Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ chủng streptomyces 9 25

BỘ Y TÊ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

LÊ QUANG VŨ

GÓP PHẦIV IVÍiHLÊIV c r tr SLYII TỔNG
HỢP K H M G SLYII TỪ COẺNG
STREPTOMTCES 9 .2 5
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ ĐẠI HỌC
Khoá 1998 - 2003

Giáo viên hướng dẫn: TS. Cao Văn Thu
Noi thực hiện:
BM Công Nghiệp Dược
Thời gian thực hiện:
2/2003- 5/2003

Hà Nội - 5/2003

li?64-


Tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với thầy giáo TS. CAO VĂN THU,
người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện khoá luận này.
Đồng thời tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong bộ
môn Công Nghiệp Dược đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện
khoá luận.
Với kiến thức và thời gian thực hiện khoá luận còn hạn chế, chắc rằng
khoá luận của tôi còn nhiều thiếu sót. Tôi rất mong được sự đóng góp ỷ kiến
của các thầy cô và bạn bè để khóa luận của tôi được hoàn thiện hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn.

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2003
Sinh viên
Lê Quang Vũ


MỤC LỤC
TRANG
PHẦN I.

ĐẶT VẤN ĐỂ

PHẨN II.

TỔNG QUAN

2.1. Đặc điểm chung về Streptomyces

1
3
3

2.1.1. Một số đặc điểm về hình thái của chi Streptomyces.
2.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của Streptomyces.
2.1.3. Một số khá lớn kháng sinh do một số loài Streptomyces sinh tổng
hợp đã được nghiên cứu và sử dụng
2.2.

Cải tạo giống vi sinh vật

5

2.2.1. Chọn lọc ngẫu nhiên
2.2.2. Đột biến nhân tạo.
2.3.

Lên men

6

2.3.1. Lên men bề mặt.
2.3.2. Lên men chìm.
2.4.

Chiết tách và tinh chế

8

2.4.1. Phương pháp chia cắt pha.
2.4.2. Phương pháp chuyển pha.
2.5.

Các kết quả mới về quá trình nuôi cấy và chiết tách một sô

kháng sinh

1 1


2.5.1. Bafilomycin B, và Cị.
2.5.2. Kháng sinh adriamycin, 14 hydroxyl daunomycin chống ung thư

từ chủng Str. peucetius var. caesius.
PHẦN m. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

13

3.1.

13

Nguyên liệu và trang thiết bị
3.1.1. Chủng gốc vi sinh vật và nguyên liệu.
3.1.2. Các trang thết bị

3.2.

Phương pháp thực nghiệm

17

3.2.1. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuyếch tán.
3.2.2. Phương pháp cải tạo giống
3.2.3. Phương pháp lên men.
3.2.5.Phương pháp xác định kháng sinh nội bào.
3.2.4. Phương pháp thử độ ổn định của hoạt chất kháng sinh trong dịch
lên men với pH khác nhau.
3.2.6.

Phương pháp chiết tách kháng sinh.

3.2.7. Phương pháp sắc ký.

3.2.8. Phương pháp phân loại Streptomyces theo ISP (International
Strepmyces Project).
3.3.

Kết quả và nhận xét

24

3.3.1. Kết quả thử hoạt tính kháng sinh Streptomyces 9.25 sinh tổng hợp
trong môi trường 2
3.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các loại môi trường đến khả
năng sinh tổng hợp kháng sinh.


3.3.3. Kết quả nghiên cứu tuyển chon giống bằng phương pháp sàng lọc
ngẫu nhiên.
3.3.4. Kết quả cải tạo giống bằng phương pháp đột biến nhân tạo với các
tác nhân ánh sáng u v (k = 254nm).
3.3.5. Kết quả khảo sát chọn môi trường lên men chìm có khả năng sinh
tổng hợp kháng sinh cao nhất.
3.3.6. Kết quả thử khả năng sinh tổng hợp sinh kháng sinh của các biến
chủng sau đột biến
3.3.7. Kết quả thử kháng sinh nội bào.
3.3.8. Kết quả quá trình lựa chọ dung môi chiết và pH chiết thích hợp với
hoạt chất kháng sinh ở dịch lọc dịch lên men.
3.3.9. Kết quả thử độ ổn định của hoạt chất tại các pH khác nhau
3.3.10. Kết quả sắc ký lớp mỏng.
3.3. 11. Kết quả phân loại và định tên Streptomỵces 9.25
PHẦN IV.

KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT

37

4.1. Kết luận

37

4.2. Đề xuất

38

TẢI LIỆU THAM KHÁO
PHU LUC


CHÚ GIẢI CHỮVIÊT TẮT

ADN:

Adenin deoxyribonucleic

BC:

Bacillus cereus

Bp:

Bacillus pumilis

Bs :

Bacillus subtilis

BuOH:

n- butanol

BuOAc:

Butyl acetat

EC:

Escherichia coli

EtOAc:

Ethyl acetat

Gy:

Grey

MeOH:

Methanol

MT:

Môi trường

Pro:

Proteus mirabilis

Pseu:

Pseudomonas aeruginosa

Shi:

Shigella flexneri

SL:

Sarcina lutea

sm:

smooth

Sta:

Staphylococcus aureus

RF:

Rectiflexibiles

STH:

Sinh tổng hợp

Typhi:

Samonella typhi

VSVKĐ:

Vi sinh vật kiểm định

W:

White

Y:

Yellow


PHẦN I

ĐẶT VẤN ĐỂ
•

Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, ngày càng có nhiều kháng
sinh mới, đã được sản xuất bằng phương pháp bán tổng hợp hoặc tổng hợp
toàn phần, nhưng việc tìm ra các kháng sinh mới nguyên gốc từ các loài vi
sinh vật vẫn đang được nhiều quốc gia trên thế giới quan tâm.

