Tuyển chọn chủng nấm men, nghiên cứu ảnh hưởng của ph, nhiệt độ và KH2PO4 tới quá trình lên men vang táo mèo, dâu và mơ

Khoá luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Huệ

Lời cảm ơn

Với tấm lòng biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn cô
PGS.TS . Đinh Thị Kim Nhung và thầy ThS. Nguyễn Khắc Thanh

đã tận tình hướng dẫn em trong thời gian qua.
Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong
khoa Sinh-KTNN đã tạo điều kiện cho em thực hiện đề tài.
Cảm ơn tất cả các bạn sinh viên đã giúp đỡ tôi để tôi hoàn
thành khoá luân một cách tốt đẹp.

Hà Nội, ngày tháng 5 năm 2008
Sinh viên
Nguyễn Thị Huệ

Trường ĐHSP Hà Nội 2

1

K30C - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Huệ

BảN CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài: Tuyển chọn chủng nấm men, nghiên cứu ảnh hưởng
của pH, nhiệt độ và KH2PO4 tới quá trình lên men vang táo mèo, dâu và mơ là
do tôi thực hiện, không có sự trùng lặp với tác giả khác.
Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.
Hà Nội, ngày tháng 5 năm 2008
Sinh viên

Nguyễn Thị Huệ

Trường ĐHSP Hà Nội 2

2

K30C - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Huệ
Mục lục

Lời cảm ơn ..................................................................................................... 1
Bản cam đoan2
Mục lục .......................................................................................................... 3
Dang mục chữ viết tắt, bảng , đồ thị, biểu thị, hình vẽ.................................. 7
ặt vấn đề ...................................................................................................... 9
1. Lý do chọn đề tài ....................................................................................... 9
2. Mục tiêu của công trình........................................................................... 10
3. Đối tượng nghiên cứu .............................................................................. 10
4. ý nghĩa lý luận và thực tiễn của công trình. .......................................... 10

Chương 1: Tổng quan tài liệu ...................................................................... 11
1.1. Khái quát chung về rượu vang.............................................................. 11
1.1.1.Thành phần của rượu vang. ................................................................ 11
1.1.2. Các loại rượu vang ............................................................................. 11
1.1.3. Nguyên liệu sản xuất rượu vang ở nước ta. ....................................... 11
1.1.4. Tàng trữ rượu vang ............................................................................ 11
1.2. Một số đặc tính sinh học của tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae.
..................................................................................................................... 12
1.2.1. Sơ lược về nấm men........................................................................... 12
1.1.2. Hình thái và kích thước của tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae
..................................................................................................................... 12
1.1.3. Cấu tạo của tế bào nấm men.............................................................. 13
1.2.4. Sinh sản của tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae ................. 14
1.3. Những biến động sinh lý sinh hóa, vi sinh khi lên men rượu vang, khả
năng lên men đường của Saccharomyces cerevisiae .................................. 15
1.4. Vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men rượu vang, bệnh vang. ..... 18
1.4.1. Nấm men ........................................................................................... 18
1.4.2. Nấm mốc ........................................................................................... 18
Trường ĐHSP Hà Nội 2

3

K30C - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Huệ

1.4.3. Vi sinh vật làm hỏng vang................................................................. 18

1.4.4. Bệnh vang .......................................................................................... 19
1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của nấm men ........... 19
1.5.1. Nguồn Cacbon ................................................................................... 19
1.5.2. Nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ............................................................... 20
1.5.3. Nguồn photpho vô cơ ........................................................................ 20
1.5.4. Nguồn nguyên tố khoáng .................................................................. 20
1.5.5. Nguồn oxi .......................................................................................... 20
1.6. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men ........................................ 21
1.6.1. ảnh hưởng của nhiệt độ .................................................................... 21
1.6.2. ảnh hưởng của nồng độ cồn ............................................................. 21
1.6.3. ảnh hưởng của pH ............................................................................ 21
1.6.4. ảnh hưởng của nồng độ đường và áp suất thẩm thấu ....................... 21
1.6.5. ảnh hưởng của hàm lượng giống. .................................................... 22
1.6.6. ảnh hưởng của SO2 ........................................................................... 22
1.6.7. ảnh hưởng của nồng độ oxi .............................................................. 22
Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu......................................23
2.1.Đối tượng nghiên cứu ............................................................................ 23
2.2. Hoá chất và thiết bị............................................................................... 23
2.2.1.Hoá chất.............................................................................................. 23
2.2.2. Thiết bị .............................................................................................. 23
2.3. Môi trường. ........................................................................................... 23
2.3.1. Môi trường Hansen (MT1) g/l ........................................................... 23
2.3.2. Môi trường nhân giống (MT2) g/l ..................................................... 23
2.3.3.Môi trường lên men (MT3) g/l ........................................................... 24
2.4. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 24
2.4.1. Các phương pháp vi sinh ................................................................... 24
Trường ĐHSP Hà Nội 2

