Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây xoan ta ( melia azedarach l,) phục vụ chuyển gen

Trờng ĐHSP H Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Mở đầu
1. Lý do chọn đề tài
Xoan ta (Melia azedarach L.) là cây thân gỗ, sớm rụng lá, thuộc họ xoan
(Meliaceae), có nguồn gốc ở ấn độ, miền nam Trung Quốc và Australia.
Xoan ta đợc phân bố ở nhiều nớc nh Việt Nam, Lào, Campuchia.
Riêng ở Việt Nam từ Bắc vào Nam hầu nh tỉnh nào cũng thấy sự hiện diện của
cây xoan ta, chúng mọc tự nhiên hoặc đợc trồng thành rừng [18].
Xoan ta là một trong những cây trồng quan trọng trong chiến lợc phát
triển lâm nghiệp, đợc trồng ở 6 trong số 9 vùng sinh thái lâm nghiệp, trong đó
có các vùng: vùng Đồng bằng sông hồng, vùng Trung du, vùng Tây bắc, vùng
Nam trung bộ, vùng Tây nguyên, vùng Đông nam bộ [18].
Xoan ta đứng đầu trong danh mục các cây trồng đợc u tiên phát triển theo
quyết định số 16/2005/ QĐBNN ngày 15/03/2005 của bộ trởng bộ Nông nghiệp
và Phát triển Nông thôn [26].
Xoan ta là loài cây gỗ lớn có thể cao đến 30m, đờng kính gần 100cm. Gỗ
xoan có lõi màu hồng hay nâu nhạt, dác xám trắng, gỗ nhẹ, vân thớ đẹp, nếu
đợc ngâm tẩm thì đây là loại gỗ khá bền và khó bị mối mọt, cho nên gỗ xoan
thờng đợc dùng để xây dựng, trang trí nội thất, điêu khắc [18].
Vì là một loài cây mang nhiều giá trị kinh tế nên hiện nay cây xoan đang
khuyến khích trồng và ngày càng mở rộng diện tích. Để đáp ứng nhu cầu sản
xuất thì cần đa ra các giống mới có đặc điểm nh kháng bệnh, chống chịu các
điều kiện bất lợi của môi trờng, có chất lợng gỗ tốt, sinh trởng phát triển
nhanh. Công nghệ chuyển gen đã dần trở thành nhân tố mang tính chìa khoá để
giải quyết các vấn đề trên. Tuy nhiên, để thực hiện đợc việc chuyển gen thì phải
có một hệ thống tái sinh cây hoàn chỉnh. Với mục đích tạo ra cây xoan ta có chất
lợng gỗ tốt, khả năng sinh trởng, phát triển nhanh nhờ chuyển gen thì trớc
tiên cần phải thiết lập đợc hệ thống tái sinh xoan ta invitro đạt hiệu suất cao. Vì

vậy chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu hệ thống tái sinh xoan ta (Melia
azedarach L.) phục vụ chuyển gen.

2. Mục đích nghiên cứu

DiệpThị Lan

1

Lớp K31A


Trờng ĐHSP H Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Tạo ra hệ thống tái sinh cây xoan ta invitro hoàn chỉnh phục vụ chuyển
gen bằng cách tạo đa chồi từ thân mầm, lá mầm.
3. Nội dung nghiên cứu
Chuẩn bị các môi trờng nuôi cấy khác nhau để đánh giá:
Khả năng cảm ứng tạo cụm chồi từ lá mầm
Khả năng cảm ứng tạo cụm chồi từ thân mầm
Khả năng kích thích kéo dài chồi
Khả năng tạo rễ và ra cây
Sau đó tìm ra môi trờng thích hợp nhất cho sự tái sinh của cây
4. ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Đây là hớng nghiên cứu mới ứng dụng công nghệ gen vào cải tiến giống
xoan ta. Việc xây dựng hệ thống tái sinh cây xoan ta hoàn chỉnh là bớc đột phá
quan trọng trong quy trình chọn tạo giống mới cung cấp cho các đơn vị trồng
rừng, nhằm phát triển rừng nguyên liệu có năng suất cao phẩm chất gỗ tốt.

Nội dung
DiệpThị Lan

2

Lớp K31A


Trờng ĐHSP H Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Chơng 1. Tổng quan tài liệu
1.1. Các đặc điểm tự nhiên của cây xoan ta
Là cây thân gỗ phân bố ở nhiều nớc trên thế giới nh Việt Nam, Trung
Quốc, Lào ... ở Việt Nam chúng mọc tự nhiên hoặc đợc trồng thành rừng [19].
Xoan ta là loại cây thờng rụng lá vào mùa đông, thân thẳng, tán lá tha,
vỏ màu nâu xám. Hoa nhỏ, đều, lỡng tính, có mùi thơm hắc với 5 cánh hoa có
màu tím nhạt hoặc tím hoa cà, mọc thành cụm (hình 1).

Hình 1: ảnh cành xoan mang hoa đang nở [23]
Quả hạch có màu vàng nhạt khi chín, treo trên cây suốt mùa đông và có
nhân màu trắng (hình 2) [21].

DiệpThị Lan

3

Lớp K31A

Trờng ĐHSP H Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Hình 2: ảnh cành xoan mang quả [23]
Lá dài đến 50 cm mọc so le, cuống lá với 2 hoặc 3 lần lá phức mọc đối, lá
chét mép có răng ca [21].
Hệ rễ ngang khá phát triển, thờng ăn nông và lan rộng, rễ cọc ăn sâu.
Xoan thờng phân cành sớm, khả năng đâm chồi nhanh nên có thể lợi dụng tái
sinh chồi đợc [23].
`

Xoan là cây nguyên sản ở các vùng nhiệt đới á và nhiệt đới châu á. Xoan

a sáng, sinh trởng nhanh, sau khi trồng từ 6-8 năm có thể thu hoạch đợc.
Xoan a khí hậu nóng ẩm có 2 mùa: mùa ma và mùa khô, lợng ma hàng năm
từ 1000 mm trở lên, những vùng có thể chịu đợc hạn với lợng ma hàng năm là
500 mm [23].
Xoan sinh trởng trên nhiều loại đất khác nhau nhng thích hợp nhất là
đất pha cát, đất phù sa ven sông có độ phì cao và sâu ẩm.
Xoan có thể chịu đợc muối, lợng muối trong đất từ 0,4-0,5%, đất chua
có độ PH 5-6, hơi kiềm. Những nơi đất bạc màu, khô hạn hoặc úng nớc đều
không thích hợp với xoan [23].
Xoan có khả năng tái sinh (mọc lại từ gốc cũ đã thu hoạch) từ 3-4 lần [18].

