Các phương pháp phân tích sắc kí

CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÍ

GVHD: NGÔ VĂN TỨ

MỞ ĐẦU
Sắc kí điện di mao quản hiệu năng cao (HPCEC) là sự kết hợp
giữa điện di cổ điển với tính chất của cột sắc kí khí mao quản và các
detector có độ nhạy cao của kĩ thuật HPLC. Dựa trên cơ sở tính chất
điện di của các phần tử chất tan (các ion chất tan, chất phân tích)
trong ống mao quản (đường kính trong 25 - 100 μm) trên nền của
dung dịch chất điện giải và chất đệm pH thích hợp, dưới tác dụng của
một điện trường E nhất định được cung cấp bởi nguồn thế cao một
chiều (10 - 40 kV) đặt vào hai đầu ống mao quản.
Với lượng mẫu nạp vào cột tách rất nhỏ (khoảng 5 - 20nL), và
thời gian phân tích ngắn (khoảng 5 – 20 phút) nên kĩ thuật HPCEC có
bước phát triển nhảy vọt. Nó đã và đang phát triển ở mức độ cao và
được ứng dụng rất hiệu quả trong nhiều lĩnh vực khác nhau của khoa
học công nghệ, nhất là y dược và sinh học.

Trang 1


CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÍ

Trang 2

GVHD: NGÔ VĂN TỨ


CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÍ

GVHD: NGÔ VĂN TỨ

PHẦN I: NỘI DUNG
I.1 Lớp điện kép trên thành mao quản
Trong quá trình điện di, lớp điện kép và thế Zêta sát thành mao quản
luôn xuất hiện, nó phụ thuộc vào lực ion của dung dịch pha động điện
di. Yếu tố bề mặt mao quản, thành phần và pH của pha động có liên
quan đến sự hình thành, độ lớn và sự tồn tại của lớp điện kép trên bề
mặt mao quản và thế Zêta. Khi lực ion của dung dịch điện di tăng thì
lớp điện kép sẽ bị nén lại làm thế Zêta giảm và ảnh hưởng đến dòng
điện di thẩm thấu.

Hình 1. Lớp điện kép trên thành mao quản
(thành mao quản tích điện âm do các nhóm SiO-)

Trang 3


CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÍ

GVHD: NGÔ VĂN TỨ

Độ lớn của thế Zêta (Vzet) được tính gần đúng theo công thức:

VZet =

4π RD q
ε

(1.1)

Trong đó:
ε là hằng số điện môi của dung dịch pha động;
q là tổng điện tích dung dịch theo một đơn vị thể tích;
RD là bán kính hydrat của ion (bán kính Debye) được xác định
theo biểu thức:

RD =

ε kT
8π e 2 I

(1.2)

Trong đó:
e là điện tích của electron; k là hằng số Bolzoman; T là nhiệt độ
tuyệt đối; I là lực ion của dung dịch đệm điện di.
Công thức (1.2) cho thấy: khi nồng độ chất đệm điện li lớn, thì
giá trị lực ion I lớn thì RD giảm dẫn đến thế Zeta giảm theo (1.1).
Bên cạnh việc ảnh hưởng đến lớp điện kép trên bề mặt mao
quản, nồng độ của chất đệm, loại chất điện giải cũng ảnh hưởng đến
sự điện di của chất tan. Tác động này thể hiện qua sự ổn định và duy
trì dòng điện i và cả dòng điện di thẩm thấu EOF trong mao quản.
Từ đó ảnh hưởng đến độ điện di hiệu lực μef của chất phân tích.

Trang 4


CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÍ

I.2 Dòng điện di thẩm thấu (EOF)

Trang 5

GVHD: NGÔ VĂN TỨ


CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÍ

I.

