Nghiên cứu sơ bộ thành phần hóa học của thân cây chè vằng (jasminum subtriplinerve blume oleaceae)

p
BOY TE
TRUÔNG DAI HOC DUOC HÀ NÔI

DINH PHÜONG LIÊN

NGHIÊN CtJU SO BÔ THÀNH PHAN
HOÂ HOC CÜA THÂN CÂY CHÈ VANG
(Jasminum subtriplinerve Blume Oleaceae)

KHOA LU AN TOT NGHTF.P
DUOC Si KHOÂ 1998-2003

Nguài huâng ddn

: PGS.TS Bê Thj Thuân
DS. Nguyên Quÿnh Chi
Noi thuc hiên
Bô mon Dirac lieu
Thôi gian thuc hiên: 5/3/03 -15/5/03

( ? / 3 J D .C r ^ \y \

i*(THir-VlK *
HA NOI, 5 - 2003

f4 4
/ ^4Dl


LÔI CÂM ON

W / l o i n / h iè t d u s it u &At±, f ô i æ in . e J u n i t h ù i i h e ü n t o u :

PGS.TS. BeThi Thuan
DS. Nguyên Quÿnh Chi
J là . n h u t u / u q t t ô i f i n 11/ t e n e t i è p /tu ô 'tiq d a n f ô i f t o u q q u â fr îit /i t in t e Itiètt
UltOii l u à n u t i l / .
Ç Jèi x i u b ù q t ô l o i n / b iè t Ou e u a n i i n h t o i t o à n t h è e u e t h a ï / q i â o , eô
q i â o , e u e e ê Ut/ f / m û t o i ê u f t o m / Im rviôtt ^ D uoe l i e u e t u i q e u e p l t è i u j /u n i
t r o u q f r u ô u q êtâ q i t i p êtô o ù t u o m o i (t ie n U iên f l u t û i i l d i e h o t ô i fio iu t
f h ù u h tô t U lu )a h u n i . Ç Jô i æ in e h à n fl iiu ilt e d r n oit s u q i t t p êtô (fin / h a u
et'u t e u e fit a i/ e â ït ii q i ù n l i e h o t ô i.
@ u êi e i t n q t ê i t i n êttû ïe e à i u o’n s u q iû p , êtô OÙ êtô u q o i ê u U lu eli l i
et n i Ifu n h è , u q n ô i t l i à u t r o u q sitô t q u â fr i a i t f ô i tlu i'e /t ie n êtê t ù i n ù t / .

'Jùù Ql&i, tn/ùij 16 thittu/ 5 tuint 2003
cS iu h o i ê u

Dinh Phircmg Liên


MUC LUC

DAT VAN DE............................................................................................................ 1
PHAN I - TÔNG QUAN.............................................................................................2
1.1. Mot sohiéu biet vê cây Chè vang...................................................................2
1.1.1. Dàc diëm thuc vât......................................................................................... 2
1.1.2. Phân bo.......................................................................................................... 3
1.1.3. Bô phân dùng, thu hâi và ché bien................................................................3
1.1.4. Thành phân hoâ hoc...................................................................................... 3

1.1.5. Tac dung, công dung.................................................................................... 3
1.2. Tôm tât phuang phâp nghiên cûu thành phân hoâ hoc............................. 6
1.2.1. Djnh tm h ....................................................................................................... 6
1.2.2. Dinh luong.....................................................................................................6
1.2.3. Chiét xuât......................................................................................................6
1.2.4. Phân lâp......................................................................................................... 7
1.2.5. Nhân dang..................................................................................................... 7
1.3. Phuong phâp nghiên cûu hop chat Flavonoid trong duoc lieu .................8
1.3.1. Dinh tmh sa bô flavonoid trong duoc lieu.................................................. 8
1.3.2. Dinh luong flavonoid.................................................................................... 9
1.3.3. Chiét xuâ't.................................................... ............................................. 10
1.3.4. Phân lâp.....................................................................................................11
1.3.5. Nhân dang.................................................................................................12
PHÂN II- THÜC NGHIÊM VÀ KET QUÂ............................................................ 13
2.1. Nguyên lieu và phuong phâp thuc nghiêm.............................................13


2.1.1. Nguyên lieu................................................................................................. 13
2.1.2. Phuong phâp thuc nghiêm........................... ................................................13
2.2. Thuc nghiêm và kêtquâ.............................................................................. 14
2.2.1. Dinh tmh câc nhôm chât tu nhiên trong thân cây Chè vàng..................... 14
2.2.2. Chiét xuât, dinh tmh flavonoid bàng sâc kÿ côt.......................................... 21
2.2.3. Phân lâp và nhân dang flavonoid.................................................................25
2.2.4. Phân lâp, phân tich và nhân dang chât M ................................................... 27
2.3. Bàn luân....................................................................... .............................. 28
PHAN III- KÉT LUÂN VÀ DE NGHI......................................................................29
3.1. Kêt luân......................................................................................................... 29
3.2. De nghi.......................................................................................................... 29

CÂC CHÜ VIÉT TÂT
SKLM

: Sâc kÿ ldp mông

SKG

: Sâc kÿ giay

UV

: Tûngoai

IR

: Hong ngoai


DAT VAN DE

Viêt Nam nâm trong vùng khi hâu nhiêt dôi cô thâm thuc vât phong phü và
da dang. Tir rat lâu dôi nhân dân ta dâ biét sir dung cây cô dé làm thuô'c phông
và chûa bênh. Chè vàng là mot cây thuôc dâ dugc su dung tir lâu trong dân
gian, tuy nhiên vé thành phàn hoâ hoc, chè vàng chua dugc nghiên cûu nhiêu.
Théo kinh nghiêm dân gian, chè vàng thuông dugc dùng cho phu nù sau khi
dê dé phông và chông nhiêm trùng, thiéu n^âu, met moi, kém ân. Ngoài ra chè
vàng côn dugc dùng dé chüa kinh nguyêt không dèu, thây kinh dau bung,
chüa tri câc vét thuang nhiêm trùng gây mü. Trên thé giôi cô nhiêu loài khâc
cùng chi (Jasminum) cüng dugc sir dung làm thuôc, dâ cô nhiêu tài lieu
nghiên cüu vê thành phân hoâ hoc và tac dung sinh hoc cüa câc loài dô. Tuy

