Nghiên cứu một số thành phần hoá học của cây bách bệnh (eurycoma longifolia jack)
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.09 MB, 54 trang )
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
Trƣờng đại học sƣ phạm Hà Nội 2
Khoa Hoá học
-----------------------------
Trần Thị Huyền
Nghiên cứu một số thành phần hoá học của cây
bách bệnh
(EURYCOMA LONGIFoLIA JACK)
Khóa luận tốt nghiệp đại học
Chuyên ngành: Hoá hữu cơ
Hà nội – 2009
Trần Thị Huyền
1
K31- Khoa Hóa Học
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
Trƣờng đại học sƣ phạm Hà Nội 2
Khoa Hoá học
------------------------------
Trần Thị Huyền
Nghiên cứu một số thành phần hoá học của cây
bách bệnh
(EURYCOMA LONGIFOLIA JACK)
Khóa luận tốt nghiệp đại học
Chuyên ngành: Hoá hữu cơ
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
TS. Nguyễn Văn Bằng
Hà nội - 2009
Trần Thị Huyền
2
K31- Khoa Hóa Học
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
Lời cảm ơn
Khóa luận tốt nghiệp này được thực hiện tại phòng xúc tác hữu cơ,
Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên- Viện Khoa học và Công nghệ Việt
Nam.
Trước tiên, em xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới thầy
giáo- TS. Nguyễn Văn Bằng, khoa Hóa học- Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã
nhiệt tình, tận tâm hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận
này.
Em trân trọng cảm ơn và bày tỏ lòng kính trọng tới sự giúp đỡ tận tình
của thầy giáo- TS. Phan Văn Kiệm, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiênViện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Em xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể các thầy cô trong bộ môn Hóa hữu
cơ-Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2 và các cán bộ phòng xúc tác hữu cơ,
Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên- Viện Khoa học và Công nghệ Việt
Nam đã ủng hộ và tận tình chỉ bảo tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành
khóa luận tốt nghiệp này. Mặc dù em đã hết sức cố gắng nhưng khóa luận tốt
nghiệp vẫn còn một số sai sót. Vì vậy, em kính mong nhận được sự góp ý chỉ
bảo của các thầy, cô và các bạn sinh viên quan tâm.
Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2009
Sinh viên
Trần Thị Huyền
Trần Thị Huyền
3
K31- Khoa Hóa Học
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan các kết quả trong khóa luận tốt nghiệp: “Nghiên cứu
một số thành phần hóa học của cây Bách bệnh” dưới sự hướng dẫn khoa
học của thầy giáo- TS. Nguyễn Văn Bằng, là hoàn toàn trung thực, do tôi
nghiên cứu ra mà không hề sao chép của ai. Nếu có bất kỳ vấn đề gì không
đúng tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.
Trần Thị Huyền
4
K31- Khoa Hóa Học
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
Mục lục
Danh mục chữ viết tắt
Danh mục hình, sơ đồ và bảng biểu
Trang
Mở đầu
1
Chƣơng 1: Tổng quan
3
1.1 . Những nghiên cứu tổng quan về cây Bách bệnh………….
3
1.1.1. Thực vật học……………………………………………
3
1.1.2. Phân bố, sinh thái………………………………………
4
1.1.3. Một số nghiên cứu về thành phần hóa học của cây
Bách bệnh………………………………………………
4
1.1.4. Bộ phận dùng ………………………………………….
7
1.1.5. Tác dụng dược lý……………………………………….
7
1.1.6. Tính vị và công năng…………………………………...
7
1.2 . Các phƣơng pháp chiết mẫu thực vật……………………..
7
1.2.1 Chọn dung môi chiết…………………………………..
8
1.2.2 Quá trình chiết…………………………………………
10
1.3 .Các phƣơng pháp sắc ký…………………………………….
11
1.3.1 Sắc ký cột………………………………………………
12
1.3.2 Sắc ký lớp mỏng……………………………………….
13
1.4 . Các phƣơng pháp xác định cấu trúc của các hợp chất
hữu cơ………………………………………………………....
14
1.4.1 Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy)………………
14
Trần Thị Huyền
5
K31- Khoa Hóa Học
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
1.4.2 Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy)………………….
15
1.4.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
(Nuclear MagnetiResonance Spectroscopy)……………
16
Chƣơng 2: Thực nghiệm và phƣơng pháp nghiên cứu
20
2.1 Dụng cụ và thiết bị…………………………………………..
20
2.1.1 Dụng cụ và thiết bị tách chiết…………………………
20
2.1.2 Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc………………......
20
2.2 Hóa chất……………………………………………………….
21
2.3 Chiết phân đoạn và phân lập các hợp chất…………………
21
2.4 Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất……….