4

K30C - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Huệ

2.4.1.1. Phương pháp phân lập , tuyển chọn chủng nấm men ..................... 24
2.4.1.2. Phương pháp hoạt hoá giống. ......................................................... 25
2.4.1.3. Phương pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men. ................. 25
2.4.1.4. Phương pháp xác định số lượng tế bào nấm men. .......................... 25
2.4.1.5. Xác định khả năng kết lắng ............................................................ 26
2.4.1.6. Quan sát hình dạng tế bào nấm men trên kính hiển vi ................... 26
2.4.2. Phương pháp hoá học ........................................................................ 26
2.4.3. Phương pháp toán học. ...................................................................... 26
2.5. Phạm vi nghiên cứu. ............................................................................. 27
2.6. Địa điểm thực hiện đề tài ..................................................................... 27
2.7. Thời gian thực hiện đề tài. .................................................................... 27
Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận ............................................... 28
3.1. Thành phần hoá học của táo mèo, dâu và mơ. ..................................... 28
3.2. Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang táo mèo,
dâu và mơ. ................................................................................................... 28
3.2.1. Tiêu chuẩn chọn chủng ..................................................................... 28
3.2.2. Phân lập chủng nấm men từ dịch quả................................................ 28
3.3. Tuyển chọn chủng nấm men lên men vang táo mèo, dâu và mơ. ........ 31
3.3.2. Khả năng lên men ở hàm lượng đường cao. ...................................... 32
3.3.3. Khả năng kết lắng của hai chủng nấm men. ..................................... 33
3.3.4. Nghiên cứu động thái phát triển của hai chủng nấm men Saccharomyces
cerevisiae TD5 và TD7 trong môi trường nhân giống. ................................. 33
3.3.5. Xác định tên khoa học của hai mẫu nấm men TD5 và TD7. .............. 34

3.4. ảnh hưởng của một số nhân tố trong quá trình nhân giống ................. 34
3.4.1. ảnh hưởng của pH đến quá trình nhân giống ................................... 34
3.4.2. ảnh hưởng của hàm lượng đường đến quá trình nhân giống ............ 35

Trường ĐHSP Hà Nội 2

5

K30C - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Huệ

3.5. ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường dinh dưỡng đến sự phát triển
của hai chủng nấm men TD5, TD7 trong môi trường lên men. .................... 36
3.5.1. Động thái lên men vang táo mèo, dâu và mơ .................................... 36
3.5.2. Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men vang táo
mèo , dâu và mơ. ......................................................................................... 39
3.5.2.1. ảnh hưởng của độ pH tới quá trình lên men .................................. 39
3.5.2.2. ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình lên men. .............................. 40
3.5.2.3. ảnh hưởng của nồng độ KH2PO4 tới quá trình lên men. ............... 42
3.6. Quy trình công nghệ lên men vang táo mèo, dâu và mơ. ..................... 44
3.6.1. Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất vang táo mèo, dâu và mơ. ........ 44
3.6.2. Thuyết minh công nghệ ..................................................................... 45
3.6.2.1. Giai đoạn 1: chế biến dịch lên men ............................................... 45
3.6.2.2. Giai đoạn 2: lên men chính ........................................................... 45
3.6.2.3. Giai on 3: Lên men phụ ............................................................. 45
3.6.2.4. Giai đoạn 4: Hoàn thiện và tiêu thụ sản phẩm ............................... 45

Kết luận và đề nghị ...................................................................................... 46
1. Kết luận. .................................................................................................. 46
2. Đề nghị. ................................................................................................... 46
Tài liệu tham khảo ....................................................................................... 47

Trường ĐHSP Hà Nội 2

6

K30C - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Huệ

Dang mục chữ viết tắt, bảng và hình vẽ
1. Danh mục chữ viết tắt
Nxb: nhà xuất bản
HLTB : Hàm lượng tế bào.
2. Danh mục các bảng
Bảng 3.1. Thành phần hoá học của táo mèo, dâu và mơ.
Bảng 3.2 . tỉ lệ phối hợp nguyên liệu.
Bảng 3.3. Hàm lượng CO2 giải phóng sau 72h lên men của hai chủng nấm
men Saccharomyces cerevisiae TD5 và TD7.
Bảng 3.4. khả năng lên men ở hàm lượng đường cao.
Bảng 3.5. ảnh hưởng của hàm lượng oxy hoà tan trong quá trình nhân giống.
Bảng 3.6. ảnh hưởng của hàm lượng đường đến quá trình nhân giống của hai
chủng nấm men TD5 và TD7.
Bảng 3.7. ảnh hưởng của độ pH tới quá trình lên men của chủng TD5.

Bảng 3.8. ảnh hưởng của độ pH tới quá trình lên men của chủng TD7.
Bảng 3.9. ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình lên men của chủng nấm men
Saccharomyces cerevisiae TD5.
Bảng 3.10. ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình lên men của chủng nấm men
Saccharomyces cerevisiae TD7.
Bảng 3.11. ảnh hưởng của nồng độ KH2PO4 tới quá trình lên men của hai
chủng nấm men TD5 và TD7.
3. Danh mục các hình
Hình 3.1. Chủng nấm men TD5 và TD7 trên môi trường thạch nghiêng
Hình3.2. Tế bào nấm men của hai chủng nấm men trên kính hiển vi
quang học.
Hình 3.3. Khuẩn lạc hai chủng nấm men.
Trường ĐHSP Hà Nội 2

7

K30C - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Huệ

Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn động thái phát triển của hai chủng nấm men
Saccharomyces cerevisiae TD5 và TD7 trong môi trường nhân giống.
Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên của hàm lượng đường và hàm
lượng cồn của chủng TD7.
Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên của hàm lượng đường và hàm lượng
cồn của chủng TD5.
Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên số lượng tế bào của chủng TD5 và

TD7.
Hình 3.8. Biểu đồ biểu diễn số lượng tế bào trung bình sau 28h nuôi cấy ở
các giá trị pH khác nhau.
Hình 3.9. Biểu đồ biểu diễn hàm lượng đường sót trong dịch lên men ở các
nồng độ KH2PO4 khác nhau.
Hình 3.10. Biểu đồ biểu diễn hàm lượng cồn sinh ra trong dịch lênmen ở các
nồng độ KH2PO4 khác nhau.