Ở Việt Nam có điều kiện khí hậu nhiệt đới là điều kiện tốt cho các loài
vi sinh vật phát triển trong đó có nhiều loài có khả năng sinh tổng hợp kháng
sinh tốt, tiêu biểu là chi Streptomyces thuộc lớp phụ Actinomycetales cũng
đang được đánh giá cao và nhiều nhà khoa học quan tâm.
Việc phân lập các chủng Streptomyces được tiến hành nghiên cứu tại bộ
môn công nghiệp dược của trường ĐH Dược Hà Nội. Tuy nhiên những chủng
nguyên thuỷ ban đầu, khả năng sinh tổng hợp kháng sinh chưa cao. Do vậy,
nghiên cưú nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh và nghiên cứu chiết
tách tinh chế kháng sinh là điều kiện cần thiết ở quy mô phòng thí nghiệm
trước khi đưa ra công nghiệp hoá.
Tiếp tục từ những việc nghiên cứu đã

lởi phát) chúng tôi lựa chọn đề

tài có tên: “Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ chủng xạ
khuẩn streptomyces 9.25" với các mục tiêu sau:
- Nghiên cứu cải tạo giống và lên men để nâng cao hiệu suất sinh tổng
hợp kháng sinh.
- Nghiên cứu sơ bộ phương pháp chiết tách và tinh chế kháng sinh.
- Nhận dạng định tên chủng Streptomyces 9.25

1


PHẦN II

TỔNG QUAN
2.1. Đặc điểm chung về streptomyces
2.1.1. Một sô đặc điểm về hình thái của chi streptomyces
Streptomyces là chi thuộc lớp phụ Actinomycetales phân bố rộng rãi trong tự

nhiên ở nhiều nơi: đất, bùn ao hồ, cát, nước... Trung bình cứ

1

gam đất nói

chung có trên một triêu xạ khuẩn. Mật độ xạ khuẩn ở các mẫu đất khác nhau
rất khác nhau, phụ thuộc nhiều điều kiện: môi trường như độ ẩm, nhiệt độ,
dinh dưỡng, pH....
Streptomỵces tạo ra khuẩn ty khí sinh và khuẩn ty cơ chất, các khuẩn lạc
hình thành sau vài ngày nuôi cấy có mầu sắc hết sức phong phú, thường hay
gặp là màu trắng, màu xám, màu tím... Khuẩn lạc thường có dạng thô ráp,
dạng phấn, không trong suốt có nếp toả ra hình phóng xạ.
Khuẩn ty cơ chất đang sinh trưởng có tính chất như xốp, bề mặt nhẵn
hoăc xù xì có xu hướng dính chặt vào môi trường.
Khuẩn ty khí sinh có đường kính từ 0,5 - 1,4 |Lim và từ đó hình thành nên
những chuỗi bào tử. Đây là cơ sở sinh sản đặc trưng, chuỗi bào tử có cấu tạo
gồm một sợi trục không có chức năng sinh sản, những đoạn phân nhánh cuối
cùng mới có khả năng sinh bào tử. Trên mỗi nhánh có từ 10 - 100 bào tử. Bào
tử có thể hình cầu, elip... Đường kính của bào tử có kính thước tương ứng với
đường kính của khuẩn ty.
2.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của Streptomyces.
Streptomyces phát triển được ở nhiệt độ từ 20 - 40 °c. Nhưng điều kiện
phát triển tối thích của nó là 30 ± 2°c và ở pH: 7,0 ± 0,2.
Một số đặc điểm cần lưu ý của streptomyces là sự tạo sắc tố hoà tan,
khuẩn lạc có màu sắc khác nhau trên các môi trường nuôi cấy khác nhau, đây
cũng là những cơ sở để giúp phân loại định tên loài cho các loài Streptomyces.

2

Các loài trong chi Streptomyces là các vi khuẩn gram dương, hiếu khí,
sống hoại sinh trong đất và nước. Chúng có khả năng phân huỷ mạnh glucid,
có thành tế bào kiểu I chức DAP (diaminopimelat) và glycin.
2.1.3. Một sô khá lớn kháng sinh do một sô loài streptomyces sinh tổng
hợp đã được nghiên cứu và sử dụng
Nhiều loài Streptomyces có khả năng sinh tổng hợp tạo ra được nhiều loại
thuộc nhiều nhóm kháng sinh khác nhau như: aminoglycosid, phenicol,
macrolid, lincosamid, tetracylin...
- Nhóm Amỉnosid
+ Streptomycin do S.griseus (Waskman 1943)
+ Kanamycin do S.kanamycetiusịUmezawa 1957)
+ Torbramỵcin do S.tenebreus
+ Neomycin do s.fradie
+Paromomycin do S.rimosus formaparomomycinus
/
+ Spectimomycin do S.pectabilis
-Nhóm phenỉcol.
+ Cloramphenicol do s.venzuelae
- Nhóm Tetracyclin.
+ Tetracylin do S.aureofaciens
+ Oxy tetracylin do S.rimosus
+ Clotetracylin do S.aureofaciens
-Nhóm macrolid.
+ Erythromycin do S.erythreus
+ Olean domycin do S.antibioticus
+ Spiramycin do S.ambofaciens
- Nhóm lincosamỉd.
+ Lincomycin do S.lincolensis

