Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa protease của HIV 1 trên nấm men pichia pastoris

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Đặng Thị Thanh Nhàn

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ
HÓA PROTEASE CỦA HIV-1 TRÊN
NẤM MEN PICHIA PASTORIS

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

MỞ ĐẦU

Hà Nội, 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Đặng Thị Thanh Nhàn

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEASE
CỦA HIV-1 TRÊN NẤM MEN PICHIA PASTORIS
Chuyên nghành: Di truyền học
Mã số:

60420121

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. Đinh Nho Thái
TS. Nguyễn Thị Hồng Loan

Hà Nội, 2015


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin phép bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Đinh Nho Thái,
người thầy đã tận tình chỉ bảo, tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm
thí nghiệm và viết luận văn. Thầy đã không ngại khó khăn hướng dẫn, giúp đỡ tôi
làm quen từ những nguyên tắc và thao tác đầu tiên trong nghiên cứu khoa học.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Thị Hồng Loan, đã tận tình hướng
dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn này.
Trong quá trình học tập và nghiên cứu, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của các
cán bộ, thành viên trong nhóm nghiên cứu tại bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học
và phòng protein tái tổ hợp, phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ enzym và
protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN. Tôi xin chân thành cảm ơn
về sự giúp đỡ quý báu đó.
Tôi xin cảm ơn các thầy, cô giáo trong bộ môn Di truyền học cũng như các
thầy, cô giáo trong Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN
đã giảng dạy và chỉ bảo cho tôi những kiến thức và kỹ năng cần thiết trong quá
trình học tập và làm luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo cùng các đồng nghiệp tại Trường THPT
Nguyễn Du, Thanh Oai, HN, đã ủng hộ, tạo điều kiện cho tôi trong thời gian học
tập vừa qua.
Lời cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ, chồng,
con, những người thân trong gia đình tôi đã chia sẻ, động viên và hết lòng giúp đỡ
tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu hoàn thành luận văn.

Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2014

Học viên:
Đặng Thị Thanh Nhàn


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................3
1.1. TỔNG QUAN VỀ AIDS VÀ HIV ........................................................................3
1.1.1. Lịch sử hình thành AIDS ...........................................................................3
1.1.2. Thực trạng nhiễm HIV-1 ............................................................................4
1.1.3. Cấu trúc hình thể và hệ gen của HIV-1 .....................................................5
1.1.4. Các thuốc điều trị HIV/AIDS hiện nay .....................................................9
1.2. TỔNG QUAN VỀ PROTEASE HIV-1 ..............................................................12
1.2.1. Protease HIV-1 ..........................................................................................12
1.2.2. Chức năng của protease HIV – 1. ............................................................13
1.2.3. Sơ lƣợc về nghiên cứu biểu hiện protease HIV-1 trên thế giới. ..............13
1.2.4. Thực trạng sản xuất protease HIV-1 ở Việt Nam ....................................16
1.3. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ P. PASTORIS ...........................................................17
1.3.1. Đặc điểm của P. pastoris .........................................................................18
1.3.2. Ƣu nhƣợc điểm của hệ thống biểu hiện P. pastoris .................................19
1.3.3. Chủng nấm men P. pastoris biểu hiện protease HIV-1 ...........................20
1.3.4. Vector nhân dòng và biểu hiện ở P. pastoris ...........................................21
1.3.5. Cơ chế sát nhập gen ngoại lai vào hệ gen P. pastoris ..............................22

1.3.6. Quá trình tiết protein ngoại bào ở P. pastoris ..........................................22
Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................24
2.1. NGUYÊN LIỆU .................................................................................................24
2.1.1. Chủng vi sinh vật .....................................................................................24
2.1.2. Các hóa chất, nguyên liệu khác ................................................................24
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................25
2.2.1. Nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng kỹ thuật PCR .............25
2.2.2. Điện di DNA trên gel agarose ..................................................................27
2.2.3. Gắn đoạn gen mã hóa protease HIV-1 vào vector biểu hiện: ..................28
2.2.4. Tách chiết và định lƣợng DNA plasmid ..................................................30


2.2.5. Giải trình tự các đoạn gen mã hóa protease HIV-1 ..................................31
2.2.6. Biến nạp vector vào nấm men bằng phƣơng pháp xung điện ..................32
2.2.7. Điện di protein trên gel polyacyamide (SDS-PAGE) .............................33
2.2.8. Thẩm tách miễn dịch (Western Blotting) ................................................34
2.2.9. Phƣơng pháp biểu hiện và thu nhận protein.............................................35
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………………………………37
3.1. NHÂN DÒNG ĐOẠN GEN MÃ HÓA PROTEASE HIV-1. ............................37
3.1.1. Nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng PCR ...........................37
3.1.2. Tinh sạch plasmid pPIC9 từ E. coli .........................................................39
3.1.3. Cắt sản phẩm PCR và cắt mở vòng plasmid bằng enzym giới hạn .........40
3.1.4. Tạo vector tái tổ hợp pPIC9 chứa gen mã hóa protease HIV-1 bằng phản
ứng ligase ..................................................................................................................41
3.1.5. Kết quả giải trình tự xác định sự có mặt của protease HIV-1 trong vector
biểu hiện pPIC9 .........................................................................................................42
3.2. TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEASE HIV-1 TRÊN P.
PASTORIS. ................................................................................................................44
3.2.1. Tạo dòng nấm men P. pastoris có chứa plasmid tái tổ hợp mang gen mã
hóa protease HIV-1 ...................................................................................................44

3.2.2. Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa protease HIV-1 trên P. pastoris ........47
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................53
1. KẾT LUẬN ...........................................................................................................53
2. KIẾN NGHỊ ...........................................................................................................53
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................54


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. Cấu trúc của một hạt virus HIV-1......................................................................6
Hình 2. Cấu tạo của hệ gen virus HIV-1......................................................................7
Hình 3. Mô hình cấu trúc bậc hai của protease HIV-1................... ..............................12
Hình 4. Bản đồ vector biểu hiện pPIC9.... ...................................................................21
Hình 5. Cơ chế trao đổi chéo xảy ra tại locus HIS4 giữa bộ gen của tế bào với vector
biểu hiện....................................................................................................................22

Hình 6. Kết quả nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng PCR.................38
Hình 7. Điện di sản phẩm tách chiết plasmid...........................................................39
Hình 8. Điện di sản phẩm cắt mở vòng plasmid và sản phẩm PCR bằng các enzym
giới hạn NotI và EcoRI..............................................................................................40
Hình 9. Điện di sản phẩm PCR của các khuẩn lạc E. coli DH5α............................42
Hình 10. So sánh trình tự cấu trúc Prot trên khuẩn lạc với cấu trúc Prot lý thuyết..43
Hình 11. Sự hình thành khuẩn lạc trên P. pastoris SMD1168................................45
Hình 12. Sản phẩm PCR khuẩn lạc thu đƣợc sau biến nạp vector tái tổ hợp vào nấm
men............................................................................................................................46
Hình 13. Đƣờng cong sinh trƣởng của các chủng P. pastoris SMD1168 sau khi biểu
hiện ở môi trƣờng có chứa 0.5% methanol theo thời gian…………………………49
Hình 14. Điện di SDS-PAGE kiểm tra sự có mặt của protease HIV-1 trong chủng
tái tổ hợp SMD1168..................................................................................................50
Hình 15. Kết quả kiểm tra protein bằng thẩm tách miễn dịch Western Blot...........51

