khảo sát lý hóa tính và mật số vi khuẩn cố định đạm, vi khuẩn hòa tan lân trong đất xám trồng bắp ở miền đông nam bộ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC






LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC




KHẢO SÁT LÝ HÓA TÍNH VÀ MẬT SỐ
VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM, VI KHUẨN HÒA TAN LÂN
TRONG ĐẤT XÁM TRỒNG BẮP Ở MIỀN
ĐÔNG NAM BỘ







CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
GS.Ts CAO NGỌC ĐIỆP LÝ HOÀNG THÂN
MSSV: 3102864
LỚP: CNSH K36

Cần Thơ, Tháng 11/2013




PHẦN KÝ DUYỆT




CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

Cao Ngọc Điệp Lý Hoàng Thân


XÉT DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN







Cần Thơ, Ngày tháng năm 2013.
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

LỜI CẢM TẠ


Đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến cha mẹ - những người đã có
công sinh thành, nuôi dưỡng và dạy dỗ con đến ngày hôm nay.
Chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo cùng tất cả quý thầy cô Viện Nghiên cứu và
Phát triển Công nghệ Sinh học đã tạo điều kiện cho em học tập, nghiên cứu, trao dồi
kiến thức trong 4 năm qua.
Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy hướng dẫn – GS. Ts Cao Ngọc Điệp đã
dìu dắt, tận tâm chỉ dẫn trong suốt thời gian học tâp cũng như trong quá trình thực
hiện thí nghiệm và viết luận văn.
Cám ơn chị Trần Thị Giang – cán bộ phòng thí nghiệm và các anh, chị, em
trong phòng thí nghiệm Vi sinh vật môi trường – Viện Nghiên cứu và Phát triển Công
nghệ Sinh học cùng tất cả các bạn lớp Công nghệ Sinh học K36 đã nhiệt tình giúp đỡ,
động viên và cho tôi những lời khuyên bổ ích trong thời gian học tập cũng như lúc
thực hiện luận văn.
Cuối lời, xin kính chúc Cha Mẹ, quý Thầy Cô và các anh chị dồi dào sức khoẻ,
thành công và hạnh phúc, chúc tất cả các bạn lớp Công nghệ Sinh học K36 đều hoàn
thành luận văn xuất sắc.

i

TÓM LƯỢC

Khảo sát một số lý hóa tính đất bao gồm các chỉ tiêu pH, hàm lượng chất hữu
cơ, lân hữu dụng, đạm tổng số nhằm hiểu thêm về thổ nhưỡng về vùng đất ở Đông

Nam Bộ. Kiểm tra mật số 2 loài vi khuẩn có ích là vi khuẩn hòa tan lân và vi khuẩn cố
định đạm có trong đất xám trồng bắp tại các tỉnh: Tây Ninh, Đồng Nai, Bà Rịa- Vũng
Tàu, Bình Phước. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, đếm mật số vi khuẩn
trong 24 mẫu đất được lặp lại 3 lần bằng phương pháp đếm sống nhỏ giọt. Sau kết
quả khảo sát thấy 2 loài vi khuẩn có ích hiện diện trong đất trồng bắp ở Đông Nam
Bộ với mật số cao, có tiềm năng khai thác loài vi khuẩn bản địa làm phân sinh học là
rất lớn.Kiểm tra sự tương quan giữa mật số 2 loài vi khuẩn với các chỉ tiêu hóa lý của
đất, cho thấy một số chỉ tiêu đất có tương quan với mật số 2 loài vi khuẩn trên. Mật số
vi khuẩn cố định đạm và pH (r =0,724*), chất hữu cơ trong đất (r =0,651*), đạm tổng
số (r =0,491*). Vi khuẩn hòa tan lân với pH (r =0,692*) và chất hữu cơ (r =0,412*).
Ngoài ra sự tương quan của các chỉ tiêu khác như lân hữu dụng, đạm tổng số với mật
số vi khuẩn không có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê ở mức 5%.
Từ khóa: đạm tổng số, đếm sống nhỏ giọt, hệ số tương quan, lân hữu dụng, vi khuẩn
cố định đạm, vi khuẩn hòa tan lân












ii

MỤC LỤC
PHẦN KÍ DUYỆT

LỜI CẢM TẠ
TÓM TẮT i
MỤC LỤC … ii

DANH SÁCH BẢNG V
DANH SÁCH HÌNH VI
TỪ VIẾT TẮT………… …………… ……………………………………………VII
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu đề tài 1
CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2
2.1. Sơ lược về cây Bắp 2
2.1.1. Đặc điểm hình thái 2
2.1.2. Đặc điểm sinh trưởng của cây bắp 2
2.1.3. Tình hình trồng bắp ở nước ta 3
2.2. Sơ lược về đất ở Đông Nam Bộ 3
2.3. Quá trình cố định đạm sinh học 4
2.3.1. Quá trình cố định đạm (cố định nitơ phân tử) 4
2.3.2. Các loài vi sinh vật tham gia quá trình cố định đạm 5
2.4. Quá trình chuyển hóa lân trong đất 8
2.4.1. Đối với lân hữu cơ 8
2.4.2. Đối với lân vô cơ 9
2.4.2.1. Sự chuyển hóa lân ở đất chua 9
2.4.2.2. Sự chuyển hóa lân ở đất kiềm 10
2.4.3. Các vi sinh vật chuyển hóa lân 10
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 12
iii