3


- Kháng sinh chống nấm.
+ Nystatin do S.noursei
+ Amphotericin do s. nodosus
2

.2 . Cải tạo giống vi sinh vật
Hầu hết các vi sinh vật sinh kháng sinh phân lập được từ các cơ chất

thiên nhiên thường có hoạt tính thấp, đồng thời trong quá trình nuôi cấy hoạt
tính của chúng thường giảm dần. Do đó để thu được những chủng có hoạt tính
cao, ổn định đưa vào sản xuất cần phải tiến hành cải tạo giống bằng các biện
pháp khác nhau.
2.2.1. Chọn lọc ngẫu nhiên
Các vi sinh vật biến dị tự nhiên theo tần số khác nhau có cá thể tăng hoạt
tính kháng sinh so với cá thể khác. Ta cần chọn lấy những cá thể có hoạt tính
cao nhất để nghiên cứu tiếp.
Trên thực tế tần suất xuất hiện các biến chủng dương tính rất thấp và việc
chọn lọc tự nhiên các cá thể có hoạt tính kháng sinh cao chỉ để nghiên cứu
ban đầu ít có giá trị áp dụng vào sản xuất, để thu được những chủng có khả
năng sinh tổng hợp kháng sinh cao. Ta phải cải tạo giống. Ở đây chúng tôi kết
hợp đột biến và sàng lọc.
Ngày nay với sự phát triển mạnh mẽ của di truyền học hiện đại và việc
tìm ra bản chất gen, hiểu bản chất đột biến và quá trình phát sinh đột biến.
Người ta có khả năng tạo ra đột biến mạnh để tăng hiệu quả trong quá trình
nghiên cứu sản xuất.
2

.2 .2 . Đột biến nhân tạo
Đột biến là quá trình làm thay đổi trình tự sắp xếp của các base hoặc thay

đổi bản thân các base trong ADN. Các yếu tố gây đột biến là các tác nhân gây
đột biến có thể làm thay đổi một vài nhược điểm của giống.
Đột biến nhân tạo là đột biến được tạo bởi các tác nhân đột biến với mục
đích nhằm nâng cao tần suất xuất hiện đột biến.

4


Các tác nhân đột biến:
+ Tác nhân vật lý: Tia X, ánh sáng uv, tia Ỵ...
+ Tác nhân hoá học: N-mustar, etylenimin, HN02...
+ Tác nhân sinh học: Đột biến do hiện tượng thiếu các base, nitơ hay do
tác động của gen gây đột biến.
Trong khoá luận này chúng tôi chỉ nghiên cứu cải tạo giống bằng cách
gây đột biến bằng ánh sáng tử ngoại. Ánh sáng u v có khả năng đâm thấu tới
nhân với tế bào vi sinh vật nên được sử dụng rộng rãi trong việc cải tạo giống.
Cơ chế gây đột biến của ánh sáng UV:
Ánh sáng

uv có tác dụng trên ADN và mạnh nhất ở bước sóng 260 nm,

gây dime hoá thymin (do làm đứt liên kết hydro trong mạch kép ADN). Ở đây
2 thymin gần nhau sẽ liên kết cộng hoá trị với nhau ở nguyên tử C5 và C6, hậu
quả là sao chép bị nhầm. Do ADN- polymease dễ lắp một nucleotit vào vị trí
trên. Ngoài ra do tác dụng của ánh sáng uv trên sợi ADN cũng xuất hiện một
dime pyrimidin khác gọi là quang sản phẩm 6-4. Ở đây C6 của pyrimidin 5'
được liên kết với C4 của pyrimindin 3'. Các sản phẩm này là nguyên nhân chủ

yếu gây lên đột biến bỏti tia uv.
Các yếu tố ảnh hưởng đến hậu quả gây chết và tần số phát sinh đột biến:
+ Thòi gian chiếu.
+ Khoảng cách chiếu.
+ Độ pha loãng.
2.3. Lên men.
Lên men là quá trình nuôi cấy vi sinh vật trong điều kiện tối ưu để sản
xuất các sản phẩm trao đổi chất nhờ các vi sinh vật hoặc các thành phần tế bào
của chúng.


Hầu hết các kháng sinh hiện có đều là sản phẩm của quá trình lên men
hoặc bán tổng hợp rất ít kháng sinh có thể tổng hợp toàn phần như
cloramphenicol.
Có 2 kiểu lên men chính:
+ Lên men bề mặt.
+ Lên men chìm.
2.3.1. Lên men bề mặt
Vi sinh vật được nuôi cấy trên bề mặt môi trường rắn hay lỏng hấp thụ
các chất dinh dưỡng của môi trường và sử dụng oxi không khí để hô hấp trên
bề mặt môi trường dinh dưỡng. Vì vậy lên men bề mặt đòi hỏi phải có bề mặt
rộng và lớp môi trường không quá sâu.
Lên men bề mặt có ưu điểm đơn giản, dễ thực hiện đầu tư ban đầu thấp
nhưng cũng có nhược điểm hiệu suất sử dụng thấp, đòi hỏi diện tích lớn, khó
cơ giới tự động hoá. Vì vậy không được áp dụng trong sản xuất công nghiệp
mà chỉ sử dụng để chọn giống trong phòng thí nghiệm.
2.3.2. Lên men chìm.
Đa số các kháng sinh hiện nay đều được sản xuất bằng phương pháp lên
men chìm. Ở phương pháp này vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường
lỏng, phát triển trong không gian 3 chiều. Giống lên men được tạo ra qua các

cấp nhân giống khác nhau.
+ Giống cấp I: được nuôi cấy trong bình trên máy lắc,
+ Giống cấp II: trong bình giống 50 lít,
+ Giống cấpIII: nuôi cấy trong bình có dung tích 1- 5 m3
Tỷ lệ giống từ 1-10 %. Tuỳ thuộc vào sản phẩm và thời gian lên men có
thể kéo dài từ 96h — 180h, tuy nhiên hiệu quả lên men tăng lên khi thời gian
lên men được rút ngắn.


