ảnh hưởng của các yếu tố môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm men trên bã bia

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

----------

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN CỦA NẤM MEN
TRÊN BÃ BIA

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

SINH VIÊN THỰC HIỆN

TS. BÙI THỊ MINH DIỆU

NGUYỄN TRUNG DUẨN
MSSV: 3103949
LỚP: VSV K36

Cần Thơ, Tháng 11/2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

----------

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN CỦA NẤM MEN
TRÊN BÃ BIA

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

SINH VIÊN THỰC HIỆN

TS. BÙI THỊ MINH DIỆU

NGUYỄN TRUNG DUẨN
MSSV: 3103949
LỚP: VSV K36

Cần Thơ, Tháng 11/2013


PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
(ký tên)

Bùi Thị Minh Diệu

SINH VIÊN THỰC HIỆN
(ký tên)

Nguyễn Trung Duẩn

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(ký tên)


LỜI CẢM ƠN
---------*---------

Qua thời gian thực hiện luận văn đã giúp em rèn luyện khả năng làm việc độc lập,
học cách tiếp cận với những vấn đề mới. Để hoàn thành được đề tài này có sự đóng góp
không nhỏ của Quý thầy cô, bạn bè và người thân. Qua đây em xin gửi lời cảm ơn sâu
sắc đến cô Bùi Thị Minh Diệu đã tận tình hướng dẫn, cung cấp tài liệu và truyền đạt
nhiều kiến thức cũng như kinh nghiệm quý báu giúp em hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Xin chân thành cảm ơn Quý thầy cô Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ
Sinh học đã truyền đạt kiến thức trong suốt thời gian em học tập tại trường.
Xin cảm ơn các anh chị, các bạn của phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử Thực vật
đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình thực hiện đề tài.
Cảm ơn tập thể lớp Vi sinh vật học khóa 36 đã nhiệt tình giúp đỡ, chia sẻ thông tin
và tài liệu trong quá trình học tập.
Kính chúc Quý thầy cô, các anh chị và các bạn luôn dồi dào sức khỏe và thành

công trong cuộc sống.

Ngày 20 tháng 11 năm 2013

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Trung Duẩn


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013

Trường ĐH Cần Thơ

TÓM LƯỢC
Ở Việt Nam, hiện nay các nhà máy sản xuất bia vẫn chưa ứng dụng bã bia thải ra
một cách có hiệu quả mà chỉ dừng lại ở việc dùng làm thức ăn thô cho gia súc hoặc làm
phân bón. Bã bia chứa rất nhiều thành phần dinh dưỡng (tinh bột, đường, acid amin,
vitamin, canxi, photpho, kali, sắt, kẽm,…) rất thích hợp cho sự phát triển của các vi sinh
vật trong đó có nấm men. Nghiên cứu ứng dụng các kỹ thuật xử lý bã bia và sản xuất các
sản phẩm từ bã bia sẽ mang lại hiệu quả kinh tế cao nhờ tận dụng được các phụ phế
phẩm để tạo ra sản phẩm có giá trị dinh dưỡng. Do đó, đề tài “Ảnh hưởng của các yếu
tố môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm men trên bã bia” đã được thực hiện
nhằm bước đầu nghiên cứu sản xuất sinh khối nấm men từ bã bia. Các thí nghiệm đã
được tiến hành để khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố môi trường nuôi cấy (độ pha loãng
bã bia, nồng độ rỉ đường bổ sung, pH, mật số nấm men ban đầu) lên quá trình tăng sinh
khối của nấm men trên bã bia. Mật số nấm men được xác định bằng phương pháp đếm
trực tiếp dưới kính hiển vi bằng buồng đếm hồng cầu. Kết quả thí nghiệm cho thấy, hàm
lượng bã bia trong môi trường thích hợp cho sự phát triển của nấm men là 30 g/l. Sinh
khối nấm men tăng rõ rệt và khác biệt có ý nghĩa thống kê khi bổ sung 3% rỉ đường. Mật
số nấm men ban đầu thích hợp là 104 tế bào/ml và đạt 108 tế bào/ml sau 48 giờ nuôi cấy.

Nghiên cứu cho thấy có thể sản xuất sinh khối nấm men Saccharomyces cerevisiae từ
nguồn dinh dưỡng còn lại trong bã bia, mở ra hướng sản xuất thức ăn chăn nuôi giàu
dinh dưỡng từ nguồn phụ phẩm này.

Từ khóa: bã bia, nấm men, Saccharomyces cerevisiae, sinh khối

Chuyên ngành Vi sinh vật học

i

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013

Trường ĐH Cần Thơ

MỤC LỤC
Trang
PHẦN KÝ DUYỆT ........................................................................................................
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................
TÓM LƯỢC.................................................................................................................. i
MỤC LỤC .................................................................................................................... ii
DANH SÁCH BẢNG .................................................................................................. iv
DANH SÁCH HÌNH .................................................................................................... v
TỪ VIẾT TẮT ............................................................................................................ vi
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU ....................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề.............................................................................................................. 1
1.2. Mục tiêu đề tài ....................................................................................................... 1
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ..................................................................... 2

