Khoá luận tốt nghiệp nghiên cứu tổng hợp thuốc chữa bệnh tiểu đường metformin hydrochiloride

TRƯỜNG ĐẠI HỌC s u PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA HÓA HỌC

NGUYỄN THỊ THƯ HẠNH

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP THUỐC
CHỮA BỆNH TIỂU ĐƯỜNG
METFORMIN HYDROCHLORIDE
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
•

•

•

•

C h u y ên n g à n h : H ó a h ữ u cơ

Người hướng dẫn khoa học
GS.TS Nguyễn Văn Tuyến

HÀ NỘI - 2015


L Ờ I CẢM ƠN

Khóa luận tốt nghiệp này được hoàn thành tại phòng Hóa Dược - Viện
Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Trong suốt quá trình nghiên cún và hoàn thành khóa luận, ngoài sự nỗ
lực của bản thân, em còn nhận được sự giúp đõ' của Ban giám hiệu nhà

trường, các thầy cô giáo trong khoa Hóa học - Trường Đại học Sư Phạm Hà
Nội 2.
Em xin chân thành cảm ơn GS.TS Nguyễn Văn Tuyến người đã tạo
điều kiện cho em được làm thực nghiệm tại phòng Hóa dược, các chuyên viên
kĩ thuật phòng Hóa dược - Viện hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện để em học tập và hoàn thành tốt khóa
luận này.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TS Nguyễn Văn Tyến,
người đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo em trong suốt thời gian học tập, hướng dẫn,
giúp chỉnh sửa và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn đến người thân và bạn bè đã chia
sẻ, động viên, giúp đõ' em trong suốt quá trình làm và hoàn thành khóa luận.
Do đây là lần đầu tiên em được làm quen với việc nghiên cứu, do điều
kiện thời gian và trình độ hạn chế, nên khóa luận này không tránh khỏi những
thiếu sót. Em rất mong nhận được sự đóng góp quý báu của các thầy giáo, cô
giáo để khóa luận của em được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, Ngày 08 tháng 05 năm 2015
Sinh viên
Nguyễn Thị Thu Hạnh


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC L Ụ C ......................................................................................................................
MỞ Đ Ầ U ........................................................................................................................ 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN........................................................................................ 2
1.1. Khái quát về bệnh tiểu đường........................................................................... 2
1.1.1. Phân loại bệnh tìấỉ đưàĩg........................................................................................2
1.1.2. Các thuốc điều trị bậĩh tăng đường huyết.................................................................3

1.1.3. Quan niệm của y học cô truyấĩ về bệnh tiêu đuừĩg.................................................. 5
1.1.4. Các thuốc Đông y điều trị bậih tiấi đường............................................................... 5
1.2. Thuốc chữa bệnh tiểu đường Metformin hydrochloride................................5
1.2.1. Tông quan về Metformin hydrochloride....................................................................5
1.2.2. Tĩnh hình nghiên cứu trong nước............................................................................. 7
1.2.3. Tình hình nghiên cứu ngoài nước..............................................................................8
1.2.4. Cácphươngpháp nghiên cứu.................................................................................10
1.3. Tổng quan về các phương pháp xác định cấu trúc hợp chất hữu cơ........17
1.3.1. Điắn nóng chảy (Mp).............................................................................................17
1.3.2. Độ quay cực ([a]D)................................................................................................ 18
1.3.3. Phô cộng hưởng ứ ’hạt nhân.................................................................................. 18
1.3.4. Phô khối lượng (Mass spectrocopy, MS)................................................................ 20
CHƯƠNG II. THỰC NGHIỆM ................................................................................21
2.1. Mục tiêu của khóa lu ậ n ...................................................................................21
2.2. Phương pháp nghiên cứu, nguyên liệu và thiết b ị.......................................21
2.3. Định tính phản úng và kiếm tra độ tình khiết của các họp chất bằng sắc kí lóp mỏng.. 24
2.4. Định lượng phản úng.............................................................................................. 25
2.5. Phương pháp thực nghiệm....................................................................... 25
2.6. Tống họp Metformin hydrochloride..............................................................26
2.7. Nghiên cứu kết tinh metformin hydrochloride..........................................................26
2.8. Nghiên cứu xác định độc tính cap (LD50) của metformine hydrochloride...........27
2.9. Nghiên cún hàm lượng metformine hydrochloride ửieo phương pháp HPLC-MS)...27
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN cứ u VÀ THẢO LU Ậ N ..............................28


3.1. Tổng họp metformine hydrochloride..............................................................28
3.2. Nghiên cún kết tình metformine hydrochloride.......................................................... 31
3.3. Nghiến cứu xác định độc tính cap (LD50) của metformine hydrochloride...................32
3.4. Hàm lượng metformin hydrochloride theo phương pháp HPLC.................................34
KẾT LU Ậ N ................................................................................................................. 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................... 38
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỦ VIẾT TẮT

13C- NMR

Phô cộng hưởng tù’ hạt nhân carbon-13
( l3C Nuclear Magnetic Resonance Spectromotry)

DMSO

Dimethyl sulfoxide

'H-

Phô cộng hưởng từ hạt nhân proton

nmr

(*H Nuclear Magnetic Resonance Spectromotry)

HPLC

Săc ký lỏng hiệu năng cao
(High Performance Liquid Chromatography)

IR

Phô hông ngoại
(Infrared Spectroscopy)

MS

Phô khôi lượng va chạm điện tử
( Electron Impact-Mass Spectrometry)