ư u điểm của lên men chìm:
+ Sử dụng môi trường dinh dưỡng tối ưu, đáp ứng được nhu cầu sinh lý,
sinh hoá của vi sinh vật.
+ Hiệu suất sử dụng không gian cao.
+ Các thiết bị lên men chìm dễ cơ giới hoá tự động hoá tiết kiệm được
mặt bằng, nhân công.
Tuy nhiên lên men chìm đòi hỏi nhiều trang thiết bị kỹ thuật, các thiết bị
chịu áp lực và vô trùng tuyệt đối, đòi hỏi đầu tư lớn.
Lên men chìm được chia ra nhiều kiểu như: lên men gián đoạn, lên men
có bổ sung và lên men liên tục.
*. Lên men gián đoạn: Lên men gián đoạn như một hệ thống đóng kín
sau khi cấy giống trong điều kiện vô trùng, tiến hành lên men trong điều kiện
sinh lý tối ưu, trong thòi gian lên men ngoài cấp khí, chất phá bọt, chất điều
chỉnh pH ngoài ra không bổ sung gì thêm.
Để theo dõi quá trình lên men người ta tiến hành phân tích các mẫu dịch
lên men mới lấy để xác định tham số chính.
*. Lên men liên tục: Hệ thống lên men liên tục hoạt động như một hệ mở.
Trong quá trình lên men vừa bổ sung liên tục môi trường dinh dưỡng vừa lấy
bớt ra đồng lượng dịch lên men đã biến đổi cùng vi sinh vật trong đó giữ thể
tích không đổi, lên men liên tục có sản lượng cao, có thời gian chết ngắn hơn
lên men gián đoạn.

*. Lên men bổ sung là biến tướng phát triển tiếp tục của lên men gián
đoạn khi ta bổ sung thêm môi trường dinh dưỡng để tránh các ức chế trao đổi
chất của vi sinh vật nhằm tăng cường sinh tổng hợp hoạt chất.
Trong quá trình lên men, lượng giống, tuổi, cách nuôi cấy, điều kiện nuôi
cấy có ảnh hưởng đến hiệu suất của quá trình. Theo kinh nghiệm, nếu muốn
đạt hiệu suất sinh tổng hợp cao thì môi trường nhân giống phải khác môi
trường lên men.

7


2.4. Chiết tách và tinh chê
Các sản phẩm mục tiêu có trong dịch lên men thường có nồng độ thấp.
Ngoài ra dịch lên men còn tồn tại nhiều sản phẩm phụ của quá trình trao đổi
chất khác. Do đó việc nghiên cứu quá trình chiết tách và nghiên cứu kháng
sinh là một việc vô cùng quan trọng.
Có hai phương pháp hay dùng nhất để chiết hỗn hợp đổng nhất đó là
phương pháp chia cắt pha và phương pháp chuyển pha.
2.4.1. Phương pháp chia cắt pha
Đây là phương pháp đi từ hỗn hợp đồng nhất tách thành hỗn hợp không
đồng nhất.
*. Loại dung môi: Bằng cách cô đặc có thể tiến hành ở áp suất giảm. Nếu
cô ở áp suất thường thì hoạt chất có thể bị phân huỷ bởi nhiệt độ cao. Nhưng
ngược lại cô ở áp suất giảm, tiến hành phức tạp hơn ở nhiệt độ thấp hơn sẽ an
toàn cho hoạt chất hơn. Người ta thường dùng một bình cất quay nối với một
bơm chân không, dung môi ngưng đọng chảy qua một bình khác. Sự quay làm
tăng diện tích bề mặt bay hơi, do dung môi được tráng lên thành bình.
*. Giảm khả năng hoà tan của dung môi.
- Thay đổi nhiệt độ.
- Thêm chất lỏng không phải là dung môi vào dung dịch.

- Phương pháp muối kết (dựa vào độ mạnh yếu khách nhau của các
ion).
2.4.2. Phương pháp chuyển pha.
Dùng một dung môi hay một hệ dung môi thích hợp để chuyển một chất
từ pha này sang pha khác. Trong nhóm này hai phương pháp chiết và sắc ký là
hay được sử dụng để nghiên cứu kháng sinh.
*. Phương pháp chiết
Nguyên tắc: Dựa vào sự phân bố khác nhau của chất tan giữa hai pha
không đồng tan vói nhau.