nhiên chüng tôi chua tïm thây tài lieu nào trong và ngoài nuôc nghiên cüu eu
thé vê câc chat cô hoat tînh sinh hoc trong cây chè vàng à nuôc ta. Mot diêu
dang quan tâm nûa là mot. sô tài lieu và ngay câ Dugc dién Viêt Nam in lân
thü nhâ't (tâp II) cüng dêu viêt bô phân dùng cüa chè vàng chî là la, nhung
trong thuc té nhân dân ta vân dùng câ thân và lâ cây chè vàng, phâi châng cô
thé cô su khâc nhau vê thành phàn hoat chât giûa thân và lâ cüa cây?
Xuâ't phât tù thuc té trên, chüng tôi tiê'n hành làm khoâ luân tôt nghiêp vôi
dê tài "Nghiên cüu sa bô thành phàn hoâ hoc cüa thân cây chè vàng"
nhàm hai mue tiêu là:
• Xâc dinh mot sô hgp chât tu nhiên trong thân cây chè vâng.
•

Chiét tâch, phân lâp và du doân câu truc chât phân lâp dugc.


PHAN I : TÔNG QUAN
1.1.. MOT SÔ HIÉU BIÉT VE CÂY CHÈ VÀNG
1.1.1. Dde diem thuc vât:
Chè vâng cèn cô tên khâc nhtf: dâm trâng, lài ba gân [3], chè cuôc man,
dây câm vân, chè vàn [9]. Chè vâng cô tên khoa hoc là:
Jcisminum subtriplinerve Blume, thuôc ho Nhài (Oleaceae).
Chè vàng là mot cây nhô, moc thành bui à bô rào hay bui tre hoâc bâm
vào câc cây lôn. Thân cây crïng chia thành tùng dot duông kmh 5-6mm và
viron dài tôi 15-20m, thân và cành dêu nhân. La moc dô'i hinh müi mâc, phîa
cuô'ng tu hay hcri tron, dàu hai nhon, dài 4-7,5mm, rông 2-4,5mm; nhüng la
phia trên nhô hon la phia duôi, mép nguyên trên cô chia 3 gân rô rêt. Cuông la
nhân, dài 3-12mm. Hoa moc thành xim, nhiêu hoa ( chùng 7-9 hoa), cânh hoa
màu trâng. Quâ hinh càu, diràng kfnh 7-8mm. Khi quâ chîn cô màu vàng,
trong quâ cô mot hat rân châc. Mùa quâ chîn vào thâng 7 dên thâng 10 trong
nâm [8].

Ânh 1: Cây chè vâng.
-2-


1.1.2. Phân bo :
Chè vàng moc hoang và duoc trông nhiêu à vùng rùng nui và trung du
nuôc ta. Gap nhiêu à câc tînh Lào Cai, Vînh Phüc, Quâng Ninh, Hà Nôi, Ninh
Binh, Thanh Hoâ, Nghê An, Thùa Thiên - Hué, Quâng Nam, Dà Nâng, Khânh
Hoà [6,7]
1.1.3 Bô phân dùng, thu h â i, chê bien:
Théo câc tài lieu [6,8,11] bô phân dùng cüa chè vàng là la. Nhung trên
thuc té nhân dân ta hay dùng câ lâ và thân chè vàng thu hâi quanh nàm, co thé
dùng khô hoâc tuai.
1.1.4 Thành phân hoâ hoc:
Mot so tài lieu môi chî de câp dén su cô mât cüa nhua, flavonoid,
alcaloid trong lâ chè vàng [3,8]. Tù cao côn 90° cüa cà lâ và thân cây chè .
vàng, Nguyên Thi Ninh Hâi [7] dâ tién hành tâch phân doan bàng câc dung
môi cô dô phân eue khâc nhau. Dira vào két quâ thu duoc bàng phuong phâp
sàc kÿ dôi vôi tirng phân doan tac già dâ so bô két luân trong cây chè vàng cô
câc dân xuât terpen, nhua lighin, glucosid dâng, flavonoid và alcaloid. Tuy
nhiên két quâ này duge dua ra hoàn toàn chî dira trên màu sàc cüa vêt chat
trên sâc kÿ dô sau khi phun thuôc thü hiên màu, két hop vôi câc két quâ
nghiên cüu dâ duoc công bô trên thé giôi vê mât hoâ hoc cüa mot sô loài
thuôc chi Jasminum cô nghîa là tac giâ luân an môi chî dè câp râ't so bô vé câc
nhôm châ't cô trong thân và lâ cây chè vàng.
1.1.5. Tac dung, công dung :
1.1.5.1

.T ac dung duac ly

□ Tâc dung khâng khuln:
Bàng phuong phâp •khuêch tan, dùng khoanh giây trên môi truông
thach, câc dang ché phâm cüa thân và lâ chè vàng (cao nuôc, cao côn 90°, 40°)
cô tâc dung khâng khuân manh vôi câc chüng vi khuln Staphylococcus
aureits, Streptococcus haemolyticus, Shigella shigea, Samonella typhy, tâc
-3-


