Phân lập và tuyển chọn chủng nấm men sinh tổng hợp beta carotene

i •■:■■;- : '■' :■■■
■■
;.■■: ■
®MlMMSẩềÉẼ-ằỆMềếỂỂỆẾÊếế. 'ÂMMỆẩỀìÊlễêẩềềÊềiãấẵễĩỂẵMâ1- & M '1

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
%
J>A

#
Ị%rỊ%*Ị% rj%rỊ* rỊ%

LÊ XUÂN HOÀN
n

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM
MEN SINH TỔNG HỢP p - CAROTENE
(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 1998-2003)

Giáo viên hướng dẫn
Nơi thực hiện
Thời gian

: TS. Vũ Nguyên Thành
GVC. Nguyễn Lệ Phi
I
: Viện Công nghiệp thực phẩm
24/2 - 24/5/03
OA /7;
/ o / 3 .M

^ ỵ y s ỵ iỈỊđ ìc i

Hà Nội - 6/2003
— illmmMÊtgmmmm■—

tỉ2(d
iw

* m x (m«Bsssar '

16


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với:
TS. Vũ Nguyên Thành
GVC. Nguyễn Lệ Phi
Là những thầy cô đã tận tình chỉ bảo, trực tiếp hướng dẫn tôi làm
khoá luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ kỹ thuật viên bộ môn Vi
sinh - Viện Công nghiệp Thực phẩm, bộ môn Vi sinh - Trường Đại học
Dược Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi cũng xin cảm ơn PGS.TS. Trần Tử An, DS. Lê Hồng Dũng
người đã có những đóng góp quý báu cho tôi trong quá trình thực hiện
đề tài này.
Tôi xin cảm ơn tất cả người thân, bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi
trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Hà Nội, tháng 5 năm 2003
Sinh viên
Lê Xuân Hoành

MỤC LỤC
Đặt vấn đ ề..........................................................................................................1
Phần I: Tổng quan........................................................................................... 2
1. Khái quát về Carotenoid............................................................................... 2
1.1. Khái niệm................................................:................................................ 2
1.2. Cấu trúc....................................................................................................... 2
1.3. Trạng thái tự nhiên, tính chất lý hoá........................................................... 5
1.4. Tác dụng sinh học....................................................................................... 5
1.5. Tầm quan trọng........................................................................................... 8
2. Đại cương vê nấm men................................................................................. 9
2.1. Khái niệm....................................................................................................9
2.2. Dinh dưỡng và các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng của nấm men..... 9
2.3. Sinh sản của nấm men............................................................................... 10
2.4. Úng dụng của nấm men............................................................................. 10
3. Sinh tổng hợp ị3- carotene.............................................................................11
Phần II: Thực nghiệm và kết quả................................................................. 14
2.1. Nguyên vật liệu, thiết b ị......................... ................................................. 14
2.2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 15
2.2.1. Phân lập nấm men từ lá cây.................................................................... 15
2.2.2. Tuyển chọn sơ bộ nấm men cho màu đậm nhất..................................... 16
2.2.3. Tuyển chọn nấm men tổng hợp tốt Carotenoid trên các môi trường có
nguồn Nitơ, Cacbon khác nhau........................................................................ 16
2.2.4. Xác định thành phần Carotenoid............................................................17
2.3. Tiến hành và kết quả................................................................................ 18
2.3.1. Phân lập và thuần khiết.......................................................................... 18
2.3.2. Sơ bộ tuyển chọn nấm men tổng hợp nhiều Carotenoid........................ 19
2.3.3. Xác định sự ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng Nitơ.............................. 19
2.3.4. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng Cacbon............................................22

2.3.5. Tách chiết Carotenoid từ nấm m en...... i................................................ 24
2.3.6. Định lượng Carotenoid toàn phần bằng đo độ hấp thụ UV-VIS........ 25
2.3.7. Xác định thành phần Carotenoid và p - Carotene bằng HPLC..............26
Phần n i: Kết luận và đề xuất.......................................................................33
3.1. Kết luận.................................................................................................... 33
3.2. Đề xuất......................................................................................................33
Phụ lục........................................................... ................................................. 34
Tài liệu tham khảo....................................... ................................................. 36


ĐẬT VẤN ĐỀ
p - carotene, một dạng thực phẩm thuốc với vai trò là tiền vitamin A cung
cấp khoảng 80% nhu cầu vitamin A của con người. Tuy nhiên quá trình chế
biến của người dân đã làm mất đi một lượng lớn họfp chất này ưong thức ăn.
Vi thế bệnh thiếu vitamin A vẫn còn rất phổ biến ở Việt Nam mặc dù chúng
ta đã có chương trình quốc gia phòng chống thiếu Vitamin A được triển khai
rộng rãi vài năm gần đây [ 12].
Mặt khác cùng với Vitamin E, Vitamin c và Selen hữu cơ, [3 - Carotene
còn được chứng minh là chất chống oxy hoá (antioxidant) quan trọng và đang
được sử dụng rộng rãi trong y học hiện đại để điều trị các bệnh về lão hoá, tim
mạch, suy giảm miễn dịch, ung thư...Tuy nhiên, việc sản xuất các chế phẩm
chứa hợp chất này thay thế thuốc nhập ngoại ở Việt Nam vẫn còn nhiều khó
khăn.
Đe góp phần tìm kiếm nguồn cung cấp p - Carotene mới, đáp ứng một
phần nhu cầu nguyên liệu trong các lĩnh vực công nghiệp thực phẩm, dược
phẩm và dinh dưỡng, chúng tôi tiến hành đề tài: “Phân lập và tuyển chọn
nấm men sinh tổng hợp p - Carotene” với các mục tiêu:
• Phân lập nấm men sinh Carotenoid
• Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng tới sinh tổng hợp
Carotenoid