Trường ĐHSP Hà Nội 2

8

K30C - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Huệ

đặt vấn đề
1. Lý do chọn đề tài
Rượu vang (wine) đã được biết đến từ thời Hy Lạp Cổ ại, khi con
người lần đầu tiên biết sử dụng đồ uống lên men tự nhiên từ dịch trái nho.
Rượu vang có độ cồn thấp, nhiều vitamin và các chất khoáng có mùi thơm dễ
chịu, có hương vị đặc trưng cho từng loại quả. Rượu vang kích thích tiêu hóa,
tuần hoàn, thần kinh...[3].
ở Việt Nam ngành sản xuất rượu vang mới thực sự bắt đầu những năm
80 của thế kỷ XX, được đánh dấu bằng sự hiện diện của vang Thăng Long.
Sau đó một số cơ sở sản xuất rượu vang khác như vang Gia Lâm, vang Thanh
Ba, vang Đà lạt...[8].

Thực tế cho thấy phần lớn các loại quả có chứa đường, axit, vitamin,
khoáng và không độc hại thì đều có thể sử dụng để lên men vang nhưng để có
vang tốt thì không phải loại quả nào cũng làm được. Trước kia nguồn nguyên
liệu để sản xuất vang ở hầu hết các quốc gia chỉ là quả nho chín được trồng ở
một số vùng nhất định và một số giống cụ thể. Ngày nay do sự phát triển
mạnh mẽ của công nghệ sinh học mà nguồn nguyên liệu để sản xuất rượu
vang được chuyển sang một số loại quả khác như dâu, táo, lê, mơ, vải ...
Nước ta nằm trong khu vực nhiệt đới có điều kiện khí hậu thích hợp với
nhiều loại cây ăn quả và có nhiều loại quả có thể sử dụng để lên men vang.
Song để có được loại vang có chất lượng cao thì không phải bất kỳ loại quả
nào cũng có thể sử dụng để sản xuất vang được. Vì vy việc lựa chọn nguyên
liệu phù hợp với yêu cầu của công nghệ và chất lượng sản phẩm nâng cao hiệu
suất lên men phù hợp với nhu cầu thị hiếu người tiêu dùng trong nước là vấn
đề cấp thiết đối với ngành sản xuất rượu vang ở Việt Nam. Xuất phát từ yêu
cầu đó tôi chọn đề tài: Tuyển chọn chủng nấm men, nghiên cứu ảnh

Trường ĐHSP Hà Nội 2

9

K30C - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Huệ

hưởng của pH, nhiệt độ và KH2PO4 tới quá trình lên men vang táo mèo,
dâu và mơ.

2. Mục tiêu của công trình
Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men phù hợp cho lên men vang phối
hợp táo mèo, dâu và mơ.
Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng nấm men
Lên men phối hợp với quy mô phòng thí nghiệm, xây dựng quy trình
lên men vang táo mèo, dâu và mơ.
3. Đối tượng nghiên cứu
Quả táo mèo (Docynia indica), quả Dâu (Morus alba L.) [5], quả mơ
(Prunus armeniaca L.)
Chủng nấm men có khả năng lên men vang phối hợp táo mèo, dâu và mơ.
4. ý nghĩa lý luận và thực tiễn của công trình.
Nghiên cứu đặc tính sinh lý, sinh hóa của chủng nấm men có khả năng
lên men vang phối hợp, góp phần bổ sung cho các nghiên cứu về nấm men và
ứng dụng của nấm men trong đời sống.
Tận dụng nguồn nguyên liệu sẵn có của địa phương nhằm sản suất
một loại vang phù hợp thị hiếu người tiêu dùng góp phần làm phong phú thị
trường vang trong nước.

Trường ĐHSP Hà Nội 2

10

K30C - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Huệ

Chương 1

Tổng quan tài liệu
1.1. Khái quát chung về rượu vang
1.1.1.Thành phần của rượu vang
Thành phần chủ yếu của rượu vang gồm: cồn etanol (10- 120), axit vô cơ và
axit hữu cơ (4-7g/l), chất bổ dưỡng, vitamin và các axit amin
1.1.2. Các loại rượu vang
Rượu vang là loại nước giải khát thơm ngon giàu chất bổ dưỡng với độ
cồn nhẹ và hương thơm dịch trái cây còn giữ lại trong rượu. Rượu vang theo
đúng nghĩa là rượu lên men từ nước ép nho ( không qua chưng cất). Ngày nay
người ta mở rộng khái niệm rượu vang để chỉ các loại rượu lên men từ các loại
hoa quả khác như mơ, dâu, vải.
Rượu vang có thể chia làm 2 loại chính: rượu vang không gas ( trong
vang thành phẩm không có co2) và rượu vang có gas ( trong vang thành phẩm
có co2)[3], [10]. Trong hai loại rượu chính vang được chia ra làm nhiều loại
theo màu sắc và hàm lượng đường.
Theo màu sắc: vang trắng, vang đỏ, vang hồng
Theo hàm lượng đường: vang khô (ít đường), vang ngọt( nhiều đường),
vang nửa khô....
1.1.3. Nguyên liệu sản xuất rượu vang ở nước ta
Rượu vang được sản xuất chủ yếu từ quả nho. Tuy nhiên nước ta là
nước nhiệt đới gió mùa không thích hợp cho cây nho phát triển nhưng lại là sứ
sở của nhiều loại hoa quả. Đây là nguyên liệu phong phú phục vụ cho ngành
công nghiệp chế biến: mận, mơ, táo, dâu, dứa, chuối, vải, nhãn.....
1.1.4. Tàng trữ rượu vang
Vang được tàng trữ từ 1- 5 năm hoặc có thể tàng trữ hàng trăm năm.
trong thời gian này xảy ra quá trình oxi hóa khử màu tím sang màu đỏ tía,
Trường ĐHSP Hà Nội 2

