Nghiên cứu phương pháp định lượng nifedipin trong huyết tương chó để đánh giá sinh khả dụng viên nén nifedipin tác dụng kéo dài

BỘ Y TÊ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC D ược HÀ NỘI
----- o ó o -----

NGUYỄN HẢI LINH

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG NIFEDIPIN
TRONG HUYẾT TƯƠNG CHÓ ĐE ĐÁNH GIÁ SINH KHẢ
DỤNG VIÊN NÉN NIFEDIPIN TÁC DỤNG KÉO DÀI

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ ĐẠI HỌC
KHOÁ 1997-2002

Giáo viên hướng dẫn : TS. Võ Xuân Minh
ThS. Phạm Thị Minh Huệ
Nơi thực hiện
: Bộ môn Bào chế - ĐH Dược
Trung tâm kiểm nghiệm
dược quân đội
Thời gian thực hiện : 01/03 đến 25/5/2002

Hà N ội-5/2002


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên em xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới
các thầy giáo, cô giáo:
TS: Vỗ Xuân Minh
ThS: Phạm Thị Minh Huệ
Và các thầy cô giáo, cán bộ công nhân viên bộ môn bào chế, bộ môn
dược lý, bộ môn dược lâm sàng, phòng thí nghiệm GMP trường Đại học

Dược Hà Nội. Em xin cảm ơn Labo dược động học, khoa vật lý, ban Giám
đốc Trung tâm kiểm nghiệm dược quân đội đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ
và tạo mọi điều kiện để em thực hiện và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp
này.
Em xin chân thành cảm ơn tất cả các thầy giáo, cô giáo và cán bộ
trường Đại học Dược Hà Nội cùng tất cả bạn bè đã dạy bảo và giúp đỡ em
trong suốt 5 năm học vừa qua.

Hà Nội, ngày 24 tháng 05 năm 2002

Nguyễn Hải Linh


CÁC CHỮVIÊT TẮT

c

Nồng độ.

DĐH

Dược động học.

HPLC

Sắc kí lỏng hiệu năng cao.

NIFE

Nifedipin.

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối.

SD

Độ lệch chuẩn.

SKD

Sinh khả dụng.

t°c

Nhiệt độ.

TB

Trung bình.

TDKD

Tác dụng kéo dài.


MỤC LỤC
ĐẶT VÂN ĐỂ
PHẦN 1: TỔNG QUAN
1.1. Nifedipin...........................................................

1.1.1. Công thức cấu tạo và tính chất.........................................
1.1.2. Dược động học...................................................
1.1.3. Tác dụng.............................................................
1.1.4. Chỉ định..............................................................
1.1.5. Tác dụng bất lợi.........................................................
1.1.6. Liều dùng.............................................................

Trang
2
2
2
3
3
3
4

1.1.7. Một số chế phẩm nifedipin tác dụng kéo dài trên thị trường.....4
1.1.8. Các phương pháp định lượng nifedipin........................................ 5
1.2. Sinh khả dụng và cách đánh giá.............................................
8
1.2.1. Các khái niệm cơ bản........................................................
8
1.2.2. Sinh khả dụng của viên nén........................................................11
1.2.3. Phương pháp đánh giá sinh khả dụng......................................... 12

PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiêm...................................... 16
2.1.1. Nguyên vật liệu, phương tiện nghiên cứu và súc vật thí nghiệmló
2.1.2. Phương pháp thực nghiệm...........................................................17
2.2. Kết quả thực nghiệm...................................................................

20
2.2.1. Khảo sát một số hệ dung môi pha động để định lượng nifedipin
trong huyết tương chó bằng HPLC............................................................... 20
2.2.2. Xây dựng đường chuẩn nifedipin trong huyết tương chó........23
2.2.3. Xác định tính chính xác và độ lặp lại của phương pháp............ 24
2.2.4. Xác định hiệu suất chiết của nifedipin trong huyết tương chó . 26
2.2.5. Định lượng nifedipin trong huyết tương chó...............................27
2.3. Bàn luận...........................................................................
34

PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUÂT.
3.1. Kết luận..........................................................................
3.2. Đề xuất.................................................................................

35
35


Đ Ặ T V Ấ N ĐỂ
Một chế phẩm thuốc mới bào chế, đặc biệt là thuốc tác dụng
kéo dài thì việc so sánh sinh khả dụng in vivo với chế phẩm đối
chiếu (đã có uy tín về hiệu quả điều trị) là việc làm thực sự cần
thiết để chứng minh tính khả dụng sinh học của nó. Hiện nay, rất
ít các xí nghiệp sản xuất dược phẩm và trung tâm nghiên cứu về
dược trong nước nghiên cứu vấn đề này vì khó khăn về trang thiết
bị và phương pháp nghiên cứu...
Nifedipin là thuốc chẹn kênh calci, dùng để điều trị cao huyết
áp và đau thắt ngực, đây là bệnh đòi hỏi người bệnh phải sử dụng
thuốc thường xuyên, kéo dài. Nifedipin có thời gian bán thải ngắn
(t1/2 = 2-5 giờ) nên cần được bào chế dạng thuốc tác dụng kéo dài.