• Thiết lập quy trình tách chiết Carotenoid từ nấm men
• Xác định các thành phần Carotenoid và Ị3 - Carotene

1


PHẦN I . TỎNG QUAN
1. Khái quát về Carotenoid:
1.1. Khái niệm:
Carotenoid là hợp nhất màu lớn nhất, quan trọng và phân bố rộng trong tự
nhiên. Nó chứa nhiều trong rau, củ, quả và tạo màu vàng, da cam, đỏ cho
các loại thực phẩm này. Độ đậm màu của thực phẩm phụ thuộc loại
carotenoid chứa trong đó. Mặc dù có mặt trong lá cây nhưng màu của chất
diệp lục đã che khuất phần lớn màu của carotenoid. Carotenoid được tìm thấy
ở tảo (Dunaniella) , vi khuẩn (Agrobacterium), nấm mốc (Blakeslea trispora),
và đặc biêt có nhiều ở một số loại nấm men (Rhodoturola, Phaffia)
1.2. Cấu trúc của Carotenoỉd
Cấu trúc cơ bản của các Carotenoid là một mạch thẳng, gồm 40 cacbon
được cấu thành từ 8 đon vị isoprenoid chứa 5-cacbon liên kết nhau, đối xứng
qua trung tâm. Điểm nổi bật và đặc biệt trong cấu trúc là hệ thống nối đôi liên
hợp, xen kẽ nối đơn, nối đôi tạo chuỗi polyen. Chính cấu trúc này đã tạo nên
các đặc tính quan trọng như: dễ bị oxi hoá , đồng phân hoá, hấp thụ ánh sáng
(đặc biệt là ánh sáng tử ngoại) và thể hiện màu của hợp chất ( màu càng đậm
khi hệ thống dây nối đôi càng dài). [14] Khung cấu trúc cơ bản:

Cấu trúc cơ bản này có thể biến đổi theo các cách: Cộng hợp H2 hoặc
dehydro hóa, hydroxyl hoá, cacboxyl hoá, di chuyển nối đôi, đóng vòng, cắt
thành nhiều chuỗi nhỏ...Tạo nên một lượng lớn các cấu trúc khác nhau. Kết

2

quả là có khoảng 600 hợp chất khác nhau, đã được tách chiết và xác định đặc
tính. Một số cấu trúc chính được trình bày dưới đây [8,14]:

Phytofluene

^-Carotene

Lycopene


Zeaxanthin

Trong nhóm này a, Y, P-carotene và Cryptoxanthin là những tiền chất
Vitamin A quan trọng, cho cơ thể người và động vật. Một phân tử Y, acarotene và Cryptoxanthin khi vào cơ thể động vật thuỷ phân cho một phân tử
Vitamin A, |3-carotene thuỷ phân cho hai phân tử Vitamin A. Chính vì vậy
ị3-carotene được đánh giá là chất có hoạt tính sinh học mạnh và quan trọng
nhất của carotenoid.

4


1.3. Trạng thái tự nhiên, tính chất lý hóa
Trang thải tư nhierv. trong thực vật, động vật P-Carotene có thể ở dạng
tinh thể, chất rắn vô định hình, tan trong dung môi dầu béo thành dung dịch,
phân tán keo hoặc tạo phức với Protein trong môi trường nước.
Tính chất vật lý : ị3-carotene tạo tinh thể hình kim, màu nâu đỏ tan trong
dầu và các dung môi hữu cơ như aceton, alcohol, ethyl-ether, tetrahydroíuran,
dầu ether và hexan, không tan trong nước[14 ].

Nhờ có hệ thống dây nối đôi liên hợp dài mà p-carotene có ái lực mạnh với
oxy đơn bội (' 0 2 ), dễ bị oxy hoá, đồng phân hoá trong điều kiện tiếp xúc với
không khí, ánh sáng, nhiệt độ. Tính chất của Carotenoid được khái quát trong
sơ đồ

1.4. Tác dụng sinh học
Các Carotenoid tự nhiên trong cơ thể sinh vật do chúng tự tổng họp nhằm
mục đích bảo vệ, chống lại các tác động bất lợi của nội môi, ngoại môi. Nội
môi có thể là các gốc tự do, ngoại môi như là tia tử ngoại của ánh sáng mặt
trời.

5


Một số Carotenoid là tiền Vitamin A ở động vật có vú, chúng giữ chức
năng sinh học quan trọng trong quá trình phát triển cá thể như : phát triển
thính giác, vị giác, tăng đáp ứng miễn dịch, tăng sự sinh sản và tạo tinh trùng.
Tác động chủ yếu của carotenoid không chỉ là chống oxy hoá mà còn trao đổi
thông tin từ tế bào đến tế bào, tác động tới cấu trúc và chức năng của màng tế
bào, tăng cường sự đáp ứng miễn dịch của cơ thể. Vì vậy mà carotenoid được
xác định là chất điều hoà dinh dưỡng [14].
Đặc biệt P-carotene không độc với cơ thể khi sử dụng liều cao và kéo dài.
Ngược lại dùng vitamin A liều cao và kéo dài sẽ gây rối loạn thị giác, rối loạn
chức năng gan. Nguyên nhân là do cơ thể có khả năng chuyển hoá 1/6 lượng
ị3-carotene thành vitamin A khi có nhu cầu. [7]

2

Vitamin A

Theo một số tài liệu gần đây thì căn nguyên của các bệnh ung thư, tim
mạch, sự thoái hoá, lão hóa là do các gốc tự do được sinh ra theo những cơ
chế khác nhau trong cơ thể. Các gốc tự do này được giải phóng trong quá
trình chuyển hoá, tích tụ và tấn công liên tục vào vật chất di truyền (ADN,
ARN), màng tế bào, các tế bào miễn dịch làm phát sinh bệnh và lão hóa.
Cơ chế chống oxy hoả : [11,8,1].