Rf

Hệ sô di chuyên

ÔH, 5C

Độ chuyên dịch hóa học của proton và cacbon

Ppm

Phân triệu
( parts per million )

s

Singlet

CHCỈ3

Clorofom

EtOH

Etanol

MW

Microwave

MeOH

Metanol

OMe

Methoxy


DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH
Bảng 1: Các thiết bị chính sử dụng trong phòng thí nghiệm..................................... 22
Bảng 2: Các dụng cụ chính sử dụng trong phòng thí nghiệm................................... 23
Hình 1: Phổ 1H-NMR của chất metformin hydrochloride........................................ 29
Hình 2: Phố 13C-NMR của chat metformin hydrochloride.......................................30
Hình 3: Đồ thị về mối tương quan giữa liều dùng và số chuột chết.......................... 34
Hình 4: sắc kí đồ HPLC của metformin hydrochloride............................................ 36


DANH MỤC S ơ ĐÒ
Sơ đồ 1.1: Quá

trình tống hợp calci cyanamid....................................................... 7

Sơ đồ 1.2: Quá

trình tống hợp 1-cyanoguanidine.................................................. 7

Sơ đồ 1.3: Quá

trình tổng hợp metformin hydrochloride.....................................8

Sơ đồ 1.4: Quá

trình tống hợp metformin hydrochloride theoShapiro............... 9

Sơ đồ 1.5: Quá

trình tổng hợp metformin hydrochloride theo Shalmashi..........9

Sơ đồ 1.6: Chuyển hóa các tiền chất về m etform in..............................................9
Sơ đồ 1.7: Tổng hợp các dẫn xuất của m etform in............................................... 10


MỜ ĐÀU
Tiểu đường là căn bệnh nguy hiếm thuộc hệ nội tiết, đe doạ nghiêm
trọng sức khoẻ con người và gây nhiều biến chứng nguy hiểm, đặc biệt là tiểu
đường tuýp II (chiếm tới 90-95%). Theo Hiệp hội thế giới về tiểu đường, tử
vong của bệnh này đứng hàng thứ tư ở các nước phát triển, bệnh có thể gây
nhiều tai biến nguy hiêm như: mù loà và giảm thị lực ở người trưởng thành;
đoạn chi không do tai nạn nhiều hơn người bình thường từ 15-40 lần; suy thận
giai đoạn cuối nên cần phải chạy thận hoặc thay thận nhân tạo; gây ra những
biến chứng tim mạch nguy hiêm. Theo ước tính, hiện thế giới có 194 triệu
người mắc bệnh tiểu đường chiếm tới 5,1% dân số thế giới, ước tính đến năm

2025 số người bị bệnh tiếu đường sẽ là 333 triệu người. Theo thống kê năm
2008, tỷ lệ mắc bệnh đái tháo đường ở Việt Nam là 5% dân số (khoảng 4,5
triệu người) và 7,2% tại các thành phố lớn. TP. Hồ Chí Minh có hơn 800.000
người mắc bệnh. Trong danh sách thuốc thiết yếu của WHO 2007 và trong
danh mục thuốc thiết yếu của Bộ Y tế, metformin là một thuốc tiếu đường
được sử dụng theo đường uống chữa bệnh tiểu đường tuýp II. Metformin làm
chậm hấp thụ đường trong ruột non; ngăn cản gan chuyển đường dự trữ vào
trong máu và giúp cơ thể sử dụng insulin tự nhiên hiệu quả hơn. Như vậy nếu
tổng họp được metformin thì chúng ta có thể chủ động sản xuất được loại
thuốc thiết yếu nhất để chữa bệnh tiểu đường tuýp II, làm tăng thêm sự lựa
chọn, tăng tính hiệu quả của việc chữa bệnh tiếu đường và chủ động sản xuất
thuốc generic chữa bệnh tiêu đường giá rẻ ở Việt Nam.
Vì vậy, tôi đã tiến hành lựa chọn đề tài: “Nghiên cún tong hợp thuốc
chữa bệnh tiếu đường metformin hydrochloride” có ý nghĩa rất lớn về khoa
học và thực tiễn.

1


CHƯƠNG I. TỐNG QUAN
1.1. Khái quát về bệnh tiểu đường.
1.1.1. Phân loại bệnh tiếu đường.
Bệnh tiểu đường là một nhóm bệnh rối loạn chuyển hóa cacbohydrat
khi hoóc môn insulin của tụy bị thiếu hay giảm tác động trong cơ thế, biểu
hiện bằng mức đường trong máu luôn cao; trong giai đoạn mới phát thường
làm bệnh nhân đi tiểu nhiều, tiểu ban đêm và do đó làm khát nước. Bệnh tiểu
đường là một trong những nguyên nhân chính của nhiều bệnh hiểm nghèo,
điên hình là bệnh tim mạch vành, tai biến mạch máu não, mù mắt, suy
thận, liệt dương, hoại thư, v.v.
Bệnh tiểu đường được chia thành hai loại như sau:

Tiểu đường tuýp I:
Tiểu đường tuýp I là một bệnh tự miễn trong đó hệ thống miễn dịch
của cơ thế phản ứng lại và phá huỷ tế bào p sản xuất insulin của đảo tuỵ.
Sự thiếu hụt insulin

dẫn đến tăng glucose máu và thường dẫn đến các

biến chứng mãn tính.
Khoảng 5-10% tổng số bệnh nhân mắc bệnh tiểu đường thuộc loại I,
phần lớn xảy ra ở trẻ em và người trẻ tuối (<20 tuổi). Các triệu chứng thường
khởi phát đột ngột và tiến triển nhanh nếu không điều trị. Giai đoạn toàn phát
có tình trạng thiếu insulin tuyệt đối gây tăng đường huyết và nhiễm Ceton.
Những triệu chứng điển hình của bệnh tiểu đường loại I là: ăn nhiều,
uống nhiều, tiêu nhiều, gầy nhiều (4 nhiều), mờ mắt, dị cảm và sụt cân, trẻ em
chậm phát triển và dễ bị nhiễm trùng.
Tiểu đưòìig túyp II:
Bệnh tiểu đường tuýp II được đặc trung bởi kháng insulin và giảm tiết
chế insulin dẫn đến mất khả năng duy trì mức glucose máu bình thường.