Bộ môn bào chế trường Đại học Dược Hà Nội đã nghiên cứu
và bào chế viên nén nifedipin tác dụng kéo dài hàm lượng 20 mg.
Để chế phẩm đến được với người dùng thì ngoài đánh giá sự giải
phóng in vitro cần được đánh giá sinh khả dụng in vivo và thử
nghiệm lâm sàng.
Trong phạm vi khoá luận tốt nghiệp này mục tiêu nghiên cứu
của chúng tôi là :
> Nghiên cứu, khảo sát điều kiện để định lượng nifedipin trong
huyết tương chó bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
> Xác định nồng độ nifedipin trong huyết tương chó sau khi
cho uống viên nén nifedipin tác dụng kéo dài và viên đối
chiếu (Adalat- retard 20mg) từ đó so sánh sinh khả dụng của
viên nén nifedipin tác dụng kéo dài với viên Adalat- retard.

1


PHẦN 1: TỔNG QUAN
1.1. NIFEDIPIN.
1.1.1. Công thức cấu tạo và tính chất.[17]
Nifedipin có công thức cấu tạo như sau:
H3cooc

i>o52

0

H3COOC

CTPT: C17H 18N2O ó

TLPT: 346,34
Tên khoa học:

3,5 Pyridine dicarboxylic acid, 1,4- dihydro-

2,6- dimethyl - 4- (2- nitrophenyl) - dimethyl ester.
(Dimethyl 1,4- dihydro- 2,6 dimethyl- 4(0- nitrophenyl) - 3,5
- pyridine dicarboxylate)
Tinh thể bột màu vàng, hầu như không tan trong nước, tan
trong methanol, ethanol, 10 phần aceton, dễ tan trong cloroform.
Dưới

tác

dụng

của

ánh

sáng

dễ

bị

biến

đổi

thành

nitrosophenylpyridin.
Tnc= 171- 175°c.
1.1.2. Dược động học[12]
Hấp thu: nifedipin được hấp thu nhanh qua đường tiêu hoá,
tuy nhiên sinh khả dụng của thuốc dùng đường uống khá thấp

2


(SKD 45- 75%). Nồng độ trong máu đạt tối đa sau khi uống 30
- 60 phút. Thời gian bán thải 2-5 giờ.
Phân bố: Nifedipin gắn vào huyết tương với tỷ lệ cao (Khoảng
92- 98%).
Chuyển hoá: Chuyển hoá hoàn toàn ở gan thành chất không
còn hoạt tính (Chất chuyển hoá chưa rõ).
Thải trừ: Thải trừ chính qua nước tiểu ( 80% ngoài ra còn thải
trừ qua phân và mật 20%). Sau 24 giờ thải trừ hết thuốc khỏi cơ
thể.
1.1.3. Tác dụng/12]
Nifedipin là một tác nhân chẹn kênh calci, có tác dụng ức chế
một cách chọn lọc ion calci khi vào tế bào cơ tim, cơ trơn mạch
máu ở nồng độ thấp. Nên nó gây giãn mạch, chậm nhịp tim, giảm
co bóp cơ tim,giảm dẫn truyền nhĩ thất. Tác dụng chính của
nifedipin là giãn động mạch vành và mạch?vi (động mạch, tiểu
động mạch), thuốc ít có tác dụng trên tĩnh mạch.
1.1.4. Chỉ địnhl 12]
- Dự phòng và điều trị các cơn đau thắt ngực do co thắt mạch
vành.

- Chống loạn nhịp tim.
- Điều trị cao huyết áp thể vừa và nhẹ.
- Điều trị triệu chứng các hiện tượng Raynaud sơ hay thứ phát.
1.1.5. Tác dụng bất lợi [12]
ít xảy ra, thường xảy ra đối với những người mới dùng thuốc,
xảy ra khi ngay mới bắt đầu điều trị. Có thể gây cơn bốc hoả đỏ

3


bừng mặt, đau đầu, hoa mắt, chóng mặt, buồn nôn, đầy bụng, hạ
huyết áp thế đứng, chậm nhịp tim, bloc nhĩ thất, phù chi dưới,...
Triệu chứng bất lợi tăng trong chứng thiếu máu cục bộ đau
thắt ngực, tăng nhạy cảm với thuốc khi chức năng thận suy giảm.
1.1.6. Liều dù ng [1 2],[1]
- Liều thường dùng là lOmg

X

3 lần/ ngày. Uống sau bữa ăn và

tăng dần liều nếu cần.
- Liều tối đa : 180mg/ ngày- Dùng theo chỉ dẫn của bác sĩ.
- Với bệnh nhân cao tuổi hoặc khi dùng kèm thuốc khác, liều bắt
đầu là 5mg X 3 lần/ ngày.