dung yéu vai Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Shigella sonnai [7],
Bênh viên Thâi Binh dâ làm khâng sinh do so sânh chè vàng vai câc
khâng sinh peniciline, streptomycin, clorocid và sulfamid thi thây chè vàng cô
tâc dung khâng sinh manh hon câc thuôc trên doi vôi tu càu khuàn và liên câu
tan huyê't [8].
□ Tâc dung chông viêm:
Chè vàng cô tâc dùng Chông viêm cap trong mô hïnh gây phù vai
carragenin, kaolin và serotonin. Dôi vôi viêm man chè vàng cô tâc dung à
mire dô vira. Chè vàng gây thu teo tuyên ûc cüa chuôt công non [7].
□ Tâc dung làm lành vêt thuang và bào vê niêm mac:
Dang thuôc mô chè vàng cô tâc dung thuc day quâ trïnh hàn gân vêt
thuang trên da dông vât thi nghiêm. Ngoài ra dang cao côn 90° cüa thân và lâ
côn cô khâ nâng bào vê niêm mac da dày, chông lai câc yéu to gây loét do u
trê dich vi, do thành mach bi hu hai, thiéu mâu [7].
□ Tâc dung dô'i vôi hoat dông cüa tü cung:
Cao nuôc chè vàng 1:1 lieu 0.1g nhô vào 30ml dich nuôi làm giâm co
bôp tü cung cô lâp chuôt công tuang tu papaverin. Chè vàng không làm co bôp
tü cung nhu ich mâu, chàm mèo, nhung chè vàng không khâng lai tâc dung
cüa oxytoxin trên tü cung cô lâp chuôt công. Dây là ca sô dê gôp phàn xâc
minh giâ tri khoa hoc cüa kinh nghiêm nhân dân dùng chè vàng cho chi em
phu nü sau khi sinh dé, dông thôi dùng dé chüa bé kinh hoâc thây kinh dau

bung [7].
□ Mot sô'tâc dung khâc:
Chè vàng cô khâ nâng tâng tiét dich mât và cân mât. Cô thé coi chè vàng là
mot thuôc lai mât.
Chè vàng làm mât tâc dung kîch thich co bôp ruôt cüa hai chât acetylcholin
và Bari clorua trên ruôt cô lâp cüa chuôt công trâng.


Két quà nghiên cûu vé dôc tînh cap và dôc tmh mân cho thây chè vâng ît dôc
[7], Nhung không dùng chè vâng cho phu nû co thai.
1.1.5.2. Cô.ng dung theo kinh nghiêm dân gian
□ Theo Y hoc co truyên:
Nhu chüng tôi dâ dê câp à trên, bô phân dùng cüa chè vâng theo da sô câc
tài lieu là la. La chè vàng cô vi dâng, hoi chât, tînh âm, qui kinh tâm, tÿ vôi
công nâng khu phong, hoat huyêt, dièu kinh, tiêu viêm, trù mü [8]; thuông
duoc dùng sâc uông cho phu nû sau khi sinh nhât là sau khi sinh bi nhiêm
trùng, sot cao, viêm hach bach huyêt, viêm tu cung và viêm tuyén sua. Ngoài
ra, chè vàng côn duoc dùng cho phu nû kinh nguyêt không dêu, bé kinh hoâc
thây kinh dau bung; chûa phong thâ'p, dau nhrïc câc dâu chi và khôp xuong.
Bên canh do chè vàng côn duoc dùng dun nuôc tâm de chûa ghè lô, chôc dâu,
câc bênh ngoài da [8]. Ngoài công dung làm thuôc, thuc té à mot sô nüi hiên
nay chüng tôi thây nglrôi dân su dung câ thân và lâ chè vàng de hâm uông
thay chè hàng ngày.
□ Mot sô bài thuôc:
1. Bài thuôc chûa kinh nguyêt không dêu, bé kinh dau bung [7],
Chè vàng: 20g
Ich mâu: 16g
Hy thiêm: 16g
Ngài cûu: 8g
Bach dàu nû: 8 g

Nuôc: 500ml
Sâc côn 300ml, chia ba lân uông trong ngày.
2. Dùng lâ chè vâng chûa âp xe vu:
Dùng lâ chè vâng giâ nât roi trôn vôi côn 50° dâp vào noi sung dau
ngày 3 lân, dêm 2 lân. Thôi gian diêu tri thucmg

là 1 ngày - 1tuân tuÿ theo

bênh nâng, nhe và duac chûa bàng lâ chè vàng sôm hay muôn.Trung bînh tù
-5-


1 , 5 - 2 ngy. Bờnh nhõn diộu tri bng chố võng thuụng hột sot sau 2 gi dựng
thuụ'c. Sau khi khụi, cụng thỹc v sụ luong bach cu trụ lai bùnh thuụng, sua
cỹng trụ lai binh thuụng [5].
1.2. TễM TT PHUĩNG PHP NGHIấN CĩU THNH PHAN HO HOC
CY THUOC
1.2.1. Dinh tmh :
De dinh tợnh cõc nhụm chõt tu nhiờn trong cõy thuục truục hột tiộn hnh
bõng cõc phõn ỹng hoõ hoc dộ xõc dinh duoc bụ phõn no cỹa cõy cụ nhỹng
nhụm chõt gù. Sau dụ ta dinh tmh bng SKLM hoõc SKG de xõc dinh trong
nhụm chõt dụ cụ bao nhiờu vờt chõt v vờt chõt no cụ dụ dõm cao (nụng dụ
cụ thộ cao) de tự dụ cụ dinh huụng trong viờc chiột xuõt v phõn lõp.
1.2.2. Dinh luong :
Dinh luong nhụm chõt chợnh l võn dờ quan trong, nụ giỹp xõc dinh bụ
phõn no cỹa cõy cụ hm luong chõt dụ cao nhõt v hm luong chõt dụ cao
nhõt vo thụi diởm no trong nõm de tự dụ cụ kộ hoach thu hai phự hop.
1.2.3. Chiột xuõt :
Phuong phõp chiột xuõt bao gụm cõ viờc chon dung mụi, dung eu chiột v
cõch chiột. Cõc hop chõt tu nhiờn cụ tợnh chõt dõc trung khõc nhau v tợnh chõt

cn quan tõm nhõt trong chiột xuõt l tợnh phõn eue. Tuy theo dụ phõn eue cỹa
nhụm chõt de chon dung mụi chiột thợch hop nhõt.
Phuong phõp chiột xuõt co diởn mot duoc lieu de nghiờn cỹu thõm dụ l
dựng mot dõy dung mụi bõt dõu tự khụng phõn eue dộn phõn eue manh ( Vợ du
dõy dung mụi : ether dau, ether, cloroform, cụn v cuụi cựng l nuục) dộ chiột
phõn doan cõc chõt ra khụi duoc lieu.
Cõch chiột thụng dung l chiột nụng bng mõy chiột liờn tue (Soxhlet)
hoõc chiột hụi luu. Cõch chiột don gian nhõt l ngõm phõn doan hay cụn goi l
chiột nguụi. Ngoi ra cụn chiột bng dung eu ngõm kiờt, chiột nguoc dụng...