DiệpThị Lan

4

Lớp K31A


Trờng ĐHSP H Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Cây trồng 3 - 4 năm đã bắt đầu cho quả. Chọn những cây mẹ từ 10 - 20
tuổi mọc từ hạt, có thân thẳng, phân cành cao, tán lá đều, ít cành ngang, không
sâu bệnh để thu hái hạt làm giống [23].
Khi gieo ngâm hạt trong nớc ấm khoảng 450C trong 8h. Nhiệt độ thích
hợp cho sự nảy mầm là 16-220C, lợng ma trung bình từ 1700-2000 mm [19],
[20].
Xoan là cây thờng phân cành sớm, vì vậy để thúc đẩy cây sinh trởng,
phát triển nhanh về đờng kính, chiều cao và tạo ra đoạn thân sử dụng dài, cần
tiến hành chăm sóc nh: làm cỏ, xới đất, vun gốc kết hợp với bón phân đầy đủ
cho cây đồng thời thực hiện tỉa cành nhân tạo ngay từ khi cây 1,5 - 3 tuổi. Sau
tuổi này không nên tỉa tha nữa vì lúc này cành đã lớn việc tỉa tha dễ làm cây bị
rỗng ruột [23].
Xoan đâm chồi rất mạnh, cả chồi thân và chồi rễ do vậy có thể tạo cây
chồi sau khi khai thác. Kinh nghiệm nhân dân cho biết gỗ cây mọc từ chồi
thờng thẳng, chắc hơn mọc từ hạt nhất là những cây mọc từ chồi rễ [23].
1.2. ý nghĩa kinh tế của cây xoan
Gỗ xoan thuộc nhóm gỗ V, có lõi màu hồng hay nâu nhạt, dác xám trắng,
gỗ nhẹ mềm tỉ trọng 0,565, lực kéo ngang thớ 22kg/cm2, nén dọc thớ 339kg/cm2
[18].
Gỗ xoan nhẹ nhng khá bền ít bị mối mọt, mềm rất dễ bào nhẵn, ca xẻ
trạm trổ, nhng có nhợc điểm là dễ nứt. Nếu đợc ngâm nớc từ 5 - 6 tháng thì
trở nên rất bền và khó bị mối mọt cho nên gỗ xoan thờng đợc dùng trong xây

dựng nhà cửa, đóng đồ gia dụng, trang trí nội thất và dùng trong điêu khắc [23].
Than và củi xoan cung cấp một lợng nhiệt lớn. Ngoài ra lá, rễ xoan còn
dùng làm phân xanh, thuốc sát trùng, hạt có thể ép dầu chữa một số bệnh, trồng
xoan để che bóng và phòng hộ [18].
Với đặc điểm sinh hoá nh trên cũng nh có giá trị về nhiều mặt nên xoan
là loài cây trồng lâm nghiệp có nhiều tiềm năng phát triển rộng rãi.
1.3. Tình hình trồng xoan ở nớc ta
Theo quyết định của Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn Việt Nam số
16/2005/QĐ- BNN ngày 15/03/2005

DiệpThị Lan

5

Lớp K31A


Trờng ĐHSP H Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Danh mục các loài cây chủ yếu cho trồng rừng sản xuất theo 9 vùng sinh
thái lâm nghiệp.Trong đó các vùng trồng xoan nh: vùng Tây bắc gồm các tỉnh
Lai Châu, Điện Biên, Sơn La, Hòa Bình; vùng Trung du (TD) gồm 6 tỉnh: Lo
Cai, Yên Bái, H Giang, Tuyên Quang, Phú Thọ, Vĩnh Phúc; vùng đồng bằng
sông Hông (ĐBSH) gồm 10 tỉnh: Hải Phòng, Hải Dơng, Bắc Ninh, Hng Yên,
Hà Nội, Hà Tây, Thái Bình, Nam Định, Hà Nam, Ninh Bình; vùng Bắc Trung Bộ
(BTB) gồm 6 tỉnh: Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa
Thiên Huế; vùng Nam Trung Bộ (NTB) gồm 7 tỉnh: Quảng Nam, Quảng Ngãi,
Bình Định, Phú Yên, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận; vùng Tây Nguyên

(TN) gồm 5 tỉnh: Lâm Đồng, Đắk Nông, Đắc Lắc, Gia Lai, Kon Tum; vùng
Đông Nam Bộ gồm 6 tỉnh: Bà Rịa - Vũng Tàu, Đồng Nai, Bình Dơng, Bình
Phớc, Tây Ninh, Tp Hồ Chí Minh; vùng Tây Nam Bộ (TNB) gồm 12 tỉnh: Long
An, Bến Tre, Đồng Tháp, Sóc Trăng, Vĩnh Long, Cần Thơ,Tiền Giang, Bạc Liêu,
Cà Mau, Kiên Giang, An Giang, Trà Vinh [26].
1.4. Các phơng pháp kỹ thuật ứng dụng trong cải tiến di truyền giống xoan
1.4.1. Các kỹ thuật truyền thống
Phơng pháp truyền thống nh gieo hạt, hom rễ nhng khả năng cung cấp
với số lợng lớn, đúng mùa vụ trồng gặp nhiều khó khăn. Mặt khác do phơng
pháp nhân giống bằng hạt có nhiều nhợc điểm nh:
Thời gian bảo quản ngắn khoảng 6 - 7 tháng
Cây sinh trởng và phát triển không đồng đều do có sự phân li trong di
truyền
Khả năng kháng sâu bệnh của cây thấp [18].
1.4.2. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
Ta thấy cây xoan có nhiều tiềm năng phát triển rộng khắp các tỉnh. Khi
diện tích trồng xoan tăng đồng nghĩa với việc tăng nguồn giống. Để khắc phục
nhợc điểm của nhân giống bằng hạt và hom rễ nên trong thời gian qua trung
tâm ứng dụng tiến bộ khoa học và công nghệ đã ứng dụng thành công kỹ thuật
nhân giống vô tính cây xoan bằng phơng pháp nuôi cấy mô tế bào nhằm giải
quyết những khó khăn trên [18].

DiệpThị Lan

6

Lớp K31A


Trờng ĐHSP H Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Tính u việt của cây xoan cấy mô là: đảm bảo đặc tính di truyền, ít thoái
hoá, cây có khả năng sinh trởng và phát triển nhanh, có độ đồng đều cao, đảm
bảo lợng lớn cây trồng đúng thời vụ [18].
Có thể nói đây là một bớc đột phá quan trọng nhằm giải quyết khó khăn
về nhiều mặt, đồng thời sản xuất cung ứng giống cho các đơn vị trồng rừng kỹ
thuật, phát triển rừng nguyên liệu, đảm bảo chất lợng, nâng cao năng suất cây
trồng [18].
1.5. Cơ sở kĩ thuật của nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.5.1. Tính toàn năng của tế bào
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các
loại nuôi cấy các nguyên liệu (tế bào, mô, phôi...) thực vật hoàn toàn sạch các vi
sinh vật trên môi trờng dinh dỡng nhân tạo trong điều kiện vô trùng [1].
Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những công nghệ
quan trọng của công nghệ sinh học, là nền tảng để nghiên cứu và ứng dụng các
công nghệ khác trong lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật [1].
Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đợc tiến hành ở nớc ta từ những
năm 1960 tại miền Nam và những năm 1970 tại miền Bắc. Tuy nhiên chỉ từ cuối
những năm 1980 trở lại đây công nghệ mô tế bào mới phát triển mạnh mẽ và
nhanh chóng, nhiều phòng thí nghiệm, nghiên cứu đã đợc xây dựng và triển
khai ở hầu khắp các tỉnh thành trong cả nớc [ 22].
Cơ sở nuôi cấy mô tế bào thực vật là tính toàn năng của tế bào, điều này
lần đầu tiên đợc haberlandt (1902) đề cập, ông cho rằng: mỗi tế bào bất kỳ của
cơ thể đa bào đều tiềm tàng khả năng phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh.
Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hoá
đều mang toàn bộ thông tin di truyền của toàn bộ cơ thể. Trong điều kiện thích
hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh, đó là tính toàn
năng của tế bào. Tính toàn năng là cơ sở của phơng pháp nuôi cấy mô, tế bào