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1. Một số chủng P. pastoris phổ biến đƣợc sử dụng để biểu hiện protein tái tổ
hợp............................................................................................................................20
Bảng 2. Các cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR.................................................26
Bảng 3. Thành phần phản ứng PCR.........................................................................27
Bảng 4. Thành phần phản ứng cắt enzym giới hạn..................................................28
Bảng 5. Thành phần gel tách và gel cô trong SDS-PAGE ......................................33
Bảng 6. Khả năng sinh trƣởng của các dòng nấm men tái tổ hợp thông qua chỉ số
OD600 theo thời gian lên men, lặp lại thí nghiệm 3 lần.............................................48


BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AIDS

Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải
(Acquired Immuno Deficiency Syndrome)

ART

Liệu pháp dùng thuốc chống retrovirus(Antiretroviral drug therapy)

AOX

Alcohol oxidase

Amp

Ampicillin

BMGY

Buffered Minimal Glycerol Yeast

Bp

Base pair

DNA

Axit deoxyribonucleic

ddNTP

dideoxyribonucleotide – triphosphate

E. coli

Escherichia coli

HIV

Virus gây suy giảm miễn dịch ở ngƣời
(Human immunodeficiency virus)

HIS:

Histidine

KLPT

Khối lƣợng phân tử

kb

Kilobase

kDa

Kilo Dalton

LB

Luria-Bertani

mRNA

RNA thông tin (Messenger RNA)

MM:

Môi trƣờng Minimal Methanol

P. pastoris

Pichia pastoris

PCR

Phản ứng chuỗi Polymerase (Polymerase Chain Reaction)

PI

Chất ức chế protease (Protease Inlibitor)

RNA

Axit ribonucleic

SDS

Sodium dodecyl sunfat

SDS-PAGE:

phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamid có SDS
(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)

UNAIDS

Chƣơng trình HIV/AIDS của Liên hiệp quốc
( United Nation Program on HIV/AIDS)


MỞ ĐẦU
Virus gây suy giảm miễm dịch ở ngƣời (Human Immuno Deficiency VirusHIV) là nguyên nhân chính gây nên hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ở
ngƣời (AIDS). Đây là một trong các bệnh đã làm nhiều ngƣời chết nhất trong lịch
sử loài ngƣời [49]. Có hai type HIV gây nên AIDS là HIV type 1 (HIV-1) và HIV
type 2 (HIV - 2), nhƣng HIV-1 độc hơn HIV-2 và là nguyên nhân chính của các ca

nhiễm HIV trên toàn thế giới từ khi xuất hiện cho tới nay [28].
Để tồn tại và phát triển, HIV-1 cần đến 3 enzym quan trọng không thể thiếu
trong sao chép, đóng gói và hình thành virus hoàn chỉnh đó là: enzym phiên mã
ngƣợc reverse transcriptase, enzym integrase và enzym protease. Nếu một trong ba
enzym này bị ức chế chu kì sống của HIV sẽ bị ảnh hƣởng, chính vì vậy hƣớng
nghiên cứu tìm ra chất ức chế các enzym trên để sản xuất thuốc điều trị cho các bệnh
nhân AIDS đã đƣợc rất nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm. Các điều trị theo
hƣớng sử dụng chất ức chế 3 enzym đó gọi là liệu pháp dùng thuốc chống retrovirus
ART (antiretroviral drug therapy) [28].
Enzym protease của HIV-1 (đƣợc gọi tắt là protease HIV-1) đƣợc mã hoá bởi
gen pol của virus có chức năng cắt các chuỗi polyprotein (gag, gag – pol) thành các
protein cấu trúc và chức năng cần thiết cho virus có thể tiếp tục lây nhiễm. Nếu
protease bị mất hoạt tính, HIV-1 sẽ không đƣợc đóng gói phù hợp để tạo virus hoàn
chỉnh [19]. Tuy nhiên, do HIV-1 có tốc độ sinh sản nhanh, có khoảng 10 triệu hạt
virus mới đƣợc tạo ra mỗi ngày và tỷ lệ sai sót của enzym reverse transcriptase là
1/10.000 base dẫn đến tình trạng kháng thuốc phổ biến ở những bệnh nhân nhiễm
bệnh thậm chí khi chƣa điều trị. Ngày càng có nhiều chất ức chế protease (PI)
chống HIV đƣợc phát triển và thƣơng mại hóa nhƣng vẫn chƣa tìm đƣợc chất ức
chế nào thực sự có hiệu quả. Vì vậy, việc nghiên cứu tìm ra chất ức chế protease
một cách hiệu quả là nhiệm vụ quan trọng góp phần đẩy lùi HIV/AIDS. Quá trình
nghiên cứu nhằm tìm ra chất ức chế protease này cần một lƣợng lớn protease nên
việc sản xuất, tinh sạch protease HIV-1 là rất cần thiết.

1


Cho đến nay, đã có nhiều công trình nghiên cứu để sản xuất protease HIV-1
trên toàn thế giới. Trong thực tế nghiên cứu, protease HIV-1 không dễ dàng biểu
hiện trong tế bào vật chủ do đặc tính gây độc tế bào, khó tan, lƣợng protease thu
đƣợc sau biểu hiện thƣờng thấp, khó phát hiện. Do đó, cần có những nghiên cứu để