3.1.1. Thời gian nghiên cứu 12

3.1.2. Địa điểm nghiên cứu 12
3.2. Nguyên vật liệu nghiên cứu 12
3.3. Phương tiện nghiên cứu 12
3.3.1. Thiết bị 12
3.3.2. Dụng cụ thí nghiệm 12
3.3.3. Hóa chất 13
3.4. Phương pháp nghiên cứu 14
3.4.1. Thí nghiệm đo đạt một số chỉ tiêu chất lượng đất 14
3.4.2. Khảo sát mật số vi khuẩn cố định đạm và vi khuẩn hòa tan lân 14
3.4.3. Xác định mật số vi sinh vật bằng phương pháp đếm sống nhỏ giọt
(Drop plate count) (Hoben và Somasegaran, 1982) 15
3.4.3. Xác định độ ẩm 16
3.4.4. Phương pháp xử lý số liệu 17
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18
4.1. Các chỉ tiêu hóa lý của các mẫu đất xám trồng bắp ở Đông Nam Bộ 18
4.1.1. Kết quả đo lân hữu dụng, chất hữu cơ và pH trong các mẫu đất 18
4.1.2. Kết quả đo hàm lượng đạm tổng số 19
4.2. Kết quả khảo sát mật số vi khuẩn cố định đạm và vi khuẩn hòa tan lân
trong đất xám ở Đông Nam Bộ 20
4.2.1. Mật số vi khuẩn cố định đạm 20
4.2.2. Mật số vi khuẩn hòa tan lân 21
4.3. Kiểm tra sự tương quan giữa mật số vi khuẩn cố định đạm, vi khuẩn
hòa tan lân với một số chỉ tiêu hóa lý của đất 22
4.3.1. Tương quan giữa mật số vi khuẩn cố định đạm với các chỉ tiêu hóa lý
của đất. 22
4.3.1.1. Tương quan mật số vi khuẩn cố định đạm và pH 22
4.3.1.2. Tương quan mật số vi khuẩn cố định đạm và đạm tổng số 24
iv

4.3.1.3. Tương quan mật số vi khuẩn cố định đạm và chất hữu cơ 25

4.3.1.4. Tương quan mật số vi khuẩn cố định đạm và lân hữu dụng 27
4.3.2. Tương quan giữa mật số vi khuẩn hòa tan lân với các chỉ tiêu hóa lý
của đất. 28
4.3.2.1. Tương quan giữa mật số vi khuẩn hòa tan lân với pH 28
4.3.2.2. Tương quan giữa mật số vi khuẩn hòa tan lân với đạm tổng số 29
4.3.2.3. Tương quan giữa mật số vi khuẩn hòa tan lân với chất hữu cơ 30
4.3.2.4. Tương quan giữa mật số vi khuẩn hòa tan lân với lân hữu dụng 31
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 32
5.1. Kết luận 32
5.2. Đề nghị 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO 33
PHỤ LỤC














v

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1: Các loại đất chính ở vùng Đông Nam Bộ 4
Bảng 2: Kết quả đo lân hữu dụng, chất hữu cơ và pH………………………………19























vi

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1: Cây bắp 2

Hình 2: Vi khuẩn Sinorhizobium meliloti 6
Hình 3: Vi khuẩn Rhizobium và nốt sần rễ 6
Hình 4: Vi khuẩn Azotobacter sp. 8
Hình 5: Vi khuẩn Clostridium sp. 8
Hình 6: Vi khuẩn Bacillus megaterium 11
Hình 7: Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens 11
Hình 8: Pha loãng và nhỏ giọt trong phương pháp đếm sống nhỏ giọt 16
Hình 9: Hàm lượng đạm tổng trong các mẫu đất khảo sát……………………… 20
Hình 10: Mật số vi khuẩn cố định đạm trong các mẫu đất khảo sát……………… 21
Hình 11: Mật số vi khuẩn hòa tan lân trong các mẫu đất khảo sát………………… 22
Hình 12: Tương quan mật số vi khuẩn cố định đạm với pH…………………… 23
Hình 13: Tương quan mật số vi khuẩn cố định đạm với hàm lượng đạm tổng số ….24
Hình 14: Tương quan mật số vi khuẩn cố định đạm với hàm lượng chất hữu cơ ….25
Hình 15: Tương quan mật số vi khuẩn cố định đạm với hàm lượng lân hữu dụng …26
Hình 16: Tương quan mật số vi khuẩn hòa tan lân với pH………………………… 27
Hình 17: Tương quan mật số vi khuẩn hòa tan lân với chất hữu cơ…………………28


