Khoá luận tốt nghiệp nghiên cứu phản ứng điều chế chitosan khối lượng phân tử thấp

TRƯỜNG ĐẠI HỌC s u PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA HÓA HỌC

ĐINH THỊ HẠNH

NGHIÊN CỨU PHẢN ỨNG
ĐIÈU CHÉ CHITOSAN KHỐI LƯỢNG
PHÂN TỬ THẤP

KHÓA LUẬN
TỐT NGHIỆP
ĐẠI
HỌC
•
•
•
•
C huyên ngành: H óa công nghệ m ôi trư ờng

Người hướng dẫn khoa học
TS. TRẰN THỊ Ý NHI

HÀ NỘI - 2015


L Ờ I C Ả M ƠN

Trước tiên em xin cảm ơn thầy giáo ThS. Lê Cao Khải, cùng toàn thể
các thầy cô giáo trong khoa Hóa Học - Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2,
đã tạo điều kiện cho em được tiếp thu những kiến thức chuyên môn về hóa
học hữu cơ và công nghệ môi trường.

Em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.Trần Thị Ý Nhi Viện Hóa Học - Viện Hàn ỉâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã tận
tình hướng dẫn và truyền đạt cho em các phương pháp nghiên cứu khoa học
và những kinh nghiệm học thuật quý báu trong quá trình thực hiện khóa luận.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô, các anh chị tại Viện
Hóa Học - Viện Hàn lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã tận tình
giảng dạy, chỉ bảo và dìu dắt em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận.

Hà Nội, tháng 05 năm 2015
Sinh viên

Đỉnh Thị Hạnh


DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1: Phổ hồng ngoại của (3-chitin.............................................................29
Hình 3.2: Phổ hồng ngoại của (3-chitosan........................................................31
Hình 3.3: Giản đồ nhiễu xạ tia X của chitosan............................................... 32
Hình 3.4: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa n / c và nồng độ chitosan....... 33
Hình 3.5: Phổ FT-IR của P-chitosan theo phương pháp phá kết tinh............33
Hình 3.6: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa n / c và c ..................................35
Hình 3.7: Phổ FT-IR của chitosan khối lượng phân tử thấp.......................... 39
Hình 3.8: Phổ nhiễu xạ tia X của chitosan khối lượng phân tử thấp.............40


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1: Thành phần chính của một số nguyên liệu chứa chitin.................. 24
Bảng 3.1: Hàm lượng P-chitin trong mai mực ống.......................................... 29
Bảng 3.2: Ket quả đo áp suất thẩm thấu của chitosan tại các nồng độ
khác nhau........................................................................................... 32

Bảng 3.3: Kêt quả đo áp suất thẩm thấu của chitosan DA~0...........................34
Bảng 3.4: Kết quả xác định khối lượng phân tử khi sử dụng nồng độ axit
khác nhau...........................................................................................36
Bảng 3.5: Ket quả xác định khối lượng phân tử khi phản ứng thực hiện ở
nhiệt độ khác nhau............................................................................ 37
Bảng 3.6: Mối quan hệ giữa độ tan và khối lượng phân tử trung bình của
các mẫu L W C ................................................................................... 38


DANH MỤC CÁC S ơ ĐỒ
Sơ đồ 1.1: Cấu tạo của Xenluloza, Chitin, Chitosan...........................................3
Sơ đồ 1.2: Điều chế chitosan................................................................................ 9
Sơ đồ 1.3: Quá trình sản xuất chitin/chitosan truyền thống............................10
Sơ đồ 1.4: Công thức cấu tạo của chitin/chitosan........................................... 10
Sơ dồ 1.5: Phản ứng đeaxetyl hóa chitin .........................................................11
Sơ đồ 1.6: Quá trình thủy phân bằng enzym .................................................. 14
Sơ đồ 1.7: Thủy phân chitosan bang axit HC1 loãng.......................................15
Sơ đồ 1.8: Sơ đồ cơ chế thủy phân axit liên kết glucozitcủa chitosan. Cơ
chế được chấp nhận của quá trình thủy phânliên kếtglucozit..... 17
Sơ đồ 1.9: Cơ chế thủy phân liên kết N-axetyl............................................... 17
Sơ đồ 1.10: Quy trình điều chế chitosan khối lượng phân tử thấp................27
Sơ đồ 1.11: Phản ứng đeaxetyl hóa chitin........................................................30


BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẤT TRONG KHÓA LUẬN

Ac

: C H 3C O

CTS

: Chitosan

DDA

: Độ đề axetyl hóa

DA

: Độ axetyl hóa

DMAc

: N,N-đimetyl axetamit

DP

: Độ polymer hóa trung bình

GlcN

: D-glucosamin

GlcNAc : N-axetyl-D-glucosamin
IR

: Hồng ngoại

LAB

: Lactic axit bacterial

Mn

: Khối lượng phân tử trung bình

Me

: CH 3

NMR

: Nuclear Magnetic Resonance - Cộng hưởng từ hạt nhân

LWC

: Chitosan khối lượng phân tử thấp


MỤC LỤC
MỞ ĐÀU.................................................................................................................. 1
1. Lí do chọn đề tài............................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cún....................................................................................... 2
3. Nhiệm vụ nghiên cún......................................................................................2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN..................................................................................3
1.1. Giới thiệu chung về chitin/chitosan............................................................3
1.1.1. Cấu trúc tinh th ế ....................................................................................4
1.1.2. Tính ta n .................................................................................................. 4
1.1.3. Khối lượỉĩg phân tử ................................................................................5