- Dạng đặt dưới lưỡi hoặc ngậm cho hiệu quả nhanh sau 5 - 10
phút. Uống nhắc lại sau 5-15 phút.
- Trong cơn tăng huyết áp: Uống 10- 20mg, hiệu quả sau 15 - 20
phút, uống nhắc lại sau 30 phút.

- Với viên tác dụng kéo dài 20mg, dùng lviên/lần X 2 lần/ngày.
- Phối hợp thuốc có lợi trong điều trị.
Dùng kèm thuốc chẹn p trong đau thắt ngực và cao huyết áp.
Dùng kèm nitrat trong đau thắt ngực.
Phối hợp với ức chế enzym chuyển anginotensine trong cao
huyết áp.
1.1.7. Một s ố ch ế phẩm niýedipỉn tác dụng kéo dài trên thị
trường[12], [17]
- Viên nén Adalat - retard 20mg.
Hãng sản xuất: Bayer-Pharma. Thuốc có tác dụng kéo dài 12 giờ.
- Adalat LA viên nén thẩm thấu 30mg, 60mg, 90mg. Thuốc có tác
dụng kéo dài 24h.
Hãng sản xuất Bayer-Pharma.

4


- Viên nén Nifehexal Retard
Hãng sản xuất: Hexal AG. Viên nén dạng bao phim 20 mg tác
dụng kéo dài 12giờ.
- Viên Nifedipin - Rationphar
Hãng sản xuất: Lagon - Ration pharma. Thuốc có tác dụng kéo dài
12 giờ.
- Viên nén Nifelate 20 mg.
Hãng sản xuất Biogalenique. Thuốc có tác dụng kéo dài 12h.
1.1.8. Các phương pháp định lượng nifedipin.
a - Định lượng nifedipin nguyên liệu.
Phương pháp hoá h oci[13],[15]; Hoà tan nifedipin trong hỗn hợp
gồm 2 - methyl 2 - propanol acid percloric (tỷ lệ 1:1 v/v). Định
lượng bằng dung dịch amoni ceric Sulfat 0,1M. Chỉ thị là Ferroin

đến khi màu hồng biến mất.
Phương pháp vât lv: T221 sử dụng phương pháp HPLC.
Nguyên tắc của phương pháp: Các chất trong hỗn hợp được
tách dựa trên khả năng phân bô khác nhau của chúng vào hai pha
không hòa lẫn vào nhau luôn tiếp xúc, một pha tĩnh và một pha
động.
- Pha động gồm: nước/acetonitril/ methanol với tỷ lệ 50: 25 :
25 v/v.
- Detector UV: 235 nm.
- Dung dịch chuẩn và dung dịch thử được pha bằng cách hoà
tan chất chuẩn và chất thử trong methanol, sau đó pha loãng bằng
pha động. Tiến hành chạy sắc ký, ghi sắc đồ. Tính kết quả dựa
trên các pic chuẩn.
b - Định lượng nifedipin trong viên nén
+ Phương pháp đo quang[16]:

5


- Dung dịch thử: Nghiền viên chứa niíedipin thành bột mịn,
hoà tan trong methanol, lọc lấy dịch trong sau đó pha loãng bằng
nước cất
- Dung dịch chuẩn: Tiến hành song song cùng điều kiện với
dung dịch thử.
Tiến hành đo quang dựa vào mật độ quang của chất chuẩn,
chất thử ta tính được hàm lượng niíedipin trong viên.
+ Phương pháp HPLC[22]:
- Pha động: nước/acetonitril/ methanol với tỷ lệ 50:25:25 v/v,
- Detector UV: 235 nm.
- Dung dịch thử: Nghiền viên chứa niíedipin thành bột mịn,

hoà tan trong methanol, lọc lấy dịch trong sau đó pha loãng bằng
pha động.
- Dung dịch chuẩn: Tiến hành song song cùng điều kiện với
dung dịch thử, chạy sắc kí thu được các sắc đồ, dựa vào pic thử,
pic chuẩn và các yếu tố khác tính được hàm lượng niíedipin trong
viên.
c. Định lượng niỷedipin trong huyết tương [14], [18], [19]
K* Phương pháp chiết tách hoạt chất từ dịch sinh học:
Nguyên tắc: chuyển hoạt chất từ dạng liên kết với protein
thành dạng tự do tan trong dung môi hữu cơ rồi sử dụng dung môi
hữu cơ thích hợp để chiết tách.
Dung môi và điều kiện chiết xuất: để thu được kết quả định
lượng chính xác đòi hỏi phải có hiệu suất chiết cao. Do vậy việc
lựa chọn dung môi là rất quan trọng
Một số hệ dung môi được sử dụng:
+ Dicloromethan:n-pentan với tỷ lệ30/70. (v/v)
+ M ethyl-t-butyl ether: iso octan với tỷ lệ 75/25 v/v.