2.1. Tổng quan về nấm men Saccharomyces cerevisiae .............................................. 2
2.1.1. Phân loại ........................................................................................................... 2
2.1.2. Đặc điểm hình thái ............................................................................................ 2
2.1.3. Thành phần cấu tạo ........................................................................................... 3
2.1.4. Sinh trưởng và sinh sản ..................................................................................... 5
2.1.5. Giá trị dinh dưỡng của nấm men........................................................................7
2.1.6. Quá trình trao đổi chất của nấm men ..................................................................8
2.3. Bã bia .....................................................................................................................9
2.3.1. Tổng quan về bã bia ........................................................................................ 10
2.3.2. Thành phần hóa học ....................................................................................... 10
2.4. Rỉ đường ............................................................................................................. 11

Chuyên ngành Vi sinh vật học

ii

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013

Trường ĐH Cần Thơ

CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 14
3.1. Phương tiện nghiên cứu ...................................................................................... 14
3.1.1. Địa điểm – Thời gian nghiên cứu ............................................................... 14
3.1.2. Dụng cụ ..................................................................................................... 14
3.1.3. Hóa chất .................................................................................................... 14
3.1.4. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................... 15
3.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 15

3.2.1. Quy trình chung cho các thí nghiệm ............................................................... 15
3.2.2. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của độ pha loãng bã bia đến khả năng tạo sinh khối
nấm men .............................................................................................................. 16
3.2.3. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ rỉ đường bổ sung đến khả năng tạo
sinh khối nấm men .............................................................................................. 17
3.2.4. Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của pH đến khả năng tạo sinh khối nấm men .... 17
3.2.5. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của mật số nấm men giống đến khả năng tạo sinh
khối nấm men theo thời gian ............................................................................... 18
3.3. Phương pháp xử lý số liệu .................................................................................. 18
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 19
4.1. Ảnh hưởng của độ pha loãng bã bia đến khả năng tạo sinh khối nấm men ............ 19
4.2. Ảnh hưởng của nồng độ rỉ đường đến khả năng tạo sinh khối nấm men ................ 21
4.3. Ảnh hưởng của pH đến khả năng tạo sinh khối nấm men ...................................... 23
4.4. Ảnh hưởng của mật số nấm men giống đến khả năng tạo sinh khối nấm men theo
thời gian................................................................................................................................ 25
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................. 27
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 28
PHỤ LỤC .......................................................................................................................
Phụ lục 1: Các hình ảnh
Phụ lục 2. Kết quả
Phụ lục 3. Kết quả thống kê

Chuyên ngành Vi sinh vật học

iii

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013

Trường ĐH Cần Thơ

DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 1. Thành phần vách tế bào nấm men Saccharomyces cerevisise ........................... 3
Bảng 2. Hàm lượng các amino acid, vitamin trong tế bào nấm men Saccharomyces
cerevisise ....................................................................................................................... 8
Bảng 3. Thành phần bã malt ........................................................................................ 9
Bảng 4. Thành phần trung bình của tro ...................................................................... 10
Bảng 5. Thành phần hóa học của mầm malt ............................................................... 10
Bảng 6. Giá trị thức ăn gia súc của mầm malt (trong 100 kg mầm malt) .................... 10
Bảng 7. Thành phần dinh dưỡng của rỉ đường mía ...................................................... 11
Bảng 8. Kết quả đếm mật số thí nghiệm 1 ..................................................................PL2
Bảng 9. Kết quả đếm mật số thí nghiệm 2 ..................................................................PL2
Bảng 10. Kết quả đếm mật số thí nghiệm 3 ................................................................PL2
Bảng 11. Kết quả đếm mật số thí nghiệm 4 ................................................................PL2
Bảng 12. Mật số tế bào S. cerevisiae trong 1 ml dung dịch ở các độ pha loãng bã bia khác
nhau bằng phương pháp đếm hồng cầu (qui về giá trị logarit). ...................................PL3
Bảng 13. Mật số tế bào S. cerevisiae trong 1 ml dung dịch ở các nghiệm thức bằng phương
pháp đếm hồng cầu (qui về giá trị logarit). .................................................................PL3
Bảng 14. Mật số tế bào S. cerevisiae trong 1 ml dung dịch ở các pH khác nhau bằng
phương pháp đếm hồng cầu (qui về giá trị logarit). ....................................................PL3
Bảng 15. Mật số tế bào S. cerevisiae trong 1 ml dung dịch ở các nghiệm thức mật số giống
khác nhau bằng phương pháp đếm hồng cầu (qui về giá trị logarit). ...........................PL3

Chuyên ngành Vi sinh vật học

iv

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013

Trường ĐH Cần Thơ

DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 1. Hình thái nấm men Saccharomyces cerevisiae ............................................ 2
Hình 2. Cấu tạo của nấm men Saccharomyces cerevisiae ........................................ 4
Hình 3. Đường cong sinh trưởng của quần thể nấm men trong môi trường nuôi cấy. ... 5
Hình 4. Quy trình thực hiện thí nghiệm ......................................................................15
Hình 5. Ảnh hưởng của độ pha loãng bã bia đến khả năng tạo sinh khối nấm men .....19
Hình 6. Mật số tế bào S. cerevisiae trong 1 ml dung dịch ở các độ pha loãng bã bia khác
nhau sau 3 ngày nuôi cấy ........................................................................................... 20
Hình 7. Ảnh hưởng của nồng độ rỉ đường đến khả năng tạo sinh khối nấm men. .......21
Hình 8. Mật số tế bào S. cerevisiae trong 1 ml dung dịch ở các nồng độ rỉ đường bổ sung
khác nhau sau 3 ngày nuôi cấy ................................................................................... 22
Hình 9. Ảnh hưởng của pH đến khả năng tạo sinh khối nấm men .............................. 23
Hình 10. Mật số nấm men ở các mức độ pH khác nhau sau 3 ngày nuôi cấy .............. 24
Hình 11. Ảnh hưởng của mật số tế bào men giống đến khả năng tạo sinh khối nấm men
theo thời gian ............................................................................................................. 25
Hình 12. Hình ảnh về thiết bị sử dụng trong phòng thí nghiệm .............................. PL1
Hình 13. Bình nấm men giống ............................................................................... PL1
Hình 14. Khuẩn lạc nấm men Saccharomyces cerevisiae ....................................... PL1
Hình 15. Tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae dưới kính hiển vi ................. PL1
Hình 16. Tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae trong môi trường bã bia ở các thời
điểm nuôi cấy ......................................................................................................... PL1