1.1.4. Độ axetyl hóa - Xác định độ axetyl/đeaxetyl h ó a .............................. 6
1.2. Phương pháp điều chế chitin/chitosan........................................................7
1.2.1. Tách chitỉn từ vỏ phế thải thủy hải sản................................................ 8
1.2.2. Điều chế chỉtosan...................................................................................9
1.3. Tính chất hóa học....................................................................................... 10
ỉ .3.1 Phản ứng ở nhóm -O H ......................................................................... 11
1.3.2. Phản ứng ở nhóm axetamit..................................................................11
1.3.3. Phản ứng ở nhóm -N H 2.......................................................................12
1.3.4. Phản ứìĩg cắt mạch chitosan............................................................... 12
1.4. Một số ứng dụng của chitin/chitosan và dẫn xuất................................... 21
1.4.1. ứng dụng trong xử lý nước th ả i......................................................... 21
1.4.2. ứng dụng trongy dược....................................................................... 23
1.4.3. ứng dụng trong nông nghiệp..............................................................23
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM...........................................................................25
2.1.

Nguycn liệu, hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghicn cún.......................25

2.1.1. Nguyên liệu, hóa chất......................................................................... 25


2.1.2. Dụng cụ, thiêt bị nghiên cứu............................................................. 25
2.2. Thực nghiệm ............................................................................................ 26
2.2.1. Điều chế Chitin/chitosan.................................................................. 26
2.2.2. Điều chế chitosan khối lưọng phân tử thấp(LWC)....................... 29
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................... 31
3.1. Điều chế chitin/chitosan.......................................................................... 31
3.1.1. Điều chế chitin...................................................................................31
3.1.2. Điều chế chitosan từ chitin theo phương pháp kiềm đặc kết
hợp nhiệt độ cao........................................................................................... 32

3.1.3.Điều chế chitosan có DA thấp...........................................................35
3.2. Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến phản ứng điều chế chitosan
khối lượng phân tử thấp..................................................................................37
3.2. 1. Anh hưởng của nồng độ axỉt HCl đến khối lượng phân tử
trung bình ( Mn) sảnphấmphản ứng đềpolyme hoảchitosan................. 37
3.2.2. Anh hưởng của nhiệt độ đến khối lượng phần tử trung bình
( M n) sản phắm phản ứng đềpoỉyme hoả chitosan..................................39
3.2.3. Đảnh giả độ tan trong nước của các mâu chỉtosan trọng lượng
phân tử thấp..................................................................................................40
3.3. Xác định cấu trúc của chitosan khối lượng phân tủ’ thấp...................... 40
KẾT LUẬN CHUNG......................................................................................... 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................44


MỞ ĐẦU

1. Lí do chọn đề tài
Chitin

[poly-P-(1^4)-2-axetamiđo-2-đeoxy-D-glucopyranozơ],

một

polysaccarit với hàm lượng đứng hàng thứ hai trong tự nhiên sau xenlulozơ,
là thành phần chính của vỏ các loài động vật giáp xác như: vỏ tôm, mai cua,
mai mực...
Chitin/chitosan là một polyme có nhiều tính chất đặc biệt: Tính hòa hợp
sinh học, phân hủy sinh học, tính kháng khuẩn, kháng nấm, chống độc... Do
đó được sử dụng nhiều trong các lĩnh vực y học, dược phẩm, nông nghiệp, mỹ
phẩm, công nghệ môi trường... Mặc dù vậy khả năng ứng dụng này còn hạn

chế bởi chitin rất ít tan trong các dung môi hữu cơ và không tan trong nước do
cấu trúc tinh thể chặt chẽ. Vì vậy rất nhiều nghiên cứu đã được tiến hành
nhằm cải thiện tính tan của chitin/chitosan như kỹ thuật biến tính hóa học, tạo
ra các dẫn xuất tan trong nước với các nhóm chức có tính năng đặc biệt, hay
kỹ thuật đề polyme hóa làm giảm đáng kể trọng lượng của chitosan.
Chitin/chitosan oligome (LMC) là sản phẩm thu được trong quá trình
phân huỷ hoặc thuỷ phân chitin/chitosan. Phân tử chitin/chitosan có độ trùng
họp n ~ 20 (n = 20-40) được gọi là chitin/chitosan khối lượng phân tử thấp.
Ngoài các tính chất chung của chitin/chitosan, chitin/chitosan oligome còn có
tính chất đặc biệt là tan trong nước ở dải pH rộng (pH = 5h-8).
Chitin/chitosan khối lượng phân tử thấp (chitooligome) là một vật liệu
có hoạt tính sinh học cao. Chúng có khả năng ngăn cản sự phát triển của khối
u, kích thích hệ thống miễn dịch, tăng cường hoạt động của lysozym và có
khả năng kháng khuẩn cao hon cả của chitosan. Nói chung, chitin/chitosan
khối lượng phân tử thấp điều hoà sự lớn lên và phát triến của thực vật bằng
chức năng của các gen bảo vệ, vì thế làm tăng các quá trình sinh trưởng phát