Nếu lắc dung dịch A có chứa chất tan

s với dung môi B thì quá trình

phân bố chất tan s vào hai pha A và B sẽ được trạng thái cân bằng như sau:
c
K=
q CA
CA, CBlần lượt là nồng độ của chất s trong pha (A và B)
Kq là hằng số cân bằng ở nhiệt độ xác định trong những điều kiện lý
tưởng.
Các phương pháp chiết:
- Chiết một lần (chiết đơn) thường cho hiệu suất thấp.
- Chiết lặp (chiết nhiều lần) cho hiệu suất cao, nhưng tốnthời gian và
công sức, có thể chiết gián đoạn hay chiết liên tục.
- Chiết ngược dòng: dựa trên nguyên tắc dung môi chiết và dung dịch
cần chiết chuyển động ngược chiều nhau hai pha tiếp xúc chặt chẽ, pha
trộn và di động ngược chiều nhau.
*. Sắc ký:

Sắc ký là phương pháp tách và phân tích các chất dựa vào sự phân bố của
chúng giữa hai pha: pha động và pha tĩnh. Khi tiếp xúc vói hai pha các cấu tử
hỗn hợp sẽ phân bố vào hai pha tương ứng với các phần tử của pha động mới
chuyển động dọc theo hệ thống sắc ký .
Các chất khác nhau thì có các ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh,
chất có ái lực lớn với pha tĩnh thì chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký
so vói chất có ái lực yếu hơn với pha này do vậy các chất có thể được tách
riêng xa nhau.
Theo bản chất có thể chia sắc ký thành 4 loại:
Sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion và sắc ký trên gel
- Sắc ký phân bố: pha tĩnh là chất lỏng không hoà tan được với pha
động chất lỏng này được bao trên bề mặt chất rắn gọi là giá mang.
- Sắc ký hấp phụ: pha tĩnh là chất rắn có khả năng hấp phụ.

Q


- sắc ký trao đổi ion: pha tĩnh là chất mang có nhóm hoạt hoá chứa các
ion trao đổi, sắc ký trao đổi ion dựa vào hiện tượng trao đổi thuận nghịch
giữa các ion trong dung dịch với các ion thành phần của chất trao đổi ion.
- Sắc ký trên gel: chất hấp phụ là các gel, pha tĩnh là dung môi nằm
trong lỗ xốp các hạt, pha động là dung môi giữa các hạt, các phân tử chất
có phân tử lượng lớn thì sẽ không bị giữ và di chuyển theo dung môi các
phân tử nhỏ chui vào các lỗ xốp. Khi rửa các phân tử sẽ ra lần lượt là các
cỡ lớn đến nhỏ. Có nhiều loại gel với các lỗ xốp khác nhau để tách phân
tử có trọng lượng khác nhau.
Khi chiết tách và tinh chế sản phẩm người ta dùng kết hợp cả hai phương
pháp: phương pháp chia cắt pha và phương pháp chuyển pha.
2.5. Các kết quả mới về quá trình nuôi cấy và chiết tách một sô kháng
sinh.

2.5.1. Bafilomycin

và

.

Khi nuôi cấy Streptomyces halstedii theo phương pháp thông thường thì
tác dụng chống nấm không phát hiện được ở cả dịch môi trường và dịch chiết
nội bào. Tuy nhiên khi nuôi cấy Streptomyces halstedii trong môi trường dạng
film mỏng

1

mm thì thấy đây là một môi trường thích hợp cho sự tạo kháng

sinh chống nấm. S.halstedii được nuôi cấy qua đêm ở nhiệt độ 30°c trong môi
trường này, sau đó dùng

1

ml môi trường trên thêm vào 15 ml môi trường lên

men, hỗn hợp này được phân tán vào bình Rhou để ở nhiệt độ 30°c đến khi
tạo bào tử (từ 10-14 ngày). Ly tâm để lấy hệ sợi, hệ sợi được rửa bằng nước
cất và lọc qua phễu lọc cellulose. Hệ sợi được thu nhận và chiết bằng MeOH.
Ly tâm phá vỡ tế bào bằng siêu âm, sau đó ly tâm lấy dịch.
Để thu đủ hoạt chất tinh khiết phục vụ cho việc phân tích cấu trúc, dịch
chiết của 80 bình lên men được gộp lại để cất quay và cô đặc. Dịch cô đặc
được tinh chế bằng cột C18Ec, chất hấp phụ được hoạt hóa bằng MeOH và
được rửa bằng nước.

Sau đó được phản hấp phụ bằng hệ dung môi MeOH: nước {8:2}. Các
phân đoạn chứa kháng sinh được phát hiện bằng hai phương pháp: Phương
pháp vi sinh vật và phương pháp sắc ký lóp mỏng với hệ dung môi EtOAc :
MeOH : H20 {7:2:1}
Hai chất bafilomycin B| và Cịđược tách riêng và phân tích bằng phương
pháp HPLC. Kết quả phân tích cho thấy bafilomycin là một kháng sinh thuộc
nhóm macrolid.
2.5.2. Kháng sinh adrỉamycỉn, 14 - hydroxyl daunomycin chống ung thư
từ chủng Str. peucetius var. caesius
Daunomycin là một kháng sinh thuộc nhóm anthracylin được chiết từ
môi trường nuôi cấy Streptomyces peucetius. Cấu trúc của daunomycin là một
một a- glucosid của daunomicinon (có 4 vòng là dẫn chất có màu của
anthraquinon). Daunomycin được chỉ định trong bệnh bạch cầu cấp tính, đặc
biệt là ở trẻ em. Chủng sinh tổng hợp daunomycin là Str.peucetius var.caesius
có đặc điểm: Khuẩn ty khí sinh phát triển yếu, có màu trắng hoặc đỏ, khuẩn ty
cơ chất có màu vàng chanh, vàng da cam hoặc nâu đỏ, khi nuôi cấy trên môi
trường hữu cơ hình thành sắc tố màu đỏ sáng. Khi đột biến bằng tác nhân Nnitroso-Nmetylurethan tạo ra được biến chủng caesius có khuẩn ty khí sinh
phát triển mạnh, màu xanh xám, khuẩn ty cơ chất màu đỏ sẫm, sắc tố hoà tan
từ màu vàng đến cam hay tím. Biến chủng này có khả năng sinh tổng hợp một
hợp chất mới có cấu trúc gần giống daunomycin đó là adriamycin.
Adriamycin là một kháng sinh nội bào quá trình chiết tách bao gồm chiết
bằng dung môi, sắc ký cột, cellulose và kết tinh dưới dạng Hydroclorid.
Adriamycin hydroclorid tan trong nước, ethanol không tan trong các dung môi
hữu cơ không phân cực, dung dịch adriamycin có màu da cam à pH acid, da
cam đỏ ở pH trung tính, tím xanh ở pH > 9. Khi thuỷ phân adriamycin bằng
acid yếu thì thu được aglycon là adriamycinon là một đường amin. Những
nghiên cứu hoá trị liệu cho thấy adriamycinon kìm hãm sự phát triển của ung