24
2.4.1 Hợp chất 1 (11-Dehydroklaineanone)...............................
24
2.4.2 Hợp chất 2 (9-Methoxycanthin-6-one)………….............
24
Chƣơng 3: Kết quả và thảo luận
26
3.1 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 1
(11-Dehydroklaineanone )…………………………………….....
26
3.2 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 2
(9-Methoxycanthin-6-one)……………………………………….
3.3 Tổng hợp các hợp chất đã phân lập đƣợc từ cây Bách
bệnh
Trần Thị Huyền
33
38
Kết luận
39
Tài liệu tham khảo
40
6
K31- Khoa Hóa Học
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
Danh mục chữ viết tắt
[ỏ]D
Độ quay cực (Specific Optical Rotation)
13
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13
C- NMR
Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy
1
H- NMR
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
Proton Magnetic Resonance Spectroscopy
1
H-1H COSY
1
H-1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy
2D-NMR
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều
Two-Dimensional NMR
CC
Sắc ký cột (Column Chromatography)
DEPT
Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer
EI-MS
Phổ khối lượng va chạm electron
Electron Impact Mass Spectrometry
FAB-MS
Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh
Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry
HMBC
Heteronuclear Multiple Bond Connectivity
HMQC
Heteronuclear Multiple Quantum Coherence
HR-FAB-MS
Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh phân giải cao
High Resolution Fast Atom Bombardment Mass
Spectrometry
IR
Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy)
Me
Nhóm metyl
MS
Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy)
Trần Thị Huyền
7
K31- Khoa Hóa Học
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
NOESY
TLC
Khóa luận tốt nghiệp
Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy
Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)
Trần Thị Huyền
8
K31- Khoa Hóa Học
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
Danh mục hình, sơ đồ và bảng biểu
Trang
Hình 1.1. Cây Bách bệnh (Eurycoma longifolia Jack)……………….
3
Hình 1.2. Một số cấu trúc đặc trưng có trong thành phần hóa học của
cây Bách bệnh………………………………………………………
6
Hình 3.1.a. Cấu trúc hóa học của hợp chất 1………………………...
26
Hình 3.1.b. Phổ 1H-NMR của hợp chất 1…………………………….
27
Hình 3.1.c. Phổ 13C-NMR của hợp chất 1……………………………
27
Hình 3.1.d. Phổ 13C-NMR và các phổ DEPT của hợp chất 1………..
28
Hình 3.1.e. Phổ HSQC của hợp chất 1……………………………….
28
Hình 3.1.f. Phổ HMBC của hợp chất 1……………………………
29
Hình 3.1.g. Phổ ESI - MS của hợp chất 1……………………………
30
Hình 3.2.a. Phổ 1H-NMR của hợp chất 2…………………………….
32
Hình 3.2.b. Cấu trúc hóa học của hợp chất 2………………………..
33
Hình 3.2c. Phổ 1H-NMR dãn rộng của hợp chất 2…………………..
33
Hình 3.2d. Phổ 13C-NMR của hợp chất 2…………………………….
35
Hình 3.2.e. Phổ 13C-NMR và các phổ DEPT của hợp chất 2………
35
Bảng 3.1.Kết quả phổ NMR của hợp chất 1 và
11-Dehydroklaineanone……………………………………………...
31
Bảng 3.2. Kết quả phổ NMR của hợp chất 2 và
9-Methoxycanthin-6-one……………………………………….........
36
Bảng 3.3. Bảng tổng hợp các hợp chất đã phân lập từ phân đoạn
Clorofoc………………………………………………………………
37
Sơ đồ 1: Sơ đồ chiết các phân đoạn lá cây Bách bệnh……………….
21
Sơ đồ 2: Sơ đồ phân lập các chất tinh khiết………………………….
22
Trần Thị Huyền
9
K31- Khoa Hóa Học
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
Mở đầu
Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học đóng một vai trò hết sức
quan trọng trong đời sống con người. Các chất có hoạt tính sinh học được sử
dụng làm thuốc chữa bệnh cho con người, vật nuôi, các thuốc bảo vệ thực vật,
các chất kích thích, điều hòa sinh trưởng động thực vật và làm nguyên liệu
cho công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, mĩ phẩm.
Không như những nguồn tài nguyên hóa thạch khác (các loại quặng,
khoáng vật, dầu mỏ, khí đốt,…) tài nguyên sinh học (cụ thể là tài nguyên thực
vật) có thể tái tạo được. Bảo vệ và sử dụng hợp lí nguồn tài nguyên này thì nó
không bị cạn kiệt, trái lại chúng ta có thể làm phong phú hơn về lượng và chất
để phục vụ con người.