2


Bệnh tiểu đường loại 2 chiếm khoảng 90-95% trong tồng số bệnh nhân
bệnh tiếu đường, thường gặp ở lứa tuối trên 40, nhưng gần đây xuất hiện ngày
càng nhiều ở lứa tuối 30, thậm chí cả lứa tuối thanh thiếu niên.
Bệnh nhân thường ít có triệu chứng và thường chỉ được phát hiện bởi
các triệu chứng của biến chứng, hoặc chỉ được phát hiện tình cờ khi đi xét
nghiệm máu trước khi mổ hoặc khi có biến chúng như nhồi máu cơ tim, tai
biến mạch máu não; khi bị nhiễm trùng da kéo dài; bệnh nhân nữ hay bị ngứa
vùng do nhiễm nấm âm hộ; bệnh nhân nam bị liệt dương.

Các túyp tăng đường huyết đặc hiệu khác:
- Đái tháo đường thai kỳ.
- Thiếu hụt di truyền chức năng tế bào p.
- Thiếu hụt di truyền về tác động của insulin.
- Bệnh tuyến tụy ngoại ti ế t....
1.1.2. Các thuốc điều trị bệnh tàng đường huyết.
Dựa vào tác dụng và cơ chế tác dụng, các thuốc điều trị bệnh tiểu đường
được chia thành 3 nhóm chính như sau:
- Insulin và các thuốc kích thích bài tiết insulin.
- Các thuốc làm tăng nhạy cảm insulin.
- Các thuốc chống tăng đường huyết sau bữa ăn.
1.1.2.1.

Insulin và các thuốc kích thích bài tiết insulin.

+ Insuỉỉn:
Insulin là hormon do tế bào p của tuyến tuỵ tiết xuất, đóng vai trò chủ
yếu trong cơ chế điều hoà đường huyết của cơ thê. Insulin là một trong những
hormon quan trọng của cơ thể, không chỉ tác dụng trên chuyển hoá năng
lượng và phát triển cơ thể, mà còn là chất cần thiết cho sự sống. Tác dụng của

3


insulin bao gồm các đáp ứng phức tạp mà ảnh hưởng cuối cùng là trên chuyến
hoá glucid, lipid và protid.
+ Thuốc kích thích bài tiết insulin
Các sulfonylurea:
Năm 1942, Janbon đã tình cờ phát hiện tác dụng hạ đường huyết của dẫn
suất sulfonamid (1154RP) ở nhũng bệnh nhân điều trị sốt thương hàn. Từ

phát hiện này, nhiều nghiên cứu về tác dụng hạ đường huyết của các
sulfonylurea đã được tiến hành. Các nghiên cún ngày càng làm sáng tỏ cơ
chế tác dụng của thuốc. Nhiều thuốc thuộc nhóm sulfonylurea đã ra đời, bao
gồm các thuốc thế hệ I (tolbutamide, chlorpropamide) và các thuốc thế hệ II
(Glyburide, Glypizide). Các thuốc này đang được sử dụng rộng rãi trên lâm
sàng, đem lại nhiều kết quả khả quan cho người bệnh.
1.1.2.2. Các thuốc làm tăng nhạy cảm insulin.
Các biguanide:
Năm 1926, Frank và cộng sự đã tổng hợp synthalin từ nhân guanidin.
Chính các synthalin là tiền thân của các biguanid sau này.
Công thức chung:
R- N H -

c- N H - c - N H2
II

II

NH

NH

Các thuốc thuộc nhóm biguanide bao gồm: metformin, phenformin và
buformin. Hiện nay metformin là thuốc đang được sử dụng phồ biến nhất, vì
ít gây tăng axit lactic trong máu hơn. Các biguanide là thuốc chống tăng
đường huyết, không gây hạ đường huyết. Thuốc tác dụng chủ yếu ngoài tuỵ,
không có tác dụng kích thích tế bào p tuyến tuỵ bài tiết insulin.

4

1.1.2.3. Thuốc chống tăng đường huyết sau ăn (thuốc ức chế enzym aglucosỉdase).
Acarbose:
Acarbose là thuốc ức chế enzym glucosidase của tế bào niêm mạc ruột.
Do tác dụng ức chế enzym này, thuốc làm giảm hoặc chậm quá trình hấp thụ
tinh bột, dextran và các disaccharide ở ruột non, tránh được tình trạng tăng
đường huyết sau ăn. Thuốc có tác dụng tốt cho cả 2 tuýp bệnh.
1.1.3. Quan niệm củ a y học cổ truyền về bệnh tiểu đưòĩig.
Theo quan niệm của Đông y, bệnh thuộc phạm vi chứng tiêu khát với ba
triệu chứng chủ yếu là ăn nhiều, uống nhiều và tiểu nhiều.
1.1.4. Các thuốc Đông y điều trị bệnh tiểu đường.
Các thuốc Đông y điều trị bệnh tiếu đường chủ yếu là các thuốc có
nguồn gốc từ dược liệu như sinh địa (Rehmania glutinosa Libosch,
Scrophulariaceae), cỏ ngọt (Stevia rebaudiana, Asteraceae), mưóp đắng
(Momordica charantia L.Cucurbitaceae), hoàng kỳ (Astragalus
membranaceus, Fabaceae), huyền sâm (Scrophularỉa ningpoensis Hemsl,
Scrophulariaceae)...
1.2. Thuốc chữa bệnh tiểu đường Metformin hydrochloride.
1.2.1. Tống quan về Metformin hydrochloride
1.2.1.1. Công thức
- Công thức phân tử:C4Hi]N5.HCl
- Phân tử lượng: 165.6
- Tên khoa học: 1,1 - dimethyl biguanid hydrochloride
1.2.1.2. Tính chất lý hóa
- Tinh thê màu trăng;