2.1

GVHD: NGÔ VĂN TỨ

Khái niệm dòng điện di thẩm thấu

Bản chất chính của sự hoạt động trong ống mao quản của HPCEC
là dòng chảy điện di thẩm thấu EOF, gọi tắt là dòng điện di thẩm thấu.
Dòng EOF là dòng chảy khối của chất lỏng trong ống mao quản,
nó quan hệ mật thiết với lớp điện tích trên thành mao quản.
Dòng EOF sẽ xác định thời gian tồn tại của chất tan trong mao
quản. Nó bao trùm lên dòng di chuyển của chất tan, nghĩa là chất tan di
chuyển trong dòng EOF này.
I.2.2

Nguồn gốc dòng điện di thẩm thấu

Khi điện di với mao quản silica, các nhóm silanol (Si-OH) trên
thành mao quản sẽ giải phóng ra ion H + và bề mặt mao quản mang

điện tích âm. Do bề mặt mang điện tích âm nên các cation do lực hút
tĩnh điện sẽ tạo thành lớp điện kép để cân bằng điện tích và tạo nên
hiệu thế sát thành mao quản (thế Zeta).

Hình 2. Dòng điện di thẩm thấu EOF
Trang 6


CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÍ

GVHD: NGÔ VĂN TỨ

Khi áp thế V vào 2 đầu mao quản, các cation trong lớp điện kép
sẽ đi về catot. Nhưng vì các cation này bị sonvat hóa nên kéo cả khối
dung dịch trong mao quản đi về catot. Sự di chuyển của khối dung
dịch trong mao quản silica dưới tác dụng của điện trường tạo nên
dòng điện thẩm thấu EOF.
Tốc độ v của dòng EOF tỉ lệ thuận điện trường E, với thế zeta V Zet
và tỉ lệ nghịch với độ nhớt η của dung dịch đệm điện li theo công
thức:

vEOF =

ε EVZet
η

(1.3)

Tốc độ tuyến tính u

uEOF =

ε EVZet
4πη

(1.4)

Độ điện di của dòng EOF:

µEOF =

εVZet
η

(1.5)

Dòng EOF được quyết định bởi thế V đặt vào 2 đầu mao quản,
pH dung dịch đệm điện li, chất điện giải, lớp điện kép, độ nhớt của
dung dịch pha động, hằng số điện môi, độ xốp, cỡ hạt. Nhờ đặc tính
này người ta chọn được các điều kiện tối ưu để có tốc độ dòng EOF
phù hợp cho quá trình tách sắc kí.

Trang 7


CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÍ

GVHD: NGÔ VĂN TỨ

Hình 3. Ảnh hưởng của pH lên dòng EOF

I.2.3

Đặc điểm của dòng điện di thẩm thấu

Dòng EOF có 2 đặc điểm chính:
Thứ nhất, dòng EOF là dòng chuyển khối phẳng trong mao quản.
Có đặc điểm này vì lực tạo ra sự di chuyển của dòng EOF phân bố
đồng nhất dọc theo mao quản nên không có sụt áp trong mao quản.
Trong HPLC thì dòng chảy có dạng parabol do hiệu ứng thành:
các phần tử giữa dòng di chuyển nhanh, các phần tử gần thành di
chuyển chậm). Vì vậy pic sắc kí trong HPCEC gọn và sắc nét hơn
HPLC.
Trang 8


CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÍ

GVHD: NGÔ VĂN TỨ

Thứ hai, dòng EOF đưa tất cả các tiểu phân có mặt trong dung
dịch điện di, bất kể có mang điện hay không di chuyển theo cùng một
hướng nhất định từ anot (cực +) về catot (cực -) (nếu pH ≥ 4):
 Các cation di chuyển nhanh về catot với tốc độ khác nhau
tùy điện tích và kích thước của nó;
 Các phân tử trung hòa được dòng EOF mang theo cùng với
tốc độ của dòng EOF (nhưng chúng không tách ra được
trong CEC);
 Các anion di chuyển về anot nếu tốc độ của nó lớn hơn tốc
độ dòng EOF. Ngược lại chúng bị dòng EOF mang theo về
catot

Trang 9


CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÍ

GVHD: NGÔ VĂN TỨ

Hình 4. So sánh dòng chảy trong HPLC và trong CEC

Trang 10


CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÍ

GVHD: NGÔ VĂN TỨ

Hình 5. Sự chuyển của các phần tử trong CEC
Theo đó thứ tự rửa giải theo thời gian sẽ là: cation điện tích lớn,
kích thước nhỏ ra đầu tiên → các phân tử trung hòa → anion có
điện tích lớn và kích thước nhỏ ra sau cùng (Hình 6).