6


+ Dicloromethan:n-hecxan với tỷ lệ30/70 v/v.
+ Cloroíorm
+ Ethyl acetat
+ Chiết pha rắn(solid phase extraction)
Trong đó hay sử dụng là:
Dicloromethan:n-pentan với tỷ lệ 30/70 v/v
M ethyl-t-butyl ether:iso octan với tỷ lệ 75/25.
Phương pháp định lượng:
Các phương pháp định lượng niíedipin trong huyết tương bao

gồm: phương pháp sắc kí khí, sắc kí lỏng hiệu năng cao.
* Phương pháp sắc kí khí để định lượng niíedipin trong huyết
tương gặp một số khó khăn: Nhiệt độ cao sẽ ảnh hưởng đến
nifedipin, độ lặp lại thấp. Kết quả của phương pháp này sẽ bị giảm
khi xuất hiện một lượng đáng kể các chất có nguồn gốc từ pyridin
trong mẫu sinh học.
* Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao để định lượng niíedipin
trong huyết tương đã được nghiên cứu nhiều. Nó có khả năng định
tính, định lượng với hàm lượng niíedipin hàng nanogam trong lm l
huyết tương.
Với sắc kí lỏng

" hiệu năng cao thì việc lựa chọn pha động

để chạy sắc kí rất quan trọng. Nó ảnh hưởng đến thời gian lưu, khả
năng tách và diện tích pic.
Một số pha động được sử dụng trong định lượng niíedipin.
+ Acetonitril /đệm acetat pH=4
+ M ethanol/ nước/acid acetic (thêm triethylamin)
+ M ethanol/ đệm phosphat (pH=6,l hoặc 6,7)
+ M ethanol/ nước
+ M ethanol/ dung dịch amoni/đệm acetat

7


* Một số phương pháp định lượng nifedipin trong huyết tương
bằng HPLC.
Phương pháp 1:
- Pha động: Acetonitril : đệm acetat pH=4

- Cột sắc ký: C18250 X 4,6mm, 5|Lim
- Detector UV: 238ựim
- Tốc độ dòng: 2,5 ml/phút
- Xử lý mẫu: Hoạt chất được chiết bằng hỗn hợp gồm:
Dicloromethan: n-pentan (30/70 v/v). Thu lấy phần dung môi hữu
cơ, sau đó bốc hơi bằng khí nitơ ở nhiệt độ phòng ta thu được cắn.
Hoà tan cắn bằng pha động, lọc và chạy sắc kí.
Phương pháp 2:
- Pha động: m ethanol/ nước/acid acetic (65:34: 1 v/v trộn đều
và thêm 300|ul triethylamin vào 1000ml hỗn hợp)
- Cột sắc ký: C18 250 X 4mm, 5|j,m
- Detector u v 350 nm.
- Tốc độ dòngìlml/phút
<■>

- Xử lý mẫu: hoạt chất được chiết bằng hỗn hợp gồm: methyl t - butyl ether:iso octan (75/25 v/v ). Thu lấy phần dung môi hữu
cơ, sau đó bốc hơi bằng khí nitơ ở nhiệt độ phòng ta thu được cắn.
Hoà tan cắn bằng pha động, lọc và chạy sắc kí.
1.2.

SINH KHẢ DỤNG VÀ CÁCH ĐÁNH GIÁ.

1.2.1 Các khái niệm cơ bản [1 ], [8]
Sinh khả dụng (SKD) là khái niệm đặc trưng cho quá trình
sinh dược học của dạng thuốc: Sinh kh ả dụng là đại lượng chỉ tốc
độ và mức độ hấp thu của dược chất từ dạng bào c h ế vào vòng
tuần hoàn chung và đưa đến nơi tấc dụng.

8

SKD được phản ánh bằng đường cong biến thiên của nồng độ
dược chất trong máu ở dạng còn hoạt tính theo thời gian (hoặc
đường cong biểu diễn tổng lượng thuốc ở dạng hoạt tính hoặc dạng
đã chuyển hoá được thải trừ qua nước tiểu theo thời gian).
Đại lượng đặc trưng cho SKD là: diện tích dưới đường cong
của đồ thị biểu diễn sự biến thiên nồng độ thuốc ở dạng hoạt tính
trong máu theo thời gian.
Có hai cách để đánh giá SKD của một chế phẩm:
Sinh khả dụng tuyệt đối của một chế phẩm là tỉ lệ dược chất
vào được đại tuần hoàn ở dạng còn hoạt tính so với liều thuốc đã
dùng. SKD tuyệt đối được tính bằng tỉ số giữa tổng lượng chất
được hấp thu vào đại tuần hoàn từ dạng bào chế của nó (ở liều
dùng nhất định) và tổng lượng dược chất vào được hệ tuần hoàn từ
dạng thuốc tiêm động mạch hoặc tĩnh mạch (ở liều dùng tương
đương) . Vì thuốc tiêm động mạch hoặc tĩnh mạch được coi là có
SKD là 100%.
AUCThử X DIV
SKD tuyệt đối = -------- —----------- X 100%
AUCIV X DThử
Nếu liều của hai chế phẩm như nhau và trọng lượng người thử
thuốc như nhau ta có:
A U C Thử
SKD tuyệt đối = ----------------AUC I V