Dira vo tùnh phõn eue cỹa dung mụi v cỷa cõc hop chat dộ cụ thở dur
doõn su cụ mõt cỹa cõc chat trong mụi phõn doan chiột. Vf du : trong dich
chiột cloroform sở cụ mõt coumarin, quinon, cõc aglycon do glycosid thu
phõn tao ra, mot sụ alcaloid base yộu... hoõc trong dich chiột cụn sở cụ mõt
glycosid, alcaloid, flavonoid, cõc hop chõt phộnol khõc, acid hỹu co, tanin...
Khi cõn chiột lõy ton bụ thnh phõn trong duoc lieu thù dựng dung mụi
thich hop nhõt l cụn (methanol, ethanol) 80%. Cụn, nhõt l methanol duoc
xem l dung mụi van nõng, no ho tan duoc cõc chõt khụng phõn eue dụng
thụi cỹng cụ khõ nõng tao dõy nụi hidro vụi cõc nhụm phõn eue khõc. Dich
chiột cụn dem bục hoi dung mụi sở duoc cao ton phõn chira hõu hột hop chõt
cỷa duoc lieu.
Khi cõn tõch phõn doan cõc hop chõt trong cao thợ sỹ dung mot dõy dung
mụi khụng ho lõn vụi nuục v cụ dụ phõn eue tự yộu dộn manh. Vf du dõy
dung mụi : ether dõu, ether, cloroform, ethyl acetat, butanol...
1.2.4. Phõn lõp :
Phuong phõp pho biộn nhõt de phõn lõp chõt l dựng sc k cụt. Sõc k l
mot phuong phõp võt l dựng de tõch riờng cõc thnh phõn ra khụi hụn hop
bng cõch phõn bụ chỹng ra hai pha : mot pha cụ bờ mõt rụng goi l pha cụ
dinh v pha kia l mot chõt long hoõc khi goi l pha di dụng, di chuyởn di qua

pha cụ dinh. Trong sõc k cụt pha tùnh l chõt rõn duoc nhụi thnh cụt, nhụ dụ
m cụ thở khai triởn dung mụi liờn tue vụi nhiờu hờ dung mụi khõc nhau tự
phõn eue yộu dộn phõn eue manh.
1.2.5. Nhõn dang
Dõu tiờn ta phõi dinh tmh bng cõc phõn irng hoõ hoc, SKLM hoõc SKG 1
chiờu khai triởn ợt nhõt vụi 3 hờ dung mụi khõc nhau hoõc sc k 2 chiờu vụi 2
hờ dung mụi khõc nhau de xem. chõt dụ dõ thuc su tinh khiột chua.
Sau dụ sc k so sõnh vụi chõt chuõn du* kiộn. Nờu dung nhu du kiộn, chõt
dụ sở cụ cựng giõ tri Rf vụi chõt chuan trờn cõ ba hờ dung mụi khõc nhau.
-7-


Dộ khng dinh thờm, tien hnh do dụ chõy chõt thir hoõc hụn hop chõt thir
v chõt dir kiộn trong cựng diộu kiờn dira trờn nguyờn tõc : 2 chõt rn nộu l
cựng mot loai hop chõt thi diởm chõy cỷa hụn hop võn khụng thay doi so vụi
diởm chõy cỹa tựng hop chõt riờng rở. Su hiờu chợnh nhiờt dụ trong khoõng
2C. Nộu hai chõt dụ l mot thi nhiờt dụ cỷa hụn hop bng nhiờt dụ cỷa chõt
du kiộn 2C.
Ngoi ra ta cụ thộ so sõnh thờm cõc pho cỹa hai chõt trờn vụi nhau. Doi
vụi mot chõt m chỹng ta chua tim duoc chõt du kiộn thi ta phõi do pho cỷa nụ
dộ tim cụng thỹc. Cõc pho thu'dng do : pho tu ngoai (UV), pho hụng ngoai
(IR), khụi pho (MS). Ngoi ra nộu cụ diờu kiờn thi do thờm pho cụng huong tự
hat nhõn (NMR) v pho nhiờu xa tia X (X-Ray).
1.3. PHUONG PHP NGHIấN CU HOP CHAT FLAVONOID TRONG
DUOC LIEU:
Cỹng nhu cõc hop chõt tu nhiờn khõc trong duoc lieu, khi nghiờn cỹu hop
chõt flavonoid dờu phõi tiộn hnh theo cõc buục sau : dinh tmh, dinh luỗmg,
chiột xuõt, phõn lõp v nhõn dang.
1.3.1. Dinh tmh sa bụ flavonoid trong duoc liờu:
Truục hột bng phõn ỹng hoõ hoc, vợ du: phõn ỷng Cyanidin, phõn ỹng vụi

dung dich NaOH 10%, vụi dung dich FeCl3 5% ... de xõc dinh bụ phõn no
cỹa cõy cụ flavonoid. Sau dụ tiộn hnh dinh tmh bng SKLM hoõc SKG nhm
xõc dinh xem cụ bao nhiờu vột chõt v vột chõt no co dụ dõm cao nhõt, tự do
cụ huụng di trong viờc chiột xuõt v phõn lõp.
Dụ'i vụi flavonoid : SKG hiờn nay võn l phuang phõp thụng dung trong
phõn tich. Thuụng dựng giõ'y Whatman sụ 1,3 l thich hop cho hõu hột cõc
flavonoid. Mot sụ hờ dung mụi thụng dung vụi flavonoid hay dựng khai triộn
trong SKG l:


Acid acetic: nuục [15:85]



n-Butanol: acid acetic: nuục [4:1:5, pha trờn]
-8-


•

Cloroform: acid acetic: nuôc [13:6:1]

•

Phénol: nuôc [3:1]

•

Acid acetic: acid clohydric : nuôc [30:3:10]

Thuông su dung SKG mot chiêu và hai chiêu trong hai hê dung môi
khai trién khâc nhau.
SKLM: Mac dù SKG hay duoc su dung trong phân tîch flavonoid nhung
SKG không thuân tien do ton nhiêu thôi gian, dô nhay không cao, cho nên
ngày nay song song vôi viêc su dung SKG thi viêc âp dung SKLM ngày càng
nhiêu vï nô khâc phuc duoc nhûng han ché cüa SKG. Thuông sü dung bân
mông vôi chat hâp phu là silicagel, cellulose và polyamid. SK duoc trién khai
trong câc hê dung môi cô dô phân eue khâc nhau. Viêc lira chon hê dung môi
phu thuôc vào câu truc cüa câc flavonoid và chât hâp phu cüa bân mông.
1.3.2. Dinh luong flavonoid:
Câc flavonoid thuông duoc dinh luong bàng mot sô phuong phâp sau:
□ Phuong phâp cân:
Dùng trong truông hop chiêt flavonoid bàng dung môi thîch hop, loai tap
chât, dem sây khô tôi khôi luong không ddi roi cân. Cüng cô truông hop nguôi
ta thuÿ phân (dinh luong Rutin trong hoa hoè) nuôc duoc loc và lâc vôi dung
môi hüu co, bôc hoi dung môi, sây roi dem cân. Phuong phâp chî ùng dung
cho nhüng nguyên lieu giâu flavonoid và dich chiêt ît tap.
□ Phuong phâp do quang:
Tiên hành tao màu flavonoid bàng mot sô phân üng (phân ùng
Cyanidin, phân ùng kêt hop vôi muôi diazo...) rôi do mât dô quang ô buôc
song thîch hop, dô'i chiêu vôi duông cong chuân cüa mot chât tinh khiét.
Phuong phâp do pho tü ngoai: Dua vào dô hâp thu phân tü s hoâc dô hâp thu
E un, à mot buôc song và dung môi qui dinh cho tùng loai flavonoid.
Nhu vây, câc phuong phâp dinh luong flavonoid cho ta biét hàm luong
flavonoid trong duoc lieu, xâc dinh duoc bô phân nào cüa cây cô hàm luong
-9-


cao nhât và hàm luong cao nhât vào thôi gian nào trong nâm dé tù dô xâc dinh
duoc thôi gian thu hâi duoc lieu cho phù hop.

1.3.3. Chiét xuât:
Nguyên lieu: dé nghiên cüu thành phân hoâ hoc cây thuôc trong diëu kiên
cho phép thî nên dùng duoc lieu tuoi. Duoc lieu thu hâi xong on dinh bàng
câch nhüng vào côn hoâc nuôc dun soi trong vài phüt. Sau dô dé râo nuôc và
làm khô tu nhiên. Trânh su dung nhiêt dô cao dé làm khô duoc lieu. Khi thu
hâi nguyên lieu phâi loai bô phân bi sâu bênh, vât kÿ sinh ânh huong tôi két
quâ nghiên cüxi. Xâc dinh tên khoa hoc cüa cây là môt công viêc quan trong
phâi làm.
Dung môi: Không cô nguyên tâc chung cho viêc chon dung môi chiét xuât
flavonoid vi chung cô dô tan râ't khâc nhau trong nü'oc và câc dung môi hùu
co. Nôi chung câc glycosid cô dô phân eue manh hon câc aglycon tuong üng.
Dôi vôi câc aglycon thï isoflavon, isoflavanon và câc flavon, flavonol cô nhièu
nhôm metoxy và ît nhôm hydroxy dêu là nhüng chât phân eue yéu. De chiét
chung thuông dùng câc dung môi phân eue yéu nhu benzen, cloroform, ethyl
acetat. Mot sô cô thë tan mot phân trong ether dâu.
Câc flavon và flavonol cô nhiêu nhôm hydroxy, câc biflavon, chalcon và
glycosid là nhùng chât phân eue manh. Chiét chung bàng côn, nuôc hoâc hôn
hop côn- nuôc. Dung môi cô thë âp dung cho hâu hét câc flavonoid là dung
dich côn 80% hoâc 60% (ethanol, methanol). Chiét bàng nuôc nông âp dung
tôt vôi câc polyglycosid.
Flavonoid do cô câc nhôm OH phénol nên chung tan trong kiêm, loi dung dàc
tmh này cô thë chiét chüng bàng dung dich kiêm loâng, nuôc vôi. Sau dô acid
hoâ dich chiét dë két tüa flavonoid hoâc tâch ra bàng dung môi hüu co ô môi
truông acid.
Phuong phâp chiét xuât: Thuông dë chiét xuât flavonoid nguôi ta phâi loai
câc tap chât thân dâu bàng ether dâu hoâ hay cloroform truôc hoâc sau khi
-10-