Hình 6 . Thứ tự rửa giải trên điện di đồ

Trang 11


CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÍ

I.2.4

GVHD: NGÔ VĂN TỨ

Các yếu tố ảnh hưởng đến dòng điện di thẩm thấu

 pH đệm: Ở pH càng cao các nhóm silanol mất proton H+ càng
nhiều nên trị số dòng EOF càng lớn. Phụ thuộc vào điều kiện
điện di cụ thể, trong khoảng pH 2 - 12 dòng EOF có thể thay đổi
10 lần.
 Lực ion của dung dịch: Lực ion của dung dịch tăng lên, làm
giảm thế Zeta nên dòng EOF giảm.
 Trong một số trường hợp dung dịch đệm nước có thêm một số
dung môi hữu cơ như methanol, acetonitril (để dễ hũa tan chất
phân tích), hằng số điện môi của dung dịch diện di giảm xuống
kéo theo sự giảm dòng EOF.
I.2.5

Kiểm tra và khống chế dòng điện di thẩm thấu

Theo trên ta thấy dòng EOF là một yếu tố thuận lợi và có vai trò
quan trọng trong kĩ thuật CEC nên cần kiểm tra và khống chế nó ở
mức độ phù hợp cho mục đích phân tích. Các cách kiểm tra, khống
chế dòng EOF được tổng kết ở bảng 4.
Bảng 1. Các cách kiểm tra, khống chế EOF
Cách thức thay đổi
Kết quả
Nhận xét chung
Điện trường E (tức Sự thay đổi tỉ lệ với + Độ phân giải và số đĩa
điện thế V)
EOF

lý thuyết hiệu lực giảm.
+ Làm nóng mao quản.
Giá trị pH của EOF giảm ở pH thấp + Cách tiện lợi để thay
dung dịch đệm và tăng ở pH cao
đổi EOF
điện di
+ Thay đổi được điện
tích, cấu trúc chất tan
Lực ion, nồng độ Làm giảm thế zeta và + Lực ion lớn, tạo dòng
dung dịch đệm
EOF khi tăng lực ion, điện lớn và hiệu ứng Jun
nồng độ dung dịch lớn
Trang 12


CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÍ

đệm

GVHD: NGÔ VĂN TỨ

+ Độ nét pic sắc kí bị
ảnh hưởng nếu độ dẫn
khác độ dẫn của mẫu

+ Hạn chế sự nạp mẫu
Nhiệt độ
Thay đổi độ nhớt 2 – Dùng khi kiểm tra và
3%/0C
khống chế nhiệt độ tự

động
Dùng các chất phụ Thay đổi thế zeta, độ + Thay đổi phức, xác
gia, dung môi hữu nhớt, EOF bị giảm
định dễ dàng bằng thực
cơ
nghiệm
+ Có thể thay đổi độ
chọn lọc của hệ pha
Các chất hoạt động Hấp phụ lên thành + Chất hoạt động bề mặt
mao quản qua tương là ation làm tăng EOF,
bề mặt
tác
ionic
hay cation làm giảm EOF, có
hydrophopic
thể đổi chiều EOF
Dùng polymer
hydrophilic trung
tính

+ Thay đổi độ chọn lọc
Hấp phụ lên thành + Làm giảm EOF qua
mao quản qua tương thay đổi điện tích bề mặt
tác hydrophopic
+ Làm tăng độ nhớt

