phân lập vi khuẩncố định đạm hòa tan lân trong đất xám vùng rễ cây bắp trồng ở tỉnh bình dương và bà rịa vũng tàu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP VI KHUẨNCỐ ĐỊNH ĐẠM - HÒA TAN LÂN
TRONG ĐẤT XÁM VÙNG RỄ CÂY BẮP
TRỒNG Ở TỈNH BÌNH DƯƠNG
VÀ BÀ RỊA VŨNG TÀU
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
GS.TS CAO NGỌC ĐIỆP

SINH VIÊN THỰC HIỆN
NGUYỄN THANH HUY
MSSV:3103957
LỚP:VI SINH VẬT K36

Cần Thơ, Tháng 11/2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP VI KHUẨNCỐ ĐỊNH ĐẠM - HÒA TAN LÂN
TRONG ĐẤT XÁM VÙNG RỄ CÂY BẮP

TRỒNG Ở TỈNH BÌNH DƯƠNG
VÀ BÀ RỊA VŨNG TÀU

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
GS.TS CAO NGỌC ĐIỆP

SINH VIÊN THỰC HIỆN
NGUYỄN THANH HUY
MSSV:3103957
LỚP:VI SINH VẬT K36

Cần Thơ, Tháng 11/2013


PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

SINH VIÊN THỰC HIỆN

(ký tên)

(ký tên)

GS.TS Cao Ngọc Điệp

Nguyễn Thanh Huy

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………
Cần Thơ, ngày

tháng

năm 2013

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(ký tên)


LỜI CẢM TẠ
Trong suốt quá trình học tập tại trường cho đến khi hoàn thành luận văn này tôi
đã nhận được sự giúp đỡ từ các thầy cô, bạn bè và gia đình rất nhiều. Để có được kết
quả như hôm nay, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:
- Thầy GS.TS Cao Ngọc Điệp người đã dành nhiều thời gian, hướng dẫn tận
tình, động viên cung cấp nhiều tài liệu, kiến thức quý báu, tạo mọi điều kiện thuận lợi
và tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn này.
- Ban Lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, cô Nguyễn
Thị Pha là cố vấn học tập lớp Vi Sinh Vật Học K36 luôn quan tâm trong suốt quá trình
học tập và thực hiện đề tài.
- Chị Nguyễn Thị Xuân Mỵ, chị Trần Thị Giang Cán bộ quản lí phòng thí
nghiệm Vi Sinh Vật đất và Vi Sinh Vật Môi trường truyền đạt kinh nghiệm và động
viên tôi rất nhiều trong thời gian thực hiện đề tài.
- Gia đình cùng chia sẻ những khó khăn, tạo mọi thuận lợi cho tôi yên tâm, có
điều kiện tốt nhất để hoàn thành và đạt được kết quả trong suốt quá trình học tập của

mình.
Một lần nữa, tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến tất cả mọi người!

Cần Thơ, ngày 25 tháng 11 năm 2013.
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thanh Huy


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

TÓM LƯỢC

Bốn mươi chín dòng vi khuẩn đã được phân lập trên môi trường Burk’s không
đạm và môi trường NBRIP từ đất vùng rễ cây bắp trồng trên đất xám ở tỉnh Bình
Dương và Bà Rịa – Vũng Tàu đều đa số khuẩn lạc có dạng tròn đều, một vài dòng vi
khuẩn có khuẩn lạc dạng không đều, hầu hết các dòng vi khuẩn có dạng que ngắn và
có khả năng chuyển động. Kiểm tra khả năng tổng hợp đạm trên môi trường Burk’s
lỏng; khả năng hòa tan lân khó tan trên môi trường NBRIP lỏng và khả năng tổng hợp
IAA. Kết quả có 49/49 dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp đạm, hòa tan lân khó tan
và tổng hợp IAA chiếm tỉ lệ 100%. Trong 49 dòng vi khuẩn phân lập đã khảo sát thì có
6/49 dòng vi khuẩn tổng hợp NH4+ đạt lượng cao là: BDN2 (1,31 mg/l) VDB7c (1,43
mg/l), VDN6a (1,27 mg/l), VTN5c (4,41 mg/l, VDN2a (1,30 mg/l) và VDN3a (1,35
mg/l). Có 8/49 dòng vi khuẩn có khả năng hòa tan lân tốt là: VDN2a (66,66 mg/l),
VDB6a ( 71,24 mg/l), và dòng VDN7c (83,56 mg/l, BDB4 (70,17 mg/l, VDN7d (91,56
mg/l), VDB6b (61,38 mg/l), VDN4a (66,65 mg/l), VDB5a (64,04 mg/l). Những dòng vi
khuẩn có khả năng tổng hợp IAA cao là VDB5a (4,05 mg/l), BDN5 (4,33 mg/l, VDB7e
(3,64 mg/l), VDB4 (3,18 mg/l, VDB3b (3,21 mg/l).

Từ khóa: Cố định đạm, đất xám, hòa tan lân, tổng hợp IAA.