thực vật, trên cơ sở đó ngời ta đã tạo đợc một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một
tế bào riêng rẽ [1].
Hiện nay, ngời ta đã thực hiện đợc khả năng tạo ra đợc một cơ thể thực
vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ [1].

DiệpThị Lan

7

Lớp K31A


Trờng ĐHSP H Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

1.5.2. Sự phân hoá và phản phân hóa của tế bào
Cơ thể thực vật trởng thành là một tổng thể thống nhất bao gồm nhiều cơ
quan khác nhau, có chức năng khác nhau và đợc hình thành từ nhiều loại tế bào
khác nhau. Tuy nhiên, tất cả các loại tế bào đều bắt nguồn từ tế bào hợp tử ban
đầu. Tế bào hợp tử lúc đầu phân chia thành khối tế bào cha chuyên hóa. Các tế
bào cha chuyên hóa này tiếp tục phân chia thành các tế bào chuyên hoá đặc
trng cho các mô, cơ quan có chức năng khác nhau. Đó là hiện tợng phân hoá tế
bào. Tuy nhiên, các tế bào chuyên hóa thành các tế bào chuyên biệt lại không
mất sự hoàn toàn biến đổi của mình. Trong những điều kiện thích hợp nhất định
chúng có thể trở thành dạng tế bào nh tế bào ban đầu, nghĩa là ở dạng tế bào
cha chuyên hoá. Hiện tợng này gọi là hiện tợng phản phân hóa tế bào [1].
Sự phân hoá và phản phân hóa tế bào là một quá trình hoạt hóa, ức chế
hoạt động của các gen. Trong một giai đoạn phát triển nhất định của cây, một số
gen nào đó đang ở trạng thái ức chế không hoạt động đợc hoạt hóa để cho ra

một tính trạng biểu hiện mới. Ngợc lại một số gen lại bị ức chế đình chỉ hoạt
động. Quá trình hoạt hóa, ức chế diễn ra theo một chơng trình đã đợc lập sẵn
trong cấu trúc gen của tế bào, giúp cho sự sinh trởng, phát triển của cơ thể tế
bào thực vật đợc hài hòa. Sự hoạt động hài hoà của tế bào và mô cơ quan còn
phụ thuộc vào tế bào nằm trong khối mô, cơ quan của cơ thể. Khi tách riêng từng
tế bào, hoặc làm giảm kích thớc khối mô sẽ tạo điều kiện cho việc hoạt hóa các
gen của tế bào [1].
Kĩ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực chất là điều khiển phát triển sự phát sinh
hình thái của tế bào thực vật một cách có định hớng dựa vào sự phân hóa và
phản phân hóa của tế bào thực vật. Để điều khiển sự phát sinh hình thái của tế
bào, ngời ta bổ sung vào môi trờng nuôi cấy hai nhóm điều hoà sinh trởng
thực vật là auxin và cytokinin. Tỷ lệ hàm lợng của 2 nhóm chất điều hoà sinh
trởng này trong môi trờng nuôi cấy mô khác nhau sẽ định hớng cho sự phát
sinh hình thái (phát sinh chồi, rễ hoặc mô sẹo) của mô nuôi cấy khác nhau.
Trong môi trờng nuôi cấy, tỷ lệ nồng độ auxin/cytokinin (đại diện là IAA/KIN)
là thấp thì nuôi cấy phát sinh theo hớng tạo chồi, tỷ lệ này cao thì mô nuôi cấy

DiệpThị Lan

8

Lớp K31A


Trờng ĐHSP H Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

sẽ tạo ra mô sẹo. Mô sẹo là dạng tế bào cha phân hoá phân chia liên tục và có
khả năng hình thành phôi, chồi và cây hoàn chỉnh [1].

1.6. Nuôi cấy mô xoan
1.6.1. Lợc sử nuôi cấy mô xoan
Nuôi cấy mô tế bào thực vật đã đợc tiến hành trên nhiều đối loại cây nh:
lạc, đậu tơng, cà chua, hoa loa kèn, xoan... và đã đạt đợc những kết quả nhất
định để phục vụ cho nhiều mục đích của con ngời ví dụ nh phục vụ cho chuyển
gen, nhân giống để bảo tồn các giống quý... [3], [4], [5], [7], [8].
Nông Văn Hải, Lê Xuân Đắc, Hà Hồng Hải, Đào Thị Thu Hà, Nguyễn
Thanh Danh, Lê Thị Xuân, Lê Trần Bình đã xây dựng đợc thành công quy trình
nhân nhanh invitro cây Màng tang để bảo tồn giống quý [4].
Nguyễn Thị Phơng Thảo, Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Thị Mai đã
nghiên cứu nhân nhanh giống hoa loa kèn bằng kỹ thuật nuôi cấy invitro nhằm
tạo ra nhiều giống cung ứng cho các nhà sản xuất [8].
Đối với đối tợng là đậu tơng Nguyễn Thị Nh, Đỗ Tiến Phát, Lê Thị
Muội, Đinh Thị Phòng đã nghiên cứu đợc hệ thống tái sinh cây qua phôi soma
đối với giống ĐT12. Hiệu suất tái sinh đạt 39% và số phôi trung bình là 7,5. Đây
là bớc đầu để có thể nghiên cứu việc chuyển gen nhằm nâng cao năng suất và
chất lợng của các sản phẩm từ đậu tơng[5].
Ngoài ra ngời ta còn nghiên cứu quy trình tái sinh cây lạc, cây cà chua
phục vụ chuyển gen [3], [7].
Xoan là một đối tợng cây lâm nghiệp quan trọng và đã đợc nghiên cứu
nhiều. Cho đến nay đã có nhiều công trình của nhiều nhà khoa học nghiên cứu về
tái sinh xoan phục vụ chuyển gen nh: Ahmad và cộng sự 1990, Thakur và cộng
sự 1998, Vila và cộng sự 2003-2005, mới đây nhất là Sharry và cộng sự 2006
[10], [13], [15], [16].
Năm 1998 Thakur và cộng sự đã nghiên cứu tạo cụm chồi từ lá mầm và
đạt tỉ lệ tạo đa chồi là 74% trong 7-9 tuần nuôi cấy [15].
Năm 2005 Vila và cộng sự đã nghiên cứu tái sinh chồi từ rễ xoan ta với
việc sử dụng 0,44 M BAP cho tỉ lệ tạo cụm chồi là 66,8% không có chất điều
hoà sinh trởng tỉ lệ tạo cụm chồi là 40,3% [16].