vii

TỪ VIẾT TẮT

cfu: Colony Forming Unit


VK: Vi khuẩn

Cđđ: cố định đạm

ĐNB: Đông Nam Bộ

TQ: Tương quan
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 -2013

Trường ĐHCT



Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU

1.1. Đặt vấn đề

Đạm và lân là 2 nguyên tố đa lượng thiết yếu cho sự sinh trưởng và phát triển
của cây trồng. Tuy nhiên, 2 nguyên tố này hiện diện trong đất với hàm lượng thấp, đặc
biệt đối với lân tồn tại ở dạng khó tan, trong đá hay trầm tích (Goldstein, 1994) cây
không sử dụng được.
Ở Việt Nam hiện nay phân bón được sử dụng chủ yếu trong nông nghiệp là
phân hóa học, việc lạm dụng nhiều phân bón hóa học đã gây ra những vấn đề về ô
nhiễm môi trường, làm đất bị hoang hóa, mất cân bằng dinh dưỡng, mất khả năng
canh tác, làm chết vi sinh vật có ích.
Vì vậy, để cùng phát triển nông nghiệp bền vững đồng thời bảo vệ môi trường,
việc sử dụng phân vi sinh có các vi khuẩn có lợi như vi khuẩn cố định đạm và hòa tan
lân, đang là 1 trong những lựa chọn nhằm cải tạo đất nông nghiệp. Tuy nhiên việc sử
dụng phân sinh học là sử dụng những vi sinh vật sống nên cũng có những điều cần
quan tâm để hiệu quả cải tạo cao như: hàm lượng chất hữu cơ trong đất, chỉ số pH,

đạm tổng số,…
Đất vùng Đông Nam Bộ do tập quán canh tác cũng như những điều kiện khí
hậu, thổ nhưỡng càng làm nhanh quá trình bạc màu của đất. Vì vậy, để tìm hiểu rõ
hơn vùng đất Đông Nam Bộ về tiềm năng vi sinh vật có ích bản địa nên đề tài được
thực hiện.
1.2. Mục tiêu đề tài
Xác định mật số vi khuẩn cố định đạm, hòa tan lân trong đất vùng rễ bắp của
các tỉnh Đông Nam Bộ.




Luận văn tốt nghiệp Đại Học khóa 36-2013

Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

2


Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1. Sơ lược về cây Bắp

2.1.1. Đặc điểm hình thái
Cây bắp (Zea mays L.) thuộc họ Hòa Thảo, là loại cây hằng niên, thân bắp
thẳng, có nhiều lóng, thường cao 2–3m, lá hình mũi mác rộng bản, dài 50–100cm và

rộng 5–10cm, các lá tỏa ra từ mỗi mấu với bẹ nhẵn.


Hình 1: Cây bắp
(*nguồn: www.agrilong.com, ngày 22/11/2013)
Các bắp là các cụm hoa cái hình bông, được bao bọc trong một số lớp lá. Râu
bắp là các núm nhụy thuôn dài ban đầu màu xanh lục và sau đó chuyển dần sang màu
hung đỏ hay hung vàng.

Trên đỉnh là cụm hoa hình chùy chứa các hoa đực.

Hạt bắp
với vỏ quả hợp nhất với lớp áo hạt, là kiểu quả thông thường ở họ Hòa thảo.
2.1.2. Đặc điểm sinh trưởng của cây bắp
Thời gian sinh trưởng tính từ lúc này mầm đến khi thu hoạch khoảng 70 đến
100 ngày tùy giống, điều kiện ngoại cảnh và thời vụ.
Sự phát triển có thể chia làm 2 giai đoạn: sinh trưởng dinh dưỡng tính từ lúc
nảy mầm, sinh trưởng sinh sản từ lúc xuất hiện hoa cái đến thu hoạch. Nắm được qui
luật sinh trưởng và phát triển của cây bắp có thể chủ động áp dụng các biện pháp kĩ
thuật theo hướng có lợi nhất cho quá trình sinh trưởng và phát triển để tạo được năng
suất cao.
Luận văn tốt nghiệp Đại Học khóa 36-2013

Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

3

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

2.1.3. Tình hình trồng bắp ở nước ta
Bắp là cây lương thực đứng thứ 2 sau lúa gạo nhưng vẫn chưa được chú trọng
nhiều do truyền thống canh tác lúa nước (Ngô Hữu Tình, 2009).