11

K30C - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Huệ

vang trắng chuyển sang vang vàng thậm chí đỏ nâu. Thành phần axit tăng, độ
cồn giảm, este và hương vị tăng lên. Do vậy, trong công nghệ cổ truyền thì
người ta cần tránh can thiệp nhân tạo khi bắt buộc điều chỉnh ở mức độ tối
thiểu một số chỉ tiêu lý hóa. Ngược lại trong thực tế cơ chế thị trường đã thúc
đẩy nhà sản xuất phải sử lý tăng tốc độ tàng trữ bằng các giải pháp công nghệ
lọc, ly tâm, lạp khí co2 làm lạnh.
1.2. Một số đặc tính sinh học của tế bào nấm men Saccharomyces
cerevisiae
nấm men đóng vai trò quyết định trong sản xuất rượu vang vì quá trình
trao đổi chất của tế bào nấm men là quá trình chuyển hóa nguyên liệu thành
sản phẩm.
1.2.1. Sơ lược về nấm men
Nấm men là tên chung để chỉ nhóm nấm có cấu tạo đơn bào, sinh sản
chủ yếu bằng nảy chồi. Nấm men phân bố khá rộng trong tự nhiên (đất, nước,
không khí, trong lương thực thực phẩm, hoa quả ....) nhiều loại nấm men có
khả năng lên men rượu vì vậy từ lâu con người đã biết sử dụng nấm men để
nấu rượu, bia, sản xuất cồn....
Nấm men sinh sản theo lối nảy chồi lên sinh sản nhanh chóng, sinh
khối của chúng giàu protein, vitamin và lipit. Vì vậy nấm men được sử dụng
để sản xuất thức ăn bổ sung cho con người, gia súc , gia cầm, đặc biệt trong
ngành công nghiệp thực phẩm để sản xuất rượu, bia, nước giải khát, nước
chấm, ....
Tuy nhiên, bên cạnh một số nấm men có ích cũng còn một số loại có

hại cho sản xuất làm hư hỏng sản phẩm gây bệnh cho người, gia súc.....
1.1.2. Hình thái và kích thước của tế bào nấm men Saccharomyces
cerevisiae
hình thái: Tế bào nấm men đa số có dạng hình cầu, hình ovan, hình
trứng. Hình dạng này có thể thay đổi tuỳ thuộc vào điều kiện môi trường,
Trường ĐHSP Hà Nội 2

12

K30C - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Huệ

điều kiện nuôi cấy và tuổi của tế bào.
Kích thước: Tế bào nấm men có kích thước khoảng 4-10 micromet x 28 micromet và cũng có thể thay đổi tùy loài, giống và điều kiện môi trường
sống.
Nấm men có màu trắng đục, vàng hoặc trắng nhạt, bề mặt tế bào
thường khô và căng có thể đứng riêng lẻ hoặc dính nhau thành chuỗi .
1.1.3. Cấu tạo của tế bào nấm men
Nấm men có cấu tạo đơn bào nhưng phức tạp hơn vi khuẩn, chúng có
cấu tạo gồm màng, chất nguyên sinh và nhân [4].
Màng: Màng tế bào có cấu tạo chủ yếu là hemixenluloza, chiếm
khoảng 70% trọng lượng khô của tế bào ( 31% mannan + 29%glucam) ngoài
ra còn chứa 1-3% kitin, 6-10% protein, 8-8,5% lipit, 7% chất khoáng. Màng
giúp hình thái tế bào nấm men luôn ổn định duy trì được áp suất thẩm thấu
bên trong tế bào và điều hòa các quá trình trao đổi chất, các chất dinh dưỡng
được hấp thụ, chọn lọc qua thành tế bào.

Chất nguyên sinh: Màng chất nguyên sinh là lipoprotein, chúng ăn sâu
vào chất nguyên sinh tạo thành mạng lưới nội chất gồm 2 lớp và rầy 30 40
Ao. Màng chất nguyên sinh có chức năng chủ yếu là chủ động điều hòa việc
hấp thụ chất dinh dưỡng vào tế bào và nhờ có hệ enzym pecmease mà có chất
dinh dưỡng được hấp thụ và tích lũy lại trong tế bào. Chất nguyên sinh của tế
bào nấm men có một số bào quan như:
Ty thể: có hình bầu dục hoặc dạng hạt và có thể thay đổi tùy thuộc
vào điều kiện của môi trường cũng như trạng thái sinh lý của tế bào. Ty thể có
màng trong suốt, mỏng (60-80 A0) có tính thấm cao, màng có cấu tạo 2 lớp,
lớp trong hình thành nếp gấp hoặc ống nhỏ hình răng lược, lớp ngoài có cấu
trúc bằng nhiều đơn vị hình thái. Có khoảng 10 20 ty thể trong một tế bào
nấm men, chúng tham ra vào quá trình sinh trưởng tế bào, sự hình thành và
nảy chồi của bào tử.
Trường ĐHSP Hà Nội 2

13

K30C - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Huệ

Phức hệ golgi: Là nơi giải phóng các sản phẩm của quá trình dị hóa,
đồng thời tổng hợp oligosaccarit từ monosaccarit cho màng tế bào
Lizoxom: Có chứa nhiều loại enzym có khả năng phân giải protein,
lipit, polysaccarit.
Ngoài ra, trong tế bào nấm men còn chứa một hệ thống không bào hình
thành từ thể golgi hay mạng lưới nội chất. Không bào có tính thấm cao và là