5


- Tan nhiều trong nước, ít tan trong ancol, thực tế không tan trong

acetone và dichloromethane;
- Điểm nóng chảy: 225°c - 226°c.
1.2.1.3. Tác dụng dược lý và cơ chế tác dụng
Metformin là một thuốc chống tiểu đường nhóm biguanid, có cơ chế
tác dụng khác với các thuôc tiêu đường nhóm sulfunylure, metformin không
kích thích giải phóng insulin từ các tế bào tuyến tụy. Metformin không có tác
dụng hạ đường huyết ở người bình thường, metformin làm giảm sự tăng
đường huyết nhưng không gây tai biến hạ đường huyết. Metformin làm giảm
nồng độ glucose trong huyết tương cả khi đói và sau bữa ăn của người bệnh
tiểu đường tuýp II.
Cơ chế tác dụng ngoại biên của metformin là:
- Làm tăng sử dụng glucose ở tế bào.
- Cải thiện liên kết của insulin với thụ thể.
- ứ c chế tống hợp glucose ở gan và làm giảm hấp thu glucose ở một.
- Ngoài ra, metformin phần nào còn ảnh hưởng tốt trên chuyển hóa
lipoprotein, thường bị rối loạn ở người bị đái tháo đường không phụ thuộc
insulin.
1.2.1.4. Dược động học
- Hấp thu: Metformin hấp thu chậm và không hoàn toàn ở đường tiêu
hóa, sinh khả dụng tuyệt đối của 500mg metformin uống lúc đói là 50 - 60%.
Thức ăn làm giảm mức độ và tốc độ hấp thu của metformin.
- Phân bo: Metformin liên kết với protein huyết tương với mức độ
không đáng kể, thuốc phân bố nhanh chóng vào các mô và dịch, cả vào trong
hồng cầu.
- Chuyển hóa: Metformin không bị chuyển hóa ở gan.

6


-

Thải trừ: Metformin chủ yếu được thải trừ qua ống thận (90%), không

thải trù’ qua mật
1.2.2. Tình hình nghiên cún trong nước.
Tông hợp metformin từ CaO, ure và dimethylamin. Quá trình tông họp
được được tiến hành qua 3 bước [2J:
* Bước 1: Tổng họp calci cyanamide:
CaO + 2H2N - C O - N H 2 -> Ca(NCO)2 + 2NH3 + H 20

130-180°c

Ca(NCO)2 + 2H2N - c o - NH2 -> Ca[H{NCO),]+ NH3

180-300°c

3Ca[H(NCO)3]+ 3H 20 -> Ca3[(NCO)]2 + 3NH, + 3C 0 2

180-300°c

3Ca[H(NCO),]+ 3H 20

300-580°C

Ca3[(NCO)3]2

Ccl[(NCO),]2 + 3HNCO

3Ca(NCO)2

3CaCN2 + 3C0 2

60 0 -7 5 0 ° c

Calci cyanamide

So' đồ 1.1: Quá trình tổng họp calci cyanamid
Calci cyanamide được tạo thành phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ phản
ứng. Theo tác giả Ngô Quốc Huy, quá trình phản ứng thực hiện theo 2 giai
đoạn:
- Giai đoạn 1: Nung CaO và ure ở nhiệt độ 180-300°C
- Giai đoạn 2: Tiếp tục nung hỗn họp trên ở nhiệt độ

750°c

*Bưó’c 2: Tống họp 1-cyanoguanidine :
Từ calci cyanamide đã được tổng hợp trong bước 1, đem đun nóng trong
dung môi H 2 0 nhận được 1-cyanoguanidin được mô tả trong sơ đồ sau:
CaCN2

+

H20

^ ^
30 phút

H2N -C -N H -C N
NH

+

2 Ca(OH)2

1-cyanoguanidine
Sơ đồ 1.2: Quá trình tổng họp 1-cyanoguanidine

7


Điều kiện phản ứng thích họp tồng hợp 1-cyanoguanidine là ở nhiệt độ
70

°c trong khoảng

thời gian 30 phút. Phản ứng rất dễ bị polyme hóa nên khó

tinh chế, hiệu suất phản ứng phụ thuộc nhiều vào điều kiện phản ứng . 1Cyanoguanidine được tổng hợp từ nguyên liệu rẻ như CaO và ure rất có ý
nghĩa, tuy nhiên quá trình phản ứng phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ, đặc biệt
cần phải thực hiện phản ứng ở nhiệt độ