sản xuất protease HIV-1 có tính tan và hiệu quả hơn.
Phần lớn các công trình nghiên cứu sản xuất protease HIV-1 ở Escherichia
coli (E. coli), vì đây là hệ thống biểu hiện đơn giản, dễ nuôi cấy [3; 18; 41]. Tuy
nhiên, E. coli là một sinh vật nhân sơ và thiếu các cơ quan nội bào chẳng hạn nhƣ
mạng lƣới nội chất và bộ máy golgi nhƣ trong sinh vật nhân chuẩn (có chức năng
cải biến protein sau tổng hợp). Nhiều protein của sinh vật nhân chuẩn khi biểu hiện
ở E. coli không tạo thành dạng protein hoàn chỉnh có chức năng bởi những cải biến
sau dịch mã không diễn ra. Hạn chế này đƣợc khắc phục bằng cách sử dụng các hệ
thống biểu hiện ở sinh vật nhân chuẩn nhƣ nấm men và động vật có vú. Nấm men
có cấu trúc đơn giản, nhƣng chúng mang đầy đủ các đặc điểm của một cơ thể và là
một mô hình tiêu biểu cho cấu trúc tế bào nhân chuẩn. Nhiều protein của tế bào
nhân thực đã đƣợc sản xuất thành công bằng hệ thống biểu hiện nấm men
Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) [10]. Ngoài S. cerevisiae, nấm men Pichia
pastoris (P. pastoris) cũng bắt đầu đƣợc quan tâm sử dụng để biểu hiện protein của
sinh vật nhân chuẩn, đặc biệt từ khi promoter alcohol oxidase đƣợc phân lập và tạo
dòng. P. pastoris còn là hệ thống biểu hiện đáng tin cậy và có tiềm năng hơn E. coli
hay S. cerevisiae để sản xuất protein ngoại lai dạng hòa tan [27].
Để tạo ra chế phẩm protease HIV-1 nhằm phát triển chất ức chế sự nhân lên
của virus HIV-1, làm cơ sở cho việc nghiên cứu tìm ra thuốc điều trị HIV/AIDS,
cùng với thuận lợi của hệ thống biểu hiện của nấm men P. pastoris so với E. coli,
chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa
protease của HIV-1 trên nấm men P. pastoris” với các nội dung:
- Nhân bản gen mã hóa protease HIV-1 vào vector biểu hiện.
- Nghiên cứu sự biểu hiện của gen mã hóa protease HIV-1 trên nấm men P.
pastoris.

2


CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TỔNG QUAN VỀ AIDS VÀ HIV
1.1.1. Nguyên nhân hình thành AIDS
Thuật ngữ AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome - Hội chứng suy
giảm miễn dịch mắc phải) đƣợc đề xuất trong cuộc họp tại Washington của các nhà
lãnh đạo cộng đồng ngƣời đồng tính, các quan chức và CDC (trung tâm kiểm soát
và phòng ngừa dịch bệnh Hoa kỳ) để thay thế cho GRID (suy giảm miễn dịch liên
quan đến đồng tính) vào tháng 7 năm 1982 [11]. Đến tháng 8 năm 1982, AIDS đã
trở thành tên gọi về hội chứng suy giảm miễn dịch ở ngƣời do tác nhân HIV gây
nên [38]. Virus gây suy giảm miễn dịch đƣợc phát hiện lần đầu vào năm 1959 tại
Châu Phi, và phân lập đầu tiên do Luc Montagnier và tập thể ở Viện Pasteur Paris
thực hiện năm 1983 với tên gọi ban đầu là virus liên quan tới viêm hạch (LAV).
Năm 1986, virus này đƣợc Uỷ ban Quốc tế thống nhất gọi tên là HIV [24]. Cũng
vào 1986, L. Montagnier lại phân lập đƣợc một loại virus tƣơng tự ở Tây Phi và đặt
tên là HIV type 2 (HIV-2), đây là loại virus gốc của HIV-1. Cả HIV-1 và HIV-2 đều
làm suy giảm hệ thống miễn dịch của ngƣời nên đƣợc đặt tên chung là HIV. Chúng
giống nhau về cách thức truyền bệnh, các hình thức nhiễm bệnh cơ hội và phƣơng
pháp điều trị nhƣng ngƣời nhiễm HIV-2 ít phát sinh bệnh hơn so với HIV-1 và
HIV-2 chủ yếu thấy ở các vùng Châu Phi [28]. Bởi vậy, bệnh AIDS hiện nay đƣợc
hình thành do tác nhân chính là virus HIV-1.
Theo phân loại, HIV thuộc họ Retrovirus, chi Lentivirus, có hai loại là HIV1 và HIV-2. Retrovirus là họ gây ung thƣ cho ngƣời và động vật. HIV-1 có 4 nhóm
chính là M (main), N (new) và O (outlier) và nhóm P [40]. Trong đó, nhóm M xuất
hiện tới 90% tổng số các ca lây nhiễm HIV trên toàn thế giới, nhóm này có 9 phân
type (subtypes or clades) đƣợc kí hiệu bằng các chữ cái A; B; C; D; E; F; G; H; J; K
và 49 dạng tái tổ hợp khác gọi tắt là các phân nhóm CRF (circulating recombinant
forms) [6]. Sự khác nhau giữa phân nhóm này và phân nhóm khác là trình tự axit
amin của protein vỏ và có thể vƣợt quá 30%. Vị trí địa lý có thể ảnh hƣởng đến sự

3

lây nhiễm các phân nhóm khác nhau nhƣ phân nhóm B phổ biến ở Mỹ, Tây Âu và
Austalia, còn ở các nƣớc đang phát triển nhƣ Châu Á và Châu Phi, nơi mà có nhiều
ngƣời bị nhiễm HIV-1 đang sinh sống thì lại phổ biến các phân nhóm không thuộc
nhóm B. Cụ thể, theo ghi nhận của Ngân hàng Gen HIV Hoa Kỳ, kiểu gen
CRF25_CPX thƣờng chỉ xuất hiện ở Châu Phi [53]. Những nghiên cứu ban đầu về
dịch tễ học phân tử của HIV đã xác định đƣợc phân týp chính lƣu hành tại Việt
Nam đó là phân týp CRF01_AE (96,7%) và phân týp B (3,3%) [10]. Năm 2013,
Phạm Đức Minh và cộng sự đã công bố kết quả phân typ AE và B ở Việt Nam lần
lƣợt là 98,53% và 1,33%. [6]
1.1.2. Thực trạng nhiễm HIV-1
Sau gần nửa thế kỷ phát hiện ra HIV đến nay, HIV/AIDS vẫn là đại dịch thế
kỷ chƣa có vaccine phòng ngừa hay thuốc chữa trị đặc hiệu. Với tốc độ lây lan
nhanh, HIV/AIDS đã lan rộng trên toàn thế giới, đặc biệt là ở khu vực Châu Phi và
các nƣớc Châu Á. Theo ƣớc tính của chƣơng trình HIV/AIDS Liên hiệp quốc
UNAIDS, trung bình mỗi ngày trên thế giới có thêm khoảng 7000 ngƣời nhiễm
HIV. UNAIDS đã công bố báo cáo thống kê trong năm 2012 thế giới có khoảng 2,3
triệu các trƣờng hợp nhiễm mới HIV ở ngƣời lớn và trẻ em, giảm 33% so với năm
2001, các trƣờng hợp tử vong liên quan đến AIDS cũng giảm 30% so với mức đỉnh
năm 2005 [49]. Đây là kết quả của sự nỗ lực không ngừng trong công tác truyền
thông phòng, chống HIV và việc mở rộng tiếp cận điều trị theo hƣớng kháng virus
làm giảm số ngƣời tử vong, kéo dài sự sống cho ngƣời bệnh. Những con số thống
kê này cho thấy hy vọng có thể ngăn chặn và đẩy lùi đại dịch HIV/AIDS trên toàn
cầu khi nâng cao hơn nữa tính hiệu quả của các phƣơng pháp điều trị phòng và
chống HIV/AIDS.
Tuy nhiên, theo công bố của WHO, HIV vẫn tiếp tục là một vấn đề y tế công
cộng quan trọng toàn cầu. Đến hết năm 2013 trên toàn thế giới, có khoảng 1,5 triệu
ngƣời chết vì các nguyên nhân liên quan đến HIV, 33,2 - 37,2 triệu ngƣời sống
chung với HIV với hơn 2,1 triệu ngƣời nhiễm mới. Trong đó, Sahara Châu Phi là
khu vực có số ngƣời nhiễm HIV lớn nhất thế giới với trên 24,7 triệu ngƣời sống