1


triển của cây, đồng thời ngăn cản sự lây nhiễm và phát triển của các loại nấm
bệnh, do đó làm tăng năng suất cây trồng.
Việt Nam là một nước có 32000 km bờ biến, với nguồn nguyên liệu
thủy hải sản dồi dào, việc phát triển nghiên cứu về chitin/chitosan cũng như
các dẫn xuất của nó nhằm mở rộng hơn nữa khả năng ứng dụng của loại vật
liệu sinh học này được các nhà khoa học quan tâm nghiên cún.
Đe góp phần mở rộng ứng dụng của chitin/chitosan và các dẫn xuất,
góp phần bảo vệ môi trường, tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu
phản Ú7tg điều chế chỉtosan khối lượng phân tử thấp”.
2. Mục đích nghiên cứu

Chế tạo ra được chitosan khối lượng phân tử thấp có khả năng hòa tan
trong nước.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Điều chế chitin, chitosan từ mai mực ống;
- Khảo sát các điều kiện phản ứng để điều chế oligochitosan (LMC):
ảnh hưởng của nồng độ axit, nhiệt độ phản ứng..
- Khảo sát một số tính chất hóa lý của sản phẩm.

2


CHƯƠNG 1: TỎNG QUAN

1.1. Giới thiệu chung về chitin/chitosan [1,2,4,15,21]
Trong số các polysaccarit thì xenlulozo và chitin là nguồn tài nguyên
sinh học tự nhiên phong phú nhất. Xenlulozo được tổng họp từ thực vật còn
chitin được tổng họp chủ yếu từ động vật bậc thấp. Chitin có cấu trúc tương
tự như xenlulozo, tên gọi “chitin” xuất phát từ tiếng Hilap “chiton” nghĩa là
vỏ của các loài giáp xác như cua, tôm, mai mực.....
Chitin được đánh giá là loại vật liệu có tiềm năng lớn nhưng cho đến
này việc ứng dụng chitin vẫn chưa được rộng rãi như xenlulozo. Chitin không
chỉ là nguồn tài nguyên sẵn có mà nó còn là một loại vật liệu chức năng do
chitin là một polyme sinh học với nhiều tính chất quý báu như khả năng phân
hủy sinh học và đặc biệt là có hoạt tính sinh học.

Xenlulozo

Chitin

Chitosan

3


Sơ đồ 1.1: Cấu tạo của xenlulozo, Chitin, Chitosan
Trong thực tế chitin và chitosan cùng tồn tại trong một phân tử
polyme vì vậy khái niệm chitin, chitosan chỉ là tương đối. Khi polyme có tỷ
lệ mắt xích ß (l—>4)-D-glucozamin lớn hơn 50% (DDA > 50%) thì được gọi
là chitosan và ngược lại là chitin.
1.1.1. Cấu trúc tinh thể [1,2,4,30]
Chitin là một loại polisaccarit mạch thẳng với khối lượng phân tử lớn
được tạo bới mắt xích N-axetyl-D-glucozamin theo liên kết ß (l—>4)glucozit
như kiểu liên kết các mắt xích D-glucozo ở xenlulozo. Bằng phương pháp
nhiễu xạ tia X đã phát hiện chitin có 3 kiểu đa hình là: a, ß, y-chitin được mô
tả theo hình sau:

\

s I 1s t

a - Chitin

/^ /^ í\ í\ i\

ß - Chitin

t \ J^ \ t ế\ t \

y - Chitin

- a-chitin: cấu trúc tinh thể mạng ghép đôi song song (một mạng lên
một mạng xuống liền nhau), a-chitin thường được tách từ vỏ cua.
- ß-chitin: các mạch ghép trong tinh thế theo cách ghép song song cùng
chiều, ß-chitin chủ yếu có trong mai mực nang sừng.
- y-chitin: có mạch ghép trong tinh thể theo 2 cách, cứ 2 mạch song
song lại có 1 mạch đối song, y-chitin được tách từ sợi kén của bọ cánh cứng,
dạ dày của mực ống, là loại có trữ lượng ít nhất.
1.1.2. Tính tan [21,27]
Chitin thể hiện ái lực hạn chế với phần lớn các dung môi vì có liên kết
hidro chặt chẽ giữa các phân tử. Chitin thường (a-chitin) không tan và hầu