Sản lượng bắp ngày
càng tăng, năm 2012 đạt 4,81 triệu tấn, tăng nhẹ so với năm 2011 (4,65 triệu tấn).
Diện tích trồng bắp năm 2012 đạt 1,12 triệu ha, cao hơn so với năm 2011 (1,08 triệu
ha). (nguồn: www.agroviet.gov.vn/Lists/appsp01_statistic/ /Baocao, ngày
23/7/2013).
Tuy nhiên sản lượng trên vẫn chưa đáp ứng đủ nhu cầu trong nước để sản xuất
thức ăn chăn nuôi, thực phẩm và 1 phần sản xuất bia.
2.2. Sơ lược về đất ở Đông Nam Bộ
Vùng Đông Nam Bộ gồm các tỉnh, thành phố: Tây Ninh, Bình Dương, Bình
Phước, Đồng Nai, TP Hồ Chí Minh và Bà Rịa- Vũng Tàu, diện tích tự nhiên khoảng
2,34 triệu ha.
Trong phạm vi của vùng, hai nhóm đất có diện tích lớn nhất là đất xám chiếm
44 % tổng quỹ đất của vùng, nhóm đất đỏ vàng chiếm 32 % trong đó đất đỏ bazan
chiếm 215 nghìn ha (chiếm 29 %, của nhóm đất đỏ vàng). Các nhóm đất khác như đất
cát, đất mặn, đất phèn… chiếm 14 %.
 Nhóm đất xám có tổng diện tích 1.038 nghìn ha, phân bố chủ yếu ở các
tỉnh, thành: TP Hồ Chí Minh, Đồng Nai, Bà Rịa-Vũng Tàu, Tây Ninh và Bình Phước.
Đất xám có các loại: Xám bạc màu trên phù sa cổ, xám bạc màu glây trên phù sa cổ và
xám bạc màu phát triển trên sản phẩm phong hóa của đá macma axit và đá cát.
 Đất đen nhiệt đới có diện tích là 49 nghìn ha, phân bố chủ yếu ở tỉnh
Đồng Nai, Bà Rịa- Vũng Tàu. Đất có chất lượng khá tốt, thích hợp cho những loại
cây: bắp, đậu đỗ, mía và các loại cây ăn quả, bao gồm các loại đất: Đất nâu tím trên đá
macma bazơ và trung tính, đất nâu đỏ trên đá macma bazơ và trung tính, đất nâu vàng
trên đá macma bazơ và trung tính, đất đỏ vàng trên đá sét và biến chất, đất vàng đỏ

trên đá macma axit, đất vàng nhạt trên đá cát và đất nâu vàng trên phù sa cổ.



Luận văn tốt nghiệp Đại Học khóa 36-2013

Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

4


Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Bảng 1: Các loại đất chính ở vùng Đông Nam Bộ.
Nhóm đất
Diện tích

(ha)
Đất phù sa 131.000

Đất xám bạc màu trên phù sa cổ. 873.000

Đất xám bạc màu glây trên phù sa cổ. 46.000

Đất xám
Đất xám bạc màu trên sản phẩm phong hóa của đá
macma acid, đá cát.
119.000

Đất nâu tím trên đá macma bazo và trung tính. 831

Đất nâu đỏ trên đá macma bazơ và trung tính 215.000

Đất nâu vàng trên đá macma bazơ và trung tính 152.000

Đất đỏ vàng trên đá sét và đá biến chất 109.000

Đất vàng đỏ trên đá macma acid 53.000

Đất vàng nhạt trên đá cát 7.600

Đất đen nhiệt đới

Đất nâu vàng trên phù sa cổ 207.000

(*nguồn: 23/7/2013)
2.3. Quá trình cố định đạm sinh học
2.3.1. Quá trình cố định đạm (cố định nitơ phân tử)
Quá trình cố định nitơ phân tử (N) là quá trình đồng hóa nitơ của không
khí thành đạm amon dưới tác dụng của một số vi sinh vật có enzyme nitrogenase.
Nguồn nitơ dự trữ nhiều nhất trong tự nhiên là nguồn khí nitơ tự do (N
2
) trong khí
quyển. Chúng chiếm tỉ lệ rất cao trong không khí (78%) (Dobereiner, 1987). Tổng số
nitơ trong cả khí quyển tới 41,015 tấn. Trong khí nitơ, hai nguyên tử nitơ liên kết với
nhau bằng 3 liên kết rất bền vững. Năng lượng của 3 liên kết này cao tới 225kcal/M.
Chính vì vậy mà N
2

rất khó kết hợp với nguyên tố khác. Muốn phá vỡ 3 liên kết này,
người ta cần phải sử dụng những năng lượng rất lớn. Chẳng hạn ở nhà máy phân đạm
hóa học, muốn làm cho nitơ liên kết được với hidro để tạo thành NH
3
người ta phải
dùng một nhiệt độ là 500
o
C và một áp suất cao tới 350atm (Nguyễn Lân Dũng et al.,
2008).
Luận văn tốt nghiệp Đại Học khóa 36-2013

Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

5


Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Trong khi đó vi sinh vật dưới sự trợ giúp của enzyme nitrogenase có thể phá vỡ
3 liên kết của phân tử nitơ một cách dễ dàng ngay trong điều kiện bình thường về
nhiệt độ và áp suất. Có thể nói quá trình cố định nitơ phân tử là quá trình khử N
2
thành
NH
3
được xúc tác bởi enzyme nitrogenase và sự hiện diện của ATP.
2.3.2. Các loài vi sinh vật tham gia quá trình cố định đạm
 Vi sinh vật cố định đạm cộng sinh