4


chung với HIV, số ngƣời nhiễm mới cũng chiếm gần 70% tổng số ngƣời nhiễm trên
toàn cầu [56].
Ở Việt Nam, năm 1990 phát hiện bệnh nhân dƣơng tính với HIV đầu tiên.
Theo báo cáo của Cục phòng chống AIDS, giữa những năm 2000 đến 2007, số
ngƣời nhiễm HIV đã tăng gấp đôi từ 122.000 đến 290.000 ngƣời và mỗi năm có
khoảng 40.000 ngƣời nhiễm mới. Tính đến 30/9/2010 trên cả nƣớc có 180.631
ngƣời nhiễm HIV, đến ngày 30/9/2013 cả nƣớc có 218.427 ngƣời nhiễm HIV, trong
đó có 66.729 ngƣời ở giai đoạn AIDS, 66.116 trƣờng hợp tử vong do HIV/AIDS, và
trung bình mỗi ngày cả nƣớc phát hiện thêm 34 ngƣời nhiễm HIV [49]. Theo báo
cáo mới nhất của cục phòng chống HIV/AIDS, tính đến ngày 30/4/2014, toàn quốc
hiện có 219.163 trƣờng hợp báo cáo hiện nhiễm HIV (trong đó số bệnh nhân
chuyển sang giai đoạn AIDS là 67.557), đến 31/8/2014 có 223.130 ngƣời nhiễm
HIV đƣợc phát hiện. Đây chỉ là số ngƣời nhiễm HIV đƣợc phát hiện và xác nhận, số
ngƣời nhiễm thực tế có thể lớn hơn [49].
Nhìn chung, đại dịch HIV/AIDS vẫn trong giai đoạn tập trung và xảy ra chủ
yếu trong các nhóm có hành vi nguy cơ cao, đặc biệt nhóm tiêm chích ma túy và
mại dâm ở các thành phố lớn.
1.1.3. Hình dạng cấu trúc và hệ gen của HIV-1
1.1.3.1. Hình dạng cấu trúc của HIV-1
HIV-1 và HIV-2 có cấu trúc hình thể không khác nhau nhiều mà chỉ khác
biệt với nhau về khối lƣợng của các protein và các gen phụ trợ. Chúng đều nhân bản
trong tế bào lympho CD4 và cùng gây bệnh ở ngƣời, nhƣng mức độ suy giảm miễn
dịch do HIV-1 gây ra nhiều hơn so với HIV-2 [28].

5

Hình 1. Cấu trúc của một hạt virus HIV-1 [28]

Về cấu tạo (Hình 1), HIV-1 có dạng hình cầu, có đƣờng kính 100 nm và
đƣợc bao quanh bởi màng lipoprotein. Lớp ngoài cùng của virus là lớp lipit kép với
nhiều protein Env gắn vào và nhô lên. Protein Env gồm hai phần là phần chỏm
(gp120) và phần thân (gp41). Trong quá trình nảy chồi, các protein khác nhau từ
màng của tế bào vật chủ có thể đƣợc gắn vào màng lipoprotein của virus, (chẳng
hạn nhƣ protein HLA lớp I và II, hay protein bám dính ICAM) tạo điều kiện cho
virus tiếp xúc, gắn vào các tế bào mục tiêu. Bên trong màng lipoprotein là protein
P17, tiếp đến là lõi của virus. Lõi có dạng hình trụ đƣợc bao bọc bởi lớp capsid
đƣợc tạo thành từ 2000 bản sao của protein p24. Bên trong lõi có hai bản sao của
RNA HIV-1, các enzym phiên mã ngƣợc và integrase [28].
1.1.3.2. Cấu tạo hệ gen của HIV
Virus HIV-1 có hệ gen nằm trong phần lõi với hai sợi RNA (+) đơn, trên mỗi
sợi có 9 gen mã hoá cho 15 protein khác nhau và có chiều dài khoảng 9,8 kb. Mỗi
sợi RNA (Hình 2), có 3 gen cấu trúc là gen gag “group- antigen (kháng nguyên
nhóm)”; gen pol “polymerase” và gen env “envelope - vỏ”. Các gen gag và env mã
hoá cho nucleocapsid và glycoprotein của màng virus; gen pol mã hoá cho 3 enzym

6


reverse transcriptase, enzym integrase và enzym protease. Ngoài 3 gen chính, HIV1 còn có 6 gen khác (tat, rev, nef, vif, vpr và vpu) chứa thông tin mã hóa cho các
protein có khả năng kiểm soát sự tái bản, các cách lây nhiễm hoặc nguy cơ nhiễm
các loại bệnh khác nhau [28].

Hình 2. Cấu tạo của hệ gen virus HIV-1 [28]
Bao gồm 9 gen: gag, pol, vif, vpr, vpu, env, tat, rev và gen nef.
Gal, pol, env là 3 gen cấu trúc mã hóa các protein cấu tạo vỏ và lõi virus HIV-1
Tat, rev, vif, vpr, vpu và nef là 6 gen phụ

1.1.3.3. Sự xâm nhiễm vào tế bào và nhân lên của HIV-1
HIV truyền nhiễm theo các con đƣờng bao gồm quan hệ tình dục không an
toàn với ngƣời nhiễm HIV, truyền máu và các sản phẩm của máu (có thể qua thụ
tinh nhân tạo, ghép da và ghép tạng), dùng lại kim tiêm không tiệt trùng của ngƣời
nhiễm và từ mẹ sang con [28].
Virus HIV xâm nhiễm vào tế bào vật chủ thông qua các thụ thể. Phân tử
CD4 là thụ thể chính của HIV-1, HIV-2 và SIV, đã đƣợc mô tả từ năm 1984 [20].
CD4 có thể thấy trên bề mặt của 60% các tế bào: lympho T; các tế bào tiền thân của
lympho T trong tủy xƣơng, tuyến ức; trên các tế bào đơn, đại thực bào, bạch cầu ƣa