Ngày nay với những phương pháp và thiết bị thử hoạt tính sinh học
hiện đại với độ nhạy và độ tin cậy cao người ta có thể kiểm tra hoạt tính sinh
học của hàng triệu mẫu dịch chiết từ thực vật, các chất được tách sạch từ các
dịch chiết trong một thời gian ngắn. Bởi vậy đã phát hiện ra nhiều hoạt tính
quý giá của nhiều hợp chất thiên nhiên mà trước đây cho là không có hoạt
tính. Ví dụ: axit betulenic và các dẫn xuất của nó là những hợp chất phổ biến
trong một số loài thực vật vừa được phát hiện có hoạt tính chống HIV.
Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa. Độ ẩm cao
khoảng trên 80%, lượng mưa lớn, nhiệt độ trung bình khoảng 15- 270C, do
khí hậu như vậy nên tài nguyên sinh vật của nước ta vô cùng phong phú và đa
dạng, đặc biệt là tài nguyên rừng. Rừng Việt Nam có thảm thực vật phong
phú vào loại bậc nhất trên thế giới với khoảng 12000 loài, trong đó có 4000
loài được nhân dân ta dùng làm thảo dược [1]. Đó là một nguồn tài nguyên
Trần Thị Huyền
10
K31- Khoa Hóa Học
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
dược liệu vô cùng quý giá và cũng là chỉ tiêu nghiên cứu của các nhà khoa
học;
là một tiền đề cho sự phát triển ngành hóa học các hợp chất thiên nhiên ở
nước ta để phục vụ cho con người trong lao động và sản xuất.
Việc nghiên cứu, khảo sát về thành phần hóa học và tác dụng dược lý
của các loài cây thuốc có giá trị cao của Việt Nam nhằm đặt cơ sở khoa học
cho việc sử dụng chúng một cách hợp lí, hiệu quả. Trên cơ sở đó, tôi lựa chọn
đề tài: “Nghiên cứu một số thành phần hóa học của cây Bách bệnh
(Eurycoma Longifolia Jack)”.
Cây Bách bệnh (Eurycoma Longifolia Jack) thuộc họ Thanh thất
(Simaroubaceae) là một trong những đối tượng nghiên cứu quan trọng. Bách
bệnh được dùng nhiều trong bài thuốc chữa khí hư, huyết kém, ăn uống không
tiêu, xương yếu, chân tay đau yếu, rễ cây chữa sốt, sốt rét, chữa ngộ độc và
say rượu, giun sán, vỏ cây dùng làm thuốc bổ, chữa ăn uống không tiêu,…
Nhiệm vụ của khóa luận
1.
Nghiên cứu một số thành phần hóa học của cây Bách bệnh.
2.
Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được
bằng các phương pháp phổ.
Trần Thị Huyền
11
K31- Khoa Hóa Học
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
CHƢƠNG 1: Tổng quan
1.1. Những nghiên cứu tổng quan về cây Bách bệnh.[2]
1.1.1. Thực vật học:
Cây Bách bệnh có tên trong dân gian là cây Mật nhân hay cây Bá
bệnh và tên khoa học là Eurycoma longifolia Jack.
Hình 1.1 Cây Bách bệnh (Eurycoma longifolia Jack)
Bách bệnh thuộc loại cây trung bình, cao 2- 8m, ít phân cành. Lá cây
dạng kép gồm 21- 25 lá nhỏ sánh đôi đối nhau, hình mác hoặc bầu dục, mặt
trên xanh sẫm bóng, mặt dưới có lông màu trắng xám, cuống lá màu nâu đỏ.
Cụm hoa mọc ở ngọn thành chùm kép, hoa màu đỏ nâu, mỗi hoa có 5-6 cánh
rất nhỏ, hoa nở vào tháng 3-4; cây kết quả vào tháng 5- 6, quả non màu xanh,
khi chín đổi sang màu đỏ sẫm, quả hình trứng, dài 1- 2cm, ngang 0,5- 1cm.
Trần Thị Huyền
12
K31- Khoa Hóa Học
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
1.1.2. Phân bố, sinh thái:
Eurycoma Jack là chi nhỏ gồm những đại diện là cây bụi hoặc cây gỗ
nhỏ, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới Đông Nam á. Vùng Đông Nam á có 3
loài và một vài dưới loài, trong đó đáng chú ý nhất là loài Bách bệnh phân bố
rộng rãi từ Myanmar đến các nước Đông Dương, Thái Lan, Malaysia, đảo
Sumatra. ở Việt Nam, Bách bệnh phân bố rải rác ở các tỉnh vùng núi thấp
(dưới 1000m) và vùng trung du. Các tỉnh Tây Nguyên và miền Trung gặp
nhiều hơn các tỉnh phía Bắc.
1.1.3. Một số nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Bách bệnh
Cây Bách bệnh là cây thuốc nổi tiếng. Cây chữa được nhiều chứng
bệnh (nên có tên là Bách- nghĩa là 100). Trên thế giới đã có rất nhiều công
trình nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của cây
Bách bệnh nhằm khai thác triệt để tiềm năng y học của cây thuốc quý này.