nơi tích lũy các sản phẩn của trao đổi chất. Trong không bào có chứa các
enzym thuỷ phân polyphotphat, lipit, ion kim loại, các sản phẩn trao đổi chất
trung gian. Hình dạng của không bào thường thay đổi do sự co rút của chất
nguyên sinh. Trong không bào thường xẩy ra các phản ứng oxi hóa khử nhờ
hệ thống xitocromoxidase trong không bào.
Nhân: Khác với tế bào vi khuẩn tế bào nấm men có nhân thật. Nhân có
hình ovan được bao bọc bởi lớp màng nhân. Nhân có kích thước từ 1 - 2,4
micromet x 2-8 micromet cấu tạo bởi protein, ADN, ARN và nhiều enzym.
Nhân quyết định đặc tính di truyền và tham ra điều chỉnh tất cả mọi hoạt động
sống của tế bào nấm men.
1.2.4. Sinh sản của tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae
Nấm men có hai hình thức sinh sản là : vô tính và hữu tính
Sinh sản vô tính:
Trong điều kiện bình thường tế bào nấm men sinh sản bằng lối nẩy
chồi. Trong điều kiện không thuận lợi một số có thể chuyển sang sinh sản
bằng bào tử.
Sinh sản nảy chồi là hình thức phổ biến nhất. Khi tế bào phát triển đến
một mức độ nhất định thì cơ thể của nó đâm ra chồi nhỏ gọi là mầm (hay
chồi). Mầm sinh ra ở vị trí lệch tâm ở trên đầu tế bào mẹ. Cùng một lúc có thể
đâm ra nhiều chồi, ở mỗi chồi sẽ nhận được một phần chất nhân và chất
nguyên sinh của tế bào mẹ, sau đó nó tách khỏi tế bào mẹ sống độc lp hoặc

Trường ĐHSP Hà Nội 2

14

K30C - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Huệ

cũng có thể không tách khỏi tế bào mẹ để tạo ra một tập hợp tế bào nấm men
hình cành cây gọi là khuẩn ty giả.
Sinh sản hữu tính bằng bào tử túi:
Nấm men có khả năng hình thành bào tử túi. Bào tử túi của nấm men là
những bào tử được sinh ra trong những túi nhỏ gọi là túi nang. Mỗi túi chứa 4
- 8 bào tử túi. Nấm men được tạo thành theo phương thức sinh sản đơn tính, là
quá trình tạo bào tử trực tiếp từ một tế bào riêng rẽ không qua tiếp hợp. Bào tử
túi gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành tế bào nấm men.
1.3. Những biến động sinh lý, sinh hóa, vi sinh khi lên men rượu vang,
khả năng lên men đường của Saccharomyces cerevisiae
Lên men là quá trình sinh lý phức tạp được diễn ra dưới tác dụng xúc
tác của hệ enzym tế bào nấm men mà con đường chính là từ glucoza biến đổi
thành rượu etylic và co2 bên cạnh đó còn nhiều sản phẩm phụ như glyxerin,
axit axetic, axit lactic, ete và rượu bậc cao.
C6H12O6

2C2H5OH

+

2CO2

+

Q

Quá trình lên men rượu xảy ra theo 5 giai đoạn

Giai đoạn 1: Hoạt hóa phân tử hexoza gồm 3 phản ứng. Phân tử glucoza nhờ
enzym photphoglucokinase chuyển gốc photphat từ ATP tạo ra gluco 6photphat là dạng hoạt động.
ATP

ADP

Glucoza

gluco - 6 - photphat
Mg2+

Phân tử gluco- 6- photphat dưới tác dụng của enzym izomerase chuyển
thành fructo 6 photphat có cấu tạo kém bền hơn.
izomerase
Gluco 6 photphat
Từ

fructo-6-photphat

Fructo 6- photphat
bị

photphoril

hóa

2

lần

nhờ

enzim

photphofructokinase chuyển thành fructo-1,6- điphotphat
Trường ĐHSP Hà Nội 2

15

K30C - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Huệ
ATP

ADP

Fructo 6- photphat

fructo-1,6- điphotphat

Giai đoạn 2: Cắt mạch cacbon
fructo-1,6- điphotphat dễ dàng biến đổi thành 2 phân tử trioz photphat
(đihiđroxiaxetonphotphat và Glyxerandehit- 3 photphat) nhờ enzym aldolase.
hai trioz photphat này có thể chuyển hóa lẫn nhau nhờ một enzym đồng phân
( trioz photphat izomerase).
Aldolase
Fructo-1,6- điphotphat

Đihiđroxiaxetonphotphat +
Glyxerandehit- 3 photphat
Trioz-photphat-izomerase

Đihiđroxiaxetonphotphat

Glyxerandehit- 3 photphat

Giai đoạn 3: oxi hóa
Dưới tác dụng của enzim Glyxerandehit- 3- photphat đehiđrogenase mà
glyxerandehit -3 photphat bị ox hóa thành axit 1,3 - điphotpho glyxeric
NAD+ + H3PO4

Glyxerandehit -3 photphat

Axit 1,3 - điphotpho glyxeric

Axit này chuyển gốc photphat cao năng cho ADP để tạo thành ATP và
tạo axit 3 photphoglyxeric. Phản ứng này rất có ý nghĩa vì năng lượng được
giải phóng ra trong quá trình oxi hóa sẽ được tích lũy trong phân tử ATP, đảm
bảo cung cấp năng lượng cho hoạt động của tế bào trong điều kiện yếm khí.
Phản ứng do enzym photpho Glyxeratkinase xúc tác tạo axit 3
photphoglixeric
Photphoglixeratkinase

Axit 1,3 - điphotpho glyxeric

Axit 3 photphoglixeric

Giai đoạn 4: Sự tạo thành axit pyruvic

Trường ĐHSP Hà Nội 2

16

K30C - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Huệ

Dưới tác dụng của enzym photphat Glyxeratmutase mà axit 3 photphoglyxeric bị chuyển thành axit 2 photphoglyxeric. Sau đó axit 2photphoglyxeric chuyển thành axit photphoenolpyruvic nhờ enzym Enolase.
Dưới tác dụng của enzym pyruvatkinase mà axit 2- photphoenolpyruvic
chuyển thành axit pyruvic.
photphat Glyxeratmutase