750°c

nên khó kiểm soát và ít có ý

nghĩa thực tiễn.
* Bước 3: Tổng họp metformin hydrochloride:
1-Cyanoguanidine được phản ứng với dimethylamin hydrochloride ở
nhiệt độ cao nhận được metformin hydrochloride. Quá trình phản ứng được
mô tả trong sơ đồ sau:

h2n - c - n h - c n
II
NH

+

(CH3)2NH.HCI

t°c

NH
LĨ 'CH3
h2n - c - n h - c n
II
ch3
NH
,

•HCI

metformin hydrochloride
Sơ đồ 1.3: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride
Mặc dù phương pháp tông hợp metformin từ những nguyên liệu rẻ tiền
như: CaO, ure và dimethylamin nhưng do phản ứng cần tiến hành ở nhiệt độ
cao nên tạo ra sản phẩm polyme và khó tinh chế dẫn đến khó áp dụng ở quy
mô lớn để tổng hợp 1-cyanoguianidine (tên khác là dicyano diamide).
1.2.3. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Metformin được mô tả năm 1957 như chất có hoạt tĩnh hạ đường huyết
và năm 1979 được đưa ra thị trường ở Pháp nhưng đến tận 1994 mới được
FDA cho phép lun hành đê chữa bệnh tiêu đường tuýp 2 ở Mỹ [5J.

Metformin hydrochloride (Af,Af-dimethylimidodicarbonimidic diamide
hydrochloride) được tổng hợp bởi Shapiro và các cộng sự [12] bằng cách
cho dimethylamine hydrochloride phản ứng với dicyano diamide ở nhiệt độ


140°c (sơ đồ 1.4). Bằng con đường này Shapiro và cộng sự đã tổng họp được
hàng trăm dẫn chất biguanid. Các dẫn chất này đã được nghiên cứu hoạt tính
hạ đường huyết.
H N

__
"C = N -C =N
HpN

NH
NH
:N -C -N H -C -N H 2 .HCI
H3C
2

------------------------------ 140°c

metformin hydrochloride
So’ đồ 1.4: Quá trình tống họp metformin hydrochloride theo Shapiro
Năm 2008, Anvar Shalmashi [13] đã đưa ra phương pháp mới để tổng
họp metformin hydrochloride. Phản ứng điều chế metformin được thực hiện
trên bản mỏng điều chế và được đặt trong thiết bị microwave ở bước sóng
540W trong 5 phút đạt hiệu suất 92%.
H N _

__

NH

2 "C=N-C=N

h 2n

----------------------------MW

h 3c

NH

:n-C -N H -C -N H 2 .HCI
2

5min, 540W

So’ đồ 1.5: Quá trình tống hạp metformin hydrochloride theo Shalmashi
Gần đây đã có một số công trình nghiên cứu tạo các dẫn xuất của
metformin nhằm tăng hiệu quả sử dụng của nó trong điều trị bệnh tiếu đường.
Kristiina và các cộng sự [8] đã tổng họp được một số tiền chất của
metformin như mô tả trong sơ đồ 1.6 và sơ đồ 1.7. Các chất này có khả năng
tan tốt trong dầu và tăng khả năng hấp phụ trong ruột.
NH NH2

Ẫ
/

Ả
N

NH NH

S-R
N

H

.
------------------ -

Ẳ
/

Ẵ
N

H

NH2

Sơ đồ 1.6: Chuyển hóa các tiền chất về metformin

9


R=Ph

Sơ đồ 1.7: Tổng họp các dẫn xuất của metformin
Nhằm làm tăng hiệu quả sử dụng của metformin, Rao và các cộng sự
đã nghiên cún tống hợp các phức chất của metformin với Cu và Ni. Các phức
này đã được nghiên cún hoạt tính hạ đường huyết. Ket quả nghiên cứu cho
thấy các chất này có hoạt tính cao hơn nhiều so với metformin [11].
Ket quả nghiên cứu của Bentefrit và các cộng sự về tổng hợp phức chất
của metformin với platin cho thấy phức chat tetrachloro (metformin) platin
(IV) có hoạt tính kìm hãm sự tăng sinh của dòng tế bào ung thư P388 tương
tự như Cis-platin [4].
Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của metformin cho thấy, họp chất
metformin không chỉ có tác dụng chữa bệnh tiểu đường tuýp 2 rất hiệu quả
mà cũng có khả năng chống ung thư tuyến tụy, ung thư vú [3,6,7,9,10,14,15].
Từ các tư liệu đã có có thể thấy rằng con đường tổng hợp metformin từ
dicyano diamide là khả thi. Tống họp theo con đường này chỉ có một bước
phản ứng không cần những hóa chất đắt tiền nên rất khả thi và có thể thực
hiện được ở quy mô pilot.
1.2.4. Các phương pháp nghiên cứu
Ỉ.2 .4 .Ỉ. Phương pháp sắc kỉ bản mỏng
Sắc kí bản mỏng được sử dụng để định tính chất đầu và sản phẩm.
Thông thường sản phấm với giá trị Rf khác nhau màu sắc và sự phát quang
khác nhau... Dùng sắc kí lóp mỏng để biết được phản ứng xảy ra, không xảy
ra, kết thúc phản ứng.