Chuyên ngành Vi sinh vật học

v

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013

Trường ĐH Cần Thơ

TỪ VIẾT TẮT

DNA

Deoxyribo Nucleic Acid

YEPD

Yeast Extract Peptone Dextrose

Chuyên ngành Vi sinh vật học

vi

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013

Trường ĐH Cần Thơ

CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Ngày nay công nghệ sản xuất và thị trường tiêu thụ bia ngày càng phát triển, sản
lượng bia được tạo ra với một số lượng lớn, kéo theo lượng bã bia thải ra cũng tăng. Một
số các phụ phẩm được sản xuất gắn với sản xuất bia, bao gồm các loại bã bia ướt hoặc
khô và men bia khô. Bã bia chứa rất nhiều thành phần dinh dưỡng (tinh bột, đường, acid
amin, vitamin, calcium, photpho, kali, sắt, kẽm,…) rất thích hợp cho sự phát triển của
các vi sinh vật trong đó có nấm men, và trong tế bào nấm men lại chứa rất nhiều các
chất dinh dưỡng có giá trị nổi bật như protein và vitamin, đặc biệt là các vitamin nhóm
B. Hàm lượng protein của nấm men dao động trong khoảng từ 40 – 60 % vật chất khô
tế bào. Protein nấm men gần giống protein có nguồn gốc từ động vật, chứa khoảng 20
acid amin, trong đó có đủ các acid amin thiết yếu. Vì vậy, nấm men được sử dụng để
tạo ra men chiết xuất được sử dụng như là một chất điều vị trong chế biến thực phẩm
hay làm thành phần cung cấp nguồn nitơ và các chất kích thích sinh trưởng vào môi
trường nuôi cấy vi sinh. Men chiết xuất gồm các sản phẩm có giá trị dinh dưỡng và kinh
tế cao như dịch chiết nấm men (yeast extract), dịch tự phân nấm men (yeast autolysate),
dịch vách tế bào nấm men (yeast cell wall), hay dịch chiết nấm men chứa nucleotide tự
nhiên.
Ở Việt Nam, hiện nay các nhà máy sản xuất bia vẫn chưa ứng dụng bã bia thải ra
một cách có hiệu quả mà chỉ dừng lại ở việc dùng làm thức ăn thô cho gia súc hoặc làm
phân bón. Nghiên cứu ứng dụng các kỹ thuật xử lý bã bia và kỹ thuật sản xuất các sản
phẩm từ bã bia sẽ mang lại hiệu quả kinh tế nhờ tận dụng hiệu quả các sản phẩm phụ để
tạo ra sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao. Từ đó, đề tài “Ảnh hưởng của các yếu tố
môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm men trên bã bia” được đưa ra nhằm
bước đầu nghiên cứu ứng dụng sản xuất sinh khối nấm men từ bã bia.
1.2. Mục tiêu đề tài
Xác định các mức độ thích hợp về độ pha loãng bã bia, nồng độ rỉ đường bổ sung,
pH, mật số tế bào nấm men ban đầu cho sự phát triển của sinh khối nấm men trong môi

trường bã bia.

Chuyên ngành Vi sinh vật học

1

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013

Trường ĐH Cần Thơ

CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về nấm men Saccharomyces cerevisiae
2.1.1. Phân loại
Giới: Fungi
Ngành: Ascomycota
Ngành phụ: Saccharomycotina
Lớp: Saccharomycetes
Bộ: Saccharomycetales
Họ: Saccharomycetaceae
Chi: Saccharomyces
Loài: Saccharomyces cerevisiae
(Nguồn: ngày 30/07/2013)
2.1.2. Đặc điểm hình thái

Hình 1. Hình thái nấm men Saccharomyces cerevisiae
(*Nguồn: www.khoahoc.com.vn ngày 30/07/2013)
Nấm men Saccharomyces có hình bầu dục, gần tròn, kích thước khoảng 6 -8 µm x

5-6 µm. Nấm men Saccharomyces cerevisiae có hình cầu hay hình trứng, có kích thước
nhỏ, từ 5-14 µm, là loại nấm men thuộc nhóm cơ thể đơn bào, gồm có nấm men chìm
và nấm men nổi :