7


kiềm, tế bào tua (dendritic cell) và các tế bào thần kinh đệm (microglial cell) [28].
Các tế bào này có vai trò rất quan trọng trong hệ thống miễn dịch của cơ thể, chúng
nhận diện, báo động và huy động các tế bào lympho tấn công và tiêu diệt vi sinh vật
lạ xuất hiện trong cơ thể. Chu trình nhân bản của HIV gồm 6 bƣớc: I) gắn và xâm
nhập, II) cởi bỏ lớp vỏ bên ngoài, III) phiên mã ngƣợc, IV) gắn provirus, V) tổng
hợp protein virus và lắp ráp, VI) nảy chồi. Toàn bộ con đƣờng sao chép của HIV có
thể đƣợc chia thành 3 sự kiện chính: virus gắn vào tế bào, quá trình hoạt hóa và
dung hợp. Quá trình lây nhiễm HIV đƣợc bắt đầu khi protein bề mặt vỏ gp120 gắn
vào thụ thể CD4 trên bề mặt tế bào đích. Sự liên kết đầu tiên của gp120 với CD4 để
lộ ra các vùng đặc hiệu trên vòng V3 của gp120 để gp120 có thể gắn với các đồng
thụ thể chemokine (CCR5, CXCR4) trên bề mặt tế bào đích. Tiếp đó phân tử gp41
qua thụ thể gắn vào màng tế bào đích và hòa tan màng, HIV-1 cởi bỏ lớp vỏ lipid
bên ngoài và bơm vật liệu di truyền RNA của nó cùng với enzym reverse
transcriptase vào tế bào chất của tế bào vật chủ. Nhờ enzym reverse transcriptase
mà sợi RNA của virus đƣợc tổng hợp thành sợi DNA bổ sung (cDNA). Tiếp đến là
sự kết hợp của RNA virus với sợi cDNA thành chuỗi RNA/DNA - chuỗi lai này

chuyển thành 2 sợi DNA xoắn mạch thẳng, sau đó chuyển thành DNA xoắn dạng
vòng chui qua màng nhân vào trong nhân tế bào. Nhờ enzym integrase mà sợi DNA
virus đƣợc chèn vào DNA nhiễm sắc thể của tế bào chủ. DNA virus đƣợc hợp thành
có thể tồn tại ở trạng thái tiềm tàng trong nhiều giờ hoặc nhiều năm trƣớc khi trở
thành dạng hoạt động mà không có biểu hiện bệnh [26]. Sau khi lây nhiễm vào vật
chủ, hệ gen của virus HIV-1 sẽ đƣợc sao chép nhờ sự điều khiển phức tạp của một
số protein nhƣ Tat và các yếu tố sao chép DNA của tế bào vật chủ. Do hệ gen vật
chủ bị thay đổi cấu trúc khi DNA của virus chèn vào, DNA của virus chỉ thị cho tế
bào phiên mã ra RNA virus nhờ enzym DNA polymerase tế bào vật chủ. Số lƣợng
RNA của virus đƣợc tăng lên, tiếp tục tổng hợp các protein virus nhờ ribosome của
tế bào vật chủ, chúng cùng di chuyển ra tế bào chất hoặc màng tế bào, sau đó là quá
trình nảy chồi tạo thành các viron nằm trên màng hoặc tách ra khỏi tế bào chủ, đi
vào máu và tiếp tục gắn vào các tế bào lympho T khác [26; 28].

8


1.1.4. Các thuốc điều trị HIV/AIDS hiện nay
Lý do khiến cho việc phát triển vaccine phòng chống nhiễm HIV-1 gặp rất
nhiều khó khăn và thƣờng thất bại do thời gian ủ bệnh của HIV-1 dài, lại thƣờng
xảy ra đột biến ở vùng gen mã hóa cho kháng nguyên. Sau nhiều nghiên cứu, đến
ngày 6 tháng 3 năm 2012, các nhà nghiên cứu sinh học hàng đầu Cuba đã thử
nghiệm thành công một loại vaccine mới với tên Teravac chống HIV/AIDS trên
chuột, đã sẵn sàng để thử nghiệm trên con ngƣời. Vaccine đƣợc triển khai từ một
protein tái tổ hợp có những phân tử giống virus, kích thích đáp ứng miễn dịch. Tuy
nhiên, theo Iglesias, trƣởng nhóm nghiên cứu vaccine Teravac, vaccine này ban đầu
phải đƣợc thử nghiệm lâm sàng với số lƣợng nhỏ, trên một nhóm bệnh nhân AIDS
đang ở giai đoạn đầu và cũng không nên hy vọng quá cao vào vaccine này. Tiếp
theo là các cuộc thử nghiệm nhằm kiểm tra độ an toàn của vaccine, và việc phát
triển một vaccine hiệu quả đòi hỏi nhiều năm nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

trƣớc khi đƣa ra loại vaccine có thể thử nghiệm trên ngƣời lành [17].
Vì nhiều nguyên nhân trên mà việc sản xuất vaccine phòng HIV theo phƣơng
pháp truyền thống gặp rất nhiều khó khăn. Ngƣời nhiễm HIV-1 muốn kéo dài cuộc
sống chỉ có cách duy nhất là dùng thuốc ức chế sự sao chép và nhân lên của HIV-1.
Việc điều trị HIV/AIDS phức tạp, tốn kém và chỉ giúp kéo dài sự sống mà không
chữa khỏi đƣợc bệnh. Các loại thuốc điều trị HIV/AIDS có thể hƣớng đến các đích
khác nhau dựa trên cơ sở hiểu biết về quá trình nhiễm và nhân lên của HIV trong tế
bào nhƣ: Ức chế quá trình nảy chồi; ức chế quá trình hoà màng và xâm nhập của
HIV-1. Phƣơng pháp phổ biến nhất là liệu pháp dùng thuốc kháng retrovirus (ART)
đƣợc áp dụng từ những năm 1987 bao gồm thuốc ức chế enzym reverse
transcriptase, enzym integrase và enzym protease [28]. ART là liệu pháp điều trị sử
dụng các thuốc kháng virus hay còn gọi là thuốc ARV (Anti-retrovirus). Các thuốc
ARV có tác dụng làm chậm sự nhân lên của HIV trong cơ thể, do đó tăng khả năng
miễn dịch và ít mắc các nhiễm trùng cơ hội.
Các thuốc kháng retrovirus ức chế sự phát triển và nhân lên của HIV ở
những giai đoạn khác nhau trong vòng đời của virus. Hiện có một số nhóm nhƣ:

9


+ Các chất ức chế reverse transcriptase tương tự nucleoside (NRTI): NRTI ức chế
sự sao chép của enzym phiên mã ngƣợc reverse transcriptase. Nhóm thuốc này gồm
zidovudine, lamivudine, didanosin, zalcitabine, stavudine và abacavir. Đặc tính của
thuốc nucleoside cũng gây ra các rối loạn về chuyển hoá đặc biệt là teo mỡ. Có thể
chúng liên quan đến ức chế hoạt động của ty thể do hoạt động chức năng của ty thể
cần đến nucleoside. Qúa trình chuyển hóa trong ty thể bị rối loạn do phải sử dụng các
nucleoside “giả” dẫn đến sự thoái hoá của ty thể [25].
+ Các chất ức chế protease (PI): Đây là nhóm thuốc gây cản trở sự nhân lên của
HIV bằng cách tác động vào enzym protease của virus, làm cho cấu trúc HIV bị rối
loạn và không gây nhiễm. Tuy nhiên, khi điều trị bằng PI, bệnh nhân thƣờng phải

uống nhiều lần thuốc trong một ngày và việc điều trị kéo dài gây ra một số tác dụng
phụ nhƣ: bệnh dạ dày, ruột, giảm chức năng gan, rối loạn lipid máu, loạn nhịp tim
[13]. Những hạn chế này cũng đã đƣợc khắc phục khi PI mới (PI tăng cƣờng) ra
đời. Thuốc PI tăng cƣờng đƣợc phân biệt với thuốc PI bằng chữ “r” thêm vào sau
tên thuốc. Các thuốc trong nhóm gồm saquinavir, ritonavir, indinavir, nelfinavir,
amprenavir, lopinavir và atazanavir.
+ Các chất ức chế reverse transcriptase không nucleoside (NNRTI). Những thuốc
này phong bế hoàn toàn vị trí gắn các chất hoạt hóa enzym reverse transcriptase
bằng cách gắn trực tiếp với enzym này, làm giảm quá trình tổng hợp axit nucleic.
Nhóm thuốc này gồm các thuốc nevirapine, delavirdine và efavirenz. Một số nghiên
cứu cho rằng nếu đảm bảo đã ức chế đƣợc virus thì có thể dùng NNRTI điều trị thay
cho PI. Trong trƣờng hợp này, sử dụng NNRTI đôi khi đem lại hiệu lực tốt hơn việc
tiếp tục điều trị bằng các thuốc PI [28].
+ Các chất ức chế enzym reverse transcriptase nucleoside (NtRTI): Hoạt động của
nhóm thuốc này rất giống với NRTI nhƣng tác dụng nhanh hơn. Tenofovir là thuốc
duy nhất trong nhóm này có thể ức chế cả HIV và viêm gan B, đặc biệt lại có có
hiệu quả ngay cả ở bệnh nhân đã kháng NRTI.

10


+ Các chất ức chế hoà nhập: Nhóm thuốc này không cho virus nhân lên bằng cách
ngăn không cho màng virus hoà nhập với màng của tế bào khỏe mạnh. Thuốc đầu
tiên trong nhóm này là enfuvirtide.
Để tăng hiệu quả và hạn chế tác dụng phụ, các loại thuốc thƣờng đƣợc dùng
phối hợp trong điểu trị cho các bệnh nhân HIV/AIDS. Thực tế cho thấy, HIV/AIDS
rất khó điều trị triệt để. Thời gian ƣớc lƣợng có thể xoá sạch các tế bào mang HIV-1
là 73,3 năm, nghĩa là HIV-1 không thể chữa khỏi hoàn toàn [44].
Đối mặt với nhiều khó khăn, cùng với sự biến đổi phức tạp của HIV-1, các
nhà khoa học vẫn đang nỗ lực không ngừng, nghiên cứu và tìm ra thuốc chống HIV

mới, hiệu quả hơn mang lại hy vọng sống cho nhiều bệnh nhận HIV/AIDS.

11


1.2. TỔNG QUAN VỀ PROTEASE HIV-1
1.2.1. Protease HIV-1
Protease HIV-1 là enzym có vai trò phân cắt các polyprotein tiền thân gag và
gag-pol thành những protein cấu trúc và chức năng trong quá trình trƣởng thành của
virus. Protease HIV-1 đƣợc mã hóa bởi gen pol trong hệ gen của HIV-1 và là một
protease aspartyl (chứa aspartyl trong trung tâm hoạt động), họ retropepsin A2,
đƣợc tạo ra khi HIV-1 nhiễm vào tế bào vật chủ.
Protease HIV-1 là một dimer, chứa hai tiểu phần giống hệt nhau đƣợc sắp
xếp gần nhƣ theo kiểu đối xứng, mỗi tiểu phần có khối lƣợng khoảng 11 kDa
gồm 99 axit amin. Mỗi tiểu phần tạo thành các phiến gấp nếp β và một đoạn
xoắn α ngắn gần đầu C [47]. Trung tâm hoạt động của protease nằm tại mặt phân
giới của dimer, chứa bộ ba Asp25-Thr26-Gly27. Trong đó, mỗi monomer đều có
một bộ ba Asp-Thr-Gly với vị trí axit amin tƣơng ứng nhƣ sau: 25 (25’) - 26(26’) 27 (27’) và phân tử Asp cần thiết cho cả cấu trúc và hoạt tính xúc tác của protease
[36]. Protease HIV-1 có cấu tạo gồm ba vùng chính: vùng dimer hóa, vùng lõi và
vùng mũ.
Trung tâm hoạt động

Hình 3. Mô hình cấu trúc bậc hai của protease HIV-1 [47]
Một tiểu phần bao gồm: βa(1-4); βb(9-15); βc(16-27); βd(30-35); βa’(43-49); βb’(52-56);
βc’(69-78); βd’(83-85); Đoạn xoắn αh(86-94); chuỗi thẳng q(95-99) ở đầu C
Vùng dimer hóa gồm các axit amin: Chuỗi βa(1-4), βq(95-99), và axit amin 24-29;
Vùng lõi gồm các axit amin nằm ở 4 phần đầu sợi β : 10-32, 63-85, chứa trung tâm hoạt động
Vùng mũ gồm các axit amin từ 33-43 và 63-85 bao quanh trung tâm hoạt động.

12

1.2.2. Chức năng của protease HIV – 1
Về mặt sinh học, protease HIV-1 có vai trò quan trọng trong chu trình nhân
lên của HIV-1. Các chuỗi polyprotein (gag, gag-pol) là cơ chất đặc hiệu của
protease HIV-1, các polyprotein này đƣợc protease HIV-1 cắt thành các protein cấu
trúc và chức năng cần thiết cho virus hoàn chỉnh. Cụ thể, protease HIV-1 có thể
nhận biết và cắt các liên kết khác nhau trên chuỗi polypeptide gag để tạo thành các
protein cấu trúc: matrix P17 (MA), capsid p24 (CA), nucleocapsid p7 (NC) có vai
trò quan trọng hình thành lớp capsid và các protein bao bọc lõi tạo virus hoàn chỉnh;
protease HIV-1 còn thủy phân polypeptide gag-pol tạo thành ba enzym: protease,
reverse transcriptase và integrase cần thiết cho sự sao chép của HIV trong quá trình
lây nhiễm [25].
Ngoài ảnh hƣởng đến quá trình lây nhiễm, protease HIV-1 còn đóng vai trò
quan trọng trong quá trình sinh bệnh. Khi đã xâm nhiễm vào tế bào ngƣời, protease
HIV-1 không chỉ phân cắt các polypeptide của chính nó mà còn có thể thủy phân rất
nhiều protein của vật chủ nhƣ actin, procaspase 8, Bcl2 (protein điều hòa chết theo
chƣơng trình - apoptosis) [43]. Khi protease HIV-1 xuất hiện, gây độc và làm rối
loạn các hoạt động trong tế bào vật chủ. Nhiều nghiên cứu cũng khẳng định, sử
dụng các chất ức chế protease có thể ngăn chặn hiện tƣợng chết theo chƣơng trình
do protease HIV-1 gây nên [43].
Nhƣ vậy, Protease HIV-1 có vai trò quan trọng không thể thiếu trong chu
trình nhân lên của virus cũng nhƣ quá trình sinh bệnh ở ngƣời. Khi protease HIV-1
bị ức chế hoặc gen mã hóa protease HIV-1 bị đột biến, virus không thể đóng gói
thành virion hoàn chỉnh nên không thể xâm nhiễm vào tế bào vật chủ [19]. Một
trong những chất ức chế hoạt tính protease HIV-1 đƣợc biết đến đầu tiên là
pepstatin A [45].
1.2.3. Sơ lƣợc về nghiên cứu biểu hiện protease HIV-1 trên thế giới
Nguyên nhân mà cho đến nay chƣa sản xuất đƣợc vaccine HIV là do sự biến
đổi liên tục của kháng nguyên HIV-1, vì thế mà những bệnh nhân nhiễm HIV-1 chỉ

