 7 ngày. Sau 7 ngày kết thúc quá trình lên men pH
được chỉnh về 1,5 bằng dung dịch acid HC1 . Đun nóng ở 100 °c trong 10
phút. Sau khi làm lạnh chiết bằng 25 ml dung môi n-hecxan. Ly tâm loại
cặn.
Các dịch chiết trên được ký hiệu theo thứ tự KFP 346.1; KFP 346.2;
KFP 346.3 được chạy sắc ký khí để định lượng Ỵ-decalactone.
2.2 Kết quả thực nghiệm
2.2.1 Phân lập các chủng nấm men chuyển hoả dầu thầu dầu thành chất
thơm
Từ 28 mẫu lá cây, hoa và đất chúng tôi phân lập được 70 chủng nấm men
(HRA1-HRA70), trong đó có 41 chủng được phân lập từ lá, 18 chủng được
phân lập từ hoa và 11 chủng được phân lập từ đất. Sau khi thử hoạt lực chúng
tôi tìm được 5 chủng (HRA 1; HRA 2; HRA 51; HRA 55; HRA 61 ) có khả
năng tạo mùi thơm.
2.2.2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh trưởng và khả năng tạo
mùi thơm của 5 chủng phân lập.
Từ 5 chủng trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của thời
gian đến sinh trưởng và mùi thơm tạo ra khi nuôi cấy chủng trong môi trường
1 ở điều kiện như nhau lượng tế bào được cấy như nhau, nhiệt độ 25 °c, lắc
150 vòng / phút, thông khí bằng cách mở % vòng nắp ống nghiệm. Kết quả
được thể hiện ở bảng 3

18

Bảng 3: ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh trưởng và khả năng
tạo mùi thơm của 5 chủng HRA 1, HRA 2, HRA 51, HRA 55, HRA 61
9 ngày

7 ngày

5 ngày

3 ngày
Chủng
s

M

s

M

s

M

s

M

HRA 1

-

-

+

±

+

+

++

-

HRA 2

-

-

+

±

+

+

++

-

HRA51

-

-

+

+

+

+

++

-

HRA55

-

-

+

+

+

-

++

-

HRA 61

-

-

+

+

+

-

++

-

Ghi chú: (S): sinh trưởng; (M): mùi
Cột S: (-): Chưa mọc; (+): có mọc; (++): mọc nhiều
Cột M: (-): mùi hắc; (±): không mùi; (+): mùi thơm.

Nhân xét: Trong 5 chủng được nghiên cứu chỉ có chủng HRA 51 tạo
mùi thơm tốt và tồn tại lâu trong môi trường, sau 5 ngày đã xuất hiện mùi
thơm và tồn tại cho đến ngày thứ 7, còn hai chủng HRA 55, HRA 61 bị mất
mùi nhanh hon.
2.2.3. Tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng chuyển hoá acid
ricinoleic từ bộ sưu tập giống của Viện.
Từ 81 chủng giống trong bộ sưu tập của viện Công Nghiệp Thực Phấm
sau khi thử khả năng chuyển hoá acid ricinoleic, chúng tôi tuyển chọn được 7
chủng (KFP 346; KFP 145; KFP 116; KFP 304; KFP 248; KFP 254;
KFP 265) có khả năng chuyển hoá acid ricinoleic thành chất thơm trong đó có
3 chủng tạo mùi rất tốt (KFP 346, KFP145, KFP 248), đặc biệt chủng KFP
346. Mùi thơm tạo ra trong môi trường nuôi cấy chủng này được nhận thấy

19

chỉ sau 1 ngày và tăng dần theo thời gian cho đến khi acid ricinoleic được
chuyển hoá hết là lúc môi trường nuôi cấy không còn các hạt dầu. Thông
thường ở các chủng còn lại tại một thời điểm nhất định mùi tạo ra là tốt nhất
sau đó mùi chuyển sang hắc, nhưng riêng chủng KFP 346 mùi thơm tồn tại rất
lâu trong môi trường và cho đến khi acid ricinoleic được chuyển hoá hết mùi
thơm không bị mất đi hay chuyển sang hắc. Điều đó có thể giải thích rằng quá
trình chuyển hoá acid ricinoleic nhờ chủng KFP 346 chỉ dừng lại ở việc tạo ra
chất thơm mà không tiếp tục chuyển hoá chất thơm đó thành các chất khác.
2.2.4. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh trưởng và khả năng tạo
mùi thơm của 7 chủng tuyển chọn.
Từ bảy chủng tuyển chọn trong bộ sưu tập giống của Viện chúng tôi
tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến sinh trưởng và mùi thơm
tạo ra. Kết quả thể hiện ở bảng sau.
Bảng 4: ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh trưởng và khả năng tạo