Năm 1970, ở Việt Nam đã có những nghiên cứu về hoá học của cây
Bách bệnh, các nghiên cứu này được thực hiện bởi các tác giả L.V Thoi, N.N
Suong [4], kết quả nghiên cứu cho thấy trong thành phần hoá học của cây
Bách bệnh có hợp chất eurycomalactone; -sitosterol; campesterol; 2,6dimethoxybenzoquinone và dihydroeurycomalactone.
Năm 1982, các tác giả Muchsin Darise, Hiroshi Kohda, Kenji Mizutani
và Osamu Tanaka [5] đã tiến hành những nghiên cứu về thành phần hoá học
của rễ Bách bệnh, kết quả nghiên cứu ban đầu cho thấy trong thành phần của
rễ cây Bách bệnh có chứa: Eurycomanone, eurycomanol và Eurycomanone-2O--glycopyranoside, 9-hydroxycanthin-6-one. Cùng thời gian này, nhóm tác
giả tại Việt Nam cũng đã có những nghiên cứu tiếp theo về thành phần hoá
học của cây Bách bệnh, kết quả nghiên cứu cho thấy trong thành phần cây
Bách bệnh của Việt Nam có eurycomalactone, campesterol; 2,6-
Trần Thị Huyền
13
K31- Khoa Hóa Học
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
dimethoxybenzoquinone và dihydroeurycomalactone, 7-methoxy--carboline1-propionic acid [4].
Năm 1983, nhóm tác giả Muchsin Darise [6] tiến hành các nghiên cứu
về thành phần hoá học của cây Bách bệnh, kết quả nghiên cứu cho thấy có sitosterol; 9-hydroxycanthin-6-one-N-oxide.
Năm 1991, Itokawa, H., Kishi, E., Morrita, H. [8], tìm thấy có hợp
chất mới Eurylen có hoạt tính độc tế bào trong thành phần hoá học của Bách
bệnh. Cùng thời gian này nhóm tác giả K. L. Chan, S. Lee, T. W. Sam và d B.
H. Han [9] đã phân lập được hợp chất 3 ,18-dihydroeurycomanol; 14, 15dihydroxyklaineanone từ cây Bách bệnh.
Năm 2001, nhóm tác giả Suratwadee Jiwajinda, Vilai Santisopasri [10]
đã nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của cây Bách bệnh,
đã phân lập được: longilactone; 6-dehydroxylongilactone;
11-dehydroxyklaineanone; 15- dihydroxyklaineanone;
14,15- dihydroxyklaineanone; 15-O-acetyl-14-dihydroxyklaineanone.
Năm 2002, Hooi Hoon Ang, Yukio Hitotsuyanagi [11] đã phân lập
được
Eurycolactone
E,
Eurycolactone
F,
Eurycolactone
B
và
Eurycomalactone.
Năm 2003, nhóm tác giả Ping Chung Kuo và cs [12] đã phân lập và xác
định cấu trúc hoá học được 3 hợp chất mới: n-pentyl-carboline-1-propionate;
5-hydroxymethyl-9-methoxycanthin-6-one và 1-hydroxy-9-methoxycanthin6-one và 9-methoxycanthin-6-one; canthin-6-one đã biết từ cây Bách bệnh.
Các hợp chất phân lập được đã được tiến hành thử nghiệm hoạt tính gây độc
tế bào in vitro và hoạt tính chống sốt rét in vitro. Kết quả thử nghiệm cho
Trần Thị Huyền
14
K31- Khoa Hóa Học
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
thấy hợp chất 9-methoxycanthin-6-one; canthin-6-one thể hiện hoạt tính gây
độc tế bào trên dòng tế bào ung thư phổi và dòng tế bào ung thư vú.
Hình 1.2. Một số cấu trúc đặc trưng có trong thành phần hoá học
của cây Bách bệnh.
O
HO
HO
HO
HO
HO
O
O
O
O
O
HO
O
HO
OH
OH
OH
OH
Eurycomanol
Eurycomanone
HO
HO
O
HO
OH
OH
OH
HO
HO
HO
O
O
O
O
O
HO
O
HO
OH
OH
OH
OH
3 ,18-dihydroeurycomanol
Eurycomanone-2-O--glycopyranoside
OH
O
O
O
OH
O
O
OH
O
O
O
O
OH
Eurylene
Trần Thị Huyền
O
12-Epi-11-dehydroklaineanone
15
K31- Khoa Hóa Học
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
OH
OH
HO
OH
HO
OH
O
O
O
O
O
O
O
O
OH
Eurycolactone F
Longilactone
1.1.4. Bộ phận dùng: Rễ cây, thân cây, quả, vỏ cây, lá cây.
1.1.5. Tác dụng dược lý [1]
- Cao chiết từ Bách bệnh có tác dụng kháng kí sinh trùng sốt rét trong
thử nghiệm nuôi cấy in vitro.