X 100%

Trong đó:
AUC Thử: Diện tích dưới đường cong của chế phẩm thử
AUC IV: Diện tích dưới đường cong của dung dịch tiêm tĩnh

mạch
DThử: Liều của chế phẩm thử
DIV: Liều của dung dịch tiêm tĩnh mạch

9


Sinh khả dụng tương đối của một c h ế phẩm (thử) so với một
ch ế phẩm khác lấy làm đối chiếu là tỷ lệ dược chất của c h ế phẩm
thử ở dạng hoạt tính vào được đại tuần hoàn so với c h ế phẩm đối
chiếu. C h ế phẩm đối chiếu là dạng bào c h ế có khả năng hấp thu
tôt, có uy tín trên thị trường.
SKD tương đối được tính bằng tỉ số giữa tổng lượng dược chất
hấp thu vào đại tuần hoàn của chế phẩm thử và tổng lượng dược
chất được hấp thu vào đại tuần hoàn của chế phẩm đối chiếu (ở
liều tương đương).

SKD tương đối

AUC Thử
= ----------------- X
AƯC Chuẩn

100%

Trong đó:
AUC Xhử: Diện tích dưới đường cong của chế phẩm thử
AUC

Chuẩn"

Diện tích dưới đường cong của chế phẩm chuẩn

SKD tương đối thường được dùng để so sánh SKD của hai
dạng thuốc hoặc hai biệt dược. Nhưng nó chỉ

cho phép so sánh

mức độ hấp thu mà chưa xét tới tốc độ hấp thu của thuốc. Vì thế
người ta đưa ra khái niệm tương đương sinh học.
Hai c h ế phẩm được coi là tương đương sinh học nếu cố mức
độ và tôc độ dược chất vào hệ tuần hoàn của chúng như nhau (có
SKD giống nhau).
Hai thuốc A và B được coi là tương đương sinh học nếu:
120

> AUC(A)x100
AUC(B)

>

10

gQ


120

>

Cmax(A)xl00
c max(B)

>

8Q

120

>

T max(A)xl00
T max(B)

>
~~

gQ

* Các đại
- Diện

lượng để đánh giá sinh khả dụng là:
tích dưới đường cong (AUC): biểu thị mức độ hấp thu

của dược chất từ chế phẩm.
- Nồng độ đỉnh ( Cmax ): thể hiện cường độ tác dụng của thuốc.
Nồng độ đỉnh phải vượt qua nồng độ tối thiểu có tác dụng thì
thuốc mới có đáp ứng lâm sàng nhưng nếu nồng độ đỉnh vượt quá
nồng độ an toàn thì thuốc dễ gây

- Thời

tác dụng không mong

muốn.

gian đạt nồng độ đỉnh ( Tmax): thể hiện tốc độ hấp thu

của dược chất từ chế phẩm.
- Khi đánh giá SKD của chế phẩm ta phải

xem xét đồng

ba thông số trên thì mới đánh giá đầy đủ mức độvà tốc

thời cả

độ hấp thu

dược chất từ chế phẩm.
1.2.2 Sinh khả dụng của viên nén[9], [10]
Viên nén là dạng thuốc chiếm tỷ lệ lớn trong số các thuốc
dùng theo đường uống, tuy nhiên các thuốc này có nhược điểm khó
kiểm soát chất lượng của thuốc do có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng
tới SKD của thuốc như: nguồn nguyên liệu, quá trình sản xuất, bảo
quản, lưu thông, cách sử dụng thuốc của người bệnh, đường
dùng...
Theo J.G.Wagner, khi thuốc được đưa vào cơ thể quá trình
giải phóng dược chất từ viên nén xảy ra theo sơ đồ sau:

11


Sơ đ ồ l: Quá trình giải phóng hoạt chất của viên nén theo
John G.Wagner.
1.2.3. Phương pháp đánh giá sinh khả dụng [8], [9], [22]
Hiện nay có nhiều tiêu chuẩn để đánh giá sinh khả dụng như
thử SKD in vitro, chỉ tiêu SKD in vivo: theo dõi nồng độ thuốc
trong máu,trong nước tiểu., .sau đây là một số chỉ tiêu cơ bản.
*

Độ rã của thuốc được đánh giá bằng phép thử độ rã với các

thiết bị đặc biệt được mô tả trong các Dược điển. Việc đánh giá độ
rã đã được đưa vào tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam và cũng là một
tiêu chuẩn để kiểm tra chất lượng viên nén. Trong một thời gian
dài, độ rã được coi là tiêu chuẩn về giải phóng dược chất từ viên
nén. Nhưng hiện nay, người ta thấy không có sự tương quan chắc
chắn giữa tốc độ rã và tốc độ hoà tan, nên tốc độ rã nhanh hay
chậm của thuốc thường không phải là yếu tố quyết định tốc độ và
mức độ hoạt chất được hấp thu vào đại tuần hoàn. Nó là tiêu chuẩn
bước đầu về sinh khả dụng viên nén.