chiét flavonoid bàng dung môi thich hop. Câch chiét thông dung là chiét nông

bàng mây soxhlet hoâc chiét hôi liru. Câch chiét don gian nhât là ngâm phân
doan hay côn goi là chiét nguôi. Ngoài ra côn chiét bàng dung eu ngâm kiêt,
chiét ngugc dông.
Môi phuong phâp chiét xuât dêu cô uu diëm và nhuoc diëm riêng. Tuÿ vào
tînh chât duoc lieu và dung môi dem chiét xuât mà ta chon ra phuong phâp
tien loi và hiêu quâ nhât.
1.3.4. Phân lâp:
Dé phân lâp tùng chât flavonoid ra khôi hôn hop câc chât, nguôi ta hay âp
dung câc phuong phâp sau dây:
Sac ky côt: Câc chât hâp phu thuông dùng là bot polyamid, cellulose,
silicagel, sephadex LH20 và G25. Trong dô polyamid và sephadex LH20 cô
thé dùng dé tâch tât câ câc loai flavonoid.
Trong sâc kÿ côt, chât .hâp phu hoâc chât làm nên cho pha cô dinh duoc nhôi
trong câc ong hinh tru. Nhô vây mà cô thé khai triën dung môi liên tue vôi
nhiêu hê dung môi khâc nhau tù' phân eue yéu dén phân eue manh. Tuÿ theo
tînh chât cüa chât duoc sü dung làm côt mà su tâch trong côt sê xây ra theo co
ché hâp phu (côt hâp phu) hoâc theo co ché phân bô (côt phân bô).
Côt hâp phu thuông sü dung chât nhôi côt là silicagel cô hat 0.063 - 0.200
mm. Khi cho dich chiét di qua, do tînh hâp phu khâc nhau mà trong dich chiét
câc chât tâch thành câc lôp riêng biêt. Câc chât hâp phu manh cô khâ nâng
day câc chât hâp phu yêu xuông duôi. Khi cho mot dung môi nguyên chât di
qua côt, câc lôp chât lân luot duoc kéo ra khôi côt hâp phu và su tâch riêng
duoc hoàn chînh.
Côt phân bô thuông dùng châ't nhôi côt là sephadex LH20. Khi cho dich chiét
di qua do câc chât cô trong luong phân tü khâc nhau mà trong dich chiét chay
qua côt câc chat cô khâ nâng tâch thành câc lôp riêng biêt. Khi dùng dung môi


nguyên chât di qua côt, câc chât co trong lirong phân tü lôn sê bi dây xuông
truôc, tiê'p theo là câc chât cô trong luong phân tü nhô hon ra sau.

Dùng SKG hoâc SKLM.
SK c h é hoâ.
SK long hiêu nâng cao HPLC: Dây là phuong phâp hiên dai nhât hiên nay.
1.3.5. Nhân dang:
Sau khi dâ phân lâp duoc hop chât flavonoid, viêc dàu tiên phài làm là
tien hành dinh tfnh lai bàng câc phân iïng hoâ hoc, SKLM hoâc SKG hai chiêu
vôi hai hê dung môi khâc nhau vôi mue dich kiëm tra xem chât phân lâp duoc
dâ dat dô tinh khiêt chua.
Viêc phân tich câc hop chât flavonoid hiên nay tuong dôi nhanh chông
và cô hê thông nhô üng dung và phôi hop câc phuong phâp phân tîch quang
pho nhât là pho tü ngoai, công huông tù hat nhân, khôi pho.
Pho tü ngoai cüa hàu hét câc flavonoid gôm hai bàng hâp thu eue dai
chù yêii:
■ Bàng 1: 300-400nm
■ Bàng 2: 240-285nm
Khôi pho rat cô giâ tri xâc dinh câu truc flavonoid nhât là khi luong chât
thu chî cô duoc rât ît (tü cuông dô manh và thuông dông thôi là pic gôc. Ngoài ion phân tü, thuông
cô pic chü yéu (M-H)+ và nêu là dân chât metoxy thi thêm pic (M-CH3)+.


PHAN II
THUC NGHIÊM VÀ KET QUÂ

2.1. NGUYÊN LIÊU VÀ PHUONG PHÂP THUC NGHIÊM
2.1.1. Nguyên lieu:
Cây chè vàng duoc thu hâi tai xâ Dông San, thi xâ Tam Diêp, tmh Ninh
Binh vào thâng 6 nàm 2002.
Duoc lieu thu hâi vê duoc phoi khô bô lâ sây ô 40 - 50° C trong vài giô,
sau dô tân nhô.

2.1.2. Phuong phâp nghiên cuu:
2.1.2.1. Dinh tïnh câc nhôm chât tu nhiên theo phuong phâp ghi trong tài lieu
thuc tâp duoc lieu[2], bài giâng duoc lieu[ 1] và phuong phâp nghiên cuu hoâ
hoc cây thuôc [4].
2.1.2.2. Dinh tmh flavonoid bàng sâc kÿ giây và sâc kÿ lôp mông
a. giây mot chiêu tù duôi lên và sâc kÿ giây hai chiêu vôi giây Whatman
sô 1. Su dung hai hê dung môi:Hê I: Acid acetic: nuôc [ 15 : 85 ]
Hê II: nButanol: acid acetic: nuôc [ 4 : 1 : 5 , pha trên]
Thuôc thü hiên màu: hoi NH3 và dung dich A1C13 3% trong côn.
b.Dinh tmh flavonoid bàng sàc kÿ lôp mông: Dùng bàn silicagen chê' sàn
phât quang cüa hâng Merck kÿ hiêu 60 F254 Merck. Hê dung môi khai triën:
Ethylacetat: acid formic: nuôc [6:1:1].
2.1.2.3. Phân lâp flavonoid bàng sâc kÿ côt:
Chat nhôi côt: Sephadex LH20
Côt sàc kÿ bàng thuÿ tinh,.duông kmh d = 2cm, chiêu cao h = 40cm
Dung môi rüa giâi là dung dich methanol 80%.
2.1.2.4. Nhân dang flavonoid:
-13-


Bàng câc phân üng hôa hoc và phuong phâp quang pho.
Phuong phâp quang pho:
+ Do pho tir ngoai trên mây UV - VIS Spectrophotometer carry IE - varian
(Autralia) tai phông Thi nghiêm trung tâm - trucmg dai hoc Duoc Hà Nôi.
+ Do pho hông ngoai trên mây FT - IE Spectrophotometer 1650 - Penkin
Elmer (USA) tai phong Thi nghiêm trung tâm - trucmg dai hoc Duoc
Hà Nôi.
+ Do khôi pho (MS ) trên mây 5989 - B - MS tai phong câ'u truc, Viên hoâ
hoc.
2.2. THUC NGHIÊM VÀ KÊT QUÂ