Hoạt hóa bề mặt Tạo liên kết hóa học + Có nhiều cách thay
bằng cách cộng mới lên thành mao đổi: hydrophylicity, thay
hợp
quản

đổi điện tích
+ Làm bền bề mặt mao
quản
PHẦN II: BÀI TẬP

Trang 13


CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÍ

GVHD: NGÔ VĂN TỨ

Bài 1: Trong ống mao quản có chiều dài hiệu lực 50 cm, độ dài tổng
cộng 58,5 cm đặt một hiệu thế 25000 V. Sau quá trình chạy sắc kí,
trên sắc đồ người ta thu được 3 pic với thời gian lưu lần lượt là 38,4s,
50,7s, 93,1s ứng với 3 chất X, Y, Z. Tính độ điện di toàn phần, độ
điện di hiệu lực của X, Y, Z. Biết Y là chất trung tính, từ đó có nhận
xét gì về giá trị độ điện di hiệu lực μef ?
Giải
 Ta

có

công

thức

µtot = µi + µEOF =
→

µtot ( X ) =

µtot ( Z ) =

tính

độ

điện

di

toàn

phần:

L.l
V .ti

58, 5.50
= 3,05.10-3 (cm2.V-1.s-1)
38, 4.25000

58, 5.50
-3
2
-1 -1
=
1,26.10
(cm

.V
.s )
93,1.25000

Chất Y trung tính nên μi = 0, do đó:
µtot (Y ) = µEOF =

58, 5.50
= 2,31.10-3 (cm2.V-1.s-1)
50, 7.25000

 Độ điện di hiệu lực: µef = µtot − µEOF
→ μef (X) = 3,05.10-3 - 2,31.10-3 = 7,40.10-3 (cm2.V-1.s-1)
μef (Z) = 1,26.10-3 - 2,31.10-3 = -1,05.10-3 (cm2.V-1.s-1)
μef (Y) = 2,31.10-3 (cm2.V-1.s-1)
Nhận xét: μef (Z) < 0 → Z là một anion; μef (X) > 0 → X là một
cation.
Bài 2: Tách các protein bằng HPCEC. Mao quản dài 84 cm, thế
điện di 25000 V. Một phân tử trung hòa được dòng EOF mang theo
phải mất hết 308s để di chuyển đoạn 64 cm từ chỗ nạp mẫu đến
Trang 14


CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÍ

GVHD: NGÔ VĂN TỨ

detector. Chất A có thời gian lưu là 343s. Tính độ điện di tổng cộng
và độ điện di hiệu lực của chất A.
GIẢI

 Độ điện di tổng cộng của chất A:
Cường độ điện trường E: E = V/L = 25000/84 = 298 V/cm
μtot =

uA
64 / 343
=
E
298

= 6,26.10-4 (cm2.V-1.s-1)

Tốc độ tuyến tính của dòng EOF:
uEOF =

64
308

= 0,208 ( cm/s)

 Độ điện di của dòng EOF:
Từ uEOF = μEOF.E → μEOF = uEOF /E = 0,208 /298 = 6,98.104
(cm2.V-1.s-1)
 Độ điện di hiệu lực:

µ ef = µ tot − µ EOF

= 6,26.10-4 - 6,98.10-4
= -0,72.10-4 (cm2.V-1.s-1)

Vì μef < 0 nên có thể suy ra A là một anion.
Bài 3. Trong một phép tách HPCEC, mao quản có chiều dài tổng
bằng 1m, chiều dài hiệu lực bằng 90cm. Thế áp đặt vào hai đầu ống
mao quản là 20 kV. Detector được đặt phía trước catot với chất đệm
có pH = 5. Trong một dung dịch tiêu chuẩn, chất tan có thời gian lưu
là tm = 10 phút.
a) Tính độ điện di tổng cộng của chất đó.