Chuyên nghành Vi Sinh Vật học

i

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

MỤC LỤC
Trang
PHẦN KÍ DUYỆT ............................................................................................................
LỜI CẢM TẠ ....................................................................................................................
TÓM LƯỢC .................................................................................................................... i
MỤC LỤC ...................................................................................................................... ii
DANH SÁCH BẢNG ......................................................................................................v
DANH SÁCH HÌNH ..................................................................................................... vi
TỪ VIẾT TẮT .............................................................................................................. vii
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU .............................................................................................1
1.1 Đặt vấn đề .............................................................................................................1
1.2 Mục tiêu đề tài .......................................................................................................2
1.3 Nội dung nghiên cứu .............................................................................................2
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .........................................................................3
2.1 Sơ lược về đất xám ................................................................................................3
2.1.1 Giới thiệu chung về đất xám ...........................................................................3

2.1.2 Phân loại ..........................................................................................................3
2.2 Sơ lược về chu trình nitơ, quá trình cố định đạm và vi khuẩn cố định đạm .........5
2.2.1 Sơ lược về chu trình nitơ trong tự nhiên .........................................................5
2.2.2 Quá trình cố định đạm .....................................................................................6
2.2.3 Vi khuẩn cố định đạm. ....................................................................................6
2.3 Sơ lược về chu trình lân, quá trình hòa tan lân và vi khuẩn hòa tan lân ..............7
2.3.1 Sơ lược về chu trình lân trong tự nhiên ..........................................................7
2.3.2 Quá trình hòa tan lân của vi khuẩn .................................................................8
2.3.3 Vi khuẩn hòa tan lân .....................................................................................10
2.4 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng phân vi sinh trong sản xuất
nông nghiệp ........................................................................................................11
2.4.1 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng phân vi sinh trên thế giới ......................11
2.4.2 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng phân vi sinh trong nước ........................11
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................13
3.1 Thời gian và địa điểm..........................................................................................13
Chuyên nghành Vi Sinh Vật học

ii

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

3.2 Phương tiện thí nghiệm .......................................................................................13
3.2.1 Vật liệu thí nghiệm ........................................................................................13
3.2.2 Dụng cụ và trang thiết bị ...............................................................................13
3.2.3 Hóa chất ........................................................................................................14

3.3 Phương pháp nghiên cứu .....................................................................................16
3.3.1 Phân lập vi khuẩn ..........................................................................................16
3.3.2 Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn ........................17
3.3.3 Quan sát hình thái, đo kích thước khuẩn lạc .................................................17
3.3.4 Xác định hàm lượng NH4+ do vi khuẩn tạo ra bằng phương pháp
Indophenol Blue ...........................................................................................17
3.3.5. Xác định khả năng hòa tan lân của vi khuẩn ...............................................20
3.3.6 Khảo sát khả năng tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA) ..............................22
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ THẢO LUẬN .......................................................................23
4.1 Kết quả phân lập và đặc điểm của các dòng vi khuẩn vùng rễ
đã phân lập được .................................................................................................23
4.1.1 Nguồn gốc và kết quả phân lập vi khuẩn vùng rễ .........................................23
4.1.2 Đặc điểm của các dòng vi khuẩn đã phân lập ...............................................24
4.2 Khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn trên môi trường Burk’s .............28
4.3 Khả năng hòa tan lân của các dòng vi khuẩn trên môi trường NBRIP ...............31
4.4 Khả năng tổng hợp Indole-3-Acetic Acid (IAA) của các dòng
vi khuẩn đã phân lập ...........................................................................................34
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ. ....................................................................37
5.1 Kết luận ...............................................................................................................37
5.2 Đề nghị ................................................................................................................38
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................39

Chuyên nghành Vi Sinh Vật học

iii

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

PHỤ LỤC
Phụ luc 1: Nguồn gốc các dòng vi khuẩn đât vùng rễ cây bắp
1.

Bảng 14: Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường
Burk’s không đạm.

2.

Bảng 15: Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường
NBRIP.

Phụ lục 2: Kết quả các ngày đo đạm, lân và IAA
1.

Bảng 16: Kết quả đo đạm (mg NH4+/l) của các dòng vi khuẩn sau 2
ngày, 4ngày, 6 ngày và 8 ngày nuôi trong môi trường
Burk’s không đạm.

2.

Bảng 17: Kết quả đo lân (mg P2O5/l) của các dòng vi khuẩn sau 5
ngày, 10 ngày, 15 ngày và 20 ngày nuôi trong môi trường
NBRIP lỏng.

3.

Bảng 18: Kết quả đo IAA (mgIAA /l) của các dòng vi khuẩn sau 2
ngày, 4 ngày, 6 ngày và 8 ngày nuôi trong môi trường
NBRIP và Burk's lỏng.

Chuyên nghành Vi Sinh Vật học

iv

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 1: Thành phần môi trường Burk không đạm (Park et al., 2005)
dùng để phân lập vi khuẩn cố định đạm. ........................................................14
Bảng 2: Thành phần môi trường NBRIP (Nautiyal, 1999)
dùng để phân lập vi khuẩn hòa tan lân. ..........................................................15
Bảng 3: Thành phần của dãy đường chuẩn NH4+ . ........................................................18
Bảng 4: Giá trị đường chuẩn NH4+. ...............................................................................19
Bảng 5: Thành phần của dãy đường chuẩn P2O5...........................................................21
Bảng 6: Đường chuẩn đo IAA .......................................................................................22
Bảng 7: Nguồn gốc của 22 dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường Burk’s................23
Bảng 8: Nguồn gốc của 27 dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường NBRIP ...............23
Bảng 9: Đặc điểm của các dòng vi khuẩn đã phân lập ..................................................24
Bảng 10: Tỷ lệ (%) về các đặc điểm khuẩn lạc của dòng vi khuẩn...............................25
Bảng 11: Lượng đạm cố định (mg NH4+/l) của 49 dòng vi khuẩn phân lập