Axit 3 photphoglixeric

Axit 2 photphoglyxeric
Enolase
H2O
ATP

Dạng xeton

ADP

Dạng enol

Axitphotphoenolpyruvic
axit pyruvic pyruvatkinase

Giai đoạn 5: Sự chuyển axit pyruvic thành các sản phẩm cuối cùng
Lên men rượu: đầu tiên axit pyruvic bị khử nhóm cacboxyl thành co2 và
axetaldehit nhờ enzym xúc tác là pyruvat đecacboxylase. Sau đó axetaldehyt
bị khử thành etanol nhờ enzym alcođehiđrogenase.
NADH+H+ NAD+

co2
Axit pyruvic

Axetaldehyt

Etanol

Sự tạo thành axit lactic:
Lactatdehidrogenase
Axit pyruvic

Axit lactic

Sự tạo thành - Glyxerophotphat và glyxerin

Trường ĐHSP Hà Nội 2

17

K30C - Sinh

Khoá luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Huệ
- glyxero P đehidrogenase

Đihiđroxiaxeton P

L - - Glixero P
NADH+H+

H2O

NAD+

PV

Glixerin
Phương trình tổng quát của quá trình lên men là:
C6H12O6 + 2ADP +2H3PO4

2C2H5OH

+ 2CO2 + 2ATP+ H2O

Như vậy, sự lên men chuyển đường thành rượu là một dãy quá trình oxi hóa
khử có enzym trong tế bào nấm men tham gia.
1.4. Vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men rượu vang, bệnh vang
1.4.1. Nấm men
Nấm men được sử dụng rộng rãi nhất trong sản xuất là chủng nấm men

Saccharomyces cerevisiae. Nấm men chứa trung bình 75% nước 25% chất
khô. Theo quan điểm kinh tế người ta chia thành các chủng [3], [4], [10].
Chủng lên men với hiệu suất cồn cao, ở thời gian tối ưu sản xuất tới 17% thể
tích cồn.
Chủng lên men với thời gian ngắn, sản sinh 8 - 12% thể tích cồn thậm chí ở
nhiệt độ thấp 4 100C không bị kìm hãm.
Chủng chịu được độ cồn cao, lên men được trong rượu vang gồm 30%
đường, hàm lượng cồn 12-15% thể tích.
1.4.2. Nấm mốc
Nấm mốc phát triển ở quả, chất bã của quá trình sản xuất rượu vang,
thùng chứa thiết bị hoặc do bụi, không khí đưa đến như: Rhizopus, Aspergillus
1.4.3. Vi sinh vật làm hỏng vang
Một số vi sinh vật làm cho vang bị đục có vị chua gắt, mùi khó chịu làm
vàng bị hỏng như : Bacterium gracile, Acetobacter xyliumm [3].
Các vi khuẩn kị khí: L.brevia; L. pastoerianus, L.buchneri...làm vang bị
vẩn đục có mùi dưa muối.

Trường ĐHSP Hà Nội 2

18

K30C - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Huệ

các vi khuẩn hiếu khí: Candida, zygopichia, pichia....phân giải đường
thành axit hữu cơ axetic, xitric....làm vang bị đục độ chua tăng cao, vị không

ngon [3].
do vậy, để bảo quả rượu vang người ta có thể thanh trùng Pasteur nhưng nó
lại làm giảm chất lượng vang. Ngoài ra còn dùng phương pháp vi lọc hoặc
dùng một số chất bảo quả phổ biến như SO2 ( 75-120mg/l) [9].
1.4.4. Bệnh vang
bệnh vang đã được Pasteur nghiên cứu và khám phá. Bệnh vang luôn là
vấn đề quan tâm của các nhà sản xuất rượu vang. Đó là hiện tượng vang bị
chua chất lượng rượu vang bị giảm rất nhanh. Nguyên nhân do rượu vang bị
tiếp xúc với không khí và do dưới tác dụng của vi khuẩn lactic đã biến cồn
thành axit axetic hoặc có thể do vi sinh vật lên men trong điều kiện kị khí gây
ra.
1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của nấm men
nguồn thức ăn chủ yếu của nấm men là các hợp chất hữu cơ ở dạng rễ
hấp thu và các chất vô cơ ngoài ra còn cần một lượng nhỏ chất kích thích sinh
trưởng và nguyên tố vi lượng.
1.5.1. Nguồn Cacbon
Cacbon có trong tế bào chất thành tế bào, trong tất cả các phản ứng
enzym, axit nucleic và các sản phẩm trao đổi chất.vì vậy những hợp chất
cacbon chiếm vị trí hàng đầu cho sự sống của nấm men. Nguồn thức ăn chủ
yếu của nấm men là hiđratcacbon nó đáp ứng 3 nhu cầu [6].
Sản sinh năng lượng
Tạo tiền chất
Thực hiện các quá trình oxi hóa khử