12


* Độ hoà tan của một thuốc là đại lượng đặc trưng do quá
trình dược chất được hoà tan vào môi trường hoà tan hoặc dịch
tiêu hóa.Sự hoà tan có thể là quá trình bậc không hoặc bậc một.
Theo Noyes- Whitney, bước đầu tiên của quá trình hoà tan là sự

hoà tan dược chất ở bề mặt của tiểu phân rắn tạo thành một lớp
dung dịch bão hoà dược chất bao quanh tiểu phân đó. Sau đó, dược
chất từ lớp dung dịch bão hoà này sẽ khuyếch tán ra vùng có nồng
độ thấp hơn. Vì vậy tốc độ của quá trình hoà tan được biểu diễn
theo phương trình Noyes- Whitney như sau.

—

dt

= 5^_ (C bh
h

- C)

Trong đó:
dc/dt: Tốc độ hoà tan
D: Hệ số khuyếch tán dược chất với dung dịch.
A: Bề mặt tiễp xúc của dược chất với môi trường hoà tan.
h: Lớp bề dày lớp khuyếch tán bao quanh tiểu phân dược
chất.
Cbh: Nồng độ dược chất trong lớp dung dịch bão hoà.
C: Nồng độ dược chất trong dung môi.
Trong Dược Điển Việt Nam III phép thử độ hoà tan đã được
đưa vào tiêu chuẩn chất lượng cho viên nén.
* Độ hấp thu của thuốc từ ống tiêu hoá phụ thuộc nhiều yếu
tố như: diện tích bề mặt ống tiêu hoá, tốc độ tháo rỗng dạ dày, lưu
lượng máu đến vị trí hấp thu tốc độ hấp thu của thuốc có thể biểu
diễn bằng phương trình bậc không hoặc bậc một tuỳ thuộc vào cơ
chế hấp thu của thuốc là vận chuyển thụ động, vận chuyển tích cực

13


hay vận chuyển thuận lợi. Trong thực tế, cơ chế phổ biến nhất là
vận chuyển theo gradient nồng độ và tuân theo định luật Fick:

dC_ = D .S.K
dt
a

(Co _ Ct)

Trong đó
dC/dt: Tốc độ hấp thu
S: Diện tích bề mặt màng
a: Bề dày màng
D: Hằng số tốc độ khuyếch tán
K: Hệ số phân bố dầu/nước
Co-Ct: Sự chênh lệch nồng độ trong và ngoài màng.
Để đánh giá sự hấp thu của thuốc, phải sử dụng phương pháp
in vivo. Thuốc cần nghiên cứu được đưa vào cơ thể sống (người
hoặc súc vật thí nghiệm) theo những đường khác nhau. Sau những
khoảng thời gian xác định, người ta lấy mẫu máu (máu, nước tiểu),
đem chiết lấy hoạt chất và xác định hàm lượng thuốc (có thể ở
dạng chuyển hoá hoặc chưa chuyển hoá). Để xác định thuốc trong
dịch sinh học, có nhiều phương pháp khác nhau nhưng hay được sử
dụng nhất là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) vì
khả năng tách cao, định tính và định lượng đồng thời hoạt chất ở
hàm lượng rất nhỏ.

Việc nghiên cứu SKD có thể tiến hành trên súc vật như: chuột,
thỏ, chó trước khi tiến hành thử nghiệm trên người. Việc thử
nghiệm trên súc vật có ưu điểm là rẻ tiền dễ thực hiện. Đặc biệt,
thử nghiệm trên chó cho kết quả đáng tin cậy bởi đường tiêu hoá
của chó gần giống với đường tiêu hoá của hoá của người hơn. Việc

14


đánh giá tương đương sinh học của các thuốc phải được thử trên
người và phải thử chéo ít nhất 12- 24 người tình nguyện (thử cả
hai chế phẩm trên cùng một người). Thường thì người ta cho thử
trên hai nhóm người tình nguyện.
Hiện nay, ở nhiều nước trên thế giới, một biệt dược khi đưa ra
sử dụng trên thị trường phải có hồ sơ thử tương đương sinh học với
một thuốc khác đã được công nhận có hiệu lực. Công việc này khá
tốn kém, do vậy các nhà nghiên cứu đang cố gắng tìm mối tương
quan giữa in vitro và in vivo để có thể dùng SKD in vitro thay thế
cho SKD in vivo trong đánh giá tương đương sinh học. Trên thực
tế với nhiều thuốc người ta đã nghiên cứu thấy có mối tương quan
giữa độ hoà tan in vitro và in vivo. Theo tài liệu tổng quan của
Banakar và Block về kết quả nghiên cứ tương quan in vitro-invivo
của 50 dược chất trong một số chế phẩm bào chế, có 30 dược chất
thể hiện tương quan tỉ lệ thuận, 4 dược chất có tương quan đồng
biến ở mức độ nhất định, còn 16 chất rất ít có tương quan. Khi mối
tương quan đó được xác định thì với kết quả thử nghiệm in vitro ta
có thể dự đoán được phần nào tương đương sinh học của thuốc mà
không cần phải thực hiện đầy đủ các thử nghiệm in vivo. Có nhiều
thuốc dù đã có nhiều nghiên cứu nhưng vẫn chưa thể đưa ra một
kết luận nào về mối tương quan giữa in vitro và in vivo vì đây thực