DiệpThị Lan

9

Lớp K31A


Trờng ĐHSP H Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Năm 2006 Sharry và Teixeira dasilva sử dụng BAP kết hợp với NAA trong
việc cảm ứng tạo chồi và đã tạo đợc 160-200 chồi/g mẫu cấy [16].
ở Việt Nam, theo báo cáo năm 2007 của Hồ Văn Giảng trờng Đại học
Lâm nghiệp đã tuyển chọn đợc 15 cây trội có sản lợng gỗ cao lấy mẫu nuôi
cấy mô. Đang xác định chỉ tiêu chất lợng có liên quan đến sản lợng và chất
lợng gỗ. Đã tạo đợc mẫu sạch invitro xoan ta, bớc đầu đã xác định đợc loại
vật liệu nuôi cấy tạo phôi soma và cụm chồi, đã tái sinh đợc phôi soma và cụm
chồi. Hiện đang tiến hành nghiên cứu tiếp để hoàn thiện quy trình kĩ thuật tái
sinh cây xoan ta thông qua phôi soma và đa chồi [25].
Năm 2007 theo báo cáo của Đoàn Thị Mai Viện khoa học Lâm nghiệp
Việt Nam đã tiến hành các thí nghiệm nhân giống sinh dỡng bằng nuôi cấy mô
cho 36 dòng, bớc đầu đã tìm ra đợc môi trờng thích hợp cho từng dòng, hệ số
nhân chồi đạt từ 5,5 9,2 chồi/ cụm chồi [24].
Nghiên cứu ra rễ chồi xoan ta Sharry và Teixeira dasilva (2006), sử dụng
IBA ở nồng độ thấp 0,049M tỉ lệ chồi ra rễ chỉ đạt 17% nhng khi sử dụng
NAA ở nồng độ thấp 0,054M thì tỉ lệ ra rễ thu đợc 100% sau 6 tuần nuôi cấy
[13].
1.6.2. ảnh hởng của các thành phần môi trờng đến nuôi cấy mô xoan
Thành phần vô cơ bao gồm các muối khoáng (cả đa lợng và vi lợng)

đợc đa vào môi trờng nuôi cấy. Nhu cầu về muối khoáng của tế bào và mô
thực vật tách rời là không khác nhiều so với yêu cầu của cây đợc trồng trong
điều kiện tự nhiên. Trong thành phần muối khoáng đa lợng các nguyên tố phải
cung cấp là nitơ, kali, photpho[2].
Nitơ vô cơ đợc đa vào môi trờng ở 2 dạng là nitrat (NO3-) và amon
( NH4+ ). Đa số các môi trờng có chứa dạng nitrat nhiều hơn amon. Theo
Narayanas Wamy (1994) hàm lợng nitrat trong nhiều môi trờng khoảng 25M
còn của amon từ 2 - 20 M [2].
Trong môi trờng MS amon đợc cung cấp ở dạng muối NH4NO3,, còn
môi trờng B5 của Gramborg có amon ở dạng muối (NH4)2SO4 - các gốc nitrat
đợc đa vào môi trờng dới dạng muối nitrat canxi, nitrat kali hoặc nitrat
amon. Khi môi trờng chỉ chứa nitơ ở dạng dễ gây kiềm hoá môi trờng vì thế

DiệpThị Lan

10

Lớp K31A


Trờng ĐHSP H Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Yêu cầu về muối khoáng vi lợng của mô thực vật trong nuôi cấy khá
phức tạp và ít đợc nghiên cứu. Tuy nhiên trong nhiều loại môi trờng cơ bản đã
đợc xây dựng, các tác giả đều cung cấp cho môi trờng hầu hết các nguyên tố vi
lợng cần thiết nhằm mục đích để thúc đẩy sự sinh trởng và phát triển của mẫu
nuôi cấy [2].
Sắt đợc đa vào môi trờng dạng muối FeSO4.7H2O, Fe2(SO4)3. Nhng

chúng sẽ bị kết tủa và mẫu nuôi cấy rất khó hấp thụ các loại muối này do đó phải
cho thêm vào môi trờng nuôi cấy Na2EDTA (sodium ethyline diamine tetra
acetate) để tạo muối phức Na2FeEDTA (dạng selat) có cha Na, Fe và đợc mô
nuôi cấy hấp thụ dễ dàng [2].
Ngoài ra các thành phần hữu cơ cũng có ảnh hởng tới nuôi cấy mô.
Nguồn cacbon cung cấp cho mẫu nuôi cấy chính là đờng sucrose,
maltose...đợc sử dụng trong môi trờng. Bên cạnh vai trò là nguồn năng lợng,
vật chất cơ bản, đờng còn tạo ra một áp lực thẩm thấu giúp cho mô có sự cân
bằng cần thiết với môi trờng nuôi cấy [2].
Các tác nhân tạo g el: quyết định trạng thái vật lý của môi trờng nuôi cấy.
Các môi trờng chứa đủ hàm lợng chất tạo gel làm cho chúng đông lại ở nhiệt
độ bình thờng (25 - 30oC) [2].
Chất gel đợc sử dụng phổ biến là agar (thch) gồm một số polysaccharide
đợc lấy từ rong biển. Các polysaccharide kết hợp với các phân tử nớc tạo thành
polymer và đông lại thành gel ở nhiệt độ 450C. Hàm lợng agar sử dụng khoảng
0,5 - 10% tuỳ theo chất lợng của chúng và loại môi trờng đợc sử dụng. Nếu
nhiều quá gây hạn chế khả năng trao đổi chất giữa cơ thể với môi trờng [2].
Một số trờng hợp ngời ta còn bổ sung Adenin nồng độ 40 - 80mg/lit.
1.6.3. ảnh hởng của các chất điều hoà sinh trởng đến nuôi cấy mô xoan