13


còn cách dùng thuốc để duy trì sự sống. Các nghiên cứu tập trung vào việc tìm ra
các chất ức chế sự xâm nhiễm, lây lan của HIV-1. Protease HIV-1 là một trong các
đích quan trọng nhất của liệu pháp điều chế thuốc ức chế HIV-1 vì protease HIV-1
có vai trò không thể thiếu trong chu trình sống của HIV-1. Do vậy, cần một lƣợng
lớn protease HIV-1 trong quá trình nghiên cứu tìm ra và tổng hợp các chất ức chế,
mà lƣợng protease HIV-1 trong virus HIV rất nhỏ nên việc tách chiết trực tiếp gần
nhƣ không thể thực hiện. Ngoài ra, protease HIV-1 cắt cơ chất rất đặc hiệu nên việc
dùng các protease khác làm mô hình cũng không có hiệu quả.
Protease HIV-1 đã đƣợc nghiên cứu sản xuất dƣới dạng tái tổ hợp bằng cách
biểu hiện trên vi khuẩn E. coli, trên nấm men S. cerevisiae hoặc bằng cách tổng hợp
hóa học các monomer 99 axit amin. Vi khuẩn E. coli đƣợc sử dụng khá phổ biến
trong nhiều nghiên cứu đầu tiên. Sau đó một số loại nấm men đã đƣợc chọn bởi một
số ƣu thế so với vi khuẩn E. coli trong biểu hiện protease HIV-1.
Năm 1989, một số nhà nghiên đã biểu hiện protease HIV-1 bằng việc sử dụng
các vector pPRT và pHIVexpo15 có promoter trp trong vi khuẩn E. coli [18; 19].
Protease thu đƣợc sau khi tinh sạch đƣợc xác định khối lƣợng phân tử (KLPT) của
một monomer khoảng 11kDa, bao gồm 99 axit amin, có hoạt tính phân cắt protein
gag p55 thành p24 và p17 cũng nhƣ phân cắt cơ chất tổng hợp [19]. Tuy nhiên,
protease HIV-1 biểu hiện thấp, chỉ chiếm 0,02% protein tổng số của tế bào, và băng
protease chỉ phát hiện đƣợc bằng thẩm tách miễn dịch với kháng thể đặc hiệu.
Đến năm 1990, Cheng và tập thể đã sử dụng hệ thống vector pET3AM với
promoter T7 để biểu hiện và tinh sạch protease HIV-1 ở tế bào E. coli JM105 đồng
nhiễm với phage αCE6 [15]. Tuy nhiên, với hệ thống biểu hiện này thì việc lây
nhiễm phage vào tế bào vi khuẩn là bắt buộc mà sự có mặt của phage có thể không
thích hợp cho quá trình lên men để sản xuất lớn [46].
Năm 1992, Rangwala và tập thể đã nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến quá

trình biểu hiện protease HIV-1 ở vi khuẩn E. coli. Nghiên cứu chỉ ra rằng, protease
HIV-1 tái tổ hợp không thể biểu hiện một cách đơn giản nhƣ các protein tái tổ hợp
khác ở vi khuẩn E. coli [41].

14


Năm 1993, Leuthardt và Roesel nghiên cứu gắn thêm 3 gốc histidine
(3xHIS) ở đầu N và đầu C của protease trong nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch
protease HIV-1 tái tổ hợp bằng hệ thống vector pDS56/3H-3H trên E. coli. Việc gắn
thêm 6 gốc HIS là một cải tiến tạo thuận lợi cho quá trình tinh sạch [31]. Kết quả
của nghiên cứu cho thấy 90% protease HIV-1 sau biểu hiện đƣợc thu ở phân đoạn
tủa của tế bào (pellet) và đƣợc hòa tan hiệu quả bằng đệm ly giải có guanidine 6M.
Protease HIV-1 đã đƣợc nhiều nhóm nghiên cứu biểu hiện trên vi khuẩn E.
coli bằng cách thiết kế các vector khác nhau. Tuy nhiên, các nghiên cứu này cũng
cho thấy biểu hiện protease HIV-1 có hoạt tính là gây độc giết chết tế bào [18]. Các
nhà nghiên cứu đƣa ra nhiều lý do giải thích, trong đó có dự đoán rằng protease
HIV-1 có thể thủy phân các protein chức năng của tế bào vi khuẩn E. coli [18].
Nhằm tìm cách khắc phục tính độc này, một số nhóm nghiên cứu đã nhân dòng và
biểu hiện protease HIV-1 bằng cách sử dụng các hệ thống và quy trình biểu hiện
khác nhau nhƣ sử dụng các promoter trp, λPL, ara BAD và tac [19; 46]. Một số
nghiên cứu đã tiến hành biểu hiện protease HIV-1 ở nấm men S. cerevisiae [39].
Pichuantes và tập thể (1989) đã biểu hiện thành công protease HIV-1 tái tổ hợp ở
nấm men [39]. Protease tạo ra cũng có hoạt tính tự cắt khỏi dạng protein dung hợp
để giải phóng protease HIV-1 99 axit amin cũng nhƣ có hoạt tính cắt cơ chất protein
gag tự nhiên.
Theo kết quả công bố của nhiều nhóm nghiên cứu về biểu hiện protease
HIV-1 cho thấy rằng quá trình sản xuất protease này vẫn còn gặp nhiều khó khăn:
Thứ nhất do protease HIV-1 có hoạt tính gây độc với tế bào chủ và chủ yếu đƣợc
biểu hiện ở dạng không hòa tan (90% dạng thể vùi) [15; 31]; Thứ hai do hàm lƣợng

protease này thu đƣợc chƣa cao, một số nghiên cứu chỉ có thể phát hiện đƣợc bằng
phƣơng pháp thẩm tách miễn dịch [37]; Thứ ba là protease HIV-1 tái tổ hợp chỉ có
hoạt tính khi ở dạng dimer [19; 46]. Tuy rằng, một số nhà nghiên cứu đã đƣa
plasmid pLysS hay pLysE vào tế bào E. coli để hạn chế tính độc và dung hợp
protease với các protein khác nhằm làm tăng hiệu suất biểu hiện, tăng tính tan và
thuận tiện cho tinh sạch cũng nhƣ đảm bảo hoạt tính [46].