6


Trong cơ thể, carotenoid nói chung và Ị3 -carotene nói riêng có khả năng
chống lại các gốc tự do, dập tắt chuỗi phản ứng dây truyền. Nhờ có hệ thống
dây nối đôi liên hợp, nó vô hiệu hóa các phân tử oxy bị kích hoạt(1Ơ2). Một
phân tử ị3-carotene có thể hấp thụ năng lượng của hàng ngàn phân tử ' 0 2 rất
nguy hiểm rồi giải phóng năng lượng ấy dưới dạng nhiệt vô hại. Người ta gọi
đó là cơ chế giải tỏa năng lượng.
!Ơ2 + p - carotene —» p - carotene* +3Ơ2
(3 - carotene* —» |3 - carotene + nhiệt vô hại
Năm 1994, Mayne và cộng sự đã khảo sát trên 413 đối tượng cả nam và nữ
không hút thuốc nhận thấy ăn nhiều rau quả chứa P-carotene và vitamin E đã
có tác dụng phối họp làm giảm nguy cơ ung thư phổi cho cả nam và nữ.
Bendich và cộng sự đã nghiên cứu trên người và động vật thử nghiệm nhận
thấy p-carotene và carotenoid đều có khả năng làm tăng đáp ứng miễn dịch.
Khi sử dụng liều cao P-carotene trên bệnh nhân nhiễm HIV đã làm tăng tỉ lệ
tế bào CD4 : CD8, tác động kìm hãm sự phát triển của virus. [19]
Tác dụng sinh học của P-carotene được tóm tắt theo sơ đồ

7

1.5. Tầm quan trọng
Nhu cầu hàng ngày về vitamin A đối với người lớn khoảng 1 - 2,5 mg và ị3carotene là 2 - 5 mg. Nhu cầu với trẻ em còn cao hơn do khả năng nhạy cảm
với việc thiếu vitamin A cao hon người lớn . Sự thiếu hụt Vitamin A sẽ dẫn
đến những hậu quả nghiêm trọng tới sức khoẻ của con người.[ 1,8].
Đối với con người vitamin A được cung cấp từ hai nguồn chính là từ các
sản phẩm động vật như: gan, cá, thịt, sữa và các sản phẩm từ sữa. Những
nguồn này thường cung cấp trực tiếp vitamin A cho cơ thể. Tuy vậy những
sản phẩm này có hạn chế là giá thành cao. Khoảng 60% Vitamin A trong
thức ăn được cung cấp dưới dạng tiền vitamin A trong thực vật. Ở các nước
đang phát triển, tỷ lệ này là 82% với lý do dễ kiếm sẵn có quanh năm và giá
rẻ [14].
Áp lực công việc cùng YỚi vấn đề ô nhiễm môi trường ngày càng xuất hiện
thêm nhiều bệnh nan y như ung thư, bệnh tim mạch, thoái hoá làm tăng nhu
cầu sử dụng |3-carotene ở dạng dược chất tinh khiết. Tại Việt Nam mới chỉ có
chế phẩm Vinaga làm từ dầu gấc chứa ị3-carotene song chưa được mọi người
sử dụng rộng rãi. Chế phẩm Belaf, Cigelton của Hàn Quốc chứa 30 mg Ị3carotene và một số thành phần chống oxy hoá khác đang được ưa dùng hiện
nay ừong chống lão hoá, nâng cao sức đề kháng... Điều này đòi hỏi ngành
dược nước ta cần có sự quan tâm hon nữa để nghiên cứu và sản xuất được
những sản phẩm đáp ứng nhu cầu của người dân ngoài chế phẩm Vinaga. [7].
Trên thị trường quốc tế hiện nay có khoảng 25 biệt dược chứa ị3-carotene
[16] chuyên luận P-carotene mới chỉ có trong ƯSP24-2000, UP 97, BP98.

8


Dược điển Việt Nam III -2002 chưa đề cập tới hợp chất này ở dạng tinh khiết,
mới chỉ có chuyên luận về dầu gấc có chứa p-carotene.[23,15]
II -Đại cương về nấm men
2.1- khái niệm
Nấm men là tên chung chỉ nhóm nấm có cấu tạo đơn bào, sinh sản chủ