được sau 2, 4, 6 và 8 ngày nuôi trong môi trường Burk không đạm .............28
Bảng 12: Lượng lân hòa tan (mg P2O5/l) của 35 dòng vi khuẩn
phân lập được sau 5 và 10 ngày nuôi trong môi trường NBRIP ....................31
Bảng 13: Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn ở nghiệm thức
không có bổ sung tryptopan ...........................................................................34

Chuyên nghành Vi Sinh Vật học

v

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 1. Chu trình nitơ......................................................................................................5
Hình 2. Chu trình lân trong tự nhiên ...............................................................................8
Hình 3: Phản ứng tạo màu xanh molypdate của đường chuẩn ....................................188
Hình 4. Một số dạng khuẩn lạc trên đĩa petri môi trường đặc ......................................27

Chuyên nghành Vi Sinh Vật học

vi

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

TỪ VIẾT TẮT

DF:

degree of freedom

CV:

Coefficient of variation

ĐĐBM:

đặc điểm bề mặt

IAA:

Indole-3-acetic acid

MS:

Mean Square

NBRIP:

National Botanical Research Institute’s Phosphate.

S:

Sum of Square

LSD:

Least Significant Difference

ĐC

Đối Chứng

BR-VT

Bà Rịa – Vũng Tàu

Chuyên nghành Vi Sinh Vật học

vii

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Trong hoạt động sản xuất nông nghiệp phân bón là một trong những vật tư quan
trọng và được sử dụng với một lượng khá lớn hàng năm. Phân bón đã góp phần đáng
kể làm tăng năng suất cây trồng, chất lượng nông sản, đặc biệt là đối với cây lúa ở Việt
Nam.

Thật vậy, năng suất của hầu hết cây trồng gia tăng tuyến tính với lượng phân
bón mà chúng hấp thu. Để đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng về lương thực, mức tiêu
thụ của thế giới về các nguyên tố khoáng chính như đạm, lân và kali. Tuy nhiên, cây
trồng chỉ sử dụng dưới mức phân nửa của lượng phân đã bón (Loomis và Conner,
1992). Lượng khoáng chất còn lại có thể thấm lậu vào nước ngầm, bị cố định trong
đất, hoặc góp phần vào sự ô nhiễm không khí.
Qua những nghiên cứu cho thấy việc sử dụng phân vi sinh vật để thay thế phân
hóa học là một trong những giải pháp hữu hiệu mà chúng ta có thể áp dụng. Phân vi
sinh là sản phẩm chứa nhiều vi sinh vật có ích, có khả năng cố định đạm hay chuyển
hóa các hợp chất lân khó tan thành dạng cây trồng dễ hấp thu, tham gia trực tiếp hay
gián tiếp vào quá trình dinh dưỡng của cây trồng.
Do được bổ sung vi sinh có ích nên sản phẩm an toàn, lượng nitrat trong sản
phẩm giảm đáng kể, đất không bị ô nhiễm, khả năng giữ ẩm tốt hơn, tăng cường khả
năng cải tạo đất do các hệ sinh vật có ích hoạt động mạnh làm cho đất tơi xốp và cây
dễ hấp thu dinh dưỡng hơn. Đặc biệt ở các chủng vi sinh vật trong đất có khả năng
tổng hợp nitơ tự do tạo nguồn đạm sinh học, hòa tan lân khó tan cung cấp cho cây
trồng. Điều này có ý nghĩa rất quan trọng vì ngoài việc làm giảm chi phí trồng trọt, góp
phần nâng cao lợi nhuận cho nông dân, góp phần làm giảm ô nhiễm môi trường và xây
dựng mô hình phát triển bền vững trong nông nghiệp.
Vì thế, việc nghiên cứu để tìm ra những dòng vi khuẩn vừa có hoạt tính cố định
đạm tốt đồng thời có khả năng hòa tan lân và kali cao để phục vụ cho nhu cầu sản xuất
phân bón vi sinh là rất cần thiết.
Việc nghiên cứu, phân lập các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm và hòa
tan lân nhằm làm giảm lượng phân hóa học sử dụng trong nông nghiệp nhưng vẫn giữ


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

được năng suất cao, cải thiện độ phì nhiêu của đất và an toàn cho môi trường là rất cần
thiết.
Vì vậy, đề tài “Phân lập vi khuẩn cố định đạm - hòa tan lân từ đất vùng rễ
cây bắp ở đất xám tỉnh Bình Dương và tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu.” thực hiện nhằm
phân lập những dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm và hòa tan lân.
1.2 Mục tiêu đề tài
Phân lập và tuyển chọn được những dòng vi khuẩn sống ở đất vùng rễ bắp có
khả năng cố định đạm, hòa tan lân tốt và tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA).
1.3 Nội dung nghiên cứu
Phân lập, tuyển chọn các dòng vi khuẩn có hoạt tính cố định đạm - hòa tan lân
và tổng hợp IAA từ đất vùng rễ của cây bắp ở Bình Dương và Bà Rịa Vũng Tàu.
Đánh giá khả năng cố định đạm, hòa tan lân và tổng IAA của các dòng vi khuẩn
được tuyển chọn.