Trường ĐHSP Hà Nội 2

19

K30C - Sinh

Khoá luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Huệ

1.5.2. Nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ
Nitơ rất cần cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm men. Do đó môi
trường nuôi cấy cần cung cấp đầy đủ các hợp chất nitơ mà nấm men có thể
đồng hóa. Nitơ có tác dụng cung cấp nguyên liệu cho tế bào tổng hợp protein
và các chất khác của nguyên sinh chất.
1.5.3. Nguồn photpho vô cơ
photpho có vai trò quan trọng đối với nấm men, là nguyên liệu để tổng
hợp lên axit nucleic, các enzym, các hợp chất cao năng ATP... nếu thay đổi
nồng độ của hợp chất photpho trong môi trường sẽ dẫn đến sự thay đổi các
quá trình tổng hợp hàng loạt các hợp phần của tế bào có chứa photpho, tế bào
chất và nhân trong môi trường phân lập cũng như trong môi trường nuôi cấy
thường bổ sung KH2PO4.
1.5.4. Nguồn nguyên tố khoáng
Trong môi trường dinh dưỡng cần phải có một lượng khoáng để đảm
bảo cho tế bào phát triển. Các nguyên tố S, P đóng vai trò quan trọng trong
trao đổi chất của tế bào nấm men, tham gia chủ yếu vào thành phần của nhân,
nhiễm sắc thể, các enzym. Ion Ca2+, Mg++ điều chỉnh sự phát triển của tế bào
nấm men. Ion Fe++, Mg++ nằm trong thành phần của enzym hoạt động.
Ngoài ra, một số nguyên tố vi lượng và các chất kích thích sinh học cũng
ảnh hưởng tới sinh trưởng và phát triển của nấm men.
1.5.5. Nguồn oxi
Oxi cần trong giai đoạn đầu giúp nấm men sinh trưởng, tăng sinh khối.
Quá trình lên men diễn ra ở điều kiện hiếm khí để tăng hiệu quả tạo cồn, sự
khuấy đảo làm tăng tốc độ lên men rút ngắn thời gian lên men. Ngoài ra,
nguồn oxi có liên quan tới sự tổng hợp các xitocrom. Nếu nồng độ oxi là 0,05

micromol/l thì hệ thống xitocrom b, c1, c, a, a3 sẽ vắng mặt [2].

Trường ĐHSP Hà Nội 2

20

K30C - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Huệ

1.6. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men
1.6.1. ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng, phát triển của nấm men
và ảnh hưởng đến quá trình lên men cũng như chất lượng của rượu thành
phẩm. Nhiệt độ < 200C sự lên men chậm chạp, độ rượu tạo thành thấp; Nhiệt
độ <100C không diễn ra qua trình lên men; Nhiệt độ ở 350C không có lợi cho
quá trình lên men, nấm men không chết nhưng mất tác dụng; Nhiệt độ > 350C
quá trình lên men dừng lại lượng đường sót cao vi khuẩn hoạt động, đặc biệt là
vi khuẩn chuyển hóa đường thành axit axetic gây chua và giảm chất lượng
vang. Nhiệt độ thích hợp nhất cho nấm men phát triển là 20 280C.
1.6.2. ảnh hưởng của nồng độ cồn
quá trình lên men luôn sinh ra một lượng cồn. Nồng độ cồn thích hợp
cho rượu vang là 9-14% tính theo thể tích. Nếu nồng độ cồn cao sẽ làm tê liệt
hoạt động sống của tế bào nấm men, ức chế, kìm hãm quá trình đồng hóa
hiđratcacbon và nitơ.
1.6.3. ảnh hưởng của pH
Ban đầu pH của dịch lên men giảm do hình thành các axit hữu cơ, sau đó

pH hơi tăng do khan hiếm chất dinh dưỡng và hoạt lực lên men lớn. pH ở các
mức khác nhau thì quá trình lên men diễn ra với tốc độ khác nhau:
pH = 2,3 thì quá trình lên men yếu ; pH = 6,5- 7,5 quá trình lên men ngừng
lại; pH thích hợp 4 -5.
1.6.4. ảnh hưởng của nồng độ đường và áp suất thẩm thấu
đường và các chất hòa tan khác trong môi trường tạo lên áp suất thẩm
thấu chênh lệch giữa nấm men và môi trường nuôi cấy. Nếu nồng độ đường
quá cao áp suất thẩm thấu sẽ lớn gây hiện tượng co nguyên sinh chất của tế
bào dẫn đến tế bào sẽ không sinh trưởng được và quá trình lên men bị ngừng
trệ. nếu nồng độ đường thấp, nguồn cacbon ít thì tế bào phát triển chậm và ít
Trường ĐHSP Hà Nội 2

21

K30C - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Huệ

nguồn nguyên liệu để nấm men chuyển hóa thành rượu. Nồng độ đường phù
hợp cho quá trình lên men là 12- 25% mặt khác tỉ lệ các loại đường trong dịch
lên men cũng ảnh hưởng không nhỏ tới tốc độ và hiệu suất lên men. Theo kết
quả nghiên cứu của nhiều tác giả cho thấy glucoza là loại đường phù hợp nhất
cho sự sinh sản và phát triển của tế bào nấm men, tiếp đó là fructoza và đường
saccaroza .... Vì vậy, quả có chứa hàm lượng đường khử càng cao càng có lợi
cho quá trình lên men và chất lượng vang thành phẩm [4] , [10].
1.6.5. ảnh hưởng của hàm lượng giống
Men giống là tác nhân của quá trình lên men vì vậy hàm lượng giống

nhiều hay ít ảnh hưởng rất lớn đến quá trình lên men. Nếu hàm lượng giống
thấp thì thời gian nhân giống và lên men sẽ kéo dài hơn dễ bị nhiễm khuẩn.
Ngược lại, nếu hàm lượng giống cao thì thời gian lên men ngắn hơn, hạn chế
được khả năng nhiễm khuẩn nhưng nó lại làm thay đổi thành phần môi trường
lên men và sẽ không có lợi cho qúa trình lên men và chất lượng rượu vang.
hàm lượng giống thích hợp nhất trong dịch lên men là 8-10%.
1.6.6. ảnh hưởng của SO2
Nấm men có khả năng chịu đựng được sự ức chế bởi so2 làm tăng hiệu
suất lên men.
1.6.7. ảnh hưởng của nồng độ oxi
Nồng độ oxi hòa tan giúp nấm men sinh sản và phát triển quyết định
đến hiệu suất lên men và chất lượng của vang, việc cung cấp oxi cho quá trình
lên men vang làm mất đi một số sản phẩm lên men không cần thiết.
Khi môi trường có đầy đủ oxi thì tế bào nấm men sẽ sử dụng đường làm
nguồn năng lượng để tăng sinh khối. Khi môi trường thiếu oxi thì nấm men
tiến hành hô hấp kỵ khí và chuyển thành rượu.