DiệpThị Lan

11

Lớp K31A


Trờng ĐHSP H Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Các chất điều hoà sinh trởng có vai trò quan trọng trong kĩ thuật nuôi cấy
mô thực vật. Bằng cách cung cấp các chất điều hoà sinh trởng ở một mức thích
hợp ngời nghiên cứu có thể điều khiển đợc chiều hớng phát sinh hình thái
của mẫu nuôi cấy. Auxin và cytokinin là 2 chất đợc sử dụng phổ biến nhất.
Ngoài ra ngời ta còn sử dụng gibberellin [6].
Hiệu quả tác động của chất điều hoà sinh trởng phụ thuộc vào nồng độ sử
dụng, hoạt tính vốn có của chúng và mẫu nuôi cấy.
Auxin có hiệu quả kích thích sự sinh trởng của tế bào, cùng với cytokinin
làm tăng phân bào, hạn chế u thế đỉnh, kích thích sự hình thành rễ và tham gia
vào cảm ứng phôi vô tính [6].
Các loại Auxin thờng sử dụng trong nuôi cấy là:
IAA - Indole acetic acid
IBA - Indole butyric acid
NOA - Naphthoxy acetic acid
NAA - Naphthalene acetic acid
2,4D - 2,4 dichlorophenoxy acetic cid
IAA ít đợc sử dụng do kém bền với nhiệt và ánh sáng, những trờng hợp có bổ
sung IAA vào môi trờng nghiên cứu thì phải dùng ở nồng độ cao 1,0 - 30mg/l
(Dodds anh Roberts 1990) [2].
Theo Thakur và cộng sự (2004), Vila và cộng sự (2005) với việc sử dụng
môi trờng MS bổ sung thêm IBA ở nồng độ cao vào giai đoạn tiền cảm ứng sẽ
tăng cờng khả năng ra rễ chồi xoan ta invitro [15], [16], [17].
Các auxin khác có hàm lợng sử dụng từ 0,1 - 2,0 mg/lit - chúng có hiệu
quả sinh lý ở nồng độ thấp. Tuỳ loại auxin hàm lợng sử dụng và đối tợng nuôi
cấy mà tác động sinh lý của auxin là kích thích sinh trởng của mô, hoạt hoá sự
hình thành rễ hay thúc đẩy sự phân chia mạnh mẽ của tế bào dẫn đến hình thành
mô sẹo (callus) [2].
Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trởng của
chồi invitro. Các cytokinin có biểu hiện ức chế sự tạo rễ và sự sinh trởng của mô

sẹo nhng có ảnh hởng dơng tính rõ rệt đến phát sinh phôi vô tính của mẫu
nuôi cấy [6].

DiệpThị Lan

12

Lớp K31A


Trờng ĐHSP H Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Các loại cytokinin thờng dùng là: Kinetin (KIN), zeatin, 6Bentyl amino
purin (6BAP), Isopentenyl adenin (Zip) [2].
Kinetin đợc nhà khoa học Skoog phát hiện ngẫu nhiên trong khi chiết
xuất axit nucleic, kinetin thực chất là một dẫn xuất của bazơ nitơ adenin.
BAP là cytokinin đợc tổng hợp nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn kinetin
[6].
Theo báo cáo của Joarder và cộng sự (1993) BAP thực chất là điều hoà
sinh trởng rất tốt cho việc phát sinh chồi cây neem [17].
BAP đợc sử dụng ở nồng độ 0,44 M đã cho tỉ lệ tạo cụm chồi từ lá mầm
là 66,8%, BAP tốt hơn các cytokinin khác trong việc cảm ứng phát sinh chồi ở
cây gỗ [14], [16].
BAP ở nồng độ 4,44 M kích thích cảm ứng tạo phôi soma đạt tỉ lệ cao
nhất.
Hàm lợng sử dụng các loại cytokinin dao động từ 0,1 - 2,0 mg/lit. ở
những nồng độ cao hơn cytokinin kích thích rõ rệt sự hình thành chồi bất định
đồng thời ức chế mạnh sự tạo thành rễ của chồi nuôi cấy. Trong các loại

cytokinin nói trên thì KIN và BAP là 2 loại đợc sử dụng rộng rãi hơn cả [2].
Trong nuôi cấy có loại mẫu chỉ cần auxin hoặc cytokinin hoặc không cần
cả 2, đa số các trờng hợp sử dụng phối hợp cả auxin và cytokinin ở những
trờng hợp tỷ lệ khác nhau [2].
Tác động phối hợp của auxin và cytokinin có tác dụng quyết định đối với
sự phát triển và phát sinh hình thái của mô, tế bào. Những nghiên cứu của Skoog
cho thấy tỷ lệ auxin/cytokinin cao thì thích hợp cho sự hình thành rễ, tỷ lệ thấp
sẽ kích thích quá trình phát sinh chồi. Nếu tỷ lệ này ở mức độ cân bằng thì thuận
lợi cho phát triển mô sẹo. Das (1958) và Nitsel (1968) khẳng định rằng chỉ khi
tác động đồng thời của auxin và cytokinin thì mới kích thích mạnh mẽ sự tổng
hợp ADN, liên quan đến quá trình phân chia tế bào [9].
1.6.4. ảnh hởng của các điều kiện nuôi cấy
Các mẫu nuôi cấy thờng đợc đặt trong phòng nuôi ổn định về ánh sáng
và nhiệt độ. Tất cả các tế bào mô nuôi cấy đều cần ánh sáng trừ một số trờng
hợp nuôi cấy tạo mô sẹo, nhng trong quá trình tái sinh và nhân giống của chúng

DiệpThị Lan

13

Lớp K31A


Trờng ĐHSP H Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

1.6.5. ảnh hởng của pH
PH của đa số môi trờng nuôi cấy đều đợc điều chỉnh trong phạm vi từ
5,5 - 6.0. PH dới 5,5 làm cho agar khó chuyển sang trạng thái gel còn pH > 6,0

agar có thể rất cứng. Nếu trong thành phần môi trờng nuôi dỡng có GA3 thì
phải điều chỉnh giá trị pH của phạm vi nói trên. Vì pH quá kiềm hoặc quá acid,
GA3 sẽ chuyển sang dạng không có hoạt tính (Vanbrapt and piert 1971). Trong
quá trình nuôi cấy, pH của môi trờng có thể giảm xuống do một số mẫu thực vật
sản sinh ra các axit hữu cơ [2].

DiệpThị Lan

14

Lớp K31A


Trờng ĐHSP H Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Chơng 2:
Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu thực vật
Quả xoan ta thu hái và chọn lọc từ những cây trội đợc trung tâm giống và
công nghệ sinh học, viện sinh thái rừng và môi trờng, Đại học lâm nghiệp cung
cấp. Sau đó loại bỏ phần thịt quả bằng cơ giới và tách lấy hạt làm vật liệu nuôi
cấy.
2.1.2. Dụng cụ và hoá chất thí nghiệm
Các điều kiện máy móc và hoá chất đợc phòng Công nghệ tế bào thực vật
- Viện công nghệ sinh học cung cấp.
Môi trờng nuôi cấy, môi trờng cơ bản MS đợc sử dụng trong nghiên
cứu gồm các muối đa lợng và vi lợng theo Murashige và Skoog

Dụng cụ: nồi khử trùng, tủ cấy, bình tam giác, pipet, lò vi sóng, tủ sấy,
máy chuẩn pH....
Hoá chất: môi trờng MS, môi trờng B5 theo Gamborg, sucrose, 8gam
agar/lit, pH = 5,8 ( bảng 1).