yếu bằng cách nảy chồi, một số theo kiểu phân cắt và bào tử bắn.
Chúng có dạng hình cầu, hình bầu dục, hình elip, hình quả dưa, hình chóp,
kích thước tế bào khoảng 2 - 15|um [6]. Nấm men thuộc giới Eucaryota, trong
đó thành tế bào có chứa mannan, glucan giúp nấm men chống chịu tốt với
điều kiện ngoại cảnh. Nhìn chung nấm men thích nghi với môi trường có
lượng đường cao và phân bố rộng rãi trong tự nhiên như ở lá cây, đất
2.2 - Dinh dưỡng và các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng của
nấm men
Nấm men thuộc nhóm vi sinh vật dị dường, rất dễ phát triển trong môi
trường nuôi cấy mà không có đòi hỏi khắt khe về dinh dưỡng như vi khuẩn.
Nguồn dinh dưỡng cacbon chủ yếu của nấm men là c ác loại hydratcacbon
(monosaccarit, oligosaccarit, polysaccarit), các dẫn xuất hydratcacbon, các
loại rượu, acid hữu cơ, acid amin, protein, lipid....[3; 4]
Nguồn dinh dưỡng nitơ bao gồm cả nguồn nitơ vô cơ và nitơ hữu cơ như
muối amoni, muối nitrat, urê...Vì thế thành phần môi trường nuôi cấy cần có
đủ thức ăn cacbon, nitơ, các chất khoáng, vi lượng và các chất sinh trưởng.
Trong quá trình sống tế bào nấm men tiến hành trao đổi chất không ngừng
với môi trường xung quanh. Tuy có kích thước nhỏ nhưng vì hấp thụ các chất
dinh dưỡng và thải các sản phẩm trao đổi chất qua toàn bộ bề mặt theo cơ chế
khuyếch tán, thẩm thấu, hấp phụ cho nên cường độ trao đổi chất là rất lớn [2 ].

9


Các yếu tố như nhiệt độ, độ pH nguồn oxy của môi trường cũng ảnh
hưởng trực tiếp đến quá trình phát triển của nấm men. Điều này sẽ gây ảnh
hưởng tới quá trình tăng sinh khối cũng như các sản phẩm được tạo ra từ quá
trình trao đổi chất [3,6].
2.3. Sinh sản của nấm men
Nảy chồi : là hình thức sinh sản đơn giản và phổ biến nhất của nấm men.

Te bào mẹ nảy sinh ra một chồi nhỏ rồi lớn dần lên sau đó tách ra , đôi khi tế
bào con có thể vẫn dính trên tế bào mẹ và lại tiếp tục nảy chồi làm cho nấm
men có dạng cây xương rồng [6].
Phân c ắ t: là hình thức sinh sản của Schizosaccharrromyces. Te bào mẹ dài
ra ở hai đầu, ở giữa hình thành vách ngăn chia tế bào ra làm hai phần tương
đương nhau mỗi tế bào có một nhân. Bào tử bắn thường gặp ở chi
Sporobolomyces, Bullera, Aessosporon. Bào tử bắn là loại bào tử sau khi
được hình thành nhờ năng lượng của té bào bắn mạnh về phía đối diện. Loại
bào tử này có hình thận sinh ra trên một cuống nhỏ mọc ở các tế bào dinh
dưỡng hình trứng.
Sinh sản hữu tính: do hai tế bào nấm men kết hợp với nhau hình thành họp
tử. Hợp tử phân chia thành các tế bào nằm trong nang, nang chín được phát
tán ra ngoài. Nếu hai tế bào nấm men có hình thái, kích thước giống nhau tiếp
hợp với nhau được gọi là tiếp hợp đẳng giao, nếu hai tế bào có hinh thái, kích
thước khác nhau được gọi là tiếp họp dị giao. [ 10]
2.4. ứng dụng của nấm men
2.4.1Những ứng dụng chung
Đã từ lâu, con người đã biết sử dụng nấm men và các sản phẩm của nó
trong công nghiệp thực phẩm..Điển hình là Saccharromyces cerevisiae được
sử dụng trong việc sản xuất bánh mỳ, bia, rượu, chế glycerol hoặc men

10


invertaza. S.fragilis do khả năng lên men lactose nên đóng vai trò quan trọng
trong công việc sản xuất sữa và các sản phẩm từ sữa [9].
Sử dụng nấm men sản xuất các acid amin (đặc biệt là các acid amin không
thay thế), protein, các vitamin ngày càng có ý nghĩa. Hiện nay đã có “Nấm
men thực phẩm ” được sử dụng làm chất dinh dưỡng cho con người, (đã được
dùng nhiều trong các chiến dịch chống đói ở Ấn Độ, Angieri)

Ngoài ra nấm men còn được sử dụng nhiều trong chăn nuôi, sử dụng các
phụ phẩm của các ngành công nghiệp khác (rỉ đường, dịch thuỷ phân gỗ,
parafin ....) để làm chất dinh dưỡng cho vật nuôi, tăng ữọng và nâng cao chất
lượng thịt [6].
2.4.2 Những ứng dụng trong lĩnh vực Y- Dược
Rất nhiều loại nấm men có khả năng siêu tổng họp ngoại bào tức là sản
sinh ra một lượng enzym ngoại bào vượt xa so với nhu cầu sử dụng trong trao
đổi chất của chúng. Chính vì vậy những loài này là đối tượng của công nghiệp
sản xuất các chế phẩm enzym như: Amylase, glucoamylase, lipase : dùng làm
thuốc hỗ trợ tiêu hoá [3]
Nhiều nước trên thế giới đã và đang sử dụng các chế phẩm đông khô của
nấm men Saccharomyces boulardi như Bioflor, Ultra - Levue để điều trị một
số trường hợp.[6]
- ỉa chảy nhiễm trùng cấp tính do vi khuẩn, vi rút, nấm
- Điều trị và dự phòng ỉa chảy do sử dụng kháng sinh
- Điều trị hội chứng kích thích ruột (thường gọi là viêm đại tràng cơ năng).
^ 3. Sinh tổng hợp p-carotene
|3-carotene có thể được tổng hợp từ nhiều nguồn khác nhau như: Thực vật,
tảo, vi khuẩn, nấm mốc, nấm men trong đó nguồn sinh tổng họp Ị3-carotene
được nghiên cứu nhiều nhất là từ nấm mốc và nấm men. Bởi những ưu việt