Chuyên ngành Vi sinh vật học

2

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013

-

Trường ĐH Cần Thơ

Nấm men chìm (lager): hầu hết các tế bào khi quan sát thì nảy chồi đứng riêng lẻ

hoặc cặp đôi. Hình dạng chủ yếu là hình cầu.
-

Nấm men nổi (ale): tế bào nấm men mẹ và con sau khi nảy chồi thường dính lại

với nhau tạo thành chuỗi tế bào nấm men. Hình dạng chủ yếu là hình cầu hoặc ovan với
kích thước 7-10 µm.
Khuẩn lạc thường có màu trắng hoặc màu kem khi được nuôi cấy trên môi trường
dinh dưỡng rắn. Nấm men có thể thay đổi hình dạng và kích thước trong các giai đoạn
phát triển và điều kiện môi trường xung quanh, trừ khi được nuôi cấy trong các môi
trường dinh dưỡng tiêu chuẩn (Lương Đức Phẩm, 2006). Nếu môi trường giàu dinh

dưỡng, nấm men Saccharomyces cerevisiae có hình bầu dục, trong điều kiện yếm khí
có hình tròn và tế bào kéo dài hơn trong điều kiện hiếu khí.
2.1.3. Thành phần cấu tạo
Nấm men Saccharomyces cerevisiae gồm những thành phần chủ yếu sau:
-

Vách tế bào: chiếm 26 - 32 % trọng lượng khô của tế bào. Có chứa protein, lipid

và ít nhất 2 loại polysaccharide, mannan, glucan và glycogen. Glycogen trong vách tế
bào không có chức năng như thành phần cấu trúc. Mannan liên kết với protein hiện diện
trong tế bào. Vách tế bào gồm 3 lớp: lớp ngoài là màng nhẵn, dày 10-30 nm gồm chủ
yếu lipoprotein, lớp tiếp theo chứa phức hợp mannan protein dày 100nm, lớp trong cùng
dạng keo và sợi li ti dày từ 10 - 250 nm, cấu tạo từ những gốc glucan gồm 94% glucose
và 6% hexoamin (Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2000).
Bảng 1. Thành phần vách tế bào nấm men Saccharomyces cerevisise
Thành phần

Hàm lượng (%)

Mannan protein

30-50

1,6-beta glucan

5-10

1,3-beta glucan

30-45

Chitin

1,5-6
(Klis Frans et al., 2006)

-

Màng tế bào: nằm sát vách tế bào, có cấu tạo chủ yếu là lipoprotein,

photpholipid, giữ vai trò điều hòa vận chuyển các chất dinh dưỡng cho tế bào.

Chuyên ngành Vi sinh vật học

3

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013

-

Trường ĐH Cần Thơ

Tế bào chất: gồm có mạng lưới nội chất là vị trí của nhiều hệ thống enzyme khác

nhau, đảm bảo sự vận chuyển vật chất cho tế bào và các cấu tử khác nhau như bộ máy
Golgi, lyzosome, không bào. Năng lượng cung cấp cho tế bào qua những phản ứng xảy
ra trong ty thể cũng nằm trong tế bào chất. Trong tế bào chất có nhân chứa thông tin di

truyền cho tế bào và các thành phần liên quan trong quá trình sinh tổng hợp và sinh sản
của tế bào. Nhân nấm men có phần trên là trung thể và centrochrometin và phần đáy của
nhân có thêm không bào, bên trong chứa 6 cặp nhiễm sắc thể và bên ngoài màng nhân
có nhiều ti thể bám quanh. Ngoài ra còn có hạt glycogen, hạt mỡ dự trữ chất dinh dưỡng
cho tế bào.
-

Nhân: được bao bọc một lớp màng, bên trong là dịch nhân và hạch nhân. Nhân

chứa protein và acid nucleic. Trong trạng thái lên men, nhân tăng từ 20 đến 30 lần so
với trạng thái hô hấp. Nhân của Saccharomyces cerevisiae chứa 17 cặp nhiễm sắc thể.
DNA trong tế bào có khối lượng phân tử là 1x1010 Da (Nguyễn Lân Dũng et al., 2007).
-

Không bào: không bào thường xuất hiện lúc tế bào nấm men bị già. Trong không

bào chứa các enzyme thủy phân, ion kim loại, các sản phẩm trao đổi chất trung gian.
Ngoài tác dụng một kho dự trữ, không bào còn có chức năng điều hòa áp suất thẩm thấu
của tế bào (Nguyễn Lân Dũng et al., 2007).
-

Ty thể: có vai trò như nhà máy cung cấp năng lượng cho tế bào.

Hình 2. Cấu tạo của nấm men Saccharomyces cerevisiae
*Nguồn: (ngày 30/07/2013)
Chuyên ngành Vi sinh vật học

4

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013

Trường ĐH Cần Thơ

2.1.4. Sinh trưởng và sinh sản
-

Sinh trưởng
Cũng như các vi sinh vật khác, quá trình sinh trưởng của nấm men gồm 4 pha: pha

Log số lượng tế bào

tiềm phát, pha lũy thừa, pha cân bằng và pha suy vong.

Pha cân bằng

Pha
tiềm
phát

Thời gian

Hình 3. Đường cong sinh trưởng của quần thể nấm men
trong môi trường nuôi cấy
*Nguồn: (ngày 13/10/2013)

 Pha lag (pha tiềm phát)
Trong pha tiềm phát nấm men hầu như không sinh sản do nấm men còn thích nghi

với môi trường mới, trong đó, một số tế bào bị ức chế, thậm chí có thể bị chết. Số lượng
nấm men trong giai đoạn này không tăng hoặc tăng không đáng kể nhưng sự trao đổi
chất của chúng diễn ra mạnh mẽ. Tế bào có kích thước tăng đáng kể, hàm lượng protein,
acid nucleic đều tăng lên. Các enzyme thích ứng cũng được tổng hợp mạnh mẽ. Trong
môi trường càng đầy đủ dinh dưỡng, giống nấm men cấy vào càng trẻ thì pha tiềm phát
càng ngắn. Có thể cấy một lượng giống lớn các tế bào khỏe làm cho pha này rút ngắn
và giống có thể phát triển ngay sau khi cấy. Pha này tính từ lúc bắt đầu nuôi cấy đến khi
nấm men đạt được tốc độ sinh trưởng cực đại.
 Pha logarid (pha log)
Trong pha này nấm men sinh trưởng và phát triển theo lũy thừa. Kích thước của tế
bào, thành phần hóa học, hoạt tính sinh lý,... nói chung không thay đổi theo thời gian.
Tế bào ở trạng thái động học và được coi như là “những tế bào tiêu chuẩn”.
 Pha ổn định (pha cân bằng)