DiệpThị Lan

15

Lớp K31A


Trờng ĐHSP H Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Bảng 1: Thành phần môi trờng MS (theo Murashige và Skoog)
STT

Thành phần

Nồng độ

Muối khoáng
1

NH4N03

1650 mg/lit

2

KN03

1900 mg/lit

3

CaCl2.2H20

440 mg/lit

4

MgS04.7H20

370 mg/lit

5

KH2P04

170 mg/lit

6

H3B03

6,2 mg/lit

7

MnS04.4H20

22,3 mg/lit

8

ZnS04.7H20

8,6 mg/lit

9

KI

0.83 mg/lit

10

Na2Mo04.2H20

0,25 mg/lit

11

CuS04.5H20

0,025 mg/lit

12

CoCl2.6H20

0,025 mg/lit

13

Na2EDTA

37,3 mg/lit

14

FeS04.7H20

27,8 mg/lit

Các chất hữu cơ và vitamin
15

Myo - Inositol

100 mg/lit

16

Nicotinic acid

0,5 mg/lit

17

Vitamin B1

0,5 mg/lit

18

Vitamin B6

0,1 mg/lit

19

Glycine

2,0 mg/lit

20

sucrose

30 g/lit

21

Agar

8 g/lit

pH

5,6

B

B

DiệpThị Lan

16

Lớp K31A


Trờng ĐHSP H Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

2.2. Phơng pháp nghiên cứu
Khử trùng môi trờng và dụng cụ nuôi cấy ở nhiệt độ 1210C, áp suất 1,5
atm trong 15 phút. Nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ 25 20C cờng độ ánh sáng
3000 lux với thời gian chiếu sáng 16h/ngày.
Tái sinh cụm chồi bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật gồm các bớc theo sơ đồ
[27].
Cây giống trong vờn giống
đầu dòng
Khử trùng

Môi trờng MS căn bản

Chồi con trong ống nghiệm

Cấy chuyển

Môi trờng nhân chồi

Cụm chồi

Môi trờng nhân chồi

Môi trờng vơn thân

Cây con chuẩn bị ra rễ

Môi trờng ra rễ
Cây con hoàn chỉnh

Nhà huấn luyện

DiệpThị Lan

Ươm cây trong vờn ơm

17

Lớp K31A

Trờng ĐHSP H Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Chúng tôi tiến hành tái sinh cụm chồi từ lá mầm, thân mầm theo các bớc
nh sau:
Vô trùng mẫu
Tạo cụm chồi
Kéo dài chồi
Kéo dài rễ và hoàn thiện cây con invitro
Đa cây ra nhà lới
2.2.1. Khử trùng mẫu và chuẩn bị nguyên liệu tạo chồi
Hạt đợc sát khuẩn bề mặt bằng ethanol trong 3 phút.
Khử trùng bằng javen 60% trong 30 phút (lắc mạnh).
Loại bỏ javen và rửa sạch bằng nớc cất vô trùng 5 lần.
Hạt sau khi khử trùng đợc nuôi cấy trên môi trờng dinh dỡng MS bổ
sung thêm sucrose với mật độ 15 hạt/bình tam giác 250 ml.
2.2.2. Cảm ứng tạo cụm chồi
Sau 3 tuần nuôi cấy hạt nảy mầm, phân lá mầm đợc cắt bỏ viền lá và cắt
đôi, phần thân mầm cắt thành những đoạn nhỏ có kích thớc 4 -5 mm cấy lên
môi trờng MS bổ sung thêm vitamin B5 (Gamborg và cộng sự 1968) và 3%
sucrose + 0,44 - 13,32 M, 6BAP+ + 0,46 M KIN nuôi cấy trong 4 tuần.
2.2.3. Kích thích kéo dài chồi
Các chồi đợc tái sinh ra từ cụm chồi và cấy chuyển sang môi trờng kích
thích kéo dài chồi MS bổ sung thêm vitamin B5 + 3% sucrose + 0,44 - 2,22 M
BAP + 0,3 M GA3 nuôi cấy trong 4 tuần.
2.2.4. Khả năng tạo rễ và ra cây hoàn thiện cây con invitro
Các chồi đạt chiều dài 20 30 mm đầu tiên đợc cấy lên môi trờng tiền
cảm ứng tạo rễ MS bổ sung thêm 2% sucrose + 12,30 mM IAB nuôi cấy trong 4
ngày và sau đó cấy sang môi trờng MS có bổ sung thêm 1% sucrose, không bổ

sung chất điều hoà sinh trởng. Nuôi tiếp trong 4 tuần để kéo dài rễ.
2.2.5. Đa cây ra nhà lới
Cây mô hoàn chỉnh đợc đa ra nhà lới, trồng trên giá thể trấu hun
100%, trấu hun pha cát tỉ lệ 1:1, cát 100% trong vòng 2 tuần đầu ánh sáng trực
xạ. Tất cả môi trờng nuôi cấy đều đợc chuẩn độ pH = 5,8 và bổ sung thêm agar

DiệpThị Lan

18

Lớp K31A


Trờng ĐHSP H Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

2.2.5. Phơng pháp xử lí số liệu thực nghiệm
Số liệu đợc xử lí đánh giá theo phơng pháp toán thống kê trên máy tính
nhờ phần mềm Excel - 2003 với các thông số trung bình số học, độ lệch chuẩn,
hệ số biến động, sai số của trung bình số học, sai số của hiệu các trung bình số
học, tiêu chuẩn độ tin của hiệu.
Trung bình số học:

1
n

=

X

n



X

(X



i= 0

i

y
x


=

C V
=

m
m

d

td =

=

X

)

2

n 1
* 1 0 0
X


n

=

m
d
m

2
1

+ m

2

2

d

DiệpThị Lan

19

Lớp K31A


Trờng ĐHSP H Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Chơng 3:
Kết quả và thảo luận
3.1. Khả năng cảm ứng cụm chồi từ lá mầm
Nghiên cứu sự ảnh hởng của chất điều hoà sinh trởng BAP và KIN,
NAA lên khả năng cảm ứng tạo cụm chồi từ lá mầm cây xoan ta, kết quả thu
đợc ghi ở bảng 2 nh sau:
Bảng 2: ảnh hởng của các chất điều hoà sinh trởng đến khả năng cảm
ứng tạo cụm chồi từ mảnh lá mầm sau 4 tuần nuôi cấy.
Phần trăm

BAP

KIN

NAA

Mảnh

(M)

(M)