Trường ĐHSP Hà Nội 2

22

K30C - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Huệ

Chương 2
đối tượng và phương pháp nghiên cứu

2.1.Đối tượng nghiên cứu
Hai chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae TD5 và TD7 , tuyển chọn từ
các nguồn nguyên liệu hoa quả: táo mèo, dâu và mơ.
2.2. Hoá chất và thiết bị
2.2.1.Hoá chất
Một số hoá chất được sử dụng: MgSO4, KH2PO4, (NH4)2SO4, NaOH, HCl,
pepton, agar, phenolphtalein, glucoza.
2.2.2. Thiết bị
Hộp petri, ống nghiệm, pipet, bàn trang thuỷ tinh, bình cầu, bình tam giác,
cốc thuỷ tinh, đèn cồn, que cấy, đường kế, tủ sấy Binder (Đức), nồi hấp
Autolave, máy li tâm Sorvall (Mỹ), buồng cấy vô trùng, buồng đếm Goriaev,
cân phân tích (Precisa xt320M- Thuỵ Sĩ), kính hiển vi quang học Nikon
(Nhật).
2.3. Môi trường
2.3.1. Môi trường Hansen (MT1) g/l
Đường glucoza : 50g
Pepton

: 5g

MgSO4.7H2O

: 0,5g

KH2PO4

: 1g

(NH4)2SO4

: 1g

Thạch Agar

: 20g

Nước cất

: 1000ml

2.3.2. Môi trường nhân giống (MT2) g/l
Đường glucoza : 50g
Pepton

: 5g

Trường ĐHSP Hà Nội 2

23

K30C - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Huệ

MgSO4.7H2O

: 0,5g

KH2PO4

: 1g

(NH4)2SO4

: 1g

Nước cất

: 1000ml

2.3.3. Môi trường lên men (MT3) g/l
Dịch siro hoa quả : 200ml
MgSO4.7H2O

: 0,5g

KH2PO4

: 1g

(NH4)2SO4

: 1g

Nước cất

: 1000ml

2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Các phương pháp vi sinh
Để có được chủng nấm men tôi tiến hành phân lập và tuyển chọn theo các
bước sau:
2.4.1.1. Phương pháp phân lập, tuyển chọn chủng nấm men
2.4.1.1.a. Xử lý nguyên liệu và tạo nguồn nấm men để phân lập
Nguyên liệu để sản xuất rượu vang là táo mèo, dâu và mơ. Cả 3 loại quả
trên thu hoạch về cần phải được chọn những quả chín, không dập nát. Sau đó
đem rửa sạch bằng nước đạt tiêu chuẩn vệ sinh rồi để ráo nước. Cho các quả
đó vào các ang thùng ngâm đường theo tỉ lệ 1:1. Riêng đối với táo mèo nên
khía các đường nhỏ quanh quả, khoảng 2 ngày khuấy trộn 1 lần. Sau 1 tháng
ta thu được một thứ siro nước quả có nồng độ đường khoảng 60-80% và nhiều
chất khác được chiết ra từ thịt quả. theo dõi dịch lên men, để giữ màu sắc tự
nhiên của dịch siro quả nên bổ sung chút cồn vào và tiến hành phân lập.
2.4.1.1.b. Phân lập giống nấm men
Dịch quả đã được pha loãng 10-1-10-10 bằng nước cất. Nhỏ 1-2 giọt
huyền phù với độ pha loãng 10-9 lên trên bề mặt thạch, dùng bàn trang thuỷ
tinh vô trùng dàn đều, gói kín và nuôi trong tủ ấm ở điều kiện 24-280C trong 2
Trường ĐHSP Hà Nội 2

24

K30C - Sinh


Khoá luận tốt nghiệp

Nguyễn Thị Huệ

ngày trên bề mặt xuất hiện khuẩn lạc to, trơn, nhẵn, bóng. Sau đó đem cấy vào
ống thạch nghiêng, nghiên cứu đặc tính sinh học của các chủng tuyển chọn.
2.4.1.2. Phương pháp hoạt hoá giống
Khuẩn lạc được chọn cấy vào ống thạch nghiêng để ở 24-280C trong vòng
24h được giống cấp 1. Nấm men lấy từ các ống thạch nghiêng để đưa vào dịch
lên men phải qua hoạt hoá giống trong môi trường nhân giống để được giống
cấp 2 có số lượng nấm men lớn, tế bào nấm men to khoẻ và trẻ và được dùng
để lên men.
2.4.1.3. Phương pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men
.

Tôi xác định hoạt lực lên men của nấm men thông qua hàm lượng CO2

được sinh ra (g/l dịch lên men) khi tiến hành lên men trong các bình tam giác
có thể tích 250ml môi trường và có cùng số lượng tế bào nấm men của các
giống khác nhau. Hàm lượng CO2 sinh ra càng nhiều chứng tỏ hoạt lực lên
men càng tốt. Kết hợp với việc phân tích hàm lượng cồn và hàm lượng đường
sót để xác định hiệu suất lên men, nếu hiệu suất lên men càng cao thì hoạt lực
lên men của nấm men cao.
Công thức tính hiệu suất lên men:[10]
VTT
N=

. 100%
VLT

Trong đó :

N: Hiệu suất lên men
VTT :Nồng độ cồn thực tế

VLT : Nồng độ cồn tính theo lý thuyết

2.4.1.4. Phương pháp xác định số lượng tế bào nấm men
Để đếm số lượng tế bào nấm men sử dụng buồng đếm hồng cầu
Goriaev. Cấy giống vào môi trường nhân giống nuôi ở nhiệt độ 280C lắc đều
Trường ĐHSP Hà Nội 2

25

K30C - Sinh