Các vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh được gọi chung là Rhizobium chúng thuộc
bộ Rhizobiales, bao gồm 12 chi và 57 loài. Có 5 chi quan trọng trong nông nghiệp nhờ
đặc tính cộng sinh trên cây (Phạm Văn Kim, 2000):
 Rhizobium (họ Rhizobiaceae): Các loài quan trọng gồm R. arachis (cộng sinh
trên đậu phộng), R. etli (cộng sinh trên các loại đậu), R. gallicum (cộng sinh trên các
loại đậu), R. hainanense (cộng sinh trên các loài đậu nhiệt đới), R. huautlense (cộng
sinh trên điền thanh), R. indigoferae (cộng sinh trên cây chàm indigo),
R.leguminosarum (cộng sinh trên các loại đậu), R. phaseoli (cộng sinh trên các loại
đậu ve, đậu xanh).
 Bradyrhizobium (họ Bradyrhizobiaceae): Các loài quan trọng gồm B. betae
(cộng sinh trên củ cải đường), B. canariense (cộng sinh trên các cây họ đậu, chịu được
đất chua), B. japonicum (cộng sinh trên đậu nành), B. lupine (cộng sinh trên đậu
lupin).
 Mesorhizobium (họ Phyllobacteriaceae): Các loài quan trọng gồm M. huakuii,
M. septentrionale và M. temperatum (cộng sinh trên các loại đậu đồng cỏ), M. loti
(cộng sinh trên sen), M. amorphae, M. mediterraneum và M. tianshanense (cộng sinh
trên đậu chickpea), M. plurifarium (cộng sinh trên các loài keo).
 Sinorhizobium (họ Rhizobiaceae): Các loài quan trọng gồm S. abri (cộng sinh
trên các loại đậu nhiệt đới, điên điển), S. americanus và S. terangae (cộng sinh trên
các loài keo), S. aroris (cộng sinh trên các loại đậu của Phi châu), S. medicae và
S. meliloti (cộng sinh trên cỏ alfalfa), S. saheli (cộng sinh trên thân điên điển, điền
thanh), S. xinjiangense (cộng sinh trên các loại đậu ở Trung Quốc).
Luận văn tốt nghiệp Đại Học khóa 36-2013

Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

6

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

 Azorhizobium (họ Hyphomicrobiaceae): Các loài quan trọng gồm
A.caulinodans (cộng sinh trên rễ và thân điền thanh, điên điển), A. johannae (cộng
sinh trên đậu, điền thanh, điên điển).
Hình 2: Vi khuẩn Sinorhizobium meliloti
Hình 3: Vi khuẩn Rhizobium và nốt sần rễ
(*nguồn: en.wikipedia.org, ngày 22/11/2013)
 Vi sinh vật cố định đạm không cộng sinh
Vi khuẩn Azospirillum là một loại vi khuẩn cố định đạm hiện diện trong rễ,
vùng đất quanh rễ, thân và lá cây. Chúng sống trong đất hay cộng sinh với rễ của các
loại ngũ cốc, cỏ và cây có củ. Đây là loài vi khuẩn được nghiên cứu và ứng dụng
nhiều vì ngoài khả năng cố định nitơ chúng còn có thể tiết ra những kích thích tố tăng
trưởng như IAA (Indole-3-acetic acid), IBA (Indole-3-butyric acid), ABA (Abscisic
acid) và cytokynins (Bashan và Levanony, 1990). Những thí nghiệm ở Mỹ cho thấy
Azospirillum có thể thay thế được 40kg N/ha/năm (Smith et al., 1978). Ở Brazil,
Azospirillum lipoferum có thể cung cấp cho bắp 2kg nitơ mỗi ngày. Ở Thái Lan,
những thí nghiệm trên bắp năm 1984 – 1985 cho thấy sản lượng bắp tăng 15 – 35%
Luận văn tốt nghiệp Đại Học khóa 36-2013

Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

7


Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

(Vasuvat et al., 1986)… Ở Việt Nam, thí nghiệm của Nguyễn Thị Phương Tâm (2006)
ở Cù Lao Dung, Sóc Trăng cũng cho thấy dòng vi khuẩn Azospirillum lipoferum
HA28 làm tăng năng suất 6,6 lần so với đối chứng không bón đạm, không chủng vi
khuẩn.
 Vi khuẩn Azotobacter. Năm 1901, Beyjeirick đã phân lập được từ đất một loài vi
sinh vật có khả năng cố định nitơ phân tử cao, ông đặt tên cho loài này là Azotobacter.
 Vi khuẩn Beyjerinckii. Nhà bác học Ấn Độ Stacke (1893) đã phân lập được một
loài vi khuẩn ở ruộng lúa nước pH rất chua có khả năng cố định nitơ phân tử và ông
đặt tên là vi khuẩn Beyjerinckii.
 Vi khuẩn Clostridium. Loài vi khuẩn này được Vinogratxkii (1939) phân lập đầu
tiên (Lê Xuân Phương, 2005).
 Ngoài các vi khuẩn trên, còn có rất nhiều loài có khả năng cố định nitơ sống tự
do như:
+ Xạ khuẩn: Một số loài thuộc giống Streptomyces, Actinomyces, Frankia,
Nocardia, Actinopolyspora, Actinosynoema…
+ Các vi khuẩn quang tổng hợp: Chromatium, Rhodomicrobium,
Rhodopseudomonas, Rhodospirillum…
Các tảo lam: Anabaena, Anabaenapsis, Calothris, Nostoc, Tolvcothrix… (Phạm
Văn Kim, 2000).
Luận văn tốt nghiệp Đại Học khóa 36-2013

Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

8


Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Hình 4: Vi khuẩn Azotobacter sp.
Hình 5: Vi khuẩn Clostridium sp.
(*nguồn: microbewiki.kenyon.edu,ngày 22/11/2013)
2.4. Quá trình chuyển hóa lân trong đất
2.4.1. Đối với lân hữu cơ
Trong đất có nhiều loài vi sinh vật khoáng hóa lân hữu cơ. Các sinh vật này tiết
enzyme khử phosphoryl đồng thời giải phóng ion phosphate, phản ứng enzyme nhanh
khi hợp chất lân hữu cơ vừa mới bón vào đất sau đó chậm lại khi lân đã bị cố định.
Lân sẽ tạo phức liên kết với Fe, Al, các hợp chất hữu cơ phân tử lượng cao và bị dính
chặt trên các phần tử sét.

Luận văn tốt nghiệp Đại Học khóa 36-2013

Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

9


Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Tốc độ phân giải lân phụ thuộc vào các yếu tố sau:
Bản chất các hợp chất hữu cơ có lân: Acid nucleic dễ khoáng hóa hơn phytil.
Nguyên nhân là do hầu hết vi sinh vật khoáng hóa lân hữu cơ điều tiết enzyme phân
giải acid nucleic.
Nếu lượng C/P cao hơn 300, lân sẽ bị các vi sinh vật trong đất cố định, còn ở
mức C/P nhỏ hơn 200 thì lân sẽ được khoáng hóa (Lê Phước Thạnh, 2011).
pH tối ưu 6-7. Ở môi trường kiềm lân vô cơ được phóng thích nhanh hơn lân
hữu cơ.

Nhiệt độ cao cũng thuận lợi cho việc khoáng hóa lân hữu cơ, thích hợp là từ
45-50
o
C. Do đó, mùa hè tốc độ khoáng hóa lân nhanh hơn các mùa khác.
2.4.2. Đối với lân vô cơ
Sự tồn tại các loại ion phosphate tùy thuộc vào pH đất. Do vậy thực tế trong
đất, lân tồn tại chủ yếu ở 2 dạng: H
2
PO
4
-
và HPO
4
2-
H
2
PO
4
-
HPO
4
2 -
PO
4
3-

Dung dịch acid dung dịch kiềm
Ở pH=7 tỷ lệ 2 ion này bằng nhau. H
2
PO

4
-
dễ đồng hóa hơn HPO
4
2-
, nên về mặt
lý thuyết ở pH= 5-6 dinh dưỡng lân của cây thuận lợi nhất. Song trong đất còn có
nhiều ion khác nên quá trình chuyển hóa lân cũng rất phức tạp.
2.4.2.1. Sự chuyển hóa lân ở đất chua
Trong đất chua nghèo chất hữu cơ: ion Fe, Al và Mn thường nằm dưới dạng
hòa tan phản ứng H
2
PO
4
-
, tạo thành hợp chất không tan, cây không sử dụng được.
Al
3-
+ H
2
PO
4
-
+H
2
O 2H
+
+Al(OH)
3
. H

2
PO
4

Không tan
Ở các loại đất rất chua thì quá trình này càng diễn ra mạnh khiến H
2
PO
4
-
chỉ
còn lượng rất nhỏ trong đất.
Trong môi trường chua còn 2 quá trình cố định lân liên quan đến sét. Đó là do
sự tồn tại các ion OH- trên bề mặt khoáng sét.
Sét - OH + Ca(H
2
PO
4
)
2
sét - H
2
PO
4
-
+ 1/2Ca(OH)
2

Khả năng cố định thay đổi theo bản chất khoáng vật của keo sét theo thứ tự:
Illit > Kaolinit >Montmorillonit.

Luận văn tốt nghiệp Đại Học khóa 36-2013

Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

10


Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

2.4.2.2. Sự chuyển hóa lân ở đất kiềm
Trong môi trường kiềm giàu Ca, ion H
2
PO
4
-
phản ứng mạnh với Ca tạo các hợp
chất ít tan theo các phản ứng lần lượt sau (Võ Thị Lài, 2006):
Ca(H
2
PO
4
)
2
+ CaCO
3
+ H
2
O 2CaHPO

4
.2H
2
O +H
2
O
6CaHPO
4
.2H
2
O + 2CaCO
3
+ H
2
O Ca
8
H
2
(PO
4
)
6
.5H
2
O + 2CO
2

Ca
8
H

2
(PO
4
)
6
.5H
2
O + CaCO
3
Ca
3
(PO
4
)
2
+ CO
2
+ 6H
2
O
Lân trở nên kém hòa tan hơn nếu gặp các điều kiện thuận lợi và đủ thời gian
để Ca
3
(PO
4
)
2
có thể chuyển thành các hợp chất không tan như: hydroxyl, carbon và có
thể fluoro apatit.
2.4.3. Các vi sinh vật chuyển hóa lân