sự là một công việc khó khăn, phức tạp kể cả với các nước có công
nghệ phát triển.
Nói chung SKD in vitro chỉ là công cụ để dự doán SKD in
vivo.

15


PHẦN 2: THựC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHẤP THựC NGHIỆM.

.

2.1.1 Nguyên vật liệu, phương tiện nghiên cứu và súc vật thí nghiệm.
* Nguyên vật liệu :
Nifedipin (Sankyo Pharma GmbH, Đức)
Methanol (HPLC grade- Merck)
Acetonitril (HPLC grade- Merck)
Acid acetic băng (PA- Merck)
Natri acetat (PA- Merck)
Trietylamin (PA- Merck).
Dicloromethan (PA- Merck),
n- pentan (PA- Merck).
Natrihydroxit 0,1M (Trung Quốc).
* Phương tiện nghiên cứu:
- Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao (Dionex, Mỹ)
Cột sắc ký (Lichrospher RP -18 (5|im) 250x4, Merck - Đức)
Hệ thống bơm mẫu tự động.
- Cân phân tích (Mettle Toledo - Đức)
- Máy đo PH (Mettle Toledo - Đức)

- Máy lắc (Heidoph - Pháp)
- Máy ly tâm (Eppen dorf - Pháp)
- Máy siêu âm - hoà tan (Branson - Đức)
- Máy lọc nước siêu sạch (Elga - Pháp)
* Mẫu thử:
- Viên nifedipin TDKD 20 mg do bộ môn Bào chế trường Đại học Dược
chế tạo 9/2001. Viên được bào chế dưới dạng cốt với tá dược Carbomer, kéo

16


dài 12 giờ.
-

Viên đối chiếu: Adalat retard 20 mg của hãng Bayer Pharma, số lô

CBWJH1, hạn dùng 12- 2003. Viên dạng cốt, kéo dài 12 giờ.
* Súc vật thí nghiệm:
Súc vật thí nghiệm được lựa chọn là chó khoẻ mạnh, cân nặng 10 - 12 kg.
Được nuôi trong điều kiện cho ăn, uống đầy đủ, không cho ăn các thức ăn lạ.
2.1.2. Phương pháp thực nghiệm.
a. Phương pháp cho uống thuốc:
Chó được uống thuốc (cho uống trực tiếp) theo phương pháp cân bằng
(multiple - dose, steady - State): thuốc được uống trong 3 ngày liên tục, mỗi

ngày 2 viên/2 lần (lúc 8h sáng và 4h chiều). Sang ngày thứ 4 cho chó uống 1
viên vào buổi sáng sau đó lấy mẫu máu sau những khoảng thời gian nhất định
(Chó nhịn đói từ lOh tối của ngày trước khi lấy máu và trong thòi gian lấy
máu, tuy nhiên được

7 bổ sung chất điện giải và dung dịch glucose 20%

bằng cách tiêm vàcKbụng).
Tiến hành thử chéo trên 3 chó, mỗi chó được uống 2 loại viên: niíedipin

TDKD và viên Adalat retard, thời gian giữa 2 lần thử là 2 tuần.
b. Phương pháp lấy mẫu:
Chó sau khi uống thuốc sẽ được lấy máu ở tĩnh mạch đùi tại các thời
điểm: Oh; 0,5h; lh; 2h; 4h; 6h; 9h; 12h (mẫu Oh được lấy trước lúc cho uống
viên thứ 7 - vào buổi sáng ngày lấy mẫu), số lượng mỗi mẫu máu là 3ml. Máu
cho vào ống nghiệm tráng sẵn heparin chống đông sau đó đem li tâm vói tốc
độ 5000 vòng/ phút, thời gian 10 phút.
Tách lấy phần huyết tương cho vào ống nghiệm đã được bọc giấy nhôm
bảo vệ chống ánh sáng, sau đó đem định lượng ngay hoặc bảo quản ở tủ lạnh
sâu - 20°c.
Các bước tiến hành vói mẫu huyết tương cần tránh ánh sáng hoặc thao
tác dưới ánh sáng đèn natri để tránh sự phân huỷ của niíedipin.