Chuyên nghành Vi Sinh Vật học

2

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Sơ lược về đất xám
2.1.1 Giới thiệu chung về đất xám
Diện tích gần 20 triệu ha, chiếm diện tích lớn nhất trong các loại đất nước ta,
phân bố rộng ở trung du và rìa đông bằng.

Hình thành ở những nơi có địa hình dốc thoải, nên quá trình rữa trôi các hạt sét,
keo và chất dnh dưỡng diễn ra mạnh mẽ, cho nên đất rất dễ thoái hóa.
Có tầng đất mặt mỏng, lớp đất có thành phần cơ giới nhẹ: tỉ lệ cát lớn, lượng
sét, keo ít. Đất thường bị khô hạn, đất chua hoặc rất chua. Đất nghèo dinh dưỡng
nghèo mùn.
Số lượng vi sinh vật trong đất rất ít, hoạt động của vi sinh vật yếu.
2.1.2 Phân loại
2.1.2.1 Đất xám bạc màu
Chủ yếu phát triển phù sa cổ, đá macma acid, đá cát. Phân bố nhiều nơi có địa
hình bằng thoải, thoáng khí, thoát nước dễ, chủ yếu tập trung ở Đông Nam Bộ, Tây
Nguyên và Trung Du Bắc Bộ.
Đất có thành phần cơ giới nhẹ, pH phổ biến 3,0 – 4,5, do đó phản ứng đất chua
vừa đến rất chua, nghèo cation trao đổi, hàm lượng mùn tầng từ nghèo đến rất nghèo
(0,5 – 1,5%), mức phân gải chất hữu có mạnh (C/N < 10), các chất tổng số dễ tiêu
nghèo, độ no bazơ thấp (<50%).
2.1.2.2 Đất xám glây (Gleyic Arisols)
Diện tích 101471 ha. Phân bố tập trung ở Trung du Bắc Bộ, Tây Nguyên và
Đông Nam Bộ, ở địa hình bậc thang, bằng tấp, ít thoát nước, có thể bị chịu ảnh hưởng
của nước mặt và nước ngầm nhiều tháng trong năm.
Hình thái các đơn vị đất khác nhau căn bản bởi sự xuất hiện một trong những
tầng chẩn đoán sau: Độ sâu tầng Glây hoặc tầng kết von, hoặc tầng đá ong, thành phần
cơ giới lớp đất mặt. Những sự khác nhau về hình thái và điều kiện thành phần đất dẫn
đến sự khác nhau về bản chất phát sinh và nông học của từng đơn vị đất phụ.

Chuyên nghành Vi Sinh Vật học

3

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

Đât có thành phần cơ giới từ nhẹ đến trung bình. Phản ứng của đất rất chua,
nghòe mùn, đọ no bazơ và dung tích hấp thu thấp. nghèo chất dinh dưỡng tổng số và
dễ tiêu.
2.1.2.3 Đất xám loang lổ
Diện tích 221360 ha, phân bố tập trung ở Trung du Bắc Bộ. Đa số diện tích nằm
ở địa hình bằng, thoải hoặc lượn sóng với độ dốc dưới 150.
Đất hình thành do sản phẩm phong hóa của đá mẹ granit nên thành phần khoáng
chủ yếu là thạch anh, kaolimit, haloizit, gowtit. Thành phần tổng số chủ yếu là SO 2 và
các sesquioxyt.
Một số tính chất vật lý tầng đất mặt: thành phần cơ giới từ nhẹ đến trung bình,
dung trọng 1,4 – 1,6, tỉ trọng 2,60 – 2,70, độ xốp trung bình <40%, sức chứa ẩm cực
đại 28 – 31%, phẩu diện đất thường có tầng kết von đá ong ở độ sâu hơn 50 cm.
Đất có phản ứng chua vừa đến rất chua ( pH 3,0 – 4,5 ), nghèo mùn ( < 1% ), độ
no baz và dung tích hấp thu thấp, nghèo các chất dinh dưỡng tổng số và dễ tiêu.
2.1.2.4 Đất xám mùn trên núi (Humicacrisols )
Diện tích: 3139285 ha, phân bố tập trung độ cao 700 - 1800m so với mặt nước
biển ở đại hình chia cắt, dốc nhiều, tầng đất thường không dày. Loại đất này phát triển
trong điều kiện khí hậu nhiệt đới ẩm vùng núi trung bình với nền nhiệt độ thấp và độ
ẩm cao hơn so với vùng đồi núi thấp hơn 700m.
Có hàm lượng chất hữu cơ cao, quá trình feralit yếu hẳn hiếm thấy hiện tượng kết
von, đá ong.
2.1.2.5 Đất xám feralit ( Ferralic Acrisols)
Diện tích: 141789500 ha. Đất hình thành trong điều kiện chia cắt, dốc nhiều, trên
sản phẩm phong hóa của đá mẹ giàu secquioxyt. Đất xám Feralit phân bố rộng, đặc
điểm rất đa dạng phụ thuộc nhiều vào vị trí đại lý, mẩu chất hình thành đất, môi trường

sinh thái sữ dụng đất.
Dung trọng thấp (0,96 – 1,26 g/cm3, tỉ trọng cao ( 2,73 – 2,80 g/cm3), xốp. Đất có
phản ứng chua ( pH 3,6 – 4,8), hàm lượng mùn trung bình, dung tích hấp thu trung
bình, nghèo cation tro đổi, độ no bazơ thấp, nghèo các chất dinh dưỡng dễ tiêu.