Trang 15


CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÍ

GVHD: NGÔ VĂN TỨ

b) Nếu một phân tử nhỏ không mang điện có thời gian lưu bằng 5
phút, hãy xác định độ điện di của dòng EOF.
c) Tính độ điện di hiệu lực của chất đó.
d) Tính số đĩa lý thuyết N nếu chất có hệ số khuếch tan D = 2.10 -5
cm2/s.
GIẢI:
Tóm tắt:
L = 1m = 100cm
l= 90cm
V= 20kV= 20000V
tm = 10 phút
a. Độ điện di tổng cộng μtot :
μtot =

L.l

100.90
=
= 7,5.10 −4 (cm 2 .V −1.s −1 )
V .ti 20000.10.60

b. Độ điện di của dòng EOF có ti = 5 phút:

µ EOF = µtot (vì phân tử không mang điện)
=

L.l
100.90
=
= 1,5.10−3 (cm 2 .V −1.s −1 )
V .ti 20000.5.60

c. Độ điện di hiệu lực:

µ ef = µ tot − µ EOF = 7,5.10− 4 − 1,5.10− 3 = − 7,5.10− 4 (cm2 .V − 1.s − 1 )
Vì μef < 0 nên có thể suy ra chất đó là một anion.
d. Số đĩa lý thuyết N nếu chất có hệ số khuếch tan D = 2.10 -5
cm2/s

µtot .V .l 5.10−4.20000.90
N=
=
= 337500
−5
2.D.L
2.2.10 .100

Trang 16


CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÍ

GVHD: NGÔ VĂN TỨ

Bài 4. Phân tích sắc kí điện di mao quản với kỹ thuật CZE. Mao
quản có chiều dài tổng là 32cm, chiều dài hiệu lực là 24,5cm ở thế
điện di 30 kV. Dưới những điều kiện của thí nghiệm ghi được trong
môi trường trung tính đã xuất hiện chất có thời gian lưu là 3 phút.
a) Tính độ điện di hiệu lực của một chất có thời gian lưu 2,5 phút.
b) Tính hệ số khuyếch tán dưới những điều kiện đã cho của chất
đó, biết số đĩa lý thuyết N = 80 000.
GIẢI:
a.Độ điện di hiệu lưc:
μtot =

L.l
32.24,5
=
= 1, 742.10−4 (cm 2 .V −1.s −1 )
V .ti 30000.2,5.60

chất trong môi trường trung tính nên

µ ef = µ EOF ⇒ µ EOF =

µi = 0

32.24,5
= 1, 452.10− 4 (cm2 .V − 1.s − 1 )
30000.3.60

Độ điện di hiệu lực của một chất có thời gian lưu 2,5 phút.

µ ef = µ tot − µ EOF = 1,742.10− 4 − 1,452.10− 3 = 2,88.10− 5 (cm2 .V − 1.s − 1 )
b. Hệ số khuyếch tán khi số đĩa lý thuyết N = 80 000:

µ tot .V .l
N=
2.D.L
µ tot .V .l 1,742.10− 4.30000.24,5
⇒ D=
=
= 2,5.10− 5 (cm2 .s − 1 )
2.L.N
2.32.80000
Trang 17


CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÍ

GVHD: NGÔ VĂN TỨ

Bài 5. Cho một cột mao quản dài 50cm được áp đặt thế 30 000V,
độ điện di tính được với thời gian 10 phút là 2.10 -8 m2s-1V-1. Tính số
đĩa lý thuyết cho ion Li+ (D = 1,0.10-9 m2s-1) và cho một protein có
phân tử khối 105 (D = 3.10-11m2s-1).
Tóm tắt:

L= 50cm
V=30000V
t = 10

phút

DLi + = 10−9 m 2 .s −1
D proton = 3.10−11 m 2 .s −1

GIẢI:
- Số đĩa lý thuyết cho ion Li+

N Li+

µ i .V 2.10− 8.30000
5
đĩa
=
=
=
3.10
−9
2.D
2.10

- Số đĩa lí thuyết cho proton:

2.10− 8.30000
7
đĩa

N proton =
=
10
− 11
2.3.10
Bài 6. Định lượng vitamin B1 bằng kĩ thuật CZE hoặc MEKC sử
dụng chất nội chuẩn là o-ethoxybenzamide. Khi phân tích dung dịch
chứa 100,0 ppm B1 và 100,0 ppm o- ethoxybenzamide thì diện tích
pic của B1 bằng 71% diện tích pic chất nội chuẩn. Phân tích 0,125g
thuốc viên vitamin B cho diện tích pic của B 1 bằng 1,82 lần so với
chất nội chuẩn. Tính số mg vitamin B1 có trong thuốc này, biết thể
tích dung dịch ban đầu là 20 mL.
Trang 18


CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÍ

GVHD: NGÔ VĂN TỨ

GIẢI:
Áp dụng công thức trong phương pháp nội chuẩn:
SA
S IS

=
k.

CA
CIS

Trong đó: SA, SIS lần lượt là diện tích pic của chất chuẩn và chất
nội chuẩn (o-ethoxybenzamide); CA, CIS lần lượt là nồng độ của chất
chuẩn và chất nội chuẩn.
Theo đề bài ta có: SA = 0,71.SIS ; CA =100ppm; CIS =100ppm

0, 71.S IS
100
=
k
.

S IS
100

→ k = 0,71

Đối với mẫu thuốc viên vitamin B ta có: SA = 1,81.SIS ; CA = ?
ppm; CIS =100ppm

1,81.S IS
C
= 0, 71. A
S IS
100

→ CA = 256,338 ppm

 số mg vitamin B1 có trong thuốc là: 256,338.

20

= 5,126( mg )
1000

Bài 7. Một cation vô cơ có độ điện di 4,31.10 -4 cm2.V-1.s-1 và hệ
số khuếch tán 9,8.10-6 cm2.s-1 được phân tích bằng kĩ thuật CZE với
mao quản dài 50 cm và thế điện di 10 kV. Trong điều kiện này, dòng
điện di thẩm thấu có tốc đô 0,85 mm/s đi về phía catot. Nếu detector
được đặt cách điểm nạp mẫu 40 cm thì cation mất bao lâu để đến
được detector ?

Trang 19


CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÍ

GVHD: NGÔ VĂN TỨ

Tóm tắt:
µtot = 4,31.10−4 cm 2 .V −1.s −1

D = 9,8.10-6 cm2.s-1
L = 50 cm , l =40cm
V = 10000 V
ν

= 0,85 mm/s
GIẢI:
Ta có:

l

ti =
V

V =VEOF +Vi
mà Vi = µi .
* Tính

µi :

µ tot = µ EOF + µ i

Trang 20

V
L


CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÍ

GVHD: NGÔ VĂN TỨ

Mà


V
 ⇒ VEOF = µ EOF .
L

L 0,85.500
⇒ µ EOF = VEOF . =

= 0, 0425(mm 2 / V .s)
V
10000
ε .Vzet
η
ε .V V
VEOF = zet .
η L
µ EOF =

⇒ µi = 4,31.10 −2 − 0, 0425 = 0, 0431( mm 2 / V .s)
V
= 0,862( mm / s )
L
⇒ V = Vi + VEOF = 0,862 + 0,85 = 1, 712( mm / s )
⇒ Vi = µi .

⇒t =

Trang 21

l
400
=
= 233, 64( s) = 3,9 phút
V 0, 712


CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÍ

GVHD: NGÔ VĂN TỨ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Ngô Văn Tứ, Bài giảng sắc ký.
2. Phạm Luận (2002), Cơ sở lý thuyết của Sắc kí điện di mao
quản hiệu năng cao (HPCEC), ĐH KHTN – ĐHQG Hà
Nội.
3. Robetr
Weinberger
Electrophoresis, AP.

(1999),

Practical

Capillary

4. Ruth Freitag (2002), Modern Advances in Chromatography,
University of California, USA.

Trang 22