- Bách bệnh có tác dụng tăng dục, có mối tương quan giữa hoạt tính
kích thích sinh dục nam và lượng nội tiết tố sinh dục nam trong huyết thanh.
Thân và rễ Bách bệnh làm tăng lượng testosteron trong huyết thanh động vật,
rễ làm tăng testosteron nhiều hơn thân cây.
- Một chế phẩm thuốc gồm 3 dược liệu: Bách bệnh, Trâm bầu và Xấu hổ
có độc tính cấp diễn và trường diễn thấp. Thuốc có tác dụng lợi mật rõ rệt và
không làm thay đổi thành phần của mật ở Chuột lang. Thuốc làm thải trừ BSP
của gan Thỏ so với đối chứng.
- Chế phẩm thuốc này có tác dụng làm chậm quá trình hư biến của gan
Chuột cống trắng gây nên do carbon tetraclorid. Nó cũng làm tăng sự tái tạo
của tế bào gan Chuột nhắt trắng trong mô hình gây tổn thương gan thực
nghiệm.
1.1.6. Tính vị và công năng [2]
Trần Thị Huyền
16
K31- Khoa Hóa Học
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
Rễ thường dùng nhất để chữa khí hư, huyết kém, ăn uống không tiêu,
trong ngực có cục tích, gân đờ, xương yếu, tay chân đau yếu.
Nhân dân thường dùng rễ chữa sốt, sốt rét, chữa ngộ độc và say rượu,
giun sán. Vỏ, thân làm thuốc bổ, chữa ăn uống không tiêu, nôn.
Quả dùng để chữa tiêu chảy, lá dùng để nấu nước tắm, trị ghẻ, ngứa.
1.2. Các phƣơng pháp chiết mẫu thực vật [4,5]
Sau khi tiến hành thu hái và sấy mẫu, tùy thuộc vào đối tượng chất có
trong mẫu khác nhau (chất không phân cực, chất có độ phân cực vừa phải…)
mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau.
1.2.1. Chọn dung môi chiết
Thường thì các chất chuyển hóa thứ cấp trong cây có độ phân cực khác
nhau. Đôi khi để tạo ra độ phân cực của dung môi thích hợp người ta không
chỉ dùng đơn thuần một loại dung môi mà phối hợp một tỉ lệ nhất định để tạo
ra một hệ thống dung môi mới. Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít
khi được quan tâm. Dung môi dùng cho quá trình chiết cần phải được lựa
chọn rất cẩn thận. Nó cần hòa tan những chất chuyển hóa thứ cấp đang nghiên
cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu),
không độc, không dễ bốc cháy. Những dung môi này nên được chưng cất để
thu được dạng sạch trước khi sử dụng nếu chúng có lẫn các chất khác có thể
ảnh hưởng đến hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết. Thường có một số
chất dẻo lẫn trong dung môi như các diankyl phtalat, tri-n-butyl-axetylnitrat
và tributylphotphat. Những chất này có thể hòa lẫn với dung môi trong quá
trình sản xuất dung môi hoặc trong khâu bảo quản như trong các thùng chứa
bằng nhựa hoặc các nút nhựa.
Trần Thị Huyền
17
K31- Khoa Hóa Học
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
Metanol và clorofoc thường chứa dioctylphtalat, [di-(2- etylhexyl)
phtalat hoặc bis- 2- etylhexyl- phtalat]. Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân
lập trong các quá trình nghiên cứu hóa thực vật. Chất này còn thể hiện hoạt
tính trong thử nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây.
Clorofoc, metylen clorit và methanol là những dung môi thường được lựa
chọn trong quá trình chiết sơ bộ một phần của cây ( như lá, thân, rễ, củ, quả,
hoa…)
Những tạp chất của clorofoc như: CH2Cl2, CH2ClBr có thể phản ứng
với một vài hợp chất như các ancaloit tạo muối bậc bốn và những sản phẩm
khác. Tương tự như vậy sự có mặt của một lượng nhỏ axit Clohidiric (HCl)
cũng có thể gây ra sự phân hủy, sự khử nước, hay sự đồng phân hóa với các
hợp chất khác. Bởi vì Clorofoc có thể gây tổn thương cho gan và thận nên nó
cần được thao tác khéo léo, cẩn thận ở nơi khô thoáng và phải đeo mặt nạ
phòng độc.
Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn clorofoc.
Metanol và etanol 80% là những dung môi phân cực hơn các
hidrocacbon thế clo. Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ
thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu
được lượng lớn các thành phần trong tế bào.