10


Phương pháp sắc kí lớp mỏng gồm pha tĩnh là 1 lớp mỏng các chất hấp
phụ, thường là Silicagel 60F254, aluminum oxide được phủ trên một mặt
phẳng chất trơ. Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong
dung môi thích hợp và được hút lên sắc kí bởi mao dẫn, tách dung dịch thí

nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong dung dịch.
Dùng mao quản chấm một vết nhỏ dung dịch nguyên liệu đầu, một
vệt là sản phản phản ứng khoảng lcm từ dưới lên. Bản sắc kí sau đó được
nhúng vào một hệ dung môi thích hợp n-hexan/EtOAc được đặt trong bình
triên khai. Dung môi được chuyển lên bản sắc kí gặp phải mẫu thử và dung
dịch chuyển mẫu thử lên bản sắc kí. Các chất với R f khác nhau dịch chuyển
với tốc độ khác nhau do chúng có sức hút khác nhau với pha tĩnh và độ tan
khác nhau trong dung môi. Hợp chất có tính phân cực sẽ di chuyến lên cao
hơn trên bản sắc kí. Đối với những chất có ƯV ta kiểm tra

ưv

có thể nhận

được các vết khác nhau. Dựa vào các vết trên bản mỏng cùng với giá thị R f
tương ứng ta có thế nhận biết được phản ứng đã xảy ra hay chưa, nguyên
liệu đầu còn hay hết.
Dựa vào tính chất đó chúng ta có thể tìm được dung môi hoặc hỗn họp
dung môi để các chất tách ra khỏi nhau (Rf khác nhau) tìm được hệ dung môi
cần để tinh chế các chất.
Có thể sử dụng một hỗn họp hai dung môi. Trong hai dung môi đó một
dung môi có khả năng hòa tan tốt chất kết tinh còn dung môi kia thì ngược lại
hoặc ít tan. Hỗn hợp hai dung môi này phải hòa tan vào nhau tạo thành một
dung dịch đồng nhất trong suốt.
Thông thường một chất dễ hòa tan trong dung môi có cấu trúc hóa học
gần gũi. Ví dụ các este dễ hòa tan trong cồn hoặc trong etylaxetat. Các


hidrocacbon dễ tan trong benzen, ete, dầu, n-hexan. Thường dung môi có
nhiệt độ sôi từ 600C - 800C là thích hợp.

1.2.4.2. Chiết
Chiết là quá trình tách và phân li các chất dựa vào quá trình chuyến một
chất hòa tan trong một pha lỏng (thường là nước) một pha lỏng khác không
hòa tan vào nó (thường là dung môi hữu cơ không hòa tan với nước). Như vậy
ta có quá trình chiết lỏng.
Chiết là phương pháp có ứng dụng rất có hiệu quả vào các mục đích
tách, phân ly, làm giàu các chất đặc biệt khi cần tách một lượng nhỏ các tạp
chất ra khỏi một lượng lớn các chất khác.
Ưu điểm của quá trình là thực hiện nhanh. Các thiết bị chiết đơn giản
chỉ là phễu chiết thường người ta không cần thiết bị gì thêm. Chọn được dung
môi (dung môi chiết CH2C12) và điều kiện chiết thích hợp với chất thử người
ta có thể tách được bất kì cấu tử nào ra khỏi hỗn hợp bất kì. Trường hợp chất
chiết có màu ta có thế sử dụng phần chiết vào mục đích phân tích định lượng
theo các phương pháp đo quang.
1.2.4.3. Loại bỏ dung môi ở áp suất thấp
Dùng máy cất quay chân không. Sau khi loại bỏ dung môi để thu được
chất khô hoàn toàn ta dùng máy hút chân không hút làm khô chất.
1.2.4.4. Sắc kí cột
Nguyên tắc sắc kí cột dựa trên ái lực hấp phụ khác nhau của các chất
thử đối với chất hấp phụ đế tách các chất riêng ra. Nhưng trong sắc kí cột,
chất làm nền cho pha cố định được nhồi trong ống hình trụ và vì thế mà gọi là
sắc kí cột. Với cột hấp phụ người ta có thể triển khai một dung môi liên tục,
hoặc một hệ thống các dung môi từ phân cực yếu đến phân cực mạnh.

12


Dụng cụ chủ yếu là cột để nhồi chất hấp phụ để làm thành cột kí. Cột
có thế là những ống hình trụ dài 3 0 - 1 OOcm, đường kính từ 1 - 8cm tùy theo
chiều dài cột tỉ lệ giữa đường kính.

1.2.4.5. Phương pháp nhồi cột huyền phù
Cột đem dùng phải thật sạch, khi đối với chất hấp phụ là nhôm oxit, có
thê dùng phương pháp nhồi cột khô, nghĩa là lắp cột thắng đứng, chắc chắn.
Đố lượng A1203 qua phễu, theo một ống đố vào đáy cột. Rót từ từ đều
đặn để tạo nên một cột liên tục đều đặn, bằng phang không có chỗ rỗng, chỗ
dày, chỗ mỏng sau khi rót hết chất nhồi vào cột người ta có thể dùng một đũa
thủy tinh đầu gắn với một nút cao su và gõ nhẹ đều vào thành cột cho đến khi
nhận được một chiều cao nhất định.
1.2.4.6. Phương pháp lựa chọn chất hâp phụ và dung môi chạy cột sắc kí
Chọn chất hấp phụ
Thông thường ta sử dụng chất hấp phụ là silicagel, ngoài ra còn dùng
Sephadex, sắc kí trao đổi ion.
Lựa chọn dung môi chạy cột sắc kí
Để lựa chọn dung môi hay hệ dung môi chạy cột sắc kí silicagel ta phải
dựa vào sắc kí lớp mỏng với các bước cơ bản sau:
- Hoà tan hoàn toàn một lượng nhỏ mẫu chạy cột trong dung môi
thích hợp.
- Chuẩn bị 4-^6 tấm bản mỏng rồi chấm dung dịch mẫu trên lên mỗi
tấm với lượng tương đương nhau.
- Mỗi bản mỏng được chạy với loại dung môi có độ phân cực khác
nhau. Tiếp theo hiện hình dưới đèn ƯV hoặc thuốc thử. Với đơn dung môi sẽ
dễ dàng thấy được dung môi nào thích hợp. Từ kết quả đó tìm được hệ dung