Chuyên nghành Vi Sinh Vật học

4

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

2.2 Sơ lược về chu trình nitơ, quá trình cố định đạm và vi khuẩn cố định đạm
2.2.1 Sơ lược về chu trình nitơ trong tự nhiên
Nitơ là một chất cần thiết cho sự sống, là thành phần của protein và acid nucleic
trong các tế bào động vật, thực vật và vi sinh vật. Khí nitơ chiếm nhiều nhất trong
không khí (79%) và là yếu tố dinh dưỡng giới hạn trong môi trường nước và trong các
loại đất nông nghiệp. Tuy nhiên, hầu hết các sinh vật lại không sử dụng được nếu
chúng không được chuyển thành ammonia.
Chu trình nitơ được tóm tắt bao gồm các quá trình cơ bản sau:
- Cố định đạm
- Đồng hóa đạm
- Khoáng hóa đạm
- Sự nitrate hóa
- Sự khử nitrate

Hình 1. Chu trình nitơ
(Nguồn: ngày 07/07/2012)

Chuyên nghành Vi Sinh Vật học

5

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

2.2.2 Quá trình cố định đạm
Quá trình cố định nitơ xảy ra bởi các tác nhân vật lý, hóa học hoặc sinh học.
Trong đó người ta quan tâm nhiều đến quá trình cố định đạm sinh học vì hiệu quả và
tính an toàn của nó đối với môi trường.
Quá trình cố định đạm sinh học là quá trình đồng hóa nitơ của không khí dưới
tác dụng của một số vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme nitrogenase hay nói
cách khác quá trình cố định nitơ phân tử là quá trình khử N2 thành NH3 dưới xúc tác
của enzyme nitrogenase khi có mặt ATP, trong đó nitrogenase được cấu tạo bởi hai
phần: Fe-protein có khối lượng khoảng 6,0x104 Dal và Mo-Fe-protein có khối lượng
phân tử khoảng 2,2x105 Dal theo sơ đồ phản ứng sau:
+

Nitrogenase

N2 + 6H + 6e

2NH3

NH3 sẽ kếp hợp với acid hữu cơ tạo thành protein.
NH3 + Acid hữu cơ

Amino acid

Protein

(Lê Văn Nhương et al., 2009)
2.2.3 Vi khuẩn cố định đạm.
Trong đất vi khuẩn thường tập trung xung quanh rễ cây. Rễ cây tác động đến sự
phát triển của vi sinh vật và ngược lại thực vật bị tác động bởi hoạt động của vi sinh
vật vùng rễ. Kết quả phân tích cho thấy dịch rễ cung cấp nguồn dinh dưỡng cho vi sinh
vật đất, kích thích sự gia tăng của một số vi sinh vật ở vùng rễ và ngăn cản sự sống của
những vi sinh vật khác. Một đặc tính quan trọng là dịch rễ có tỉ lệ C/N cao, điều này
quyết định đến sự phát triển dồi dào của vi sinh vật cố định đạm ở vùng rễ, mà vi sinh
vật này liên quan đến sự tăng trưởng, ngăn chặn bệnh cây và được xem là vi khuẩn
kích thích tăng trưởng thực vật (plant growth-promoting rhizobacteria-PGPR)
(Kloepper, 1994).
Một số vi sinh vật có khả năng cố định đạm trong đất như:
Azospirillum là vi khuẩn Gram âm, chuyển động và có dạng hình que ngắn, là
vi khuẩn cố định đạm thúc đẩy sự phát triển, tăng năng suất cây trồng, tổng hợp IAA,
hòa tan lân dạng khó tan và các chất dinh dưỡng khác (Bilal et al., 1990). Azospirillum
hiện diện ở trong rễ, vùng đất quanh rễ, thân và lá của cây trồng (Glick, 1995). Chúng
Chuyên nghành Vi Sinh Vật học