Chuyên ngành Vi sinh vật học

5

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013

Trường ĐH Cần Thơ

Trong pha này quần thể nấm men ở trạng thái cân bằng động học, số tế bào mới
sinh ra bằng số tế bào cũ chết đi. Kết quả là số tế bào sống không tăng cũng không giảm.
Tốc độ sinh trưởng phụ thuộc vào nồng độ cơ chất. Cho nên khi giảm nồng độ cơ chất
(trước khi cơ chất bị cạn hoàn toàn) tốc độ sinh trưởng của nấm men cũng giảm. Do đó
việc chuyển từ pha log sang pha ổn định diễn ra dần dần. Nguyên nhân tồn tại của pha

ổn định rõ ràng là do sự tích lũy sản phẩm độc của trao đổi cơ chất (các loại rượu, acid
hữu cơ) và việc cạn chất dinh dưỡng (thường là chất dinh dưỡng có nồng độ thấp nhất).
 Pha suy vong
Trong pha này số lượng tế bào có khả năng sống giảm theo lũy thừa (mặc dù số
lượng tế bào tổng cộng có thể không giảm). Đôi khi các tế bào bị tự phân nhờ các enzyme
của bản thân. Thực ra chưa có một qui luật chung cho pha suy vong. Sự chết của tế bào
có thể nhanh hay chậm và có liên quan đến quá trình tự phân. Nguyên nhân của pha suy
vong chưa thật rõ ràng, nhưng có liên quan đến điều kiện bất lợi của môi trường. Trong
trường hợp môi trường tích lũy các acid là nguyên nhân của sự chết tế bào tương đối dễ
hiểu. Nồng độ chất dinh dưỡng thấp dưới mức cần thiết cho hậu quả làm giảm hoạt tính
trao đổi chất, phân hủy dần dần các chất dự trữ và cuối cùng dẫn đến sự chết của hàng
loạt tế bào. Ngoài đặc tính của bản thân chủng nấm men, tính chất của các sản phẩm
trao đổi chất tích lũy lại cũng ảnh hưởng đến tiến trình của pha suy vong. Một số enzyme
thể hiện hoạt tính xúc tác cực đại trong pha tử vong như deaminase, decarboxylase, các
amylase và protease ngoại bào. Ngoài chức năng xúc tác một số quá trình tổng hợp
những enzyme nói trên chủ yếu xúc tác cho quá trình phân giải.
-

Sinh sản:
Nấm men có thể sinh sản vô tính thông qua mọc chồi hoặc hữu tính thông qua sự

hình thành của nang bào tử. Chồi nấm men được bắt đầu khi tế bào mẹ đạt tới một kích
thước tới hạn cùng lúc với sự khởi đầu sinh tổng hợp DNA. Tiếp theo là làm yếu đi một
vị trí trên vách tế bào, cùng với sức căng bề mặt do áp suất, cho phép phun tế bào chất
vào trong vùng giới hạn bởi vật liệu của vách tế bào mới. Trong quá trình sinh sản vô
tính, chồi mới phát triển từ nấm men mẹ khi các điều kiện thích hợp và sau đó, khi chồi
đạt tới kích thước của nấm men trưởng thành thì nó tách ra khỏi nấm men mẹ. Khi các
điều kiện dinh dưỡng kém các nấm men có khả năng sinh sản hữu tính sẽ tạo ra các nang
bào tử.

Chuyên ngành Vi sinh vật học

6

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013

Trường ĐH Cần Thơ

 Sinh sản vô tính: Sinh sản vô tính ở nấm men thường gặp nhất là nẩy chồi, khi
một chồi hoàn chỉnh sẽ phát triển ngay, ở đó chồi sẽ nối liền với tế bào mẹ và khi chồi
rời ra tế bào mẹ gọi là điểm sinh sản.
 Sinh sản hữu tính: Nấm men không sinh ra các cơ quan sinh dục mà chúng sinh
ra hai tế bào dinh dưỡng mà nhiệm vụ giống như các giao tử. Quá trình hợp tế bào chất
và hợp nhân xảy ra và thành lập tế bào nhị bội, nang và cuối cùng là bào tử nang thành
lập trong nang (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Văn Thành, 2010). Số bào tử nang tùy thuộc
vào số lần phân chia nhân nhưng thường là 8, bào tử nang được giải phóng, nảy mầm
để hình thành tế bào dinh dưỡng mới từ đây chúng sinh sản vô tính bằng sự nẩy chồi
hay phân đôi.
2.1.5. Giá trị dinh dưỡng của nấm men
Nấm men rất giàu chất đạm, chất khoáng, chất xơ, sinh tố và khoáng chất. Ngoài
ra, nấm men còn chứa các polysaccharid (mannan, glucan), sterol (ergosterol,
zymosterol) có giá trị cao. Ngoài việc cung cấp nhiều dưỡng chất bổ dưỡng, người ta
còn dùng men tươi, men khô (còn sống) để uống giúp điều hòa môi trường ruột, trị nhiều
rối loạn tiêu hóa, biến dưỡng đường ruột. Nấm men thường được dùng để trị tiêu chảy,
giúp ăn ngon miệng, mụn trứng cá và là nguồn cung cấp vitamin B. Nấm men có những
tác dụng chống lại các vi khuẩn độc hại ở ruột, nấm men làm giảm lưu lượng nước và
chất điện giải nơi ruột, kích ứng bởi độc tố của E. coli. Men bia cũng có thể giúp tăng