thư biểu mô, có khả năng ức chê mạnh sacom và ung thư tuỷ ác tính oberlinggluerin-gluerin. Chỉ số điều trị adriamycin có nhiều triển vọng hơn cả
daunomycin.


PHẦN III

THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1. Nguyên liệu và trang thiết bị
3.1.1. Chủng gốc vi sinh vật và nguyên liệu
*. Giống xạ khuẩn gốc: Streptomyces 9.25 do phòng thí nghiệm vi sinh
kháng sinh bộ môn Công Nghiệp Dược trường ĐH Dược Hà Nội cung cấp.
*. Chủng vi sinh vật kiểm định:
- Escherichia coli (EC) A TCC25922
- Proteus mirabilis (pro) B V 108
- Pseudomonas aeruginosa (pseu) VM201
- Shigella ũexneri (shi) DTI 12
- Salmonella typhi (Typhi) DT220
- Bacillus cereus (BC) A TCC9946
- Bacillus pumilus (Bp) A TCC10241
- Bacillus subtilis (Bs) A TCC10241
- Sarcima lutea (SL) A TCC9341
- Staphynococus aureus (sta) A TCC1228
- Candida albicans Cl DV216
- Aspergillus niger DIPC109
*. Các môi trường đã sử dụng:
Môi trường 1 (MT 1): Tinh bột 20g; KNO3 l,0g; K2 HP0

4

0,5g;

MgS04 .7H20 0,5g; NaCl 0,5g; FeS0 4 .6H20 0,lg; thạch 18,0g;
nước cất vừa đủ lOOOml, pH : 6 ,8 - 7,2, tiệt trùng ở 120°c, thời gian
30 phút.

13


Môi trường 3 (MT 3): Lactose 30,Og; NH4 NO3 2,0g; cao ngô
5,0g; K2 HP0 4 l,0g; MgS04 .7H20 0,2 g; Na2 S0 4 0,5g; thạchl8,0g,
nước cất vừa đủ 1000ml, pH:

6 ,8

- 7,2 tiệt trùng 120°c, thời gian

30 phút.
Môi trường 4 (MT 4): Glucose 20g; cao ngô 5,0g; K2 HP0 4 0,5g;
MgS04 .7H20 0,5g; NH4 NO3 2,0g; CaC03 4,0g; thạch 18,0g, nước
cất vừa đủ 1000ml; pH: 6 ,8-7,2, tiệt trùng ở 120°c, thời gian 30
phút.
Môi trường 5 (MT 5): Bột ngô 20g; bột đậu tương 10,Og; NaCl
lg; CaC0 3 2,0g; K2 HP0 4 l,Og; CoC12 .7H20 0.002g; thạchl8,0g,
nước cất vừa đủ 1000ml; pH: 6 ,8-7,2 tiệt trùng ở 120°c, thời gian
30 phút.
Môi trường

6

(MT 6 ): Bột đậu tương 15,0g; tinh bột khoai tây

20,Og; (NH4 )2 S0 4 2,0g, cao nấm men 5,0g; CaC0 3 4,0g;
CoC12 .7H20 0.02g, thạch 18,0g, nước cất vừa đủ 1000ml;
pH: 6 ,8-7,2 tiệt trùng ở 120°c, thời gian 30 phút.
Môi trường 7 (MT 7):

Saccarose 30,Og; bột đậu tương lOg;

(NH4 )2 S0 4 2,0g ; CaC0 3 2,0g ; NaCl l,Og; CoC12 .7H20 0,002g;
thạch 18,Og; nước vừa đủ 1000ml; pH

6 ,8

— 7,2. Tiệt trùng ở 120°

c, thời gian 30 phút.
. Môi trường lên men chìm:
Môi trường l ũ (MT 1’) : Tinh bột 20g; KNO3 1,0g; K2 HP0 4 0,5g;
MgS04 .7H20 0,5 g; NaCl 0,5g; FeS0 4 .7H20 0,0 lg; nước cất vừa
đủ 1000ml; pH: 6 ,8-7,2 tiệt trùng ở 120°c, thời gian 30 phút.
Môi trường 2D (MT 2'): Tinh bột 20g; NaN0 3 2,()g; K2 HP0 4 1,0g;
KC1 0,5g; MgS04 .7H20 0,5 g; nước cất vừa đủ 1000ml; pH: 6 ,8 7,2 tiệt trùng ở 120°c, thòi gian 30 phút.