2.2.1. Dinh tinh câc nhôm chât tu nhiên trong thân cây chè vàng bàng câc
phân ung hoâ hoc:
2.2.1.1. Dinh tinh flavonoid
Cho 2 gam duoc lieu vào mot ông nghiêm to. Thêm 5ml côn 90°. Dun
câch thuÿ trong vài phüt, loc. Dich loc thu duoc tiên hành làm câc phân üng:
□ Phân ûng vôi kiêm:
Nhô 1 giot dich chiêt lên tô giây loc, de khô, ho lên miêng lo dung
amoniac dàc thây màu vàng tàng lên.
□ Phân ûng vôi sàt (III) clorid 5%:
Cho 1ml dich chiét vào ông nghiêm, thêm vài giot dung dich sàt (III)
clorid. Thây xuât hiên màu xanh rêu.
□ Phân trng Cyanidin:
Cho 1ml dich chiét vào ông nghiêm, thêm vài giot dung dich acid HC1
dàc và bot magiê kim loai, dun câch thuÿ vài phüt thây dung dich chuyén màu
hông.
Scf bô ket luân trong duçfc lieu cô flavonoid.


2.2.1.2.. Dinh tợnh coumarin:
Cho vo mot binh non cụ nỹt mi 3g bot duoc lieu, thờm 20ml cụn 90,
thợnh thong lõc. De yờn qua dờm, loc qua giõy loc. Dich loc tiờ'n hnh lm
cõc phõn ợợng dinh tợnh:
Phõn ung m v dụng vụng lacton:
Cho vo 2 ong nghiờm, mụi ong 1ml dich chiột. Thờm vo ong thir nhõt
0,5ml dung dich NaOH 10%, ong thir 2 de nguyờn. Dun cõch thu cõ hai ong
nghiờm dộn soi, dộ nguụi, roi quan sõt:
- ong 1: cụ tỹa duc mu vng.
- ong 2: trong suụt.
Thờm vo cõ 2 ong nghiờm mụi ong 2ml nuục cõt, lõc dờu, quan sõt:
- ong 1: trong suụt.

- ong 2: cụ võn duc.
Acid hoõ ụngl bng vi giot HCL dõm dõc. ụngl sở trụ lai duc nhu
ong 2.
Phõn irng vụi thuục thir Diazo:
Cho vo ong nghiờm 1ml dung dich loc, thờm vi giot dung dich NaOH
10%. Sau dụ cho vo ụng nghiờm 2 giot thuục thir diazo thõy xuõt hiờn mu
dụ sõm.
Soi hunh quang duụi õnh sõng tir ngoai khi cho tõc dung vụi dung
dich kiờm:
Nhụ 1 giot dich chiột lờn mot miộng giõy loc, nhụ tiộp lờn dụ 1 giot
NaOH 10% , sõy nhe. Che nira vờt bng dụng xu rụi soi duụi tia tir ngoai. Sau
vi phỹt bụ dụng xu ra thõy nira khụng che sõng hon nira dõ che. Tiộp tue soi
thõy nira bi che sõng dõn lờn.
Set bụ kột luõn trong dicỗc lieu cụ coumarin.


2.2.1.3. Dinh tinh Saponin:
Cho vo ong nghiờm to 5 gam duoc lieu, thờm 10ml cụn 70, dun cõch
thu 5 phỷt, loc nụng qua giõy loc. Dich loc dở lm cõc phõn irng dinh tmh:
Phõn ỹng Salkovki:
Lõy lm l dich loc cho vo ong nghiờm, thờm 1ml acid sulfuric dõc tir tir
theo thnh ong nghiờm, thõy xuõt hiờn mot vụng nõu dụ ụ giợra hai lụp chõt
long.
Hiờn tuong tao bot:
Lõy 1ml dich loc cho vo mot ụng nghiờm, thờm 5ml nirục cõt. Lc k
trong 5 phỷt thõy cụ cụt bot bờn.
So bụ kột luõn trong duoc lieu cụ Saponin.

2.2.1.4 Dinh tinh tanin, dung khỹv acid hiùu co:
Cho vo ụng nghiờm to 2g duoc lieu, thờm 15ml nuục cõt, dun soi truc tiộp

trờn bờp diờn trong 5 phỹt, loc nụng qua giõy loc gõp nờp. Dich loc dở lm cõc
phõn ỹng dinh tmh:
Dinh tmh tanin:
.

Phõn un g vụi thuục thỹ st (III) clorid 5%:

Cho vo ụng nghiờm 1ml dich loc, thờm vi giot thuục thỹ thõy xuõt
hiờn mu xanh rờu.
.

Phõn ỹng vụi dung dich gelatin 2%:

Cho vo ụng nghiờm 1ml dich loc, thờm vi giot thuục thỹ khụng thõy
xuõt hiờn tỹa bụng trng.
So bụ kột luõn trong duoc lieu khụng cụ tanin.
Dinh tmh acid hỹu co:
Lõy 2ml dich loc cho vo ụng nghiờm, thờm ft bot Na2C 0 3 khụng thõy
xuõt hiờn bot khi.
So bụ kột luõn trong duỗfc lieu khụng cụ acid hùcu co.
-16-


□ Dinh tmh duông khü tir do:
Lây 2ml dich loc cho vào ong nghiêm, thêm 2 giot thuôc thu Fehling A
2 giot Fehling B, dun câch thuÿ thây xuât hiên màu dô gach.
Sa bô két luân trong ditcfc lieu cô dtiàng khü tic do.

2.2.1.5 Dinh tinh chât béo:
Cho vào mot binh eau 2g duoc lieu, thêm 10ml ether dâu hoâ, dun hôi

luu câch thuÿ trong 15 phüt. Loc qua giây loc gâp nép. Bay hoi dung môi thu
duoc cân. Hoà tan cân bàng 2ml cloroform, nhô 1 giot lên tô giây bông mô, ho
nông nhe dên khô không thây vêt dâu mô.
Sô bô két luân trong duoc lieu không cô chât béo.