6

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

cũng được phân lập từ vùng rễ của nhiều loại cỏ, mía đường và ngũ cốc trên thế giới, ở
vùng khí hậu nhiệt đới cũng như ôn đới (Reinhold-Hurek et al., 1986).
Burk không đạmholderia là vi khuẩn Gram âm, dạng hình que ngắn, đường kính
khoảng 1µm, di chuyển nhờ các chiên mao ở đầu (Caballero-Mellado et al.,
2004). Đây là vi khuẩn sống cộng sinh với cây trồng, kích thích sự tăng trưởng của
cây, hiện diện trong vùng rễ và rễ của nhiều loại cây như: bắp, mía, cà phê, lúa (Chen
et al., 2006). Chúng sinh trưởng và phát triển trong điều kiện kỵ khí hoặc hiếu khí. Tuy
nhiên chúng phát triển tốt trong môi trường ít khí oxy.
Pseudomonas là vi khuẩn Gram âm, hình que, có chiên mao ở cực, có khả năng
di chuyển tốt trong nước, không có khả năng tạo bào tử, là vi khuẩn sống tự do (Chan,
1994).
Clostridium là vi khuẩn hình que, sinh bào tử, sống tự do trong đất và nước, có
thể sinh trưởng và phát triển trong điều kiện yếm khí (Lê Văn Nhương et al., 2009).
2.3 Sơ lược về chu trình lân, quá trình hòa tan lân và vi khuẩn hòa tan lân
2.3.1 Sơ lược về chu trình lân trong tự nhiên
Phosphate (Pi) được cây hấp thu từ đất, được động vật sử dụng khi chúng ăn
thực vật và được trả lại đất như một dạng cặn bã hữu cơ, sau đó sẽ được phân rã vào
trong đất. Hầu hết Pi được sử dụng bởi những sinh vật sống và chúng trở thành những
liên kết chặt chẽ trong những liên kết hữu cơ. Khi những vật liệu hữu cơ từ thực vật trả
lại đất thì những Pi hữu cơ này sẽ được phóng thích một cách chậm chạp như là Pi vô
cơ hoặc được liên kết chặt chẽ vào những vật liệu hữu cơ ổn định hơn và trở thành một
thành phần hữu cơ của đất. Sự phóng thích của những Pi vô cơ từ những Pi hữu cơ
được gọi là sự khoáng hóa (mineralization) và được vi sinh vật bẽ gãy những liên kết
hữu cơ. Hoạt động của vi sinh vật có hiệu quả cao là tùy thuộc vào nhiệt độ và độ ẩm

của đất (Busman et al., 2009).
Vi khuẩn có vai trò trung tâm trong chu trình lân diễn ra trong tự nhiên. Chu
trình oxi hóa và sự làm giảm hợp chất lân xảy ra thông qua sự dịch chuyển electron
một cách liên tục trong quá trình chuyển đổi số oxi hóa từ P(-3) sang P(+5) trong tự
nhiên. Mặc dù vi sinh vật tham gia vào quá trình oxi hóa khử (redox) của lân nhưng
những cơ chế sinh hóa và di truyền học của quá trình biến đổi đó hiện nay chưa được
tìm hiểu một cách rõ ràng (Ohtake et al., 1996).
Chuyên nghành Vi Sinh Vật học

7

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

Nuôi sống

Sự hô hấp tế

sinh vật dị

bào

thải

ra
Phân bón

Pi được hấp thu
bởi TV. Được
ổn định vào Pi
Nông nghiệp
Tảo, TV phù du
Khai thác
Pi trong đất

Pi dư thừa từ

Pi được phân
Sự hình thành

Một triệu năm

Hình 2. Chu trình lân trong tự nhiên
(Nguồn: ngày 20/07/2013;
(TV) Thực vật; (Pi) Phosphate)

2.3.2 Quá trình hòa tan lân của vi khuẩn
Một vài loài vi khuẩn có khả năng khoáng hóa và hòa tan lân hữu cơ và vô cơ
tương ứng (Hilda và Fraga, 2000). Cơ chế chủ yếu của sự hòa tan P vô cơ là hoạt động
tổng hợp acid hữu cơ của vi sinh vật và giảm pH đất (Kpomblekou và Tabatabai,
1994). Theo nghiên cứu của Halder et al., (1990) cho thấy những acid hữu cơ phân lập
từ Rhizobium leguminosarum hòa tan một lượng P tương đương với lượng được hòa
tan bởi chính vi khuẩn. Bên cạnh đó, việc xử lý phần nước lọc ra từ Rhizobium với
Chuyên nghành Vi Sinh Vật học

8

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

pepsin hoặc loại bỏ protein bởi việc tủa acetone thì không ảnh hưởng đến khả năng
giải phóng P. Tuy nhiên, trung hòa với NaOH sẽ phá hủy hoạt tính hòa tan.
Acid hữu cơ được phân lập từ Rhizobium leguminosarum cũng như Rhizobium
meliloti, Bacillus firmus, và một số loài vi khuẩn khác là acid α-ketogluconic. Nhưng
với vi khuẩn Pseudomonas sp, Erwinia herbicola và Burk không đạm hoderia cepacia
thì acid gluconic là acid hữu cơ chính được tạo để hòa tan lân. Một số acid khác như
acid glycolic, oxalic, malonic và succinic cũng được nhận diện trong số vi khuẩn hòa
tan lân (Illmer và Shinner, 1992).
Chất chelate và acid vô cơ được xem như cơ chế khác trong việc hòa tan lân.
Tuy nhiên hiệu quả và sự đóng góp của chúng để giải phóng lân ít hơn acid hữu cơ.
Sự phân hủy hợp chất lân hữu cơ phụ thuộc chủ yếu vào tính chất hóa lý và hóa
sinh của những phân tử này, chẳng hạn acid nucleic, phospholipids và đường
phosphate thì dễ dàng bị cắt, nhưng acid phytic, polyphosphate và phosphonate thì
được phân hủy chậm hơn nhiều (Ohtake et al., 1996). Sự khoáng hóa của những hợp
chất này được thực hiện bởi hoạt động của nhiều phosphatase (còn được gọi là
phosphohydrolase, phosphohydrolase gồm nhóm acid hoặc kiềm.). Những phản ứng
khử phosphoryl này liên quan đến sự thủy phân cầu nối phosphoester hoặc
phosphoanhydride. Acid phosphohydrolase, không giống phosphatase kiềm, hoạt động
xúc tác tối ưu ở giá trị pH từ acid đến trung tính. Hơn thế nữa, chúng còn được phân
nhóm thành acid phosphatase đặc hiệu hoặc không đặc hiệu, liên quan đến tính đặc
hiệu cơ chất của chúng. Phosphohydrolase đặc hiệu với những hoạt tính khác nhau bao
gồm 3’- nucleotidase và 5’- nucleotidase, hexose phosphatase và phytase. Một nhóm