4


như không trương trong dung môi thông dụng mà chỉ tan trong một số dung
môi đặc biệt, ví dụ: N,N-dimetylaxetamit (DMAC) có chứa 5-10% LiCl.
Chitosan là một polyamin không tan trong nước cũng như trong dung
môi hữu cơ nhưng tan trong môi trường axit loãng. Độ tan của chitosan phụ
thuộc vào độ axetyl hóa, loại axit và nồng độ axit trong dung dịch. Khi xử lý
chitin/chitosan trong môi trường axit mạnh với nồng độ lớn thường xảy ra
phản ứng depolyme hóa (cắt mạch) làm giảm khối lượng phân tử polyme.
1.1.3. Khối lượng phần tử [21]
Khối lượng phân tử chitin/chitosan là thông số quan trọng nhưng khó
có thể xác định được chính xác do tính tan kém của chúng và sự đa dạng về
kiểu phân bố các nhóm axetyl cũng như mức độ axetyl hóa. Độ dài mạch
chính của chitin/chitosan có thể giảm trong quá trình xử lý với axit và kiềm.
Khối lượng phân tử chitin sau khi tách khỏi protein cũng như các chất khác
được tính toán theo các phương pháp đo độ nhớt, sắc ký thẩm thấu gel (GPCGel Permeation Chromatography) hoặc sắc ký loại trù’ theo độ lớn phân tử
(SEC -Size Exclusion Chromatography) trong dung môi DMAc/LiCl. Ket
họp các phương pháp SEC, tán xạ ánh sáng và đo độ nhớt thì có thể xác định

được chính xác khối lượng phân tử trung bình và độ phân bố của khối lượng
phân tử. Từ các số liệu thu được từ phương pháp GPC đã khẳng định các mẫu
chitin tách từ mai cua, vỏ tôm và mai mực ống có độ polyme hóa (degree of
polymeizaion - DP) nằm trong khoảng 2000 - 4000. Chitosan tan được trong
dung dịch axit loãng và khối lượng phân tử có thể xác định theo phương pháp
sắc ký lỏng cao áp ghép nối với cột loại trừ theo độ lớn phân tử (SE-HPLCsize exlusion high performance liquid chromatography). GPC-HPLC, GPC,
phương pháp đo độ nhớt... cũng có thể chuyển hóa chitosan thành chitin qua
phản ứng N-axetyl hóa và khối lượng phân từ được tính theo phương pháp
GPC trong hệ dung môi DMAc/LiCl. Trong đó phương pháp đơn giản nhất để

5


xác định khối lượng phân tử polyme là xác định theo phương pháp gián tiếp
qua phép đo độ nhớt. Phép đo độ nhớt không phải là phương pháp tuyệt đối để
xác định khối lượng phân tử mà chỉ là phương pháp tương đối dựa trên cơ sở
độ nhớt của dung dịch polyme tăng tỉ lệ với số lượng các phân tử thêm vào.
Phương pháp đo áp suất thẩm thấu là phương pháp dựa trên định luật
Vant-Hoff. Theo định luật này, sự phụ thuộc giữa áp suất thấm thấu p, thế
tích V và nhiệt độ tuyệt đối T và số gam phân tử của vật chất trong dung dịch
pha loãng được biểu diễn bằng phương trình trùng với dạng phương trình của
dạng khí lí tưởng:
PV = nRT = (g/M)RT
p = (g/V)(RT)/M
->M = (RTC)/P
Trong đó:
g: khối lượng của chất hòa tan (g)
M: khối lượng phân tử của chất (g/mol)
C: nồng độ của dung dịch
R: hằng số

T: nhiệt độ tuyệt đối
1.1.4. Độ axetyl hóa - Xác định độ axetyl/đeaxetyl hóa [9,15,18]
Độ axetyl hóa là hàm lượng nhóm (-N H C O C H 3) còn độ đeaxetyl hóa là
hàm lượng nhóm (-NH2) trong chitin và chitosan. Mắt xích cơ sở của chitin là
N-axetyl-D-glucosamin (GlcNAc). Mặc dù hầu hết các nhóm amino gắn với

c 2 đã bị axetyl hóa, nhưng trong tự nhiên chitin vẫn tồn tại một số nhóm
amino tự do. Hơn nữa, phản ứng đeaxetyl hóa chitin còn xảy ra trong quá
trình tách loại protein bằng kiềm. Vì vậy, các mẫu chitin trên thực tế có DDA
khác nhau (khoảng 5 - 15%) phụ thuộc vào nguồn gốc và cách điều chế
chúng. Để thu được chitin có cấu trúc thuần nhất (chỉ gồm các mắt xích
GlcNAc) thì phải tiến hành N-axetyl hóa chọn lọc các nhóm amino tự do. Khi

6


chitin bị đeaxetyl hóa đáng kể thì trở nên tan trong dung dịch axit axetic loãng
và được gọi là chitosan.