(M)

cấy tạo chồi

-

-

-

0/92

0

0

0,44

-

-

0/97

0

0

2,22

-

-

5/89

5,6

1,5 0,2

4,44

-

-

81/90

90,0

6,8 0,1

6,66

-

-

86/90

91,5

6,2 0,4

90/96

93,8

5,8 0,3

8,88

mảnh cấy

C hồi/mảnh cấy

tạo chồi

11,10

-

-

72/85

84,7

5,5 0,2

13,32

-

-

61/76

80,3

5,0 0,1

2,22

0,46

-

7/97

7,2

1,7 0,3

4,44

0,46

-

84/86

97,7

7,0 0,8

6,66

0,46

-

95/97

98,0

7,3 0,8

8,88

0,46

-

85/92

92,4

6,0 0,9

4,44

-

2,68

9/71

12,7

1,2 0,0

6,66

-

2,68

9/74

12,2

1,0 0,0

8,88

-

2,68

31/92

37,0

2,5 0,5

11,10

-

2,68

26/97

26,8

2,2 0,2

Ghi chú: (-) không có chất điều hoà sinh trởng

DiệpThị Lan

20

Lớp K31A


Trờng ĐHSP H Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

ở công thức môi trờng không có chất điều hoà sinh trởng hoặc có chất
điều hòa sinh trởng là BAP ở nồng độ thấp 0,44M thì các mảnh lá mầm sau 4
tuần nuôi cấy dới điều kiện chiếu sáng không có khả năng cảm ứng tạo cụm
chồi. Trong khi đó nghiên cứu tái sinh chồi từ rễ cây xoan ta chỉ cần sử dụng
0,44M BAP đã cho tỉ lệ tạo cụm chồi là 40,3% (Vila và cộng sự 2005).Khi sử
dụng riêng BAP với nồng độ thấp 2,22M tỉ lệ cảm ứng tạo cụm chồi thấp đạt
5,6% và số chồi trung bình là 1,5 chồi/mảnh cấy. Tuy nhiên khi sử dụng riêng
BAP ở các nồng độ từ 4,44 - 13,32M khả năng cảm ứng cụm chồi diễn ra mạnh,
chỉ sau 2 tuần nuôi cấy, quan sát cho thấy hầu hết các mảnh lá mầm đã cảm ứng
tạo mô sẹo và tạo chồi tại vết cắt (hình 3) sau 4 tuần nuôi cấy tỉ lệ cảm ứng tạo
cụm chồi đạt 93,8%, số chồi trung bình 5,8 chồi/mảnh cấy ở nồng độ 8,88M
BAP (hình 4) ở nồng độ 4,44M BAP tỉ lệ mảnh cấy cảm ứng tạo cụm chồi 90%
nhng số chồi trung bình thu đợc trên mỗi mảnh cấy là 6,8 chồi/mảnh cấy. Từ
kết quả thu đợc cho thấy BAP ảnh hởng rất mạnh mẽ đến khả năng tạo chồi.
Theo nghiên cứu của Joarder và cộng sự (1993) BAP là chất điều hoà sinh
trởng thuộc nhóm cytokinin rất tốt cho sự phát sinh chồi cây neem
(Azadirachda indica Juss.meliaceae) [17].
BAP tốt hơn các cytokinin khác trong sự cảm ứng phát sinh chồi ở cây gỗ
(Zamam 1991, Thakur và cộng sự 1988) [15].
BAP ở nồng độ 4,44M cũng kích thích cảm ứng tạo phôi soma xoan ta
đạt tỷ lệ cao nhất (Sharry và cộng sự 2006) [13], [14].
Nhiều nghiên cứu ảnh hởng kết hợp giữa BAP ở nồng độ cao và KIN ở

nồng độ thấp kết quả cũng cho thấy, tỉ lệ cảm ứng cụm chồi tăng lên và số chồi
trên cụm cũng tăng. Khi sử dụng kết hợp BAP ở nồng độ thấp 2,22M BAP +
0,46 M KIN tỉ lệ cảm ứng tạo cụm chồi thấp đạt 7,2% và số chồi trung bình
cũng thấp 1,7 chồi/mảnh cấy.
Nhng khi tăng nồng độ BAP lên từ 4,44 M - 8,88 M kết hợp với
0,46M KIN thì tỉ lệ cảm ứng tạo cụm chồi tăng trong khoảng từ 92,4% - 98%
và số chồi trung bình cũng cao trong khoảng 6,0 - 7,3 chồi/mảnh cấy.Chiều cao

DiệpThị Lan

21

Lớp K31A


Trờng ĐHSP H Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Khi sử dụng kết hợp BAP và NAA trong việc cảm ứng tạo cụm chồi từ lá
mầm tỉ lệ cảm ứng tạo cụm chồi thấp, số chồi/mảnh cấy cũng thấp cụ thể: ở công
thức kết hợp 4,44M BAP + 2,68M NAA tỉ lệ cảm ứng tạo cụm chồi thấp đạt
12,7%, số chồi trung bình đạt 1,2 chồi/mảnh cấy. Và khi tăng nồng độ BAP lên
là 6,66M tỉ lệ cảm ứng cụm tạo chồi đạt 12,2%, số chồi trung bình là 1,0
chồi/mảnh cấy.
Nồng độ 8,88M BAP và 2,68M NAA chỉ cho tỉ lệ cảm ứng tạo cụm
chồi là 37% số chồi trung bình là 2,5 chồi/mảnh cấy. Và khi tăng nồng độ BAP
lên ở nồng độ 11,10M kết hợp với 2,68M NAA thì tỉ lệ cảm ứng tạo cụm chồi
lại giảm (26,8%), số chồi trung bình đạt 2,2 chồi/mảnh cấy. Nhìn chung ở các
công thức bổ sung thêm NAA tỷ lệ phần trăm cảm ứng tạo cụm chồi giảm đáng

kể, số chồi trên mảnh cũng thấp chủ yếu chồi đơn.
Môi trờng thích hợp cho việc tái sinh cụm chồi từ mảnh lá mầm là môi
trờng MS bổ sung thêm vitamin B5 + BAP ở các nồng độ từ 4,44 - 8,88M +
0,46M KIN + 3% sucrose và đợc khuyến cáo sử dụng trong công tác biến nạp
và tái sinh cây chuyển gen.
3.2. Khả năng cảm ứng tạo cụm chồi từ thân mầm
Các đoạn thân mầm đợc cắt thành các đoạn nhỏ với chiều dài 4 - 5 mm
đặt lên môi trờng tái sinh chồi với các chất điều hoà sinh trởng khác nhau và ở
các nồng độ khác nhau. Sau 4 tuần nuôi cấy thu thập và xử lý số liệu kết quả thu
đợc ghi ở bảng 3. Khác với lá mầm, thân mầm xoan ta tái sinh kém hơn. Sau 2
tuần đầu nuôi cấy đa số các đoạn thân mầm bị cảm ứng tạo mô sẹo hoá rất mạnh
và chỉ có một số mô sẹo chuyển từ màu trắng sang màu nâu và mất khả năng tái
sinh chồi. Đối với thân mầm khi nuôi cấy trên môi trờng không có chất điều hoà
sinh trởng cũng có khả năng tái sinh chồi với tỉ lệ 4,3%. Khi sử dụng đơn lẻ
BAP cho việc tái sinh chồi từ thân mầm kết quả chỉ ra rằng ở nồng độ 0,44M tỉ
lệ cảm ứng tạo cụm chồi đạt 26,6% cao hơn so với các nồng độ khác. Trong khi
đó ở nồng độ 0,44M BAP tỉ lệ tái sinh chồi từ lá mầm là 0%.