đặt hiệu của enzyme giải phóng P có thể cắt cầu nối C-P từ phosphonate hữu cơ
(Ohtake et al., 1996).
Một vài phosphohydrolase được tiết ra bên ngoài màng sinh chất, chúng được
giải phóng dưới dạng hòa tan hoặc được giữ lại như protein liên kết màng. Sự định vị
này cho phép chúng hoạt động như enzyme loại bỏ phosphoester hữu cơ, thành phần
của trọng lượng phân tử lớn (như RNA và DNA) và không thể xuyên qua màng tế bào
chất. vật chất này đầu tiên có thể được chuyển thành thành phần trọng lượng phân tử
thấp, và quá trình này có thể xuất hiện một cách liên tục như là sự biến đổi của RNA
và DNA thành nucleoside monophosphate thông qua Rnase và Dnase, tiếp theo là giải

Chuyên nghành Vi Sinh Vật học

9

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

phóng P và sản phẩm hữu cơ thông qua phosphohydrolase, cung cấp cho tế bào những
chất dinh dưỡng cần thiết (Goldstein, 1994).
2.3.3 Vi khuẩn hòa tan lân
Trong đất, vi khuẩn hòa tan lân hiện diện với số lượng khác nhau. Chúng gồm
cả dòng hiếu khí và dòng kỵ khí, thường thấy dòng hiếu khí nằm trong đất (Sperberg,
1958). Mật độ của vi khuẩn hòa tan lân trong vùng rễ cao hơn so với đất ngoài vùng rễ
(Katzelson et al., 1962), và hiện diện ở vùng đất mát mẻ và ẩm thấp nhiều hơn ở vùng
đất khô hạn. Một số vi khuẩn hòa tan lân được phát hiện như:
Bacillus megaterium là vi khuẩn hình que, Gram dương, có khả năng hình thành

bào tử, di chuyển dễ dàng, là vi khuẩn yếm khí, và hình thành acid lactic.
Bacillus pumilus là vi khuẩn Gram dương, hiếu khí, hình que, có khả năng hình
thành bào tử do đó môi trường sống của Bacillus pumilus rất đa dạng. Tuy nhiên, trong
tự nhiên chúng phân bố chủ yếu trong đất và mô thực vật chết (Smibert và Kreig,
1994).
Paenibacillus là vi khuẩn Gram dương, yếm khí, có khả năng hình thành bào tử,
phân phối rộng rãi trong đất, nước, không khí, các vùng rễ cây… (Daane et al., 2002).
Nhiều dòng trong chi Paenibacillus có vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy sự tăng
trưởng của thực vật. Tăng cường sự phát triển của thực vật theo hai cơ chế: cơ chế trực
tiếp bao gồm hòa tan lân, cố định đạm, phân hủy các chất gây ô nhiễm môi trường và
sản xuất các hoormone; cơ chế gián tiếp bao gồm kiểm soát phytopatogens bằng cách
cạnh tranh các nguồn tài nguyên như sắt, axit amin và đường, cũng như sản xuất thuốc
khánh sinh (Bloemberg và Lugtenberg, 2001).
Acinetobacter là vi khuẩn Gram âm, sống hoại sinh, không sản xuất sắc tố,
được tìm thấy nhiều nơi trong đất, nước, sinh vật ngay cả trên da người (Barbe et al.,
2004).
Brevibacillus gồm cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương, hiếu khí, chuyển động
chậm, bào tử hình elip. Brevibacillus có khả năng sản xuất acid từ glycerol,
LArabinose, rhammose, ribose, và D-Fructose, chủ yếu là các acid béo (Keiichi Goto
et al., 2004).