Môi trường 3d (MT 3’): Tinh bột 20g; NaNO3 2,0g; MgS04 .7H20
0,5 g; K2 HP0 4 l,0g; KC1 0,5g; Cao nấm men 5,0g; nước cất vừa đủ
1000ml; pH: 6 ,8-7,2 tiệt trùng ở 120°c, thời gian 30 phút.
Môi trường khác:
Môi trường thạch thường: pepton 5,0g; cao thịt 3,0g; NaCl 5,0g;

thạch 18g; nước cất vừa đủ 1000ml; pH: 6 ,8-7,2 tiệt trùng ở 118°c,
thời gian 30 phút.
Môi trường canh thang: pepton 5,0g; cao thịt 3,0g; NaCl 5,0g;
nước cất vừa đủ 1000ml; pH: 6 ,8-7,2 tiệt trùng ở 118°c, thòi gian
30 phút.
Môi trường Sabrouraud glucose 20,Og; pepton 10,Og; thạch 18,0g;
nước cất vừa đủ 1000ml; pH 6,0, tiệt trùng ò 0,8 atm, thời gian 30
phút.
Môi trường phân loại xạ khuẩn.
ISP1: pepton 5,0g; cao nấm men3,0g; nước cất vừa đủ 1000ml;
tiệt trùng ở 120°c, thời gian 30 phút.
ISP2: Cao nấm men 4,0g; dịch chiết Malt 10,Og; glucose 4,0g;
nước cất vừa đủ 1000ml; pH 7,3; thạch 20; tiệt trùng 120°c thời
gian 30 phút.
ISP 3: Yến mạch 20,Og; Dung dịch muối vi lượng l,Og; Thạch
18,Og; Nước cất vđ 1000ml; pH: 7,3. Tiệt trùng ở 120°c trong thời
gian 30 phút.
ISP4: dung dịch I: tinh bột 10,Og; nước cất vừa đủ 500ml; dung
dịch II: K2 HP0 4 l,Og; MgS04 .7H20 1,0 g; (NH4 )2 S0 4 2,0g, CaC0 3
2,0g; muối vi lượng 1,0 ml; nước cất vừa đủ 500ml pH: 7,0-7,4.
Trộn dung dịch I, II thêm 20,0g thạch tiệt trùng ở nhiệt độ 120 °c
thời gian 30phút.


ISP5: L-aspragime l,Og; glycerin 10,Og; KH2 P0 4 l,0g; dung dich
muối vi lượng lml: thạch 20,Og; nước cất vừa đủ 1000ml; pH: 7,0
— 7,4 tiệt trùng ở 120°c, thòi gian 30 phút.
ISP 6 : Pepton 20,Og; sắt amonicitrat 0,5g; K2 HP0 4 l,Og; Na2 S2 0 3
0,08g; thạch 18,0g; Cao nấm men l,0g; nước cất vừa đủ 1000ml,
pH:7,0-7,2 tiệt trùng ở 120°c, thời gian 30phút.

ISP7: glycerin 15,0g; L-tyrosin 0,5g; L-aspargin l,Og; ; K2 HP0 4
0,08g; MgS04 .7H2 0; NaCl 0,5g; FeS04 .7H20 0,01g; Muối vi
lượng 0,lml; thạch 20g; nước cất vừa đủ 1000ml; pH:7,0-7,2 tiệt
trùng ở
ISP9:

1 2 0

°c, thời gian 30phút.

(NH4 )S0 4

2,64g;

KH2 P0 4

2,38g;

K2 HP0 4

5,65g;

MgS04 .7H20 l,Og; Môi trường MTB l,Oml; nước cất vừa đủ
1000ml; pH: 7,0-7,2; tiệt trùng ở 120°c, thời gian 30phút.
Trong đó môi trường B: CuS04 .5H20 0,064g; FeS04 .7H20 0,1 lg;
MgCl2 .4H20 0,079g; ZnS04. 7H20 0,lg; nước cất vừa đủlOOml.
*. Dung dịch muối vi lượng: FeS04 .7H20 0,lg; MgCl2 .4H20 0,lg
ZnS04. 7H20 0,115g; Nước cất vừa đủ 10ml.
*. Các nguồn đường gồm các dung dịch đường 10% của các đường
sau:

+ D — xylose
+ D — manitol
+ D — fructose

+ Rhamnose
+ Raffinose
+ Saccarose

+ Arabinose
+ Inositol
+ glucose

Các dung dịch này được khử trùng bằng phương pháp tyndal.
3.1.2. Các trang thiết bị.
- Tủ sinh học

- Cân phân tích

- Đèn tử ngoại

- Cân kỹ thuật

- Máy li tâm

- pH mét

- Tủ ấm

- Nồi hấp áp lực

16


- Máy lắc

- Kính hiển vi điện tử.

3.1.3. Các dung môi hoá chất được sử dụng
- Ethylacetat

(d = 0,80 - 0,81

- Buthylacetat

(d = 0,88 - 0,89 t°s = 117 - 118°C)

- n — buthanol (d = 0,81
- Methanol

(d = 0,79

- Cloroform

(d = 1,47 - 1,48

- Diclomethan

t°s = 77°C)
t°3 = 116 - 118°C)
t°s = 64,6°C)

t°s = 60 - 62°C)

(d = 1,32

t°s = 40°C)

Một số dung môi đã sử dụng khác: Aceton, Amonihydroxyd, Ethanol...
- Bản mỏng silicagel 60F254 Merck.
3.2.