Trái lại, clorofoc khả năng phân cực thấp hơn, có thể rửa, giải các chất
nằm ngoài tế bào. Các ancol hòa tan phần lớn các chất chuyển hóa phân cực
cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp vì vậy khi chiết bằng
ancol thì các chất này cũng sẽ bị hòa tan đồng thời. Thông thường dung môi
cồn trong nước dường như có đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ.
Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng
methanol trong suốt quá trình chiết. Ví dụ trechlonolide A thu được từ
Trechonaetes laciniata được chuyển thành trechlonolide B bằng quá trình
Trần Thị Huyền
18
K31- Khoa Hóa Học
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
metyl hóa khi đun nóng với methanol chứa một ít axit và quá trình phân hủy
1- hydroxytropacocain cũng xảy ra khi Erythroxylum novogranatense được
chiết trong metanol nóng.
Người ta thường ít khi sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ cây
mà thay vào đó là dung dịch nước của metanol.
Dietyl ete hiếm khi được dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất
dễ bay hơi, dễ bốc cháy và độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit
dễ nổ, peroxit của dietyl ete dễ gây ra phản ứng oxi hóa với những hợp chất
không có khả năng tạo cholesterol như các carotenoid. Tiếp đến là axeton
cũng có thể tạo thành axetonit nếu 1,2-cis-diol có mặt trong môi trường axit.
Quá trình chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình
phân tách đặc trưng, cũng có khi xử lý các dịch chiết bằng axit- bazơ có thể
tạo ra những sản phẩm mong muốn. Sự hiểu biết về những đặc tính của những
chất chuyển hóa thứ cấp trong cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa
chọn dung môi thích hợp cho quá trình chiết, tránh được sự thủy phân chất
bởi dung môi và quá trình tạo thành chất mong muốn.
Sau khi chiết dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không
quá 30- 400C, với một vài hóa chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ cao
hơn.
1.2.2. Quá trình chiết
Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:
- Chiết ngâm
- Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet
- Chiết sắc với dung môi nước
- Chiết lôi cuốn theo hơi nước
Trần Thị Huyền
19
K31- Khoa Hóa Học
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất
trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời
gian. Thiết bị sử dụng là một bình thủy tinh với một cái khóa ở dưới đáy để
tạo tốc độ chảy cho quá trình tách rửa dung môi. Dung môi có thể nóng hoặc
lạnh. Trước kia, máy chiết ngâm đòi hỏi là phải làm bằng kim loại nhưng hiện
nay có thể dùng bình thủy tinh.
Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương
pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng
24 giờ và sau đó chất chiết được lấy ra. Cần lưu ý, sau một quá trình chiết 3
lần dung môi, cặn thu được sẽ không còn chứa những chất giá trị nữa. Sự kết
thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài cách khác nhau. Bởi vì khi
chiết các ancaloit, ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của nhiều hợp chất này ra
khỏi bình chiết bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như
tác nhân Dragendorff và tác nhân Mayer. Cũng vậy, các Flavonoid thường là
những hợp chất màu và bởi vậy khi dịch chảy ra mà không có màu sẽ đánh
dấu là đã rửa hết những chất này trong quá trình chiết. Khi chiết các chất béo,
nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và sự xuất hiện của cặn tiếp sau đó
sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết. trong trường hợp các lacton của
sesquitecpen và các glicozid trợ tim, phản ứng Kedde có thể được sử dụng để
biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với anilin axetat sẽ cho
biết sự xuất hiện của các hydrat cacbon, và từ đó có thể biết được khi nào quá
trình chiết kết thúc.
Như vậy tùy thuộc mục đích cần chiết lấy chất gì để lựa chọn dung môi
cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lí nhằm đạt hiệu quả cao.
Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các lớp
chất mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết.
Trần Thị Huyền
20
K31- Khoa Hóa Học
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
1.3. Các phƣơng pháp sắc ký [4,5]
Phương pháp tách chất bằng sắc ký được bắt đầu từ năm 1903. Năm
1903 nhà bác học người Nga Txvet đã dùng cột nhôm ôxit để tách các
picmem của lá cây thành các chất riêng biệt. Ông đã giải thích hiện tượng này
bằng ái lực hấp phụ khác nhau của các sắc tố và đặt tên là phương pháp sắc ký
(chromatography). Phương pháp sắc ký là một phương pháp phổ biến và hữu
hiệu nhất hiện nay được sử dụng để phân lập các hợp chất hữu cơ nói chung
và các hợp chất thiên nhiên nói riêng.