hoạt tính của các enzyme trong ruột như maltase và lactase để giúp giảm các triệu chứng
tiêu chảy. Men bia chứa nhiều chromium, cũng giúp tăng hoạt động của insulin rất có
ích cho bệnh nhân tiểu đường. Trong nấm men có 1 số enzyme tiêu hóa (amylase,
protease…) và vitamin (đặc biệt là vitamin B) xúc tiến nhanh quá trình trao đổi chất,
kích thích tăng trưởng. Tuy nhiên, sinh khối tế bào nấm men có nhược điểm là mặc dù
hàm lượng protein cao khoảng 55 – 60%, nhưng đồng thời nó cũng chứa lượng acid
nucleic quá cao (10%), điều này ảnh hưởng tới sức khỏe con người. Do đó, cần có các
biện pháp làm giảm lượng acid nucleic này. Ngoài ra, màng tế bào nấm men khá vững
chắc nên cần có biện pháp thích hợp để phá vỡ màng khi thu protein.

Chuyên ngành Vi sinh vật học

7

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013

Trường ĐH Cần Thơ

Bảng 2: Hàm lượng các amino acid, vitamin trong tế bào nấm men
Saccharomyces cerevisise (mg/g men khô)
Các chất thành phần

µg/g

Các chất thành phần

µg/g

Lysine

7,5

Methyonine

2,9

Arginin

1,3

Leucine

5,4

Histidine

1,1

Inositol

6000-15000

Asparagine acid

2,9

Biotin

0,6

Serine

2,7

Vitamin B1

24 - 50

Glycine

1,5

Vitamin B2

30 – 60

Glutamic acid

3,9

Vitamin B3

370 – 750

Alanine

8,7

Vitamin B5

2 - 19

Proline

2,0

Vitamin B6

14 - 39

Tyrosine

2,8

(Nguồn: Lương Đức Phẩm et al., 2006)
2.1.6. Quá trình trao đổi chất của nấm men
Hiện nay người ta nhận thấy quá trình dinh dưỡng của nấm men gồm 2 giai đoạn:
Chất dinh dưỡng qua màng tế bào chất vào tế bào. Chuỗi các phản ứng hóa học, biến
đổi chất dinh dưỡng để tổng hợp chất liệu cho tế bào. Môi trường dinh dưỡng chứa
những thành phần có áp suất thẩm thấu khác nhau. Các chất không điện tích như đường
saccharose, rượu acid hữu cơ, amino acid xâm nhập qua màng tế bào bằng cách khuếch
tán hay vận chuyển thụ động, do sự khác nhau về nồng độ các chất này giữa tế bào và
môi trường. Các chất điện tích trong dung dịch như muối KCl, Mg, Ca và các kim loại
khác có thể vào tế bào thụ động theo thang nồng độ hay vận động ngược lại thang nồng
độ (vận chuyển hoạt động). Ngoài nguồn hydratcarbon và nguồn nitơ hoặc vô cơ hoặc
hữu cơ, nấm men còn sử dụng các nguyên tố vi lượng như K, Na, Ca, Mg có vai trò
quan trọng trong dinh dưỡng nấm men. Riêng natri có ý nghĩa quan trọng trong sự tăng

trưởng của tế bào nấm men. Ion natri là thành phần duy nhất di chuyển vào tế bào bằng
cả 2 cơ chế: thụ động và hoạt động và khi nó thâm nhập vào tế bào nấm men, mang theo
cả saccharose, amino acid, ngay cả khi không có sự chênh lệch nồng độ các chất này
giữa tế bào và môi trường.
Chuyên ngành Vi sinh vật học

8

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013

Trường ĐH Cần Thơ

2.2. Bã bia
2.2.1. Tổng quan về bã bia
Một số các phụ phẩm được sản xuất gắn với sản xuất bia, bao gồm các loại bã bia
ướt hoặc khô và men bia khô. Thành phần dinh dưỡng của vật liệu sẽ khác nhau, tùy
thuộc vào loại chất nền được sử dụng (lúa mạch, lúa mì, ngô, ...), tỷ lệ lên men và quá
trình lên men được sử dụng. Nhà máy bia cho ra phụ phẩm là bã bia ướt. Bã bia ướt cần
phải được sử dụng trong thời gian ngắn vì chúng có chứa một lượng lớn nước (75-80%)
và vận chuyển có thể tốn kém. Trong ngành chăn nuôi, mầm malt được sử dụng làm
thức ăn gia súc vì hàm lượng các chất dinh dưỡng trong mầm malt rất cao. Trong công
nghiệp thực phẩm, mầm malt được dùng để sản xuất acid lactic và làm nguồn cung cấp
nitơ cho quá trình sản xuất nấm men từ rỉ đường. Ngoài ra do trong mầm malt còn có
các enzyme khác nhau nên mầm malt có khả năng thúc đẩy sự lên men của dịch đường.
Do đó, mầm malt là nguyên liệu rất tốt để điều chế các chế phẩm enzyme như protease.
2.2.2. Thành phần hóa học
Bã malt được tạo ra trong quá trình dịch hóa và lọc dịch đường. Trong quá trình

dịch hóa, dưới tác dụng của enzyme amylase, protease và các men khác thì 65 – 70 %
vật chất khô của malt sẽ chuyển vào dịch sau khi lọc, phần còn lại nằm ở trong bã malt.
Tùy thuộc vào phương pháp tách mà độ ẩm của bã dao động từ 75 – 85 %. Với độ ẩm
này thì bã malt được dùng làm thức ăn gia súc. Bã malt tươi thường có dạng sền sệt, có
màu nâu nhạt, vị ngọt và mùi mạch nha.
Bảng 3. Thành phần bã malt (%)
Chỉ số