Phương pháp thực nghiệm

3.2.1. Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuyếch tán
*. Nguyên tắc: Mẫu thử được đặt lên lófp thạch dinh dưỡng đã cấy vi sinh
vật kiểm định. Kháng sinh từ mẫu thử khuyếch tán vào môi trường thạch sẽ ức
chế sự phát triển của các vi sinh vật tạo thành vòng vô khuẩn. Đo đường kính
vòng vô khuẩn. Hoạt tính kháng sinh tỷ lệ vói đường kính vòng vô khuẩn.
*. Tiến hành:
Chuẩn bị môi trường kiểm định: vi sinh vật kiểm định trước khi thử được cấy
vào môi trường canh thang trước 18 — 24 h đối với vi khuẩn (ủ ở 37°C) và
môi trường Sabouraud lỏng trước 18 — 24 h ( đối với vi nấm ở 30°C), tạo
thành nhũ dịch vi sinh vật kiểm định có nồng độ

1 0

7-

1 0 8

tế bào trên lml, cho

vào môi trường thạch thường (đã được tiệt trùng ở 118°c, thời gian 30phút) ở
45-50°C với tỷ lệ nhũ dịch: Vthạchthường= 1:40 (vói vi khuẩn) vói môi trường
Sabouraud đặc (với vi nấm) đổ ra hộp petri (20ml/hộp).

Đặt mẫu thử:

17


Có 3 cách thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuy ếch tán:
phương pháp giếng thạch, phương pháp khoanh giấy tẩm kháng sinh, phương
pháp khối thạch.
+ Phương pháp khối thạch: Mẫu thử là các khối thạch chứa kháng sinh
(0 = 6 mm), đặt trực tiếp lên môi trường dinh dưỡng đã cấy vi sinh vật kiểm
định.
+ Phương pháp khoanh giấy tẩm kháng sinh: Tẩm kháng sinh cần thử lên
khoanh giấy lọc trong vòng 3-5 phút, sấy nhẹ ( t°<50°c ), làm 3 lần như vậy.
Dùng panh vô trùng, đặt khoanh giấy lọc đã tẩm kháng sinh lên đĩa thạch đã
cấy vi sinh vật kiểm định.
+ Phương pháp giếng thạch: dùng bộ dụng cụ đục lỗ thạch (0= 6 mm)
đục lỗ trên bề mặt thạch. Dùng pipet vô trùng nhỏ vào lỗ thạch 0,02 - 0,05 ml
dịch cần thử.
Sau khi đưa mẫu thử vào các đĩa petri được đưa vào tủ ấm (37°c đối với
vi khuẩn và 30°c đối với vi nấm), thời gian từ 18-24h, để vi sinh vật kiểm định
phát triển. Đọc kết quả bằng cách đo đường kính của vòng vô khuẩn với dụng
cụ là thước kẹp panmer vói độ chính xác 0,02mm. Kết quả thực nghiệm được
xử lý theo toán thống kê.

n

Ỳ(D,-Dý
D=

/=1

/=1

n

í

n-\

Dị: Đường kính vòng vô khuẩn.
D : Đường kính vòng vô khuẩn trung bình,
n: Số thí nghiệm song song.
S: Độ lệch chuẩn (độ lệch thực nghiệm có hiệu chỉnh).
3.2.2. Phương pháp cải tạo giống


*. Phương pháp sàng lọc ngẫu nhiên
Dùng que cấy vô trùng lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 9.25 ở
6

ngày tuổi vào ống nghiệm chứa

1 0

ml nước muối đẳng trương vô trùng, lắc

đều để bào tử phân tán trong nước, ta được hỗn dịch bào tử xạ khuẩn có độ
pha loãng 10' 1 (quy ước). Lấy lml hỗn dịch bào tử xạ khuẩn có độ pha loãng
1 0

' thêm vào ống nghiệm chứa 9 ml nước muối đẳng trương vô trùng được

hỗn dịch có nồng độ 10‘2. Tương tự ta pha được các nồng độ 10' 5 — 10'6. Nhỏ
0,05ml hỗn dịch bào tử có độ pha loãng 10' 5 — 10‘ 6 lên bề mặt MT 2 trong
hộp petri (môi trường đã được chuẩn bị từ trước). Dùng que trang vô trùng dàn
đều hỗn dịch bào tử lên mặt thạch, để ở tủ ấm 30°c trong

6

ngày. Sau

6

ngày

nuôi cấy bào tử phát triển thành các khuẩn lạc riêng rẽ.
Từ các khuẩn lạc riêng rẽ, ta cấy vạch vào 1 hộp petri môi trường và 1
ống môi trường thạch nghiêng tương ứng đánh số tiến hành với 32 khuẩn lạc,
để hộp petri vào ống nghiệm này trong tủ ấm 30°c, cho xạ khuẩn phát triển.
Sau 6 ngày tiến hành thử hoạt tính của từng chủng đã được đánh số riêng
rẽ bằng phương pháp khối thạch. Từ đó ta chọn ra 3 — 5 biến chủng tốt nhất
để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
*. Phương pháp đột biến nhân tạo
Lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 9.25 cho vào 10ml nước
muối đẳng trương vô trùng tạo hỗn dịch bào tử có độ pha loãng

1 0 '1

(quy ước).

Dùng pipet vô trùng, lấy 9ml hỗn họp dịch 10'1, đưa sang hộp petri vô trùng
(O = 80mm), lml hỗn dịch bào tử còn lại được pha thành hỗn dịch có độ pha
loãng

1 0 '6

làm mẫu đối chứng.

Hỗn dịch 10' 1 chứa trong hộp petri được mang chiếu ánh sáng u v có các
thông số sau: X = 254nm, khoảng cách chiếu 1 = 60cm, thời gian chiếu là
5phút ( sau hai phút lắc đều và chiếu tiếp). Hỗn dịch bào tử sau khi được chiếu
tia u v để trong tối 2 h, sau đó pha thành hỗn dịch bào tử có độ pha loãng 1 0 '4,
10'5. Hút chính xác

0 ,1

ml hỗn hợp dịch bào tử ở nồng độ pha loãng trên nhỏ

19