11


trong công nghệ vi sinh. Nấm mốc, điển hình là Blakeslea tripora hiệu quả,
khả năng tổng hợp (3-carotene cao nhưng điều kiện nuôi cấy, tách chiết phức
tạp nên ng ười ta chú ý tới nấm men nhiều hơn do có những ưu điểm như:
cấu tạo đơn bào, ổn định và rất dễ phát triển trên các môi trường nuôi cấy.
Trên thế giới nhiều nghiên cứu về nấm men sinh tổng hợp các hợp
carrotcarotennoid đã được ứng dụng vào sản xuất, tạo nguồn nguyên liệu cho

thực phẩm và sản xuất thuốc. Một số nấm men thuộc chi Rhodotorula
Phaffia, đã được công bố như ở bảng 1 [18, 23, 22]
Bảng 1. Các chủng nấm men sinh tổng hợp ị3-carotene đã được công bố

Tổng lượng
Carotenoid
|xg/ g sinh khối khô
40
100
70
25
75
100
120
10

Chủng
Rhodotorula araucariae CBS 6031
Rhodotorula aurantiaca CBS 317
Rhodotorula glutỉnỉs CBS20
Rhodotorula bacarum CBS 6526
Rhodotorula lactoza CBS 5826
Rhodotorula mucilaginosa CBS 17
Phaffia rhodozyma CBS 6938
Rhodotorular bogorỉensis CBS 4101

Lượng ị3-carotene
jug/ g sinh khối
khô
30

55
55
15
55
75
20
5

Cũng như các hợp chất Vitamin, kháng sinh, Carotenoid trong tế bào nấm
men là các sản phẩm chuyển hoá bậc II, đựoc tổng hợp dưới tác dụng của các
enzym trong cơ thể, thường lượng không lớn bằng các sản phẩm chuyển hoá
bậc I và chỉ một số loài có khả năng tổng hợp để phục vụ nhu cầu của chúng.
Các chủng phân lập ban đầu thường cho hiệu quả sinh tổng hợp, thành phần
P-carotene thấp. Vì thế để tăng hiệu suất sinh tổng họp, hàng loạt các nghiên

12


cứu về sự ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy như: nguồn dinh dưỡng Nitơ,
Cacbon, các nguyên tố khoáng, vi lượng, pH, nhiệt độ nhằm tối ưu hóa các điều
kiện sinh tổng họp của nấm men trong sản xuất đã được nghiên cứu [21;22].
Việc lai ghép, chuyển gen sinh tổng họp Carotenoid cũng đã được thực hiện trên
Candida utỉlis, tăng hiệu suất sinh tổng họp và thu được loại Carotenoid có tác
dụng sinh học cao như lycopene, ị3-carotene, Astaxanthin. Đặc biệt sử dụng kỹ
thuật gây đột biến đã tạo ra chủng đột biến có hiệu suất sinh tổng hợp ị3-carotene
gấp 200 lần chủng ban đầu và chiếm 80% tổng số Carotenoid. Dưới đây là sơ đồ
quá trình tổng hợp carotenoid ở nấm men Rhodotorula glutinis CBS20 [21].
Phytofluen
1: P-carotene synthase
2: Torulene synthase

3:
- - -Hỗn
- - - -hơp
T r- các enzym
oxy hoa

^
;
^;
Lycopene
ỳ
Ỵ-Carotene

_Ậ

(3-Carotene

2\ị/

Torulene
*
'l'
Torularhodin
Hinh 1: Sơ đồ qúa trình chuyển hoá các Carotenid ở Rhodotoruỉa glutỉnỉs CBS20

13


PHẦN 2: THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị.

2.1.1. Nguyên liệu, hoá chất.
- Amonium sulfat

(Trung Quốc)

- Ethyl acetat (Trung Quốc)

- Methanol

(Đức)

- Kali nitrat

(Việt Nam)

- Acetonitril

(Đức)

- Glucose

(Việt Nam)

- n-Hexan

(Trung Quốc)

- Diclometan

(Đức)

-Các loại lá cây lấy ở vườn thực vật Đại học Dược, thị trấn Quốc Oai, thị trấn
Gia Lâm
2.1.2. Máy móc- thiết bị:
- Box cấy

Bioblockscientific (Pháp)

- Nồi hấp áp lực

Himayamatoko (Nhật)

- Máy lắc ống nghiệm

IKA * KS 130 basic (Nhật)

- Máy lắc bình tam giác

Lab-Line (Mỹ)

- Máy li tâm.

Universal 16 (Hettich)

- Lò vi sóng.

LG (Hàn Quốc)

- Kính hiển vi quang học.

Eclipse E600-Nikon (Nhật)

- Máy đo quang

Jenway 6300 spectrophotometer

- Máy sắc ký lỏng cao áp HPLC

Alliance-Water (Mỹ).