15


Trong những năm cuối thế kỉ 20, đầu thế kỉ 21, đã có nhiều công trình
nghiên cứu về biểu hiện của protease HIV-1 tái tổ hợp mang những đột biến đặc
hiệu nhằm làm sáng tỏ cơ chế kháng thuốc, ái lực của protease đột biến với cơ chất,
hoặc nghiên cứu phân tích cấu trúc tinh thể của các dạng protease trong phức hợp
nhằm tìm ra các chất PI mới có hiệu lực cao [50].
Từ năm 2012 đến nay, những nghiên cứu về protease HIV-1 vẫn đƣợc các
nhà khoa học trên thế giới cũng nhƣ các trung tâm nghiên cứu rất quan tâm. Tuy
nhiên, hƣớng nghiên cứu chủ yếu về sự khác biệt trong tính đặc hiệu của protease
HIV-1 và protease HIV-2 [48]. Ngoài ra, một số nghiên cứu nhằm tìm hiểu các đột
biến của gen mã hóa protease HIV-1 khiến HIV-1 có thể kháng đƣợc thuốc ức chế,
từ đó tìm ra loại thuốc ức chế mới hiệu quả hơn [14]
Nhƣ vậy, các nghiên cứu về protease HIV-1 chủ yếu đƣợc biểu hiện ở vi
khuẩn E. coli. Trong khi, protease HIV-1 là protease của virus HIV-1 chỉ tạo ra ở tế
bào sinh vật nhân chuẩn, cần có quá trình biến đổi sau dịch mã mà E. coli lại không
thể đáp ứng đƣợc điều kiện này. Tuy đã có một số nghiên cứu trên thế giới đã biểu
hiện thành công protease HIV-1 trên nấm men S. cerevisiae. Hiện tại chƣa có công
bố nào về biểu hiện protease HIV-1 trên nấm men P. pastoris ở Việt Nam.
1.2.4. Thực trạng sản xuất protease HIV-1 ở Việt Nam
Những nghiên cứu về các enzym của HIV-1 ở Việt Nam có thể kể đến các
công trình nhƣ: Phan Trọng Hoàng và tập thể (2007) đã nhân dòng và biểu hiện

đƣợc gen mã hóa tiểu đơn vị P66 của reverse transcriptase của HIV-1 ở E. coli để
dùng cho các phản ứng tổng hợp cDNA từ RNA và tạo bộ kit chẩn đoán nhiễm
retrovirus [1]; Đồng Văn Quyền và tập thể (2008), Bạch Thị Nhƣ Quỳnh và tập thể
(2011) cũng đã biểu hiện thành công 3 gen mã hóa cho các kháng nguyên GP41,
GP120 và P24 của HIV ở E. coli [7; 8].
Từ năm 2003, Việt Nam đã sử dụng thuốc ức chế protease (PI) nhập nội để
điều trị cho bệnh nhân HIV/AIDS [49]. Việc tự sản xuất protease HIV-1 vẫn còn
trong thời gian nghiên cứu và thử nghiệm. Các nghiên cứu chủ yếu nhằm phát hiện

16


HIV trong huyết thanh, xác định các nhóm virus HIV gây bệnh và các đột biến liên
quan đến tính kháng thuốc, hoặc phát triển kit chẩn đoán HIV ở Việt Nam [3; 6; 9].
Nhằm thiết kế thuốc PI mới phù hợp với các chủng HIV lƣu hành tại Việt Nam,
năm 2010, các nhà khoa học của Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym
và Protein, Khoa Sinh học, trƣờng ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc gia Hà Nội,
do Giáo sƣ Phan Tuấn Nghĩa chỉ đạo, đã bắt tay vào nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu
protease virus gây suy giảm miễn dịch ở ngƣời (HIV) phân lập tại Việt Nam”, nhằm
mở ra khả năng tự sản xuất PI chống HIV ở Việt Nam. Đây là công trình đầu tiên ở
Việt Nam nghiên cứu có tính hệ thống, bài bản về phân lập, nhân dòng và biểu hiện
gen mã hóa protease HIV-1 tái tổ hợp từ chủng CRF01-AE của Việt Nam trong E.
coli [54]. Trong nghiên cứu này, gen mã hóa protease HIV-1 đƣợc thu nhận từ bệnh
nhân nhiễm HIV tại Việt Nam, tác giả đã biểu hiện thành công gen mã hóa protease
HIV-1 trong E. coli bằng vector pET32a, xây dựng đƣợc quy trình tinh sạch
protease HIV-1 tái tổ hợp chỉ với hai bƣớc và nghiên cứu một số tính chất của
protease HIV-1 [3]. Trong nghiên cứu này, tác giả cũng đã cải tiến gắn vào đầu N
trình tự tự cắt là 7 axit amin của protein gag-pol và đuôi 6xHIS tại đầu C của
protease HIV-1. Với cải tiến này, protease HIV-1 sau tổng hợp sẽ là chuỗi
polypeptide bắt đầu bằng axit amin Pro, và đuôi 6x HIS tạo thuận lợi cho quá trình

tinh sạch. Tuy nhiên, E. coli là một sinh vật nhân sơ và thiếu các cơ quan nội bào
chẳng hạn nhƣ mạng lƣới nội chất và bộ máy golgi nhƣ trong sinh vật nhân chuẩn.
Cho đến nay, Ở Việt nam chƣa có nghiên cứu nào biểu hiện protease HIV-1
trong nấm men P. pastoris để có thể so sánh và chọn ra một hệ thống tối ƣu nhất
trong ứng dụng sản xuất protease HIV-1 trong nƣớc.
1.3. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ P. PASTORIS
Tế bào nấm men đƣợc chọn là một giải pháp tốt cho việc biểu hiện protein của
sinh vật nhân chuẩn với hƣớng ứng dụng vào sản xuất lớn. Có hai hệ thống biểu hiện
nấm men là S. cerevisiae và P. pastoris. Trong đó, S. cerevisiae đã đƣợc nghiên cứu
biểu hiện từ những năm 1980, hệ thống này có nhƣợc điểm nhƣ protein tạo ra có gắn
đoạn oligosaccharide khá dài, từ 50-100 đƣờng manose [37]. Tuy mới đƣợc phát triển

17