Trong đó, DDA = 100-DA. Đối với chitin thì DA > DDA, đối với
chitosan thì DA < DDA. Khi DA = DDA thì có chitin tan trong nước.
Tính chất của chitin cũng như chitosan phụ thuộc rất nhiều vào độ
đeaxetyl hóa (DDA) - một thông số quan trọng nhất để chỉ ra là chitin hay
chitosan. Vì vậy, việc tìm ra phương pháp xác định DDA (hay DA) một cách
chính xác và đơn giản là vấn đề rất quan trọng và cần thiết. Có rất nhiều
phương pháp đã được áp dụng để xác định DDA của chitin/chitosan như:
phân tích nguyên tố, các phương pháp phổ như phổ hồng ngoại (IR), phổ tử
ngoại (ƯV), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NRM): 'H-NRM, l3C-NRM, và
l5N-NRM ở trạng thái rắn, cho phép đo lưỡng sắc cầu, phổ khối, chuẩn độ
điện thế, chuẩn độ nitrat (phương pháp chuẩn độ sử dụng bạc nitrat), chuẩn độ

với axit picric, chuẩn độ độ dẫn, sắc ký lỏng cao áp, sắc ký khí - lỏng, sắc ký
thẩm thấu gel, nhiệt phân - sắc ký khí, sắc ký khí.
Trong các phương pháp xác định DA đã được áp dụng thì phổ IR là
phương pháp thuận tiện đặc biệt trong trường họp mẫu ở trạng thái rắn, không
hòa tan trong các dung môi. Đối với chitosan (tan trong môi trường axit
loãng) thì phổ 'H-NRM là phương pháp nhanh, chính xác và có độ nhạy cao.
Đo trong dung môi D 20 , C D 3C O O D /D 2O hoặc DCI/D2O.
1.2. Phưoiig pháp điều chế chitin/chitosan [8,18]
Chitin có ở nhiều loài khác nhau, từ các loài nấm đến các động vật bậc
thấp. Vỏ của các loài động vật chân đốt là nguồn nguyên liệu chính để điều

7


chế chitin, trong thành phần của vỏ các loài động vật này có chứa 20 - 50%
chitin tính theo khối lượng khô. v ỏ tôm, mai cua là nguồn nguyên liệu phế
thải từ công nghiệp chế biến thủy sản, hải sản được sử dụng đế sản xuất chitin
thương mại. Các nguồn nguyên liệu khác để sản xuất chitin là: mai mực, sâu
bọ, tảo, nấm... Thành tế bào một số loại nấm chứa cả chitin cũng như
chitosan và được coi là nguồn chitosan tự nhiên. Chitosan được điều chế bằng
cách thực hiện phản ứng deaxetyl hóa chitin trong môi trường kiềm.
1.2.1. Tách chitin từ vỏ phế thải thủy hải sản [1,4,18,19]
Nguyên tắc chung để điều chế chitin là loại bỏ muối khoáng (chủ yếu là
canxicacbonat), protein và các chất màu khỏi phế liệu thủy, hải sản. Hai
phương pháp chủ yếu được áp dụng để tách chitin/chitosan là phương pháp
hóa học và phương pháp lên men vi sinh vật.
Theo phương pháp hóa học: Quá trình điều chế chitin được thực hiện
theo các bước: tách khoáng - tách protein - khử màu. Muối khoáng thường
được tách ra bằng cách xử lý nguyên liệu với dung dịch axit HC1, protein bị
thủy phân trong môi trường kiềm, chất màu được loại bỏ bằng dung môi hoặc

tác nhân oxi hóa. Trong quá trình xử lý, một số nhóm axetamit trong các mạch
đại phân tử chitin bị thay thế bởi nhóm amino do phản ứng deaxetyl hóa.
Điều chế chitin theo phương pháp hóa học có một số mặt hạn chế như
phải sử dụng một lượng lớn kiềm, axit, nước rửa do đó chi phí lớn và gây ô
nhiễm môi trường. Việc sử dụng axit và kiềm nóng dẫn đến việc cắt giảm
mạch chitin tạo ra nhiều sản phẩm khác nhau.
Theo phương pháp x ử lý vi sinh vật: Protein được tách khỏi vỏ các
loài giáp xác bằng cách xử lý với enzim hay vi sinh vật theo nguyên tắc: vi
khuẩn sinh ra lactic (LAB: lactic acid bacterial) tự có trong phủ tạng của vỏ
phế thải (vỏ tôm, cua, mai mực...) với một lượng rất nhỏ cùng với nguồn
LAB thuần chủng được bổ sung có tác dụng bảo quản và thủy phân phế

8


thải.Hỗn họp lên men bao gồm: vỏ phế thải, LAB, dung dịch glucozo. Trong
quá trình lên men, LAB sản sinh ra axit lactic làm giảm pH của môi trường,
tạo điều kiện cho quá trình thủy phân protein, thủy phân khoáng tạo thành các
lactat canxi, magie... là các muối tan được trong nước. Bằng phương pháp ly
tâm, phần dung dịch lỏng chứa protein và các muối khoáng hòa tan được loại
bỏ thu được phần chitin không hòa tan. Đe có chitin sạch, có thể xử lý tiếp
bằng dung dịch axit và kiềm loãng.
Phương pháp điều chế chitin bằng phương pháp lên men vi sinh vật có
một số ưu điểm như chi phí thấp, cấu trúc sản phấm không bịthay đổi nhiều
và đặc biệt là ít gây ô nhiễm môi trường.
(3-chitin được sản xuất chủ yếu từ mai mực ống theo cách đơn giản hơn
vì thành phần của mai mực ống chủ yếu là chitin, hàm lượng protein và muối
khoáng thường rất thấp. Hơn nữa, do sự sắp xếp các mạch đại phân tử trong
p-chitin khác hẳn với a-chitin nên a-chitin có cấc liên kết hidro chặt chẽ hơn,
vì vậy khi xử lý mai mực ống với axit và kiềm thường ở điềukiện êm dịu hơn