- Đĩa peptri, pipetman các loại, ống ependorf, ống falcon, đầu côn các loại.
2.1.3.MÔÍ số môi trường sử dụng trong nghiên cứu.
Môi trường 1: Môi trường Malt- glucose 2 °Bx.
Nước malt

l°Bx

Glucose

lOg

Nước cất vừa đủ

1000 ml

Môi trường 2:Malt- glucose 2 °Bx cóbổ xung thạch 2%, acid lactic 1%

14

Môi trường 3: Malt- glucose 2 °Bx có bổ xung thạch.2 %
Môi trường 4: Môi trường cơ bản (Base Medium).
Glucose

10 g

Vi lượng

(*)

Khoáng

(**)

(NH4)2 S0 4

5g

ĨỈ2o vừa đủ

1000ml

(*)Thành phần vi lượng ( ỊLig)
500
h 3b o 3
400
C11SO4.. 5H20
100
KI
200

FeCl3. 6H2O
400
MnS04. 4H20
200
Na2Mo04. 2H20
400
ZnS04. 7H20

(**)Thành phần khoáng (mg)
850
KH2PO4
150
KHPO4
MgSC>4.7H20
500
100
NaCl
CaCl2.6H20
100

Bảng 2. Các môi trường sử dụng trong nghiên cứu được biến đổi từ
__________________ môi trường cơ bản.__________________
Môi trường

Khoáng

Vi lượng

Nguôn nitơ

Nguôn cacbon

4
5
6
7
8
9

+
+
+
+
+
+

+
+
+
+
+
+

(NĨỈ4)2 S0 4
KNO3
(NH4)2so 4
(NH4)2so 4
kno3
kno3

glucose
glucose
ethanol
glycerin
ethanol
glycerin

Các môi trường đều hấp ở latm, 121°c trong 20 phút.

2.2. Phương pháp nghiên cứu:
2.2.1. Phân lập nấm men sắc tố từ lá cây.
Phân lập nấm men có sắc tố vàng đến đỏ từ lá cây trên môi trường (2)
theo hai phương pháp là

15


Phương pháp pha loãng: Cân 5g lá mẫu rồi cắt nhỏ vào ống fancol chứa 20
ml nước cất đã thanh trùng, ngâm và lắc trong 15 phút. Tuỳ vào lượng tế bào
trong dịch sau khi soi trên kính hiển vi pha loãng ở nồng độ thích hợp. Sau
đó cấy lên môi trường (2). Dùng que gạt trải đều trên mặt thạch sau đó để ở
25°c trong 5 ngày.
Phương pháp bào tử bắn: Dùng một lượng lá có diện tích gần bằng diện
tích mặt thạch, cố định lá trên nắp hộp peptri bằng băng dính hai mặt, mặt
dưới của lá hướng mặt thạch. Hàng ngày đổi đĩa thạch. Các đĩa thạch nuôi cấy
ở 25°c trong 5 ngày rồi quan sát.
Các mẫu nấm men sắc tố từ vàng đến đỏ sau khi phân lập được tiến hành
thuần khiết trên môi trường số (3) bằng cách cấy zic zac nhiều lần cho đến khi
thu được chủng thuần khiết.Sau đó được giữ giống trong ống eppendorf ở
nhiệt độ 5 0c.

2.2.2. Tuyển chọn sơ bộ nấm men cho màu đậm nhất.
Môi trường thử: môi trường số (3), dùng pipetman hút 100 |il nước cất vô
trùng vào từng ô của bàn chấm có 21 lỗ. Sau đó một lượng tế bào tương tự
nhau được hoà tan nhẹ nhàng vào nước chứa trong các ô từ 1~> 21 .
Dùng bàn chấm nhúng vào khoang chứa dịch nấm men sau đó chấm lên
mặt thạch. Đĩa thạch có 21 chủng được cấy chiếu sáng liên tục trong 5 ngày.
Dựa vào màu sắc, kích thước của khuẩn lạc xác định độ đậm màu của các
chủng và chọn lựa chủng cho màu đậm.
2.2.3. Tuyển chọn nấm men tổng hợp carotenoid tốt nhất trên các môi
trường có nguồn Nitơ và nguồn Cacbon khác nhau.
■Với ỴỊguồn Nỉtơ: .Môi trường thử là môi trường số (4) và số (5)

16


Trên môi trường đặc (thêm 2 % thạch): Các chủng tuyển chọn ở 2.2.2.
được cấy trên cùng một đĩa môi trường, để ở nhiệt độ phòng và chiếu sáng
liên tục trong 5 ngày rồi quan sát màu sắc, hình thái và kích thước khuẩn lạc.
Trên môi trường lỏng: đóng trong mỗi ống nghiệm có nắp đã tiệt trùng 5
ml dịch môi trường rồi cấy các chủng nấm men và lắc trên máy lắc ống
nghiệm với tốc độ lắc 320 vòng/1 phút, nhiệt độ 25° c chiếu sáng liên tục
trong năm ngày. Kết hợp cả hai môi trường đặc và lỏng chọn ra mẫu tốt nhất
trên môi trường có nguồn Nitơ tưng ứng
Với nguon Cacbon.
Môi trường thử: môi trường số (1, 4, 5, 6 , 7, 8, 9 ), cách điều chế tương tự
mục 2..1.3, số lượng môi trường là 100ml. Bốn chủng nấm men cấy một
lượng tế bào tương đương nhau vào bình tam giác dung tích 500 ml có chứa
100ml dịch môi trường tương ứng. Sau đó bình tam giác được lắc và chiếu
sáng liên tục trong 8 ngày, tốc độ lắc 140 vòng/1 phút, nhiệt độ 25°c.
Hàng ngày quan sát sự biến đổi màu của các mẫu và hút lml dịch nuôi cấy