Sắc ký bao gồm pha tĩnh và pha động. Trên thế giới hiện nay phổ biến là
sử dụng pha tĩnh là chất rắn (bao gồm các loại chất hấp phụ như: silica gel,
YMC, ODS, Al2O3 v.v…) còn pha động được sử dụng là chất lỏng (sắc ký
lỏng), hay chất khí (sắc ký khí ). Pha động được dùng trong sắc ký lỏng là các
dung môi hữu cơ, trên nguyên tắc là chất phân cực hơn sẽ tan tốt trong dung
môi phân cực hơn, và ngược lại chất ít phân cực sẽ tan tốt trong dung môi
kém phân cực hơn. Có thể sắp xếp độ phân cực của dung môi theo dãy tăng
dần độ phân cực của dung môi như sau: ete dầu hỏa, xiclohexan,
cacbontetraclorua, xylen, toluen, benzen, clorofoc, metylenclorua, axeton,
dioxan, etylaxetat, piridin, propanol, metanol, axit axetic.
Nguyên tắc căn bản được sử dụng trong phương pháp này là dựa vào sự
khác nhau về ái lực giữa các chất cần tách với chất hấp phụ. Độ phân cực của
dung môi tăng dần từ ete dầu hỏa đến nước. Tùy thuộc vào cách tiến hành sắc
ký mà người ta chia ra thành các phương pháp sắc ký chủ yếu như sau:
1.3.1. Sắc ký cột
Đây là phương pháp sắc ký phổ biến nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh bao
gồm các loại silica gel (độ hạt khác nhau) pha thường cũng như pha đảo
YMC, ODS, Dianion, v.v… Chất hấp phụ được nhồi vào cột (có thể cột bằng
Trần Thị Huyền
21
K31- Khoa Hóa Học
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
thủy tinh hay cột bằng kim loại inox, nhưng phổ biến nhất là cột thủy tinh).
Độ mịn của chất hấp phụ hết sức quan trọng, nó phản ánh số đĩa lý thuyết hay
khả năng tách của chất hấp phụ. Độ hạt của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa
lý thuyết càng lớn và do đó khả năng tách càng cao và ngược lại. Tuy nhiên
nếu chất hấp phụ có độ hạt càng nhỏ thì tốc độ dòng chảy càng giảm. Trong
một số trường hợp, khi lực trọng trường không đủ lớn thì gây hiện tượng tắc
cột (dung môi không chảy được), khi đó người ta phải sử dụng áp suất, với áp
suất trung bình (MPC), áp suất cao (HPLC).
Trong sắc ký cột, tỷ lệ đường kính cột (D) so với chiều cao cột (L) rất
quan trọng và thể hiện khả năng tách của cột. Tỷ lệ L/D phụ thuộc vào yêu
cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể. Trong sắc ký, tỷ lệ giữa
quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi được của dung môi
gọi là Rf , với mỗi một chất sẽ có một Rf khác nhau. Chính nhờ vào sự khác
nhau về Rf mà người ta tách được từng chất ra khỏi hỗn hợp chất. Tỷ lệ chất
so với tỷ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng và tùy thuộc vào yêu cầu tách.
Nếu tách thô thì tỷ lệ này thấp (dao động từ 1/5 đến 1/10), còn nếu tách tinh
thì yêu cầu tỷ lệ này cao hơn và tùy vào hệ số tách ( tức là tùy thuộc vào sự
khác nhau về Rf của các chất) mà hệ số này dao động trong khoảng 1/20 đến
1/30.
Trong sắc ký cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng. Tùy thuộc
vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng các
phương pháp khác nhau. Nếu lượng chất nhiều và chạy thô, thì phổ biến
người ta phải tẩm chất vào silica gel rồi làm khô, tơi hoàn toàn rồi đưa lên cột.
Nếu tách tinh, thì người ta hay đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hòa tan
chất bằng dung môi chạy cột với một lượng tối thiểu. Việc nhồi cột (bằng chất
hấp phụ) cũng hết sức quan trọng. Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:
Trần Thị Huyền
22
K31- Khoa Hóa Học
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
- Một là nhồi cột khô. Theo cách này, chất hấp phụ được đưa trực tiếp
vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để cho
chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột. Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy
qua cột đến khi cột trong suốt.
- Hai là nhồi cột ướt, tức là chất hấp phụ được lắc đều trong dung môi
chạy cột trước, sau đó đưa dần vào cột đến khi đủ lượng cần thiết.
- Việc chuẩn bị cột hết sức quan trọng và ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu
quả tách. Yêu cầu cột không được có bọt khí bên trong (điều này gây nên hiện
tượng chảy rối trong cột và giảm hiệu quả tách), và cột không được nứt, gẫy.
- Tốc độ dòng chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách.
Nếu tốc độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách. Tuy nhiên nếu tốc
độ dòng chảy thấp quá sẽ làm kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ
công việc.