Hàm lượng (%)

Độ ẩm

76,3

Protein

6,63

Lipid

1,7

Chất hòa tan không có nitơ

9,72

Cellulose

5,1

Tro

1,2

(Densikow, 1963)

Chuyên ngành Vi sinh vật học

9

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013

Trường ĐH Cần Thơ

Bảng 4. Thành phần trung bình của tro (%)
Thành phần

Hàm lượng (%)

K2O

3,9

Na2O

0,5

CaO

11,9

MgO

11,5

P2O5

40,5

SiO2

25,3
(Densikow, 1963)

Bảng 5. Thành phần hóa học của mầm malt (%)
Thành phần

Hàm lượng (%)

Nước

10,07

Protein

34,18

Lipid

2,23

Chất hòa tan không có nitơ

35,18

Cenlulose

11,42

Tro

7,05
(Densikow, 1963)
Bảng 6. Giá trị thức ăn gia súc của mầm malt (trong 100 kg mầm malt)

Thành phần

Hàm lượng (kg)

Protein chuyển hóa được

13,2

Photpho

0,675

Canxi

0,25

Carotin

0,025
(Densikow, 1963)

Chuyên ngành Vi sinh vật học

10

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013

Trường ĐH Cần Thơ

2.3. Rỉ đường

Rỉ đường là một phụ phẩm của ngành sản xuất đường, là sản phẩm cuối cùng của
quá trình sản xuất đường mà từ đó đường không còn có thể kết tinh một cách kinh tế
nữa bởi các công nghệ thông thường. Khoảng 75% tổng rỉ đường của thế giới được sản
xuất từ mía và đa phần còn lại có từ củ cải đường.
Thành phần chính của rỉ đường là đường, chủ yếu là saccharose một ít glucose và
fructose. Thành phần chính xác của rỉ đường rất khó dự đoán vì nó phụ thuộc vào điều
kiện thổ nhưỡng và thời tiết, khí hậu, giống mía và giai đoạn thu hoạch cũng như quy
trình sản xuất đường trong từng nhà máy. Do vậy rỉ đường thay đổi đáng kể về thành

phần dinh dưỡng, mùi vị, màu sắc và độ nhớt. Bảng 7 cho thấy biến động của các thành
phần của rỉ đường.
Bảng 7. Thành phần dinh dưỡng của rỉ đường mía (%)
Thành phần

Trung bình

Biến động

Nước

20

17-25

Saccharose

35

30-40

Glucose

7

4-9

Fructose

9

5-12

Các chất khử khác

3

1-5

Glucid khác

4

2-5

Khoáng

12

7-15

Các chất chứa N

4,5

2-6

5

2-8

0,4

0,1-1

Các chất không chứa N
Sáp, Sterol, photpholipid

Nguồn: Wolfrom và Binkley (1953)
Thành phần tiêu chuẩn của rỉ đường thường được chia thành 3 phần: đường, chất
hữu cơ không đường và chất khoáng. Các loại glucide hòa tan (đường đôi và đường đơn)
là thành phần dinh dưỡng chính của rỉ đường, trong đó saccharose là chủ yếu. Rỉ đường
mía có đặc điểm là có tỷ lệ đường khử tương đối cao. Trong chu trình kết tinh các loại
đường khử tăng lên tới mức mà saccharose không thể kết tinh được nữa bởi vì đường
Chuyên ngành Vi sinh vật học

11

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013

Trường ĐH Cần Thơ

khử làm giảm khả năng hoà tan của saccharose. Các chất khoáng có xu hướng giữ
saccharose trong dung dịch, cho nên cân bằng giữa đường khử và chất khoáng sẽ quyết
định sản lượng saccharose lý thuyết có từ cây mía.
Các chất hữu cơ không phải là đường của rỉ đường quyết định nhiều tính chất vật
lý của nó, đặc biệt là độ nhớt dính. Nó bao gồm chủ yếu là các loại glucide như tinh bột,