2.2.1.6 Dinh tinh acid amin:
Cho vào mot ông nghiêm to 3g duoc lieu, thêm 10ml côn 50°, dun câch
thuÿ trong vài phüt. Loc qua giây loc gâp nép. Lây 1ml dich loc cho vào ông
nghiêm, thêm vài giot thuôc thü Ninhydrin 2% trong aceton, dun nông, thây
xuât hiên màu tîm sâm.
Scf bô két luân trong duoc lieu cô acid amin.

2.2.1.7 Dinh tînh alcaloid:
Cân 10g dugc lieu cho vào mot binh non dung tfch 100ml, thêm 50ml
dung dich acid sulfuric 1N. Dé yên à nhiêt dô phông trong 30 phüt. Dun soi
truc tiép trong 10 phüt. Dich chiêt loc qua giây loc vào mot binh gan. Kiém
hoâ bàng dung dich amoniac dàc. Làc kÿ 3 làn vôi cloroform, môi làn 15ml.
Gôp dich chiêt cloroform, acid hoâ bàng dung dich acid sulfuric 1N. Gan lây
lôp nuôc acid dé làm câc phân üng dinh tmh:

-17-


□ Phân üng vôi thuôc thû Dragendorff:
Cho vào ông nghiêm 1ml dich chiét, thêm vài giot thuôc thir
Dragendorff không thây xuât hiên tua màu da cam.
□ Phân ung vôi thuôc thû Mayer:
Cho vào ông nghiêm 1ml dich acid, thêm vài giot thuôc thû Mayer
không thây xuât hiên tüa trâng hai vàng.
□ Phân ûng vôi thuôc thû Bouchardat:

Cho vào ông nghiêm 1ml dich chiét, thêm vài giot thuôc thû Bouchardat
không thây xuât hiên tûa nâu.
Sû bô kê't luân trong clicac lieu không cô alcaloid.

2.2.1.8 Dinh tînh glycosid tim:
Cho 10g dugc lieu vào mot binh non cô dung tfch 100ml, thêm 80ml
côn 25°. Ngâm trong 24 giô, gan dich chiét vào mot côc cô mô, loai tap bàng
dung dich chi acetat 30%. Loc bô tüa. Dich loc sau khi bay hai hét côn cho
vào binh gan, lâc kÿ 3. lân vôi cloroform, môi lân 15ml. Gan dich cloroform
vào mot côc cô mô. Bay hai dung môi, hoà tan cân bàng 10ml côn 90° de làm
câc phân üng dinh tinh:
□ Phân ûng Libërman - Bouchardat:
Lây 1ml dich chiét côn vào mot ông nghiêm sach, khô, cô can trên nôi
câch thuÿ, cân dugc hoà tan trong 1ml anhydrid acetic. Dât nghiêng ông
nghiêm 45°, cho thêm tü tù 1ml acid sulfuric dâc theo thành Ông nghiêm,
không thây xuât hiên màu nâu dô à mât phân câch.
□ Phân üng Baljet:
Lây 1ml dich chiét con, thêm 0,5ml thuôc thü Baljet (1 phân dung dich
acid picric 1% và 9 phân dung dich NaOH 10%), không thây xuât hiên màu
dô cam.


Phõn ỹùtg Lộgal:
Lõy lml dich chiột cụn, thờm 5 giot dung dich Natri nitroprusiat 1%, v
thờm tir tir vi giot dung dich NaOH 10% (dam bõo kiờm du), khụng thõy xuõt
hiờn mu dụ.
So' bụ kột luõn trong duoc lieu khụng cụ glycosid tint.

2.2.1.9 Dinh tinh iridoid:
Lõy 2g duoc lieu cho vo ụng nghiờm, thờm 10ml nuục cõt, thùnh

thoõng lõc. Sau vi giụ gan lõy 2ml dich chiột, thờm 2ml thuục thu TrimJHill
(10ml acid acetic + lml CuS04 0,2% + 0,5ml HC1), dun nụng thõy xuõt hiờn
mu xanh tim.
So bụ kột luõn trong duỗfc lieu cụ iridoid.

Nhõn xột v sỷ bụ lỗột_ hiõnj_
Kột qua dinh tmh so bụ cho thõy trong thõn cõy chố vng nghiờn cuu cụ
flavonoid, coumarin, acid amin, dirụng khir, saponin v iridoid. Khụng cụ
glycosid tim, alcaloid, tanin, acid huxi ca v chõt bộo (Kột quõ dinh tmh
duoc ghi ụ bng 1)

-19-


Bàng 1 ; Két quâ dinh tmh câc hop chât tu nhiên trong thân cây chè vâng
Hop chât

Két quâ

Câc phân üng dinh tmh

Két luân

Phàn üng Liberman_Bouchardat
Glycosid tim

Phân üng Baljet

-

Không cô

-

Không cô

+

Không cô

-

Không cô

Phân üng Légal
Phân üng vôi thuôc thu Dragendorff
Alcaloid

Phàn üng vôi thuôc thü Mayer
Phàn üng vôi thuôc thü Bouchardat
Phân üng vôi FeCl3 5%

Tanin

Phân ung vôi dung dich gelatin 2%

Acid hüu co

Phàn üng vôi Na2C 0 3

Duong khû

Phân üng vôi thuôc thir Fheling

+

Quan sât hiên tuong tao bot

+

Phân üng Salkowki

+

Saponin
Chât béo

Vêt dàu de lai trên giây bông mô

Acid amin

Phân üng vôi thuôc thü Ninhydrin 2%

+

Phân üng mô và dông vông Lacton

+

Phân üng vôi thuôc thü Diazo

+

Soi huÿnh quang duôi ânh sang tü

+

Coumarin

-

Cô
Cô
Không cô
Cô

Cô

ngoai
Iridoid
Flavonoid

Phàn üng vôi thuôc thü Trim_Hill

+

Phân üng Cyanidin

+

Phân üng vôi kiêm

+

Phân üng vôi FeCl3 5%

+

Ghi chu: Dâu (+): phân üng duong tmh
Dâu (-): phân üng âm tmh

-20-

Cô

Cô