13


môi (trong đó có một dung môi kém phân cực và một dung môi phân cực, (ví
dụ n-hexan/EtOAc) phù hợp để chạy cột sắc kí.
- Với mẫu chất được chiết từ cây cỏ (có chứa nhiều chất từ không
phân cực đến phân cực), lựa chọn dung môi chạy cột ban đầu là dung môi đẩy

vết kém phân cực nhất lên R f khoảng 0,5 và dung môi chấm dứt sắc kí là
dung môi đẩy vết phân cực nhất lên R f khoảng 0,2 trên bản mỏng.
Sau khi chọn được hệ dung môi phù hợp ta thực hiện chạy cột sắc kí
với hệ dung môi từ kém phân cực tăng dần đến phân cực.
Chú ỷ:
- Phải sử dụng pha tĩnh của sắc kí lớp mỏng và sắc kí cột giống nhau.
- Dung môi ban đầu chạy cột là dung môi phù họp đã chọn được ở trên
nhung cần điều chỉnh cho độ phân cực kém hơn một ít. Vì chất hấp phụ, ví dụ
như silicagel tráng trên bản mỏng có kích thước nhỏ hơn, độ mịn và độ chặt
chẽ lớn hơn so với silicagel khi thực hiện chạy cột sắc kí.
- Đối với sắc kí cột Sephadex ta thường dùng một dung môi là MeOH.
Tỉ lệ giữa lượng mẫu chất cần tách vói kích thưóc cột
Các khảo sát thực nghiệm cho thấy muốn tách chất tốt thì khối lượng
silicagel (chất hấp phụ) phải lớn hơn khoảng 25 - 50 lần khối lượng của mẫu
chất cần tách. Với mẫu chất cần tách là những hỗn hợp chất khó tách riêng thì
tỉ lệ này còn cao hơn (khoảng 100 - 200 lần).
Tỉ lệ giữa chiều cao lượng Silicagel và đưòng kính trong của cột sắc kí
Các khảo sát thực nghiệm cũng cho thấy muốn tách chất tốt thì
chiều cao của silicagel trong cột và đường kính trong của cột cần đạt tỉ lệ
khoảng 10:1.
Muốn biết lượng silicagel có phù hợp với cột hay không thì cho
silicagel dạng khô (chưa có dung môi) vào cột để quan sát.
Cách nạp silicagel vào cột

14


Đe việc tách chất được tốt, silicagel phải được nạp vào cột một cách
đồng nhất đế hạn chế việc “nứt” cột, bất thường. Silicagel được nạp vào cột
theo hai cách.

Nạp siỉicagen ở dạng sệt
Cố định cột trên giá. Nếu đầu ra của cột không có lớp thuỷ tinh xốp thì
ta cho một lớp bông mỏng vào đáy đê ngăn không cho silicagel chảy xuống
bình hứng. Cho hệ dung môi chạy cột ban đầu vào bình đựng (cốc, ca nhựa).
Cân lượng silicagel cần thiết (đã tính toán xác định được ở trên) cho vào bình
đựng đều đặn, mồi lần một lượng nhỏ và khuấy đều.
Lưu ý:
- Không nên thực hiện ngược lại nghĩa là rót dung môi vào silicagel
bởi vì silicagel khi gặp dung môi sẽ phát nhiệt, có thể làm vón cục, không
đồng nhất.
- Lượng dung môi phải vừa đủ đế hỗn họp không được quá sệt khiến
bọt khí sẽ bị bắt giữ trong cột và cũng không được quá lỏng.
- Rót hồn hợp sệt vào cột qua một phễu lọc và mở nhẹ khoá đế dung
môi chảy xuống bình hứng (dung môi này tiếp tục được dùng đế rót trở lại
đầu cột).
- Tiếp tục rót hỗn hợp vào cột đến hết số lượng, vừa rót vừa gõ nhẹ
thành cột bằng thanh cao su để silicagel nén đều trong cột.
- Sau khi nạp xong cho dung môi chảy đều qua cột hai, ba lần để cột
được đồng nhất.
Lưu ý:
- Nhất thiết không để đầu cột bị khô, nghĩa là luôn luôn có dung môi
phủ trên phần đầu cột.
- Sau khi nạp cột xong, mặt thoáng Silicagel phải phắng. Nếu mặt
thoáng chưa phang ta có thể dùng đũa thuỷ tinh khuấy phần dung môi sát mặt

15


thoáng làm xáo trộn phần trên đầu cột rồi để yên cho silicagel lắng xuống từ
từ tạo nên mặt thoáng bằng phắng.