Chuyên nghành Vi Sinh Vật học

10

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

2.4 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng phân vi sinh trong sản xuất nông nghiệp
2.4.1 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng phân vi sinh trên thế giới
Thế giới đã có nhiều nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật cố định đạm, hòa tan
lân trên cây trồng. Trong đó nhiều nghiên cứu cho thấy việc sử dụng phân sinh học có
chủng vi khuẩn cố định đạm và hòa tan lân có thể thay thế một lượng phân hóa học
đáng kể.
Sản phẩm phân bón vi sinh cố định nitrogen tự do từ vi khuẩn Azotobacter và
Clostridium đã được sản xuất tại Mỹ, Autralia và sử dụng nhiều nơi trên thế giới với
tên gọi E.2001. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của sản phẩm E.2001 có tác dụng tốt
trong việc nâng cao năng suất rau, trong đó mức độ tăng có thể từ 33,33% đến 56% tùy
từng loại rau. E.2001 có tác dụng làm giảm đáng kể tỷ lệ bệnh do nấm và vi khuẩn gây
nên như bệnh héo xanh, thối đen rễ, lở cổ rễ (Lê Văn Nhương et al., 2009).
Theo Gaur (1992) nhiều kết quả nghiên cứu khoa học đã chứng minh ở Liên
Xô, năng suất cây trồng tăng 5-10% và có trường hợp tăng 30% khi sử dụng vi sinh vật
hòa tan lân; hiệu quả này ở Ấn Độ tương ứng là 10-20% tương đương với bón P2O5
một lượng 50 kg/ha. Kết quả nghiên cứu mới nhất ở Canada và Ấn Độ cho thấy: vi
sinh vật phân giải lân có thể thay thế 50-75% lượng lân cần bón bằng quặng phosphate
có hàm lượng P2O5 tổng số tương đương mà năng suất và chất lượng nông sản không
thay đổi. Ngoài tác dụng phân giải phosphate khó tan, vi sinh vật phân giải lân còn có
khả năng sản sinh các chất kích thích sinh trưởng thực vật giúp cây trồng phát triển và
chống chịu tốt hơn đối với các điều kiện bất lợi ngoại cảnh hoặc sinh tổng hợp chất
kháng sinh góp phần kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật gây bệnh
vùng rễ cây trồng.
2.4.2 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng phân vi sinh trong nước
Sản phẩm Dasvila của công ty Dasco chứa hai chủng vi khuấn Azospillium sp,
Pseudomonas sp có tác dụng cố định đạm và hòa tan lân khó tiêu cung cấp cho cây
lúa. Vi khuẩn cộng sinh với cây lúa tạo ra kích thích tố tăng trưởng IAA (Indol-3acetic
acid), Cytokinins, Auxin, Gibberelin.

Theo nghiên cứu của Cao Ngọc Điệp (2011), ứng dụng vi khuẩn
Gluconacetobacter diazotrophicus và Pseudomonas stutzeri với công thức bón 500kg
phân sinh học/ha – 103,5 N – 80 P2O5 kg/ha cho năng suất mía cây tương đương với
Chuyên nghành Vi Sinh Vật học

11

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

mía bón 207 N - 160 P2O5 kg/ha nhưng trữ lượng đường và tổng lượng đường/ha cao
hơn cây mía chỉ bón phân hóa học (207 N - 160 P2O5 kg/ha) một cách rất có ý nghĩa.
Như vậy việc bón 500 kg/ha phân sinh học cho cây mía không những tiết kiệm được
103,5 N - 80 P2O5 kg/ha mà còn thu lợi cao nhất trong canh tác mía đường.

Chuyên nghành Vi Sinh Vật học

12

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm
Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi Sinh Vật môi trường và
phòng thí nghiệm Vi Sinh Vật đất thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ
Sinh học, trường Đại học Cần Thơ.
Thời gian thực hiện từ tháng 8/2013 đến tháng 11/2013.
3.2 Phương tiện thí nghiệm
3.2.1 Vật liệu thí nghiệm
Mẫu đất vùng rễ của cây bắp ở đất xám tỉnh Bình Dương một mẫu và bảy mẫu
đất lấy tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu
Mỗi mẫu lấy 100g đất ( cách vùng rễ 0,8mm) được trữ nhiệt độ phòng, tránh
ánh mặt trời sau đó đem về Cần Thơ.
3.2.2 Dụng cụ và trang thiết bị
- Đĩa petri, ống nghiệm, que cấy, que gạt thủy tinh, bình tam giác, lam,
lamen…
- Máy chụp hình Canon SX160is (Nhật).
- Kính hiển vi Olympus CH2 (Nhật).
- Cân điện tử Sartorius (Đức).
- pH kế Orion 420A (Hoa Kỳ).
- Tủ cấy vi sinh vật (Pháp).
- Tủ ủ vi sinh vật (Đức).
- Tủ lạnh giữ mẫu.
- Máy lắc mẫu GFL 3005 (Đức)
- Bộ micropipet Gibson P10, P20, P50, P200, P1000 (Đức).
- Nồi khử trùng nhiệt ướt Pbinternational (Đức).
- Lò vi sóng Panasonic (Thái Lan).

Chuyên nghành Vi Sinh Vật học

13

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013

Trường ĐHCT

3.2.3 Hóa chất
3.2.3.1 Các hóa chất sử dụng để xác định hàm lượng đạm
Bảng 1: Thành phần môi trường Burk không đạm (Park et al., 2005) dùng
để phân lập vi khuẩn cố định đạm.
Hóa chất

Khối lượng (g/l)

D-Glucose

10

KH2PO4

0,41

K2HPO4

0,52

NaCl

0,05

CaCl2

0,2

MgSO4.7H2O

0,1

FeSO4.7 H2O

0,005

NaMoO4.2 H2O

0,0025

Agar

20

Sau đó chỉnh pH môi trường về 7,0.
Dung dịch EDTA (C10H14N2O8Na2.2H2O - Ethylene diamine tetraacetic acid
disodium salt) hòa tan 6g EDTA với 100ml nước khử khoáng.
Dung dịch phenol-sodium nitroprusside dehydrate: hòa tan 7g phenol (C6H5OH)
và 0,034g sodium nitroprusside dehydrate (Na2Fe(CN)5NO.2H2O) thêm nước đủ
100ml, dung dịch này được bảo quản lạnh.
Dung dịch Sodium hypochloride: hòa tan 4,98g Na2HPO4; 1,48g NaOH và 20ml
NaClO thêm nước đủ 100ml.

Dung dịch đạm chuẩn N_NH4+ 1 mg/l.

Chuyên nghành Vi Sinh Vật học

14

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học