để lưu mẫu, theo dõi sự phát triển trên các môi trường có nguồn dinh dưỡng
Cacbon khác nhau. Xác định thời điểm tổng lượng carotenoid lớn nhất, thời
điểm bắt đầu suy thoái và nguồn Cacbon tốt nhất trong các nguồn đã thử thể
hiện qua sự biến đổi độ đậm mầu của dịch nuôi cấy.
2.2.4. Xác định thành phần carotenoid.
Tách chiết cgrrotenoid: lên men sinh khối rồi phá vỡ màng tế bào và tách
chiết carrotenoid bằng dung môi hữu cơ.
Đinh lương_ carotenoid bằng, đo quang phổ hấp thu
Nguyên tắc: . Các hợp chất carotenoid cho độ hấp thụ cực đại ở 480 nm.
Định lượng carotenoid bằng phương pháp đo màu với máy đo quang phố
Jenway6300 Spectrophotometer.[22]

17


<
"
w

\

Xác định lượng carotenoid trong mâu băng công thức:

Tổng carotenoid =

2

J5Q

X

10

4 X

k (mg)

A480 là độ hấp thụ tại X = 480
2,150: là độ hấp thụ riêng X = 480
k: là hệ số pha loãng

Xác đinh thành phần carotengid và định lương /?-carotene bang, sắc ký
lỏng, hieu năng cao(HPLC).
Nguyên tắc: Xác định các chất dựa trên sự phân bố của chất giữa 2 pha:
Pha tĩnh là chất lỏng bao boc tạo thành một tấm phim mỏng trênbề mặt một
chất rắn trơ (gọi là chất mang) được nhồi vào cột, pha động là dung môi thấm
qua toàn bộ bề mặt pha tĩnh. Khi các chất ra khỏi cột được Detector phát hiện,
máy sẽ ghi lại sắc ký đồ. Vị trí của peak trên sắc ký đồ là thể hiện định tính,
chiều cao hay diện tích peak thể hiện định lượng của chất [5].
So sánh sắc ký đồ, thời gian lưu, phổ hấp thụ UV-VIS, phổ đạo hàm bậc
nhất của chất chuẩn và carotenoid trong mẫu định tính các thành phần trong
dịch chiết. Định lượng P-carotene bằng phương pháp đường chuẩn.

2.3.Tiến hành và kết quả.
2.3.1. Phân lập và thuần khiết
Phương pháp pha loãng: Lá cây được cắt nhỏ, ngâm 15 phút trong nước cất
vô trùng sau đó pha loãng đến nồng độ thích hợp và cấy trên môi trường (2)
Phương pháp bào tử bắn: Lá cây được cố định trên nắp hộp petri theo chiều
mặt dưới của lá hướng về mặt thạch. Sau 24 giờ đổi nắp đĩa petri đã cố định
lá sang một đĩa thạch mới.

Kết quả: Từ 25 mẫu lá cây, chúng tôi đã thu được 154 chủng nấm men, ký
hiệu HRY từ 1—>154 trong đó phần lớn là các chủng màu hồng, đỏ, có 3
chủng màu vàng.

18


2.3.2. Sơ bộ tuyển chọn nấm men tổng hợp nhiều Carotenoid
Môi trường thử: môi trường số (3), các mẫu nấm men sau khi cấy truyền ra
ống thạch nghiêng tiến hành thử bằng cách cấy cùng lúc 21 chủng trên một
đĩa thạch, chiếu sáng liên tục trong 5 ngày ở nhiệt độ phòng. Chọn lựa chủng
nấm men cho màu đâm nhất. Kết quả được trình bày ở bảng 3.
Bảng 3: Độ đậm màu của các chủng nấm men trên môi trường
_________________ Malt- glucose 2 °Bx_________ _______
Chủng
HRY2, HRY5, HRY 10, HRY11, HRY13, HRY18, HRY20, HRY21,
HRY22, HRY23, HRY25, HRY26, YHR31, HRY35, HRY33, HRY44,
HRY43, HRY45, HRY46, HRY54, HRY55, HRY58, HRY64, HRY68,
HRY69, HRY77,HRY 106, HRY113, HRY115, HRY125,
HRY126, HRY128, HRY132, HRY136, HRY137, HRY138, HRY141,
HRY142, HRY148, HRY150
HRY1, HRY3, HRY4, HRY8, HRY9, HRY12, HRY15, HRY16, HRY19,
HRY17, HRY 24, HRY26, HRY28, HRY27,HRY29, HRY30, HRY34,
HRY32, HRY36, HRY37, HRY39, HRY42, HRY46, HRY47, HRY48,
HRY49, HRY51, HRY52, HRY53, HRY54, HRY57, HRY56, HRY59,
HRY60, HRY65, HRY68, HRY61, HRY62, HRY63, HRY70, HRY71,
HRY72 HRY75, HRY74, HRY76, HRY78, HRY79, HRY80, HRY83,
HRY84, HRY85, HRY86, HRY87, HRY88, HRY89, HRY90, HRY91,
HRY93, HRY94, HRY95, HRY96, HRY98, HRY99, HRY100, HRY101,
HRY103, HRY107, HRY109, HRY110, HRY114, HRY117, HRY118,

HRY121, HRY124, HRY125, HRY127, HRY129, HRY130, HRY133,
HRY138, HRY143, HRY144, HRY145, HRY146, HRY147, HRY151.
HRY 7, HRY14,HRY38, HRY41, HRY50, HRY69, HRY73, HRY79,HRY
81, HRY92, HRY102, HRY104, HRY105. HRY108, HRY112