DiệpThị Lan

22

Lớp K31A


Trờng ĐHSP H Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Sử dụng tổ hợp giữa BAP + KIN và BAP + NAA trong việc tái sinh chồi

từ đoạn thân mầm. Kết quả thu đợc cho thấy tỉ lệ mảnh cấy tạo chồi cao nhất là
(30,1%) ở công thức 8,88 M BAP + 2,68 M NAA tỷ lệ này thấp hơn rất nhiều
so với tái sinh từ lá mầm (98%), số chồi/mảnh cấy cũng thấp hơn nhiều so với
việc cảm ứng từ lá mầm, trong việc tái sinh cụm chồi từ thân mầm số chồi/mảnh
cấy chỉ trong khoảng 1,2 - 2,8 chồi/mảnh cấy.
Bảng 3: ảnh hởng cuả các chất điều hoà sinh trởng đến khả năng cảm ứng
chồi từ thân mầm sau 4 tuần nuôi cấy.

BAP

KIN

NAA

Mảnh cấy tạo

Phần trăm

chồi/mảnh

( M)

( M)

( M)

chồi

mảnh cấy

cấy

tạo chồi
-

-

-

4/94

4,3

1,0 0,0

0,44

-

-

25/94

26,6

1,8 0,2

2,22

-

-

12/92

13,0

1,5 0,4

4,44

-

-

10/97

10,0

2,5 06

6,66

-

-

6/95

6,3

2,1 0,5

8,88

-

-

5/85

5,9

2,4 0,3

2,22

0,46

-

18/96

18,8

2,6 0,7

4,44

0,46

-

12/84

14,3

2,0 0,8

6,66

0,46

-

8/90

8,9

1,5 0,2

8,88

0,46

-

7/72

9,7

2,5 0,6

2,22

-

2,68

5/80

6,3

2,2 0,0

4,44

-

2,68

11/92

12,0

2,1 0,5

6,66

-

2,68

15/95

15,8

2,6 0,7

8,88

-

2,68

28/93

30,1

2,8 0,5

Ghi chú: (-) không có chất điều hoà sinh trởng

DiệpThị Lan

23

Lớp K31A

Trờng ĐHSP H Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

3.3. Kích thích kéo dài chồi
Các chồi đạt chiều cao 7 mm đợc tách ra từ cụm chồi và cấy chuyển
sang môi trờng kích thích kéo dài chồi MS bổ sung thêm Vitamin B5 + 3%
sacrose + 0,44 - 2,22M BAP + 0,3M GA3. Sau 4 tuần nuôi cấy thống kê số
liệu thu đợc trình bày ở bảng 4.
Bảng 4: ảnh hởng các chất điều hoà sinh trởng đến khả năng kéo dài chồi
sau 4 tuần nuôi cấy.

BAP (M)

GA3 (M)

phần trăm chồi kéo dài

Chiều cao chồi (mm)

-

-

62

15,2 1,8

0,44

-

90

20,5 4,2

0,88

-

92

25,2 2,7

2,22

-

52

10,6 0,5

0,44

0,03

95

22,4 3,0

0,88

0,03

97

28,7 2,9

2,22

0,03

54

16,3 2,5

Ghi chú: (-) không có chất điều hoà sinh trởng
Chồi sử dụng là 100 trên mỗi công thức thí nghiệm số liệu cho thấy khi
không có chất điều hoà sinh trởng tỉ lệ chồi kéo dài thấp đạt 62% và chiều cao
trung bình của chồi cũng thấp 15,2 mm.
Khi sử dụng riêng BAP ở các nồng độ 0,44 và 0,88M thì tỉ lệ chồi kéo
dài lại tăng (90 - 92%),chiều cao trung bình của chồi cũng tăng (20,5 - 25,2 mm).
Nhng khi tăng nồng độ BAP lên 22,2M tỉ lệ kéo dài chồi giảm xuống (52%)
chiều cao chồi thấp hơn (10,6 mm) và xuất hiện các chồi nách ở phần gốc chồi.
Sử dụng kết hợp GA3 và BAP thì kết quả đạt đợc nh sau: ở các công
thức môi trờng sử dụng BAP ở nồng độ 0,44 và 0,88M kết hợp với 0,03M

DiệpThị Lan

24

Lớp K31A


Trờng ĐHSP H Nội 2

Khoá luận tốt nghiệp

Sử dụng GA3 ở nồng độ thấp kết hợp với BAP ở nồng độ thích hợp có tác
dụng tốt cho khả năng kích thích chiều cao chồi. Kết quả thu đợc của chúng tôi
cũng tơng tự nh nghiên cứu của Sharry và Teixeira dasilva (2006) về tái sinh
xoan ta từ lá mầm và của Vila và cộng sự 2005 về tái sinh xoan ta từ rễ [13],
[16].
3.4. Khả năng tạo rễ và ra cây
Theo Thakur và cộng sự (2004) và Vila và cộng sự (2005), môi trờng MS
bổ sung thêm IBA ở nồng độ cao vào giai đoạn tiền cảm ứng sẽ tăng cờng khả
năng tạo rễ chồi xoan ta invitro. Các chồi đạt chiều dài từ 20 - 30 mm, giai đoạn
đầu đợc cấy lên môi trờng tiền cảm ứng tạo rễ MS bổ sung thêm 12,30M IBA
+ 2% sucrose nuôi trong thời gian 4 ngày và sau đó cấy chuyển sang môi trờng
MS có chứa 1% sucrose, không có chất điều hoà sinh trởng nuôi tiếp trong thời
gian 4 tuần. Kết quả thu đợc cho thấy tỷ lệ chồi ra rễ đạt 100% (hình 5) kết quả
này phù hợp với nghiên cứu của Thakur và cộng sự (2004) và Vila và cộng sự
(2005). Khi nghiên cứu ra rễ chồi xoan ta Sharry và Teixeira dasilva (2006) sử
dụng IBA ở nồng độ thấp 0,049M tỷ lệ chồi ra rễ đạt 17% nhng khi sử dụng
NAA ở nồng độ thấp 0,054M thì tỷ lệ ra rễ thu đợc 100% sau 6 tuần nuôi cấy
[13].
Trong điều kiện invitro, cây mô đợc cung cấp đầy đủ chất dinh dỡng,
ánh sáng và sống trong điều kiện vô trùng. Với mục đích xây dựng 1 quy trình tái
sinh cây hoàn chỉnh phục vụ cho công tác chuyển gen nên hệ thống tái sinh cây
không chỉ dừng lại ở giai đoạn tạo cây mô in vitro mà tiếp tục hoàn thiện chuyển

cây ta trồng trong điều kiện nhà lới. Khi đa cây mô từ trong điều kiện phòng
thí nghiệm ra nhà lới, cây non phải trải qua các giai đoạn thích nghi dần dần.
Cây mô có bộ rễ phát triển đợc chuyển ra trồng trên 3 loại giá thể có
thành phần chủ yếu: trấu hun 100%, trấu pha cát tỷ lệ 1 : 1 và cát 100%. Trong 2
tuần đầu cây đợc nuôi cấy trong phòng nuôi cấy với nhiệt độ 270c, cờng độ
chiếu sáng 1000 - 1500 lux, thời gian chiếu sáng 12h/ngày. Sau 2 tuần đầu cây

DiệpThị Lan

25

Lớp K31A