nhiều so với xử lý vỏ tôm để thu được P-chitin.
1.2.2. Điều chế chitosan [1,2,4,19]
Chitosan là sản phẩm deaxetyl hóa của chitin. Chitosan thương mại có
nhiều loại với độ deaxetyl hóa khác nhau nhung thường được điều chế bằng
cách deaxetyl hóa chitin trong môi trường kiềm nồng độ 40 - 50% ở 100 -

130°c trong 24 giờ. Phản ứng deaxetyl hóa xảy ra như sau:

Chitosan thu được theo phương pháp này có DDA lên tới 90%.

9


Đe thu được chitosan có độ deaxetyl hóa cao hơn phải tiến hành phản
ứng lặp đi lặp lại nhiều lần. Phản ứng deaxetyl hóa ß-chitin diễn ra dễ dàng
hơn nhiều so với a-chitin: Từ các mẫu a-chitin, ß-chitin có DDA tương đương
nhau tiến hành phản ứng deaxetyl hóa trong NaOH 30% ở 100°c với thời
gian như nhau (2 giờ) thu được ß-chitosan với DDA ~ 70% trong khi đó đối
với a-chitin giá trị đó là -20% . Tuy nhiên khi sử dụng dung dịch kiềm đặc thì
bên cạnh phản ứng deaxetyl hóa còn xảy ra phản ứng thủy phân mạch
chitin/chitosan làm giảm đáng kể khối lượng phân tử của chitin/chitosan.
Ta có thể mô tả quá trình điều chế chitosan từ vỏ mai mực ống qua
sơ đồ 1.3:
Vỏ phế thải thủy hải sản
ị
Xay nghiền
ị
Khử khoáng bằng axit loãng (axit HC1)
ị
Tách loại protein bằng kiềm loãng (NaOH loãng)

ị
Chitin
ị
Deaxetyl hóa (bằng NaOH 50%, trong vòng 2h ở 100°C)
ị
Chitosan
S ơ đo 1.3: Quá trình sản xuất chitin/chitosan truyền thong
1.3. Tính chất hóa học [1,2,5]
Công thức tổng quát của chitin là: (CgH^NOs),!

10


,OH

>OH
^0

NHAc

nh 2

n

S ơ đồ 1.4: Công thức cấu tạo của chitin/chitosan
Ta thấy trong mỗi mắt xích của chitin/chitosan vừa có nhóm chức
(-OH) vừa có nhóm chức amin (-NHCOCH 3/NH 2 ) nên có ba trung tâm phản
ứng chính, vì vậy nó vừa có tính chất của ancol lại vừa có tính chất của amin.
1.3.1 Phản ứng ở nhóm -O H
Phản ứng với axit, anhidric axetic hay HC1 thu được sản phẩm ở dạng

este.
[Chit(OH)2]n + 2nHCl

[Chit(OCl)2]n + 2nH20

Phản ứng với ankyl sunfat trong ankyl halogenua thu được

các

este.

Phản ứng với các họp chất vinyl tạo este
Trong mỗi mắt xích của chitin có 2 nhóm (-OH) ở C3 và c 6, đều có khả
năng tham gia phản ứng. Do cấu trúc phân tử, nhóm (-OH) bậc 2 ở C3 bị án
ngữ không gian nên phản ứng kém hơn nhóm (-OH) bậc 1 ở c 6.
1.3.2. Phản ứng ở nhóm axetamit
Chitin có khả năng tham gia phản ứng thể hiện tính chất của amin bậc 2
như phản ứng đeaxetyl hóa tạo thành chitosan.

M = (203)n

M = (161)m

S ơ đồ 1.5: Phản ứng đeaxetyl hóa chitin

11


Phản ứng trên thường được thực hiện với NaOH 40% ở 120 °c trong
1—>3h. Hiệu suất đeaxetyl hóa chỉ đạt 70%. Điều này có nghĩa là sản phẩm

phản ứng là chuỗi polyme vẫn có cả mắt xích N-axetyl-D-glucozamin đan xen
với p (1—>4) glucozamin.
Đẻ đánh giá mức độ đeaxetyl hóa của chitin người ta đưa ra khái niệm
độ đeaxetyl hóa (DDA) được tính theo công thức sau:
203(100-A )
DDA=

203(100-42A)