Độ đậm mâu

-

+

++
+++

HRY6, HRY50, HRY82

(-): nhạt màu (+): màu hông
(++) màu đỏ
(+++) màu đỏ đậm
Sau đợt tuyển chọn thứ nhất, chúng tôi thu được 18 chủng cho màu đỏ đậm
nhất trên môi trường Malt- glucose 2 0BX.
2.3.3. Xác định sự ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng Nitơ tới khả năng
tổng hợp carotenoỉd.
Trên môi trường đăc: Trong quá trình điều chế môi trường cần lưu ý
glucose, thạch cho cùng một bình nón, các thành phần khác cho vào một bình
khác. Hấp trong nồi hấp áp lực ở latm, 121°c trong 20 phút sau đó để nguội
đến 50°c và trộn vào nhau trong box, đổ đĩa và cấy 18 chủng nấm men được
tuyển chọn ở 2.3.2 .

19

Trên mói trườns lỏng, cấy các chủng nấm men vào ống môi trường trên
rồi lắc trên máy lắc ống nghiệm với tốc độ lắc 320 vòng/1 phút, nhiệt độ 25° c
chiếu sáng liên tục trong bảy ngày. Kết quả thử trên cả hai môi trường đặc và
lỏng được trình bày ở bảng 4.
Bảng 4: Sự ảnh hưởng của nguồn Nitơ tới sự phát triển và tổng hợp
carotenoid của nấm men trên môi trường đặc và lỏng._____
Chủng
KNO3
STT
(NH4)2s o 4
r

m /V

1
2

3

4
5
6

7

8
9
10

11
12

13
14
15
16

17
18

HRY 6
HRY7
HRY 14
H R Y 38
HRY41
H R Y 50
H R Y 69
H RY 73
HRY79
H R Y 82
HRY102
HRY 104
HRY 105
HRY 108
HRY81

HRY92
HRY 112

HRY 149

4A

Độ đậm
mầu
±
±
±
±
±
±

Tôc độ
phát triển
D
D
D

w
w
D

w
w

±
±

D

G

±
++

w

±

D
D
D
G

±

±
+
++
+
+

w
D
w

±

Chú thích : w (weak): mọc yếu
G (good): mọc tốt

D (delay): mọc chậm

rp A

4A

Tôc độ
phát triển
D

w
G
D
D
D

w
G
G
w
G
G
G
G
D

G
G
G

Độ đậm
mầu
±
+
++
±
±
±
+
++
++
+
+++
+++
++
+++
+
++
+++

+++

± : nhạt mầu so với ban đầu
+ : giữ nguyên mầu
++: đậm mầu hơn
+++ đậm màu nhất

Kết quả ở bảng 3 cho thấy: Không có sự khác biệt nhiều về khả năng tổng
hợp Carotenoid trên môi trường lỏng và đặc. Song trên môi trường có
(NH4)2 SO4 các chủng phát triển tốt hon và cho màu đậm hơn trên môi trường

có KNO3. Ở môi trường đặc có (NHLt^SOị, khuẩn lạc khô , sần, kích thước to

20


trong khi ở môi trường có K N O 3 khuẩn lạc ướt, bóng và kích thước nhỏ. Với
hai nguồn Nitơ khác nhau chúng tôi chọn được: 3 chủng HRY104, HRY112,
HRY149 phát triển tốt trên môi trường có nguồn Nitơ là NILt+ và một chủng
HRY 82 phát triển tốt trên môi trường có nguồn Nitơ là N O 3 "

Hình 2. Độ đậm màu của các chủng nấm men trên môi trường nuôi cấy a: môi
trường 4, b: môi trường 5, c: môi trường 5 bổ sung 2% thạch, d: môi trường 2
bổ sung 2% thạch. Hình c, d hình thái, kích thước, độ đậm màu của các chủng
ở vị trí tương ứng có sự khác nhau rõ rệt.

21


2.3.4 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng Cacbon, thời gian nuôi cấy tới sự
phát triển và tổng hợp carotenoid.
Bốn chủng nấm men được chọn từ 2.3.3 cấy một lượng tế bào tương đương
nhau vào bình tam giác dung tích 500 ml có chứa 100ml dịch môi trường
tương ứng. Sau đó bình tam giác được lắc và chiếu sáng liên tục trong 8 ngày,
tốc độ lắc 140 vòng/1 phút, nhiệt độ 25 °c. Tiến hành so độ đục và độ đậm
màu dịch nuôi cấy của các mẫu theo thời gian.Ket quả được thể hiện trong
bảng 5.
Bảng 5: Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng cacbon và thời gian
_____ nuôi cấy tới khả năng tổng hợp Carotenoid
144h 168h 192h
72h

96h
120
Chủng
Nguồn c 48h
Malt
HRY82 Gluco
Ethanol
Glycerin
Malt
HRY104 Gluco
Ethanol
Glycerin
Malt
HRY112 Gluco
Ethanol
Glycerin
Malt
HRY149 Gluco
Ehanol
Glycerin
Chú thích:

++
+

+
0

++
+

0

++
+++

+++

++

0

+

+++

++
+

++

++

+

0
++

0
+++

0
+++
++

0
++
+

0

0
++
±
+
+

+
0
+
+
+

++
+++

+
0
+

+

±

+

+

+
++
+

+

+

++

++

++

+
+
+
++

+
+
+

0

0

±
0

++

+

0 : không mọc

(+) : màu hồng

(-): đục trắng
(±): đục, nhạt màu

(++): màu đỏ
(+++): màu đỏ tốt

22

+
++