Nhiều vi khuẩn như Bacillus megaterium, Bacillus mycoides, Bacillus
butyricus, Pseudomonas fluorescens, vi khuẩn nitrat hóa, một số vi khuẩn vùng rễ, xạ
khuẩn có khả năng phân giải Ca
3
(PO
4
)
2
và bột apatit. Khả năng phân giải lân vô cơ
liên quan mật thiết đến tự sản sinh acid của vi sinh vật. Quá trình lên men tạo acid
carbonic là acid chủ yếu thúc đẩy quá trình hòa tan lân vô cơ.
Ca
3
(PO
4
)
2
+ H
2
CO
3
+ H
2
O Ca(PO
4
)
2
.H
2
O + Ca(HCO

3
)
2
Trong đất, vi khuẩn nitrat hóa và vi khuẩn chuyển hóa lưu huỳnh cũng có vai
trò quan trọng trong việc phân giải Ca
3
(PO
4
)
2.
Vì trong quá trình sống các loài vi
khuẩn này tích lũy trong đất HNO
3
, H
2
SO
4
.
Ca
3
(PO
4
)
2
+ 4HNO
3
Ca(H
2
PO
4

)
2
+ 2Ca(NO
3
)
2
Ca
3
(PO
4
)
2
+ 2H
2
SO
4
Ca(H
2
PO
4
)
2
+ 2CaSO
4
Đối với nấm thì Aspergillus niger cho khả năng phân giải lân mạnh nhất, ngoài
ra còn 1 số chủng khác như Penicilin, Rhizopus,…
Luận văn tốt nghiệp Đại Học khóa 36-2013

Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

11


Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Hình 6: Vi khuẩn Bacillus megaterium
Hình 7: Vi khuẩn
Pseudomonas fluorescens

(*nguồn: microbewiki.kenyon.edu,ngày 22/11/2013)








Luận văn tốt nghiệp Đại Học khóa 36-2013

Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

12


Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
3.1.1. Thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 7/2013 đến tháng 11/2013.
3.1.2. Địa điểm nghiên cứu
Phòng thí nghiệm Vi sinh môi trường, Viện Nghiên cứu và Phát triển
Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
3.2. Nguyên vật liệu nghiên cứu
Đất vùng rễ cây bắp được thu từ các tỉnh: Bà Rịa- Vũng Tàu, Bình Phước, Tây
Ninh, Đồng Nai.
3.3. Phương tiện nghiên cứu
Sử dụng thiết bị và dụng cụ của phòng thí nghiệm Vi sinh vật môi trường,
phòng Khử trùng của Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại
học Cần Thơ.
3.3.1. Thiết bị
Cân điện tử.
pH kế.
Tủ cấy vô trùng.
Nồi khử trùng nhiệt ướt.
Tủ ủ.
Tủ sấy.
Máy vortex.
Máy lắc mẫu.
3.3.2. Dụng cụ thí nghiệm
Bình tam giác 250ml, bình tam giác 100ml, nút gòn, nắp giấy.
Ống nghiệm, nút đậy ống nghiệm.
Đĩa petri, cốc thủy tinh
Micropipette, đầu cole.
Và một số dụng cụ khác.

Luận văn tốt nghiệp Đại Học khóa 36-2013

Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

13


Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

3.3.3. Hóa chất
Hóa chất pha môi trường Burk’s (Park et al., 2005). Chỉnh pH môi trường về 7
bằng NaOH.
 Sucrose
 KH
2
PO
4

 K
2
HPO
4

 NaCl
 CaCl
2

 MgSO

4
.7H
2
O
 FeSO
4
.7H
2
O
 NaMoO
4
.2H
2
O
 Agar
10 g/l

0,41 g/l

0,52 g/l

0,05 g/l

0,2 g/l

0,1 g/l

0,005 g/l

0,0025 g/l

20 g/l

Hóa chất pha môi trường NBRIP (Nautiyal, 1999), Chỉnh pH môi trường về 7,2
bằng NaOH.
 D-Glucose
 (NH
4
)
2
SO
4

 MgSO
4
.7H
2
O
 MgCl
2
.6H
2
O
 KCl
 Ca
3
(PO
4
)
2

hoặc Apatide
 Bromothymol Blue
 Agar
10 g/l

0,1 g/l

0,25 g/l

0,5 g/l

0,2 g/l

5 g/l

0,5%(w/v)