1.3.2. Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng (SKLM) thường được sử dụng để kiểm tra và định
hướng cho sắc ký cột. Sắc ký lớp mỏng được tiến hành trên bản mỏng tráng
sẵn silica gel trên đế nhôm hay đế thủy tinh. Ngoài việc sử dụng SKLM để
định hướng cho sắc ký cột, người ta còn sử dụng SKLM để điều chế thu chất
trực tiếp. Bằng việc sử dụng bản SKLM điều chế (bản được tráng silica gel
dày hơn), có thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản, và sau khi chạy sắc ký,
người ta có thể cạo riêng silica gel rồi giải hấp bằng dung môi thích hợp để
thu được từng chất riêng biệt. Có thể phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn
tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trưng cho từng lớp chất hoặc sử dụng dung
dịch axit sufuric 10%.
1.4. Các phƣơng pháp xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ [3]
Trần Thị Huyền
23
K31- Khoa Hóa Học
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
Cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ được xác định nhờ vào các
phương pháp phổ kết hợp. Tùy thuộc vào cấu trúc hóa học của từng hợp chất
mà người ta sử dụng những phương pháp phổ cụ thể. Cấu trúc càng phức tạp
thì yêu cầu phối hợp các phương pháp phổ càng cao. Trong một số trường
hợp, để xác định chính xác cấu trúc hóa học của các hợp chất người ta còn
phải dựa vào các phương pháp bổ xung khác như chuyển hóa hóa học, kết
hợp với các phương pháp sắc ký so sánh…
1.4.1. Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy, IR)
Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động của
các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại. Mỗi
kiểu liên kết sẽ đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau. Chính vì vậy,
việc phân tích phổ hồng ngoại là nhằm chỉ rõ nguồn gốc các vân hấp phụ cơ
bản trên phổ, từ đó cho biết các nhóm nguyên tử trong phân tử (đặc biệt là
nhóm chức) và rút ra những kết luận về cấu trúc phân tử, ví dụ như dao động
hóa trị của nhóm OH tự do trong các hydroxyl là 3300- 3450 cm-1, của nhóm
cacbonyl C=O trong khoảng 1700- 1750 cm-1, của nhóm ete C-O-C trong
vùng 1020- 1100cm-1, của nhóm C=C trong khoảng 1630-1650 cm-1, N-H
(3400- 3500 cm-1), v.v… Đặc biệt vùng dưới 700 cm-1 được gọi là vùng vân
tay được sử dụng để nhận dạng các hợp chất hữu cơ theo phương pháp so
sánh trực tiếp. Hiện nay, thông tin chung thu được từ phổ hồng ngoại không
nhiều, mặc dù vậy lượng chất cần để thực hiện phép đo phổ này (nghiền và ép
viên với KBr bằng máy ép thủy lực dưới áp suất 13-15 atm) lại cần từ 2- 3mg
và khó thu hồi lại. Chính vì vậy, thông thường đối với các hợp chất thiên
nhiên (lượng chất thu được ít) thì phổ hồng ngoại được đo sau khi đã hoàn
chỉnh các phép đo khác như phổ cộng hưởng từ nhân hay phổ khối lượng.
Trần Thị Huyền
24
K31- Khoa Hóa Học
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Khóa luận tốt nghiệp
1.4.2.Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy, MS)
Nói một cách đơn giản máy phổ khối lượng được chế tạo để thực hiện
ba nhiệm vụ cơ bản là: chuyển chất nghiên cứu thành thể khí; tạo ra các ion
phân tử và ion mảnh từ khí đó; phân tách các ion đó rồi lại ghi tín hiệu theo tỷ
lệ khối lượng trên điện tích (m/ze) của chúng. Bởi vì e là điện tích của một
electron, được lấy là 1, nên các ion có z >1 là rất nhỏ, do đó tỷ số m/z thường
chính là khối lượng của ion. Vì thế phổ thu được có tên là phổ khối lượng viết
tắt là phổ MS (Mass Spectroscopy)
Phổ khối lượng được sử dụng khá phổ biến để xác định cấu trúc hóa
học của các hợp chất hữu cơ. Nguyên tắc chủ yếu của phương pháp phổ này
là dựa vào sự phân mảnh ion của phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion
bên ngoài. Ngoài ion phân tử, phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác mà dựa
vào đó người ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh và dựng lại được cấu
trúc hóa học của các hợp chất. Hiện nay có rất nhiều loại phổ khối lượng.
Những phương pháp chủ yếu được nêu ra dưới đây:
+ Phổ EI-MS (Electron Impact Ionization Mass Spectrometry) dựa vào
sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá với năng lượng khác
nhau phổ biến là 70 eV.
+ Phổ ESI (Electron Spray Ionization Mass Spectrometry) gọi là phổ
phun mù điện tử. Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn
nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử và các
pic đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị phá
vỡ.
Trần Thị Huyền
25
K31- Khoa Hóa Học