17


c.Phương pháp xây dựng đường chuẩn.
* Xây dựng đường chuẩn trong pha động:
Cân một lượng chính xác nguyên liệu nifedipin hoà tan trong pha động
(dùng máy siêu âm để hoà tan), thu được dung dịch chuẩn A. Từ dung dịch A,
dùng pha động để pha thành các dung dịch có nồng độ từ 10 - 320 ng/ml

Lọc qua màng millipor và tiến hành chạy sắc kí.
- Pha động: Tuỳ vào hệ dung môi khảo sát (pha động được lắc siêu âm 10 phút
để đuổi khí, chỉ sử dụng trong ngày).

- Cột sắc kí: Lichrospher RP - 18 (5|um) 250x4mm.
- Tốc độ dòng: lml/phút
- Detector UV: 238nm
- Vòng nhận mẫu: 100 |Lil
- Hệ thống bơm mẫu tự động.
Yêu cầu:
- Các pic thu được phải gọn, hệ số đối xứng, thòi gian lưu hợp lý.
- Phải có sự tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ nifedipin trong khoảng
khảo sát.
- Độ lặp lại của diện tích pic tại nồng độ khảo sát nằm trong giới hạn sai số
5%
* Xây dựng đường chuẩn trong huyết tương:
Phương pháp:
- Lựa chọn hệ dung môi để chiết niíedipin trong huyết tương là
dicloromethan/ n - pentan với tỷ lệ 30/70 v/v.
- Cân một lượng chính xác nguyên liệu niíedipin hoà tan trong pha động
(dùng máy siêu âm hoà tan) thu được dung dịch chuẩn B. Từ dung dịch B pha
thành các dung dịch có nồng độ khác nhau sao cho khi lấy một lượng (200 ỊLil)
cho vào lml huyết tương trắng ta thu được các nồng độ niíedipin từ 10 320ng/ml. Mẫu huyết tương được xử lý theo sơ đồ:

18


Sơ đồ 2: Quy trình xử lí mẫu huyết tương chó

19


Yêu cầu:
- Phải có sự tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ niíedipin trong khoảng

khảo sát.
- Độ lặp lại của diện tích pic tại nồng độ khảo sát nằm trong giới hạn sai số
5%
- Các pic thu được phải gọn, tách riêng với các pic tạp, thời gian chạy mẫu
phải thích hợp để loại tạp tránh sai số khi định lượng mẫu tiếp theo.
d. Phương pháp định lượng nỉfedipin trong huyết tương.
Định lượng niíedipin trong huyết tương bằng phương pháp HPLC vói hệ
sắc kí thu được sau khi khảo sát ở mục 2.1.2 b.
Mẫu huyết tương của chó đã uống thuốc được định lượng sau khi xử lý
theo sơ đồ 2 (không cho thêm niíedipin). Tiến hành định lượng song song
từng mẫu thử và chuẩn ở cùng thời điểm của cùng một chó.
Kết quả thu được biểu thị bằng diện tích pic, từ diện tích pic tính được
nồng độ niíedipin trong máu theo phương pháp đường chuẩn.
e. Phương pháp xử lý số liệu.
Các số liệu thu được được xử lý theo phương pháp thống kê toán học dựa
trên phân bố student với khoảng tin cậy xác suất thống kê là 0,05.
Các thông số DĐH cơ bản: T1/2, AUC, MRT (hệ số lưu trú trung bình của
thuốc), Ke được tính trên phần mềm Winnolin.

.

2.2. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM

2.2.1. Khảo sát một số hệ dung môi pha động đ ể định lượng
niýedipin trong huyết tương chó bằng HPLC.
a. Pha động 1: Acetonitril/đệm acetat pH = 4 với tỷ lệ 55/45 v/v.
* Xây dựng đường chuẩn niíedipin trong pha động.
+ Cân lượng chính xác 20mg niíedipin cho vào bình định mức
25ml hoà tan bằng pha động (lắc siêu âm để hoà tan), thêm pha
động đến vạch lắc đều được dung dịch A. Pha loãng dung dịch A

20


bằng pha động để thu được dung dịch có nồng độ lần lượt là: 10,
20, 40, 80, 160, 320 ng/ml.
+ Tiến hành chạy sắc ký như phương pháp đã nêu ở phần 2.1.2.C,
kết quả thu được thể hiện ở bảng 1:
Bảng 1: Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ (C) nifedipin
trong pha động
C(ng/ml)
Diện tích pic

10

20

40

80

160

320

1828

2847

4774

6525

11626

20547

Từ bảng 1 xây dựng phương trình đường chuẩn niíedipin trong
hệ pha động 1

Nồng độ (ng/ml)
Hình 1: Đường chuẩn niíedipin trong hệ pha động 1

b. Pha động 2: Methanol/nước/acid acetic với tỷ lệ 65/35/1 (trộn
đều và thêm 300|il triethylamin trong lOOOml hỗn hợp trên).
+ Cân lượng chính xác 20mg niíedipin cho vào bình định mức
25ml hoà tan bằng pha động (lắc siêu âm để hoà tan), thêm pha

21