20 g/l

Luận văn tốt nghiệp Đại Học khóa 36-2013

Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

14


Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Tất cả các môi trường nêu trên sau khi pha xong đều được khử trùng bằng nồi
khử trùng nhiệt ướt ở 121
0
C, áp suất 1atm trong 20 phút.
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Thí nghiệm đo đạt một số chỉ tiêu chất lượng đất
Tiến hành thí nghiệm đo một số chỉ tiêu chất lượng đất: pH, hàm lượng chất
hữu cơ, đạm tổng số, lân hữu dụng.
3.4.1.1. Chỉ số pH
pH = -log[H]
+
, là đại lượng biểu thị hoạt độ H
+
trong môi trường.
 Cách đo chỉ số pH của đất.
Cân 1g đất cần xác định chỉ số pH cho vào 15ml nước cất, lắc 5-10 phút cho
đất hòa tan hết. Để yên cho lắng, tiến hành đo pH bằng máy đo pH.
3.4.1.2. Hàm lượng chất hữu cơ
Chất hữu cơ trong đất được xác định theo phương pháp Walkley-Black. Dựa
trên nguyên tắc oxy hóa chất hữu cơ bằng K
2
Cr
2
O
7
trong môi trường H
2
SO
4
đậm đặc,

sau đó chuẩn độ lượng dư K
2
Cr
2
O
7
bằng FeSO
4
0,1N.
3.4.1.3. Hàm lượng lân hữu dụng
Hàm lượng lân hữu dụng được xác định bằng phương pháp Oniani, lân hữu
dụng được lôi cuốn bằng acid loãng 0.1N và xác định hàm lượng bằng máy đo quang
phổ hấp thụ ở bước sóng 880nm.
3.4.1.4. Hàm lượng đạm tổng số
Sử dụng phương pháp Kjeldahl xác định hàm lượng nitơ tổng trong đất (N-
amoni, N- nitrat và N- trong các hợp chất hữu cơ).
3.4.2. Khảo sát mật số vi khuẩn cố định đạm và vi khuẩn hòa tan lân
Thí nghiệm được tiến hành nhằm kiểm tra, đánh giá mật số của hai loại vi
khuẩn có lợi là cố định đạm và hòa tan lân trong đất vùng rễ bắp ở các tỉnh Đông Nam
Bộ. Mật số vi khuẩn cố định đạm được xác định trên môi trường Burk’s và vi khuẩn
hòa tan lân trên môi trường NBRIP.
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, với 3 lần lặp lại.


Luận văn tốt nghiệp Đại Học khóa 36-2013

Trường ĐHCT

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

15


Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

3.4.3. Xác định mật số vi sinh vật bằng phương pháp đếm sống nhỏ giọt
(Drop plate count) (Hoben và Somasegaran, 1982)
Phương pháp đếm sống nhỏ giọt (Drop plate count) được sử dụng để xác định
mật số vi khuẩn, nhằm xác định số tế bào vi khuẩn sống trong mẫu đất tại thời điểm
khảo sát. Phương pháp này có ưu điểm là có số lần lặp lại cao (5 giọt) và khảo sát trên
cùng 1 đĩa petri nhiều nồng độ pha loãng, nên cho kết quả tương đối chính xác.
Các bước tiến hành như sau :
- Pha loãng mẫu: Mỗi mẫu được pha loãng thành 3 độ pha loãng bậc 10 liên
tiếp với 3 ống nghiệm.
+ Cân 1 gam mẫu cho vào bình tam giác chứa 100 ml nước cất vô trùng. Lúc
này mẫu được pha loãng 100 lần, độ pha loãng là 10
2
. Lắc đều bình tam giác này bằng
máy lắc mẫu khoảng 2 – 3 giờ.
+ Hút 1 ml mẫu từ bình tam giác chứa mẫu ở trên cho vào ống nghiệm thứ
nhất có chứa 9 ml nước cất vô trùng. Trộn đều mẫu trong ống nghiệm thứ nhất bằng
máy Vortex, lúc này mẫu gốc được pha loãng 1.000 lần, độ pha loãng là 10
3
.
+ Tiếp tục hút 1 ml mẫu ở ống nghiệm thứ nhất cho vào ống nghiệm thứ hai
chứa 9 ml nước cất vô trùng (trộn đều mẫu trước khi hút), mẫu gốc đã được pha loãng
10.000 lần, độ pha loãng 10
4
. Pha loãng tương tự để được mẫu có độ pha loãng 10
5

ở
ống nghiệm thứ ba.
- Nhỏ giọt:
+ Chuẩn bị 6 đĩa môi trường(3 đĩa môi trường Burk, 3 đĩa môi trường
NBRIP) ứng với mỗi mẫu (tức là mỗi môi trường lặp lại 3 lần), mỗi đĩa được chia làm
3 phần đều nhau ứng với 3 độ pha loãng 10
3
, 10
4
, 10
5
. Ở mỗi phần đĩa, tiến hành nhỏ 5
giọt mẫu đã pha loãng ứng với nồng độ pha loãng ở phần đĩa đó.
+ Sau khi trộn đều mẫu đã pha loãng chứa trong các ống nghiệm bằng máy
Vortex, dùng micropipet hút 10 µl dung dịch mẫu và nhỏ thành một giọt trên đĩa petri
tương ứng với nồng đã đánh dấu trên đĩa, nhỏ 5 giọt/1 phần đĩa. Nhỏ những giọt gọn,
nhẹ sao cho từng giọt tỏa tròn, đều, các giọt có cùng độ pha loãng đều nằm trong 1
phần và không dính nhau. Ủ ở 30
0
C, sau 24 - 48 giờ bắt đầu đếm số khuẩn lạc hình
thành.