các hợp chất chứa N và các acid hữu cơ. Nói chung hàm lượng các chất hữu cơ không
phải là đường của rỉ đường củ cải đường cao hơn là rỉ đường mía. Trong rỉ đường không
chứa xơ và lipit. Tỉ lệ protein thô trong rỉ đường mía rất thấp (3-5%). Trong rỉ đường
mía còn có một lượng đáng kể các acid hữu cơ, trong đó chủ yếu là axit acotinic. Rỉ
đường cũng chứa một lượng acid béo bay hơi, trung bình khoảng 1,3%.
Rỉ đường là một nguồn giàu khoáng. So với các nguồn thức ăn năng lượng thông
dụng khác như hạt ngũ cốc thì hàm lượng Ca trong rỉ đường mía cao (tới 1%), trong khi
đó thì hàm lượng P lại thấp. Rỉ đường mía giàu Na, K, Mg và S. Rỉ đường cũng chứa
một lượng đáng kể các nguyên tố vi lượng như Cu (7 ppm), Zn (10 ppm), Fe (200 ppm),
Mn (200 ppm). Rỉ đường rất giàu các chất sinh trưởng như: acid pentotenic, nicotinic,
folic, B1, B2 và đặc biệt là biotin (Trương Thị Minh Hạnh et al., 2006).
Ngoài đường saccharose còn chứa nhiều chất hữu cơ, vô cơ, các chất thuộc vitamin
và các chất điều hoà sinh trưởng. Trong đó có vitamin H (biotin) là chất kích thích sinh
trưởng đối với phần lớn nấm men. Trong 2 loại rỉ đường thì rỉ đường từ mía có hàm
lượng biotin cao hơn rỉ đường từ củ cải đường. Chính vì thế, ở nhiều nước không có
mía, người ta phải nhập rỉ đường từ mía về trộn chung với rỉ đường từ củ cải đường để
đảm bảo hàm lượng biotin cho nấm men phát triển. Tuy nhiên rỉ đường cũng có những
đặc điểm không phù hợp với quá trình lên men. Muốn sử dụng cho quá trình lên men,
ta phải tiến hành một số quá trình xử lý.
Các đặc điểm ảnh hưởng quá trình lên men: Rỉ đường thường có màu nâu sẫm,
được tạo ra trong quá trình chế biến đường. Màu này rất khó bị phá hủy trong quá trình
lên men. Sau khi lên men, chúng sẽ bám vào sinh khối nấm men và tạo cho nấm men có
màu vàng sẫm. Màu này không phải màu tự nhiên của nấm men và việc tách màu ra
khỏi sinh khối rất tốn kém và khó khăn. Các chất màu này bao gồm các hợp chất
caramen, phức chất của phenol – Fe +2, Melanoidin, Melanin. Hàm lượng đường khá
cao, nên khi tiến hành lên men phải pha loãng tới nồng độ thích hợp cho sự phát triển
của nấm men.
Chuyên ngành Vi sinh vật học

12

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013

Trường ĐH Cần Thơ

Hệ keo trong rỉ đường có ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men. Hệ keo trong rỉ
đường hình thành bởi protein và pectin. Hệ keo này tạo ra độ nhớt cao làm giảm khả
năng hoà tan của oxy, làm cản trở quá trình trao đổi chất của tế bào nấm men. Nếu hệ
keo không được phá sẽ gây thoái hoá tế bào, dẫn đến hiệu suất thu nhận sinh khối nấm
men thấp.
Rỉ đường được ứng dụng trong sản xuất nhiều sản phẩm như: bột ngọt, rượu rum,
sản xuất nấm men, acid lactic, cồn, tăng sinh khối protein. Ngoài ra còn rất nhiều các
quy trình công nghệ tiên tiến khác cũng dùng rỉ đường làm nguyên liệu như: Micromix3 kết hợp bổ sung rỉ đường, NPK để xử lý rác, xử lý vỏ đầu tôm với rỉ đường và enzyme
dùng làm thứ ăn cho gia súc, gia cầm,…

Chuyên ngành Vi sinh vật học

13

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013

Trường ĐH Cần Thơ

CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Phương tiện nghiên cứu
3.1.1. Địa điểm – Thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 8/2013 đến tháng 11/2013 tại phòng thí nghiệm
Sinh học Phân tử Thực vật thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học,
Trường Đại học Cần Thơ.
3.1.2. Dụng cụ, thiết bị
-Đĩa petri
- Chai 1000ml
- Que cấy, kẹp cấy
- Đèn cồn
- Ống đong
- Micropipette
- Đầu cone
- Bình tam giác 200ml
- Giấy nhôm, kẹp, kéo
- Tủ cấy vô trùng Telstar (Spain)
- Nồi khử trùng Pbi (Italia)
- Lò vi sóng (Panasonic)
- Tủ ủ Binder (Germany)
- Máy ly tâm (Hermle)
- Máy vortex (Italia)
- Cân điện tử (USA)
- Kính hiển vi Olympus (Japan)
- pH kế Eutech (Malaysia)
- Máy nghiền (IKA)
3.1.3. Hóa chất
MgSO4, KH2PO4, NaOH, HCl, D-glucose, Agar, Yeast extract, pepton.

Chuyên ngành Vi sinh vật học

14

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 – 2013

Trường ĐH Cần Thơ

3.1.4. Vật liệu nghiên cứu
- Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae và chủng nấm mốc Aspergillus
oryzae do phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử Thực vật thuộc Viện Nghiên cứu
và Phát triển Công nghệ Sinh học trường Đại học Cần Thơ cung cấp.
- Bã bia được thu ngay sau quá trình lọc bã malt tại Công ty Cổ phần Bia Phong
Dinh, Thành phố Cần Thơ sau đó trữ lạnh ở 0oC.
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Quy trình chung cho các thí nghiệm

Bã bia

Sấy khô ở 1050C

Xay nhuyễn
Nấm men giống
Pha loãng với nước cất
Tách ròng

Nuôi trên môi
trường YEPD
lỏng

Bổ sung rỉ đường

Cấy giống

Chỉnh pH

Khử trùng

Lắc ủ 120
vòng/phút

Đếm mật số

Hình 4. Quy trình thực hiện thí nghiệm
Chuyên ngành Vi sinh vật học

15

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học