- Với sắc kí cột sephadex ta thao tác tương tự nhưng cần ngâm
sephadex với dung môi một thời gian để sephadex trương nở trước khi cho
vào cột.
Nạp silicagen ở dạng khô
- Cột được giữ thắng đứng trên giá. Cho miếng bông nhỏ vào đáy cột
(nếu cột không có lớp thuỷ tinh xốp), rót dung môi chạy cột ban đầu vào
khoảng hai phần ba cột.
- Cho từ từ silicagel dạng khô vào cột qua phễu lọc, vừa cho vào vừa
gõ nhẹ thành cột. Khi lóp silicagel trong cột cao khoảng 2 cm thì mở nhẹ
khoá và cho dung môi chảy xuống bình hứng (dung môi này tiếp tục được rót
trở lại đầu cột).
- Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy qua vài ba lần để cột được ổn
định trước khi nạp mẫu vào.
- Thông thường người ta nạp silicagel vào cột ở dạng sệt.
Cách nạp mâu vào cột
Có hai phương pháp nạp mẫu vào cột sắc kí là phương pháp khô và
phương pháp ướt.
* Phương pháp nạp cột khô:
Mầu được nạp ở dạng khô. Thường áp dụng cho trường họp mẫu chất
không tan hoặc tan kém trong dung môi chạy cột ban đầu. Cách chuẩn bị
mẫu: Hoà tan hoàn toàn mẫu trong dung môi thích hợp, cho một lượng
silicagel vừa đủ (lượng silicagel cho vào càng ít càng tốt, nhưng phải đủ đế có
thể cô quay mẫu được khô hoàn toàn) vào rồi đem cất quay đuổi dung môi
đến khô hoàn toàn. Lấy mẫu đã gắn đều trên silicagel ra, nghiền thành bột
mịn. Cột sau khi nạp silicagel được điều chỉnh lượng dung môi vừa đủ (đủ

16


thấm ướt mẫu khô cho vào). Cho mẫu vào cột qua phễu một cách từ từ để

silicagel đã được gắn đều mẫu thấm đều dung môi tránh tạo bọt khí và tránh
để mẫu bị vón cục.
* Phương pháp cột ướt:
Thường áp dụng khi mẫu tan hoàn toàn trong dung môi chạy cột ban
đầu. Lượng dung môi dùng hoà tan mẫu càng ít càng tốt, vì lóp dung dịch này
sẽ dàn trải một lóp mỏng trên cột.
Có thể áp dụng tính toán cụ thể như sau: thể tích dung môi cần lấy để
hoà tan mẫu = 0,4.d2ra/, với d là đường kính trong của cột tính bằng mm.
Mầu được cho trực tiếp vào cột bằng ống hút mẫu (pipet). Cho mẫu
chảy vào từ từ theo thành cột. Với phương pháp nạp mẫu này chúng ta cho
dung môi trong cột chảy xuống sát bề mặt silicagel trong cột rồi khoá cột. Sau
đó, mở khoá đê mẫu chảy xuống đến sát bề mặt silicagel. Cho từng lượng nhỏ
dung môi chạy cột vào để mẫu chảy qua bề mặt silicagel trong cột và rửa sạch
thành cột rồi tiến hành chạy cột (đế lớp mẫu chất chảy xuống được đồng đều).
1.3. Tổng quan

về

các phưong pháp xác định cấu trúc hợp chất hữu

CO’

Cấu trúc của chất phân lập ra được xác định bằng sự kết hợp của nhiều
phương pháp khác nhau. Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của từng hợp chất
mà người ta sử dụng các phương pháp khác nhau, c ấ u trúc càng phức tạp thì
yêu cầu phối họp các phương pháp càng cao.
1.3.1. Điểm nóng chảy (Mp)
Đối với chất rắn kết tinh, điêm chảy là một tiêu chuẩn vật lý rất quan
trọng. Thông thường việc phân tích đầu tiên sau khi thu được một sản phẩm
kết tinh là việc xác định điểm chảy vì đó là tiêu chuẩn để kiểm tra mức độ

tinh khiết của hợp chất mà chỉ cần lượng rất ít mẫu thử.
Neu điểm chảy của hai loại tinh thể thu được qua hai lần kết tinh chỉ
chênh lệch nhau không quá

0,5°c

thì có thể xem sản phẩm kết tinh là tinh

17


khiết. Khi điểm chảy xác định được, đối chiếu với tài liệu tham khảo để có thể
đưa ra kết luận sơ bộ về hợp chất đang nghiên cứu.
1.3.2. Độ quay cực ([a]D)
Ánh sáng tự nhiên đi qua một môi trường bất đắng hướng, trong điều
kiện nhất định nào đó, do tác dụng của môi trường làm cho cường độ điện
trường chỉ còn dao động theo một phương nhất định được gọi là ánh sáng
phân cực thẳng hay ánh sáng phân cực toàn phần.
Mặt phắng chứa tia sáng và phương dao động của vectơ điện trường
được gọi là mặt phẳng dao động, còn mặt phắng chứa tia sáng và vuông góc
với mặt phang dao động gọi là mặt phang phân cực.
Khi cho ánh sáng phân cực thắng đi qua dung dịch một chất quang hoạt
thì mặt phang phân cực sẽ bị quay một góc a. Tuỳ theo chất quang hoạt mà
góc quay này có thế sang phải (+) hay sang trái (-). Độ lớn củakk góc quay a
phụ thuộc vào nồng độ

c

(g/lOOml dung dịch), chiều dài lớp dung dịch (dung

môi) 1, nhiệt độ t và chiều dài sóng X:
- r [ccl* —
Cỉ
ơ. =

1

*

100

1.3.3. Phố cộng hưởng từ hạt nhân
(Nuclear Magnetìc Resonancespectroscopy, NMR)
Phố cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu
hiệu nhất hiện nay được dùng để xác định cấu trúc hoá học các hợp chất hữu cơ
nói chung và họp chất thiên nhiên nói riếng. Với việc sử dụng kết họp các kỹ
thuật phồ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định
chính xác cấu trúc của hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử. Nguyên lý
chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và phổ carbon) là sự cộng
hưởng ở các tần số khác nhau của các hạt nhân từ (]H và l3C) dưới tác dụng của
từ trường ngoài. Các tần số cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ

18