' 100%

Với A là tổng số % mắt xích N-axetyl-D-glucozamin
Muốn thu được chitosan đeaxetyl hóa hoàn toàn DDA ~ 0, phải rửa
sạch mẫu rồi xử lý kiềm lặp lại nhiều lần.
1.3.3. Phản ủng ở nhóm -N H 2
Phản ứng xảy ra ở nhóm amin -N H 2 và nhóm amit - N H C O C H 3 hai
nhóm này gắn ở vị trí c 2 (hay ở vị trí N). Tại đây nhóm -N H 2 của
chitin/chitosan có đôi điện tử không phân chia do đó về mặt hóa học, chúng
có khả năng phản ứng cao với các tác nhân ái lực electron để tạo ra các dẫn
xuất tương ứng.
Phản úng gắn với các nhóm -OH tại C3 (hoặc c 6) hay gắn polietylenglycol
vào nhóm -N H 2 thu được các dẫn xuất có cấu trúc hóa học cồng kềnh nhằm
cản trở không gian, làm giảm các liên kết cầu hidro giữa các mạch và trong
mạch phân tử của chitin/chitosan như lúc ban đầu, để tạo ra các dẫn xuất tan
trong nước.
1.3.4. Phản ửng cắt mạch chitosan
Do quá trình chuyển hóa trong động thực vật chủ yếu xảy ra trong môi
trường nước nên chitosan với khả năng tan kém trong nước đã làm hạn chế

12

phần nào hiệu quả và phạm vi ứng dụng. Vì vậy, để tăng khả năng ứng dụng
của chitosan chúng ta phải cải thiện khả năng tan trong nước của chitosan.
Hiện nay, trên thế giới, các nhà khoa học đã nghiên cún và tìm ra rất
nhiều phương pháp để cải thiện khả năng tan trong nước của chitosan, trong
đó phương pháp đề polyme hóa được coi là phương pháp đơn giản và hiệu
quả nhất.
Quá trình depolyme hóa là quá trình phả hủy các liên kết glucozit trong
mạch đại phân tử dưới các tác nhân cắt mạch như: enzym, hóa chất chiếu
xạ... Các tác nhân cắt mạch phá hủy liên kết glucozit, chuyển hóa chitosan
thành oligome có khả năng tan trong nước cao hơn so với chitosan đại phân
tử.
Có nhiều phương pháp cắt mạch chitosan như: cắt mạch bằng enzym,
cắt mạch bằng chiếu xạ, cắt mạch bằng phản ứng hóa học... Trong đó cắt
mạch bằng phản ứng hóa học là phương pháp đơn giản và được sử dụng rộng
rãi nhất.
1.3.4.1. Phương pháp chiếu xạ
Quy trình chiếu xạ để thủy phân chitosan:
Chitosan bột, đóng gói bằng polyetylen, được chiếu xạ với nguồn tia y
Co60(coban), tốc độ chiếu 1,4 kGy.h'1, liều chiếu xạ từ 10-500 kGy. Chitosan
sau khi chiếu xạ được làm trương nở trong nước (lOOg chitosan/1 lít H 20 )
trong 30 phút. Sau đó cho thêm axit axetic IN, khuấy trong 4 giờ cho tan
hoàn toàn. Tiến hành trung hòa bằng 0,5M natribicacbonat, pH của dung dịch
là 6 . Dùng H 20 2 để khử màu của sản phẩm và các sản phẩm khác trong quá
trình chiếu xạ. Tiến hành phân tách: Ket tủa bằng dung dịch etanol, sau đó lọc
thu được hai dạng sản phẩm, phần kết tủa, phần nước lọc. Phần kết tủa được
rửa bằng MeOH và làm khô.Phần nước trong được cô đặc lại, kết tủa và đem

13

lọc thu hồi sản phẩm.Tiến hành đo độ nhớt (r|) đồng thời xác định khối lượng
phân tử trung bình ( A / „) của sản phẩm. Cơ chế của quá trình chiếu xạ:
R - H ^ > R ’(Ct +Ct )+ H ’
R - H + H ' ->R'(C, +C6)+ H 2
r

-( c ^

c 4)

^

f;

+

f2

R - NH2 + / / • - > R'(C2)+ NH3
Trong đó R-H và R-NH 2 là các phân tử chitosan có khối lượng phân tử
lớn, R*{c„) là gốc chitosan khối lượng phân tử lớn nằm trong nguyên tử
cacbon c n, F*,F2 là phần của chuỗi chính. Sau khi bị bẻ gãy, độ nhạy chiếu
xạ của phân tử polyme cho trước có thể được đánh giá từ hiệu suất depolyme
chiếu xạ của nó.
Phương trình của Charlesby Pnner:
= Gứfx1,04x10'7 x Đ
yM n

M noJ

Trong đó Mn là khối lượng phân tử trung bình số của chitosan ở liều
lượng hấp thụ được; D và Mno là khối lượng phân tử trung bình số của
chitosan ban đầu. Ket quả thu được cho thấy chitosan 8 B (DDA=99%) thì
nhạy cảm hơn phương trình chiếu xạ so với 10B (DDA=90%).
Ưu điểm của phương pháp là không có dư lượng hóa chất nên có độ
tinh khiết cao. Nhược điểm là yêu cầu có thiết bị đặc biệt, hiệu quả cắt mạch
kém hơn so với phương pháp hóa học. Phương pháp chiếu xạ phù họp cho sự
phân hủy các loại polyme khác nhau.
1.3.4.2. Phương pháp thủy phân bang enzym
Sơ đồ tổng quát quá trình thủy phân bằng enzym:

14


R = N H C O C H 3; N H 2

S ơ đồ 1.6: Quá trình thủy phân bang enzym
Có tới hơn 30 loại enzym có thế sử dụng được để phân hủy
chitin/chitosan: chitosanaza, aminaza, hemicellulaza, cellulaza, papain,
lysozyme, pepsin... Trong dó pepsin, papain, pectinaza, có tác nhân lytic tot
hon các loại enzym khác và hiệu quả cắt mạch polyme cao nhất là sử dụng
pectinaza. Phương pháp thủy phân bang enzym cho phép thu được sản phẩm
có dư ít lượng hóa chất, nên rất phù hợp với mục đích sử dụng trong y học.
Tuy nhiên vấn đề mở rộng quy trình sản xuất còn có nhiều khó khăn. Trong
số các loại enzym được sử dụng loại hemicellulaza có giá thành 1'ẻ hơn cả.
Quá trình thủy phân bang enzym: Chitosan được hòa tan trong dung
dịch axit axetic 1% -ỉ- 2% khuấy sau 3 giờ, điều chỉnh pH= 5,5. Đe qua đêm,
sau đó đặt vào bể ổn nhiệt (50°c với hemixenlluloza) hay tủ ấm (37°c với

pectinaza). Cho dung dịch enzym vào, lượng enzym được tính theo lượng chất
tan (chitosan). Dừng phản ứng cắt mạch sau 3^-30 giờ (tùy từng loại enzym)
bằng cách đun sôi dung dịch phản ứng trong 10 phút để tách bỏ enzym. Tiến
hành lọc, dung dịch sau khi lọc được trung hòa bằng NaOH10%, pH đạt giá
trị pH=9. Tiến hành ly tâm thu được phần kết tủa, rủa sản phẩm kết tủa bằng
etanol nhiều lần. Sản phẩm lại được tách bằng sắc ký lỏng cao áp HPLC để
phân đoạn.
Quá trình thủy phân khi có mặt pectinaza (chiết từ nấm cúc màu nâu
sẫm) ở pH=3, nhiệt độ 37°c làm cho độ nhớt của dung dich giảm nhanh.
Oligome thu được trong quá trình này có khối lượng phân tử dao động trong

15


khoảng 20,000-ỉ-5000 Da. Chitosan khối lượng phân tử thấp có độ kết tinh cao
hơn và đa dạng hình hơn chitosan.
1.3.4.3. Phương pháp hóa học
•

Phương pháp thủy phân axỉt:
Г

_

xOH

Г

-

^OH

HC1
OH

R

m «n

OH

R

R=NHCOCH3; NH 2
Sơ đồ 1.7: Thủy phân chỉtosan bằng axit HCl loãng
Một số tác giả thủy phân chitosan bằng cách hòa tan chitosan trong axit
HC1 (0,5%) với nồng độ polyme 1%H- 1,5% khuấy ở 65°C-ỉ-100oC trong 3 giờ.
Sau đó để nguội đến nhiệt độ thường. Dùng NaOH để trung hòa (đến pH~ 8 ).
Tiến hành lọc, phần kết tủa được rủa nhiều lần bằng etanol, sau đó làm khô
bằng axeton. Phần nước trong được tách muối bằng MeOH, sau đó cô đặc lại
và kết tủa trong etanol để thu phần sản phẩm tan trong nước. Các nghiên cún
cho thấy độ polyme hóa DP phụ thuộc vào nồng độ axit HC1. Khi dùng axit
HC1 đặc nóng thu được sản phẩm có DP =2-r5, khi dùng axit HC1 loãng
(0,5%) thu được sản phẩm có D P -30...
Các loại axit vô cơ đã được sử dụng như: Axit clohydric (HC1), axit
sunfuric (H2SO4), axit photphoric (H3PO 4), axit nitric (HNO 3)... Trong đó axit
clohydric được nghiên cún nhiều hơn cả. Do giá thành HC1 và khi trung hòa
bằng NaOH, sản phẩm phụ là NaCl không độc, dễ tách.
Ưu điểm của phương pháp là: Phản ứng cắt mạch xảy ra mạnh nhanh,
nhưng các bước tách sản phẩm và dư lượng hoá chất thường khó triệt để.

Sự thủy phân của liên kết glucozit (depolyme hóa) và liên kết N-axetyl
của chitosan được nghiên cứu trong HC1 đặc, HC1 loãng. Các kết quả nghiên
cứu cho thấy, tốc độ thủy phân của kiên kết glucozit tương đương với tốc độ

16


đề N-axetyl hóa trong axit loãng. Trong khi đó thì liên kết glycozit được thủy
phân nhanh hơn 10 lần so với liên kết N-axetyl trong HC1 đặc. Điều này có
thể giải thích bằng cách giả sử rằng, quá trình thủy phân của liên kết N-axetyl
là phản ứng Sn2, trong khi thủy phân của liên kết glucozit là phản ứng SN1,
với bước làm giảm vận tốc là sự hình thành cacbocation.

17